CN112226363B - 利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法。该装置包括细胞培养基底、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统，其中细胞培养基底粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之下，聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片粘合于所述微流体控制系统之下，同时粘合于所述细胞培养基底之上，微流体控制系统粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之上。本公开提供的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法，采用包括细胞培养基底、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统的装置，结构简单，操作方便可控，克服了由于操作过程的不可控性，类器官的大小很难均一的缺点。

Description

利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法
技术领域
本公开涉及类器官体外培养及分析技术领域，具体涉及一种利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法。
背景技术
类器官是从干细胞或祖细胞产生的三维组织结构，可以在细胞的类型、组织结构和功能方面模拟相应的体内器官。类器官一般采用二维细胞培养方法进行培养，二维细胞培养方法可以良好的控制同源细胞的生长环境，方便显微镜分析和观察培养基变化，并可以维持大多数细胞类型的细胞增殖。二维细胞培养方法为人类对于细胞的研究提供了大量的理论依据和实验数据。
但是，组织器官中大多数细胞为三维结构，它们通过细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质的紧密相互作用而产生生理功能，而传统的二维细胞培养技术系统不能复制这些生物学特征，而与传统的二维细胞培养相比，三维培养的类器官不仅可以混合多种细胞，在细胞种类上和体内相似，而且模仿了细胞间物理联系，形成了更加真实的细胞间生物通信。
类器官内不同的细胞的分化与内部结构自组装的重排，描述了其在生长过程早期器官发育的分子和细胞阶段。这些特征使类器官成为体外实验的强大模型，类器官的研究为疾病建模、药物开发和筛选、精准医疗以及了解器官发生提供了巨大的机会。但是目前关于类器官的研究仅存在于小规模的实验室中，且多用于器官发育过程的探究，并不能大规模的应用。由于其制备过程不可控制，制备得到类器官大小和形态不均一，导致实验的重复性较差。这些不可控因素导致了类器官技术很难应用于疾病建模、药物开发和筛选、个性化药物中去。
现有的方法是由荷兰科学家Hans Clever提出的，在24或6孔板上，利用基质胶Matrigel Matrix包裹的原代小肠细胞，能够在体外成功的培养出具有器官结构特征的组织。利用这种方法，能够在体外进行肠、肝脏、大脑等类器官。但是由于操作过程的不可控性，类器官的大小很难均一，并且各个孔板中类器官的数目并不一致。更重要的是，利用这种方法，每孔中的类器官生成效率一般都很低，虽然培养出的类器官组织数目足够应用于了解器官的发生，但是远远不能够满足临床上的需求。
发明内容
(一)要解决的技术问题
为了克服以上种种问题，本公开提供了一种利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法，以利用微阵列深井来解决现有类器官体外培养大小不均一、严重依赖操作技术和类器官形成效率低等问题。
(二)技术方案
为达到上述目的，本公开采用的技术方案如下：
根据本公开的一个方面，提供了一种利用微阵列深井培养高通量类器官的装置，该装置包括细胞培养基底、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统，其中：所述细胞培养基底，粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之下，用于安置所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片；所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片，粘合于所述微流体控制系统之下，同时粘合于所述细胞培养基底之上，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片中的微井阵列与所述微流体控制系统相连通，用于实现与所述微流体控制系统的管道中的物质进行交换；所述微流体控制系统，粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之上，所述微流体控制系统中的微流体管道与所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片相连通，在进行物质交换的同时对微流体进行控制。
上述方案中，所述细胞培养基底以物理粘合的方式粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之下，所述细胞培养基底与所述微流体控制系统或所聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片均不进行物质交换。
上述方案中，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片以热封装后的化学键链接方式粘合于所述微流体控制系统之下，同时以物理粘合的方式粘合于所述细胞培养基底之上；所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片中的微井阵列直径为150μm-800μm，高度为100μm-300μm。
