CN110257249A - 一种用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片及给药培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微流控芯片领域，尤其涉及一种用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片及给药培养方法，其中，微流控芯片包括上下依次叠置的细胞培养层、多孔膜层和盖片层，自细胞培养层的上表面向下凹设有细胞培养区以及与细胞培养区的两端分别连通的细胞载流液入口通道和细胞载流液出口通道，自细胞培养区的底面向下凹设有多个细胞培养腔，多孔膜层上设有多孔区域。该芯片结构简单，易加工，可以实现肿瘤细胞球体高通量、大小均一的培养，能够使药物或培养基均匀扩散，减少对肿瘤细胞球体的剪切力，该芯片可以应用于抗癌药物开发过程中的体外筛选实验。

Description

一种用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片及给药培养方法
技术领域
本发明涉及微流控芯片领域，尤其涉及一种用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片及给药培养方法。
背景技术
随着组织工程的迅速发展，能够模拟人体微环境的三维细胞培养技术应运而生，逐渐显示出比传统二维细胞培养方式更加全面的优势。将三维细胞培养技术应用到肿瘤研究中，可探索肿瘤侵袭机制、肿瘤微环境、肿瘤药物筛选等系列领域，有效解决了二维培养实验结果准确性低的问题。微流控芯片技术凭借微尺度、高效率等众多优势，在细胞研究中应用广泛，通过设置合理的培养结构，可以实现一种或多种细胞的芯片在线长期培养，为生命科学领域的细胞水平研究提供了良好的实现平台。
在现有技术中，Hockemeyer等人开发了一种三维培养芯片可用于在三维微环境中对基质细胞和肿瘤细胞球体之间的相互作用进行成像，能够观察间质流、内皮细胞、白细胞和成纤维细胞与肿瘤细胞的相互作用。Jeong等提出了一种基于微流控芯片的肿瘤组织模型，该模型共培养肿瘤细胞和癌相关成纤维细胞，研究了成纤维细胞对肿瘤细胞蛋白表达和迁移活性的影响。然而，尽管目前已经报道了很多利用微芯片实现的肿瘤机制相关研究，但大多芯片结构复杂，不易加工，且难以实现高通量、尺寸可控、大小均一的肿瘤细胞球体培养，无法满足抗癌药物体外筛选实验的需要。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明提供一种用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片，解决了肿瘤细胞芯片结构复杂，不易加工，且难以实现高通量、大小均一的肿瘤细胞球体培养，并且均匀给药的问题。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
本发明一方面提供一种用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片，包括：上下依次叠置的细胞培养层、多孔膜层和盖片层，自细胞培养层的上表面向下凹设有细胞培养区以及与细胞培养区的两端分别连通的细胞载流液入口通道和细胞载流液出口通道，盖片层上设有与细胞载流液入口通道和细胞载流液出口通道分别连通的细胞载流液入口和细胞载流液出口，自细胞培养区的底面向下凹设有多个细胞培养腔；自盖片层的下表面向上凹设有药液作用区及与药液作用区的两端分别连通的药液入口通道和药液出口通道；药液入口通道和药液出口通道分别远离药液作用区的一端设有与盖片层相连通的药液入口和药液出口，多孔膜层上设有多孔区域，且药液作用区、多孔区域和细胞培养区三者上下对应设置。
根据本发明，多个细胞培养腔按照矩形阵列排布，且相邻两个细胞培养腔之间的间距相同均为50-150μm。
根据本发明，细胞培养区、细胞载流液入口通道和细胞载流液出口通道的深度均为H1，多个细胞培养腔的深度均为H2。
根据本发明，细胞培养腔的横截面为圆形，细胞培养腔的直径R与深度H2的比值为1-2。
根据本发明，细胞培养腔的直径R为150-600μm。
根据本发明，细胞培养区的两端分别靠近细胞载流液入口通道和细胞载流液出口通道处渐缩成锥形。
根据本发明，多孔区域的孔隙率为70％-80％，多孔区域的孔径为1-3μm。
根据本发明，细胞培养层和盖片层的材质均为聚二甲基硅氧烷，多孔膜层的材质为聚碳酸酯。
根据本发明，盖片层、多孔膜层和细胞培养层三者通过等离子体封装键合。
本发明另一方面提供一种肿瘤细胞的给药培养方法，给药培养方法包括如下步骤：