上述方案中，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片在与所述微流体控制系统的管道中的物质进行交换的同时，在所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行类器官的培养，并且以物理方式控制类器官大小，从而实现类器官的均一培养。
上述方案中，所述微流体控制系统以热封装后的化学键链接方式粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之上；所述微流体控制系统中的微流体管道是宽度为150μm-800μm，高度为10μm-40μm的长方体的微流体管道。
上述方案中，所述在进行物质交换的同时对微流体进行控制，具体包括：进行细胞或组织的灌入、培养基的灌入及更换、药物测试时药物流入及排出、以及实验所需的微流体的控制。
根据本公开的另一个方面，提供了一种采用上述装置培养高通量类器官的方法，该方法包括：对类器官培养所需要的细胞或组织以及培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理；在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种；清洗未进入深井的多余细胞或组织，并将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官。
上述方案中，所述对类器官培养所需要的细胞或组织以及培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理，包括：调整细胞或组织的浓度至1×104～1×107个细胞每毫升细胞悬液；对培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行表面亲水性处理，所述表面亲水性处理包括表面等离子处理、亲疏水改性、以及表面活性剂浸润处理中的至少一个。
上述方案中，所述细胞或组织包括正常组织原代细胞、多能干细胞或组织、以及肿瘤细胞系或组织。
上述方案中，所述在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种之前，还包括：采用紫外或高压灭菌的方式对聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行灭菌处理。
上述方案中，所述在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种，包括：细胞或组织自微流体控制系统的入口进入聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片上，采用静置或离心的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，完成细胞接种。
上述方案中，所述采用静置的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，静置时间为30分钟至1小时，温度为4℃，细胞或组织落入含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中；所述采用离心的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，离心条件为：离心转速400rpm-1200rpm，离心时间1-10分钟，离心温度4℃，细胞或组织落入含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中。
上述方案中，所述清洗未进入深井的多余细胞或组织，并将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官，是采用磷酸盐缓冲溶液PBS将未进入深井的多余细胞或组织清洗干净，以保证实验效果，然后将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入37℃的培养箱中培养类器官。
上述方案中，所述将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官之后，还包括：类器官培养箱中培养完成后，将类器官组织导出或在聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片上原位实施疾病建模、药物开发和筛选、精准医疗实验。
上述方案中，所述对类器官培养所需要的细胞或组织以及聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理之前，还包括：制作具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置。
上述方案中，所述制作具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置，包括：制作微阵列深井模板，并利用微阵列深井模板制作聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片；制作微流体控制系统模版，并利用微流体控制系统模版制作微流体控制系统；将制作的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统对准拼接，热封装，并在微流体控制系统出入口制作出入口，然后将封装后的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片贴合在细胞培养基底上。
上述方案中，所述制作微阵列深井模板，并利用微阵列深井模板制作聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片，包括：首先利用光刻蚀技术，制作出直径为150μm-800μm，高度为100μm-300μm的光刻微柱模板，其中所述光刻微柱模板任意两个微柱之间的圆心距为两个圆柱直径；将聚二甲基硅氧烷A液和B液充分混合并在真空中除气后，浇注在所述光刻微柱模板上，在固化后将所述光刻微柱模板与聚二甲基硅氧烷分离，得到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片。
上述方案中，所述制作微流体控制系统模版，并利用微流体控制系统模版制作微流体控制系统，包括：利用光刻蚀技术，制作出宽度150μm-800μm，高度为10μm-40μm的长方体柱模版；将聚二甲基硅氧烷A液和B液充分混合并在真空中除气后，浇注在所述长方体柱模版上，在固化两小时后将所述长方体柱模版与聚二甲基硅氧烷分离，得到微流体控制系统。
上述方案中，所述将制作的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统对准拼接，热封装，并在微流体控制系统出入口制作出入口，然后将封装后的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片贴合在细胞培养基底上，包括：采用胶带粘除聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统表面的灰尘，将聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统对准拼接，在40℃-60℃下热封装2-3小时；封装完成后，在微流体控制系统出入口利用打孔器打出出入口用以进行后续实验；将封装后的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片贴合在细胞培养基底上。
(三)有益效果
从上述技术方案可以看出，本公开具有以下有益效果：
1、本公开提供的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法，采用包括细胞培养基底、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统的装置，结构简单，操作方便可控，克服了由于操作过程的不可控性，类器官的大小很难均一的缺点。
2、本公开提供的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法，在每个聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片中存在数量一致的均一微孔阵列，改善了每孔中类器官的数目不一致的问题。
3、本公开提供的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法，在每个聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片中，存在上千个高通量的微孔，每个微孔都是独立的结构，单独的细胞或组织可以在其中生长，从而提高了类器官形成效率。
4、本公开提供的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法，应用前景良好，具有很高的实用和临床价值。
附图说明
本公开的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是依照本公开实施例的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置的结构示意图；
图2是采用图1所示的装置培养高通量类器官的方法流程图；
图3是依照本公开实施例的制作具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置的方法流程图；
图4是依照本公开实施例1的利用显微镜成像芯片明场图；
图5是依照本公开实施例1中培养小鼠肠原代细胞培养出的肠类器官明场图；
图6是依照本公开实施例1中培养小鼠肠原代细胞培养出的荧光染色图；
图7是依照本公开实施例2中培养肿瘤类器官的明场图；
图8是依照本公开实施例3中微流体控制系统和聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行药物测试的示意图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。此处的具体实例仅仅用于解释本公开，不用于限定本公开。本领域技术人员在没有具体细节的条件下，也可以完全理解本公开。
下面详细描述本公开的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本公开，而不能理解为对本公开的限制。
在本公开的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本公开和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本公开的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个所述特征。在本公开的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
在本公开的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本公开中的具体含义。
在本公开的描述中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本公开的不同结构。为了简化本公开的公开，下文中对特定例子的部件和设置进行描述。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本公开。此外，本公开可以在不同例子中重复参考数字和/或参考字母，这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。此外，本公开提供了的各种特定的工艺和材料的例子，但是本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的应用和/或其他材料的使用。