S1、将表面活性剂通过细胞载流液入口注入到细胞培养区内，静置12h-24h；
S2、将肿瘤细胞载流液通过细胞载流液入口注入到细胞培养腔内，培养24h-36h，形成肿瘤细胞球体；
S3、将药剂通过药液入口注入到药液作用区，然后通过多孔区域渗透到细胞培养腔中，继续培养6h-12h，完成给药培养。
(三)有益效果
本发明的有益效果是：
本发明提供的微流控芯片，通过在细胞培养区内设置多个细胞培养腔，可以实现肿瘤细胞球体高通量、大小均一的培养，且该芯片结构简单，易加工，在多孔膜层上设置有多孔区域可以实现药物均匀扩散，减少对肿瘤细胞球体的剪切力，可以应用于抗癌药物开发过程中的体外筛选实验。
本发明提供的给药培养方法利用上述的微流控芯片进行给药培养，可实现肿瘤细胞球体的三维体外培养及给药，能够模拟癌症患者体内实体肿瘤的机械结构。
附图说明
图1为本发明的肿瘤细胞三维培养的微流控芯片的结构示意图；
图2为本发明中细胞载流液通入细胞培养腔后的状态；
图3为在本发明中培养24h后形成的肿瘤细胞球体；
图4为本发明不同药液浓度作用下芯片内肿瘤细胞的平均存活率柱状图。
【附图标记说明】
1：细胞培养层；11：细胞培养区；111：细胞培养腔；12：细胞载流液入口通道；13：细胞载流液出口通道；
2：多孔膜层；21：多孔区域；22：第一通孔；23：第二通孔；
3：盖片层；31：细胞载流液入口；32：细胞载流液出口；33：药液作用区；34：药液入口通道；35：药液出口通道；36：药液入口；37：药液出口。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
参照图1，本实施例一方面提供一种用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片，包括：上下依次叠置的细胞培养层1、多孔膜层2和盖片层3。
具体地，自细胞培养层1的上表面向下凹设有细胞培养区11以及与细胞培养区11的两端分别连通的细胞载流液入口通道12和细胞载流液出口通道13，盖片层3上设有与细胞载流液入口通道12和细胞载流液出口通道13分别连通的细胞载流液入口31和细胞载流液出口32，自细胞培养区11的底面向下凹设有多个细胞培养腔111。在培养区设置多个细胞培养腔111可以实现高通量、均一的肿瘤细胞球体的培养。在实际应用中，多孔膜层2上设有分别与细胞载流液入口31和细胞载流液出口32对应的第一通孔22和第二通孔23。
具体地，自盖片层3的下表面向上凹设有药液作用区33及与药液作用区33的两端分别连通的药液入口通道34和药液出口通道35，药液入口通道34和药液出口通道35分别远离药液作用区33的一端设有与盖片层3相连通的药液入口36和药液出口37。在本实施例中盖片层3、多孔膜层2和细胞培养层1三者通过等离子体封装键合，当然可以采用其他的封装方式实现封装，本实施例仅为举例说明。
进一步地，多孔膜层2上设有多孔区域21，且药液作用区33、多孔区域21和细胞培养区11三者上下对应设置。多孔区域21的设置，便于药物通过多孔区域21缓慢均匀的渗透扩散于细胞培养腔111，可以实现均匀的给药。当在芯片上长时间培养肿瘤细胞球体，需要更换新鲜培养基时，将新鲜培养基通过药液入口36注入到药液作用区33，然后通过多孔区域21渗透到细胞培养腔111中，减少更换培养基时对正在培养的肿瘤细胞球体的直接剪切力。
在实际应用中，多个细胞培养腔111按照矩形阵列排布，且相邻两个细胞培养腔111之间的间距相同均为50-150μm。当然，在实际应用中，为了便于培养不同大小的肿瘤细胞球体，上述的细胞培养腔111也可以根据需要设计成不同大小的腔室，本实施例仅为举例说明。
进一步地，细胞培养区11、细胞载流液入口通道12和细胞载流液出口通道13的深度均为H1，多个细胞培养腔111的深度均为H2，细胞培养腔111的横截面为圆形，细胞培养腔111的直径R与深度H2的比值为1-2，细胞培养腔111的直径R为150-600μm，在通入细胞载流液时，使细胞更倾向于被留存在细胞培养腔111里，可以更好的培养肿瘤细胞。
在本实施例中，细胞培养区11的两端分别靠近细胞载流液入口通道12和细胞载流液出口通道13处渐缩成锥形，以形成V字形流速过渡结构，过渡结构可以使细胞载流液入口通道12中高速运动的细胞载流液降低流速，便于细胞落入细胞培养腔111。
在实际应用中，多孔区域21的孔隙率为70％-80％，多孔区域21的孔径为1-3μm。细胞培养层1和盖片层3的材质均为聚二甲基硅氧烷，多孔膜层2的材质为聚碳酸酯，当然也可以选用其它材质，本发明对此不做限定。
本实施例另一方面提供上述肿瘤细胞三维培养的微流控芯片的制备方法如下：