如图1所示，图1是依照本公开实施例的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置的结构示意图。图1所示的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置，包括细胞培养基底、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统。其中：细胞培养基底，亦称为细胞培养板，粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之下，用于安置所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片；聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片，粘合于所述微流体控制系统之下，同时粘合于所述细胞培养基底之上，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片中的微井阵列与所述微流体控制系统相连通，用于实现与所述微流体控制系统的管道中的物质进行交换；微流体控制系统，粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之上，所述微流体控制系统中的微流体管道与所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片相连通，在进行物质交换的同时对微流体进行控制。
在本公开实施例中，所述细胞培养基底以物理粘合的方式粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之下，所述细胞培养基底与所述微流体控制系统或所聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片均不进行物质交换。
在本公开实施例中，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片以热封装后的化学键链接方式粘合于所述微流体控制系统之下，同时以物理粘合的方式粘合于所述细胞培养基底之上。所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片中的微井阵列直径为150μm-800μm，高度为100μm-300μm。其中所述微井阵列任意两个微柱之间的圆心距为两个圆柱直径，可选的圆柱直径为200μm，圆心距400μm。
在本公开实施例中，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片在与所述微流体控制系统的管道中的物质进行交换的同时，在所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行类器官的培养，并且以物理方式控制类器官大小，从而实现类器官的均一培养。
在本公开实施例中，所述微流体控制系统以热封装后的化学键链接方式粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之上；所述微流体控制系统中的微流体管道是宽度为150μm-800μm，高度为10μm-40μm的长方体的微流体管道。
在本公开实施例中，所述在进行物质交换的同时对微流体进行控制，具体包括：进行细胞或组织的灌入、培养基的灌入及更换、药物测试时药物流入及排出、以及实验所需的微流体的控制。
基于图1所示的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置的结构示意图，图2示出了采用图1所示的装置培养高通量类器官的方法流程图，该方法包括：
步骤201：对类器官培养所需要的细胞或组织以及培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理；
步骤202：在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种；
步骤203：清洗未进入深井的多余细胞或组织，并将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官。
在本公开实施例中，步骤201中所述对类器官培养所需要的细胞或组织以及培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理，包括：调整细胞或组织的浓度至1×104～1×107个细胞每毫升细胞悬液；对培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行表面亲水性处理，所述表面亲水性处理包括表面等离子处理、亲疏水改性、以及表面活性剂浸润处理中的至少一个。
在本公开实施例中，所述细胞或组织包括正常组织原代细胞、多能干细胞或组织、以及肿瘤细胞系或组织。
在本公开实施例中，步骤202中所述在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种之前，还包括：采用紫外或高压灭菌的方式对聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行灭菌处理。
在本公开实施例中，步骤202中所述在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种，包括：细胞或组织自微流体控制系统的入口进入聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片上，采用静置或离心的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，完成细胞接种。其中，采用静置的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，静置时间为30分钟至1小时，温度为4℃，细胞或组织落入含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中。采用离心的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，离心条件为：离心转速400rpm-1200rpm，离心时间1-10分钟，离心温度4℃，细胞或组织落入含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中。
在本公开实施例中，步骤203中所述清洗未进入深井的多余细胞或组织，并将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官，是采用磷酸盐缓冲溶液PBS将未进入深井的多余细胞或组织清洗干净，以保证实验效果，然后将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入37℃的培养箱中培养类器官。
在本公开实施例中，步骤203中所述将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官之后，还包括：类器官培养箱中培养完成后，将类器官组织导出或在聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片上原位实施疾病建模、药物开发和筛选、精准医疗等实验。
在本公开实施例中，步骤201中所述对类器官培养所需要的细胞或组织以及聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理之前，还包括：制作具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置，具体制作方法如图3所示，包括以下步骤：
步骤301：制作微阵列深井模板，并利用微阵列深井模板制作聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片；
在本步骤的一个实施例中，首先利用光刻蚀技术，制作出直径为150μm-800μm，高度为100μm-300μm的光刻微柱模板，其中所述光刻微柱模板任意两个微柱之间的圆心距为两个圆柱直径，可选的圆柱直径为200μm，圆心距400μm；然后将聚二甲基硅氧烷A液和B液充分混合并在真空中除气后，浇注在所述光刻微柱模板上，在固化后将所述光刻微柱模板与聚二甲基硅氧烷分离，得到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片。其中，A液为聚二甲基硅氧烷PDMS液体，B液为凝固剂，A液与B液的比例为5∶1-15∶1，可选为10∶1；固化温度为，65℃-85℃，可选为85℃；固化时间一般为2小时。
步骤302：制作微流体控制系统模版，并利用微流体控制系统模版制作微流体控制系统；
在本步骤的一个实施例中，利用光刻蚀技术，制作出宽度150μm-800μm，高度为10μm-40μm的长方体柱模版；然后将聚二甲基硅氧烷A液和凝固剂B液充分混合并在真空中除气后，浇注在所述长方体柱模版上，在固化两小时后将所述长方体柱模版与聚二甲基硅氧烷分离，得到微流体控制系统。
步骤303：将制作的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统对准拼接，热封装，并在微流体控制系统出入口制作出入口，然后将封装后的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片贴合在细胞培养基底上；
在本步骤的一个实施例中，采用胶带粘除聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统表面的灰尘，将聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统对准拼接，在40℃-60℃下热封装2-3小时；封装完成后，在微流体控制系统出入口利用打孔器打出出入口用以进行后续实验；将封装后的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片贴合在细胞培养基底上。
实施例1
本实施例提供了一种利用微阵列深井培养高通量类器官的装置和方法，其中装置用以培养原代鼠小肠类器官，具体包括以下步骤：
1、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片制作。首先利用光刻蚀技术，制作出直径为200μm，高200μm，任意两个相邻微柱圆心距400μm。将聚二甲基硅氧烷A液和凝固剂B液比例为10∶1，充分混合后在真空中除气后，浇注在得到的光刻微柱模具上，在85℃固化两小时后将模具与聚二甲基硅氧烷分离。
2、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片前处理及组装。所述的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片在接入细胞之前，进行芯片表面和底面除灰处理，利用胶带粘除表面灰尘，用直径小于48孔板直径打孔器切割出大小均一的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片粘合于48孔板底部。贴合完毕后，进行紫外灭菌处理和表面亲水性处理，具体如图4所示，图4是依照本公开实施例1的利用显微镜成像芯片明场图。
3、小鼠肠原代细胞提取。取6周大小新鲜死亡的小鼠，用75％酒精表面消毒后固定，切开腹部，取盲肠上游的小肠。用预冷的磷酸盐缓冲溶液PBS灌肠清洗，放入干净有预冷磷酸盐缓冲溶液PBS的10em培养皿中，用镊子固定小肠的一端。轻轻的将小肠纵切剖开，用干净的载玻片轻轻刮掉肠内容物。将预处理好的小肠轻轻切成2-4mm长的小段.放入一个新的预装2预冷磷酸盐缓冲溶液PBS的50mL离心管。反复剧烈晃动离心管，进一步清洗小肠。用细镊子将清洗好的小肠片段轻轻夹出放入预冷的2mM-EDTA/PBS中。将离心管放到4℃摇床30-40分钟(80-100rpm)。期间保持小肠片段一直浸在溶液中。30分钟后，将离心管取出猛烈晃。将上清液依次通过100μm和70μm滤器。将此混合液通过500rpm离心3分钟，除去单细胞。悬浮沉淀使用预冷的1％的FBS或PBS，其中FBS是胎牛血清(fetal bovine serum)，PBS是磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution)。重悬浮3次，每次600rpm离心3分钟，进一步除去单细胞。根据大致浓度吸出相应体积悬浮液至1.5mL离心管中，800rpm，1分钟。备用。
4、小鼠肠类器官培养。在4℃条件下，将提取好的小鼠肠组织加入到含有生长因子的改良的DMEM/F12培养基和基质胶Matrigel Matrix比例为1∶1的培养基中混匀，并将小鼠肠隐窝数目调整至1000个每毫升，加入到微阵列深井养芯片上。然后利用水平冷冻离心机在500g，4℃条件下离心5分钟，细胞接种完成后，将装有芯片的培养装置放入37℃培养箱中继续培养。放置15-30分钟后，培养基凝固后，补充200μL培养基。