步骤1：清洗及修饰，将单晶硅片进行清洗，洗净后放置在温度为200℃的电热板上15min，将硅片放置在挥发缸中，将修饰试剂HMDS(Hexamethyldisilazane，六甲基二硅胺)滴入缸中1-2滴，等待挥发的时间约为3min。
步骤2：旋涂光刻胶，用甩胶机将处理好的硅片均匀地甩上一层光刻胶，光刻胶是一种光敏材料，在紫外光照射下会固化，根据所需的通道深度来设置甩胶机的转速，甩胶的厚度与胶的粘度有关，甩胶完毕后静置1-2min。
步骤3：曝光及显影，将有培养腔图案的光掩模覆盖在硅片上，用紫外光照射涂有光刻胶的硅片，根据光刻胶性能和曝光机功率确定曝光时间，曝光操作结束，将样片取出，置于烘胶台上处理一定时间，用光刻胶配套的显影液通过化学方法去除被曝光部分的光刻胶，然后烘干，掩模上的图案已被精确地复制在光刻胶层上。
步骤4：刻蚀，采用化学腐蚀的方法，在未曝光部分的光刻胶保护下，在硅片上精确腐蚀出掩模上的图案，去除掉遗留的光刻胶层，模具中细胞培养腔111部分加工完成。
再次进行步骤2、3、4过程，将模具中的通道部分加工完毕后，进行PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)的注塑加工。模具硅片先用1-2滴的甲基氯硅烷进行约3min的表面修饰，修饰完成后将硅片压实放在培养皿中，倒入配好的PDMS胶溶液，确定硅片上的胶溶液无气泡后放入真空烘箱中在70℃下烘烤100min。
待PDMS固化后，将PDMS从模具硅片上揭下。剥离后的PDMS可以用打孔器在出入口处打孔，用切割刀沿结构外围切出大小适中的完整芯片，肿瘤细胞球体培养层制备完成。
用相同方式制备给药作用区33，然后用等离子处理机将两层PDMS芯片与多孔膜层2键合封接在一起，放入烘箱6℃烘烤过夜，芯片制作完成。
当然，在实际应用中，上述肿瘤细胞三维培养的微流控芯片也可以采用其他的方法进行制备形成，本实施例仅为举例说明，对此不进行限定。
本实施例再一方面提供一种肿瘤细胞的给药培养方法，给药培养方法包括如下步骤：
S1、将表面活性剂通过细胞载流液入口31注入到细胞培养区11内，静置24h。
其中，表面活性剂在这里主要起到防止肿瘤细胞贴壁的作用，一般可以采用Pluronic F-127(聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物)溶液，在本实施例中Pluronic F-127溶液是由Pluronic F-127与去离子水按1:100的比例在40℃下搅拌溶解而得。当然，也可以根据需要采用其他类型的表面活性剂，只要能够具有防止肿瘤细胞贴壁的作用均可。
S2、将宫颈癌(HeLa)细胞载流液以1×107cells/mL的密度通过细胞载流液入口31注入到细胞培养腔111内，培养24h，形成肿瘤细胞球体，图2为细胞培养腔111内通入细胞载流液时的状态，图3为肿瘤细胞培养24h后形成的肿瘤细胞球体。
S3、将药液通过药液入口36注入到药液作用区33，然后通过多孔区域21渗透到细胞培养腔111中，继续培养6h，完成给药培养。
进一步地，利用上述提供的给药培养方法，细胞载流液以五种不同速度注入芯片，考察注射速度对肿瘤细胞球体形成的影响。对上述S2中分别用0.1μL/min、0.15μL/min、0.2μL/min、0.25μL/min、0.3μL/min五种不同速度注入宫颈癌(HeLa)细胞载流液，统计了注入细胞后细胞培养腔111内的初始细胞数量，统计了培养24h后形成的肿瘤细胞球体直径。发现0.15μL/min的注射速度下初始细胞数量较多且整个细胞培养腔111内的肿瘤细胞球体最均匀，其他速度下细胞培养腔111内肿瘤细胞球体尺寸大小不均，且细胞损失量大。
进一步地，对上述提供的给药培养方法，进行肿瘤细胞球体的药物筛选，以便于筛选对肿瘤细胞球体有抑制作用的药物。具体筛选过程如下：
肿瘤细胞球体培养完成后，配制不同浓度的顺铂药剂分别注入药液作用区33，注入完成后将芯片放入培养箱继续培养6h后拿出，完成给药培养，其中顺铂药液的浓度梯度设置为5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml，考察了体外肿瘤球体模型对不同浓度药物作用效果的敏感性。
然后使用0.4％台盼蓝染液进行细胞染色，染色时间为3min，在显微镜下观察细胞状态。
肿瘤细胞球体中的细胞存活率随药物浓度变化趋势如图4所示。从给药结果可以看出，顺铂药剂对肿瘤细胞球体有明显抑制效果，且药剂浓度越高，肿瘤细胞球体的细胞存活率越低，同时观察到，在大浓度的药剂通入过程中，肿瘤细胞球体明显开始收缩球体，且球体中的细胞颜色加深。在四种不同药剂浓度下，肿瘤细胞球体尺寸与肿瘤细胞球体中的细胞存活率都基本呈正相关状态，肿瘤细胞球体尺寸越大，细胞存活率越高。这侧面证明了三维肿瘤细胞球体对于抗癌药物具有一定的耐受性，而且结果表明，尺寸越大的肿瘤细胞球体，对于抗癌药物的耐受性越高。
本发明提供的微流控芯片，能够培养高通量的均一的肿瘤细胞球体，可以通过改变细胞培养腔111的径深比形成多尺寸的肿瘤细胞球体，模拟体内实体肿瘤细胞球体的三维形态，有助于进行肿瘤机制的片上研究，采用多层结构配合多孔膜层2用微孔扩散的方式进行给药，能够减少给药时或在线培养更换培养基时对肿瘤细胞球体的直接剪切力。该芯片还可用于抗癌药物的体外筛选实验，为肿瘤细胞的在线研究及抗癌药物开发等应用提供了一种新平台。
需要理解的是，以上对本发明的具体实施例进行的描述只是为了说明本发明的技术路线和特点，其目的在于让本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，但本发明并不限于上述特定实施方式。凡是在本发明权利要求的范围内做出的各种变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于肿瘤细胞三维培养的微流控芯片，其特征在于，包括上下依次叠置的细胞培养层(1)、多孔膜层(2)和盖片层(3)；
自所述细胞培养层(1)的上表面向下凹设有细胞培养区(11)以及与所述细胞培养区(11)的两端分别连通的细胞载流液入口通道(12)和细胞载流液出口通道(13)；所述盖片层(3)上设有与所述细胞载流液入口通道(12)和细胞载流液出口通道(13)分别连通的细胞载流液入口(31)和细胞载流液出口(32)，自所述细胞培养区(11)的底面向下凹设有多个细胞培养腔(111)；
自所述盖片层(3)的下表面向上凹设有药液作用区(33)及与药液作用区(33)的两端分别连通的药液入口通道(34)和药液出口通道(35)，所述药液入口通道(34)和药液出口通道(35)分别远离药液作用区(33)的一端设有与所述盖片层(3)相连通的药液入口(36)和药液出口(37)；
所述多孔膜层(2)上设有多孔区域(21)，且所述药液作用区(33)、所述多孔区域(21)和所述细胞培养区(11)三者上下对应设置。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，
多个所述细胞培养腔(111)按照矩形阵列排布，且相邻两个所述细胞培养腔(111)之间的间距相同均为50-150μm。
3.根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，
所述细胞培养区(11)、细胞载流液入口通道(12)和细胞载流液出口通道(13)的深度均为H1，多个所述细胞培养腔(111)的深度均为H2。
4.根据权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，
所述细胞培养腔(111)的横截面为圆形，所述细胞培养腔(111)的直径R与深度H2的比值为1-2。
5.根据权利要求4所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞培养腔(111)的直径R为150-600μm。
6.根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，
所述细胞培养区(11)的两端分别靠近所述细胞载流液入口通道(12)和细胞载流液出口通道(13)处渐缩成锥形。
7.根据权利要求6所述的微流控芯片，其特征在于，
所述多孔区域(21)的孔隙率为70％-80％，所述多孔区域的孔径为1-3μm。
8.根据权利要求7所述的微流控芯片，其特征在于，
所述细胞培养层(1)和所述盖片层(3)的材质均为聚二甲基硅氧烷，所述多孔膜层(2)的材质为聚碳酸酯。
9.根据权利要求8所述的微流控芯片，其特征在于，
所述盖片层(3)、多孔膜层(2)和细胞培养层(1)三者通过等离子体封装键合。
10.一种肿瘤细胞的给药培养方法，其特征在于，采用如权利要求1-9任一项所述的微流控芯片进行给药培养，所述给药培养方法包括如下步骤：
S1、将表面活性剂通过所述细胞载流液入口(31)注入到所述细胞培养区(11)内，静置12h-24h；
S2、将肿瘤细胞载流液通过所述细胞载流液入口(31)注入到所述细胞培养腔(111)内，培养24h-36h，形成肿瘤细胞球体；
S3、将药剂通过所述药液入口(36)注入到所述药液作用区(33)，然后通过所述多孔区域(21)渗透到细胞培养腔(111)中，继续培养6h-12h，完成给药培养。
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