5、每隔一天更换一次培养基，培养7天。培养1天后，每天将聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片装置放置于显微镜下，根据顺序依次进行成像。如图5和6所示，图5是依照本公开实施例1中培养小鼠肠原代细胞培养出的肠类器官明场图，图6是依照本公开实施例1中培养小鼠肠原代细胞培养出的荧光染色图。
实施例2
本实施例提供了一种肿瘤类器官的高通量培养方法，包括以下步骤：
1、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片制作。首先利用光刻蚀技术，制作出直径为200μm，高200μm，任意两个相邻微柱圆心距400μm。将聚二甲基硅氧烷A液和B液比例为10∶1，充分混合后在真空中除气后，浇注在得到的光刻微柱模具上，在85℃固化两小时后将模具与聚二甲基硅氧烷分离。其中，A液为聚二甲基硅氧烷PDMS液体，B液为凝固剂。
2、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片前处理及组装。所述的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片在接入细胞之前，进行芯片表面和底面除灰处理，利用胶带粘除表面灰尘，用直径小于48孔板直径打孔器切割出大小均一的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片粘合于48孔板底部。贴合完毕后，进行紫外灭菌处理和亲水处理。用质量百分数5％的三嵌段共聚物Pluronic F127作为细胞抗粘附剂注入到芯片中，孵育30分钟。
3、肿瘤细胞的准备。MCF-7细胞用含有10％胎牛血清(FBS)，1％双抗(PS)的DMEM培养基，在5％二氧化碳含量、37℃恒温培养箱内培养。每天将细胞原来的培养液弃去，用2-3mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗两次，更换新的细胞培养液。肿瘤细胞的传代，将长满细胞的培养瓶中原来的培养基弃去，用2-3mLPBS清洗两次，吸干后，加入0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA混合溶液2mL，37℃下孵育至细胞脱离平面。加入2mL DMEM完全培养基终止消化反应，轻轻用1mL移液枪吹打混合溶液，直到细胞悬浮，将细胞转移至灭菌的15mL离心管中。1000rpm离心3分钟，弃去上清液并用3mLDMEM培养基轻轻混匀细胞沉淀。取悬浮好的1mL细胞悬液加入到灭菌的细胞培养皿中，补充培养基至4mL。剩下的细胞留作备用。
4、吸出5％的三嵌段共聚物PluronicF127后，将数量为1×105MCF-7细胞溶液注入到准备好的芯片中，然后利用水平冷冻离心机在500g，4℃条件下离心5分钟，细胞接种完成后，用PBS将未进入深井的多余细胞冲洗干净。将装有芯片的培养装置放入37℃培养箱中培养。
5、每隔一天更换一次培养基，培养7天。培养1天后，每天将聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片装置放置于显微镜下，根据顺序依次进行成像。如图7所示，图7是依照本公开实施例2中培养肿瘤类器官的明场图。
实施例3
如图8所示，图8是依照本公开实施例3中微流体控制系统和聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行药物测试的示意图。本实施例提供一种肿瘤类器官的药物测试培养方法，包括以下步骤：
1、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片制作。首先利用光刻蚀技术，制作出直径为200μm，高200μm，任意两个相邻微柱圆心距400μm的聚二甲基硅氧烷微阵列深井芯片模版。将聚二甲基硅氧烷A液和B液比例为10∶1，充分混合后在真空中除气后，浇注在得到的光刻微柱模具上，在85℃固化两小时后将模具与聚二甲基硅氧烷分离。其中，A液为聚二甲基硅氧烷PDMS液体，B液为凝固剂；之后利用光刻蚀技术，制作出宽度150μm-800μm，高度为10μm-40μm的长方体柱模版，将聚二甲基硅氧烷A液和凝固剂B液充分混合并在真空中除气后，浇注在所述长方体柱模版上，在固化2小时后将所述长方体柱模版与聚二甲基硅氧烷分离，得到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片。
2、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片前处理及组装。所述的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片在接入细胞之前，进行芯片表面和底面除灰处理，利用胶带粘除表面灰尘，用直径小于48孔板直径打孔器切割出大小均一的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片粘合于48孔板底部。
贴合完毕后，将微流体控制系统和聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片经过在40℃-60℃下热封装2-3小时进行不可逆封接，封接后，进行紫外灭菌处理和表面亲水性处理。用质量百分数5％的三嵌段共聚物Pluronic F127作为细胞抗粘附剂注入到芯片中，孵育30分钟。
3、肿瘤细胞的准备。MCF-7细胞用含有10％胎牛血清(FBS)，1％双抗(PS)的DMEM培养基，在5％二氧化碳含量、37℃恒温培养箱内培养。每天将细胞原来的培养液弃去，用2-3mL(PBS)清洗两次，更换新的细胞培养液。肿瘤细胞的传代，将长满细胞的培养瓶中原来的培养基弃去，用2-3mLPBS清洗两次，吸干后，加入0.25％胰蛋白酶-0.1％EDTA混合溶液2mL，37℃下孵育至细胞脱离平面。加入2mL DMEM完全培养基终止消化反应，轻轻用1mL移液枪吹打混合溶液，直到细胞悬浮，将细胞转移至灭菌的15mL离心管中。1000rpm离心3分钟，弃去上清液并用3mLDMEM培养基轻轻混匀细胞沉淀。取悬浮好的1mL细胞悬液加入到灭菌的细胞培养皿中，补充培养基至4mL。剩下的细胞留作备用。
4、吸出5％的三嵌段共聚物PluronicF127后，将数量为1×105MCF-7细胞溶液注入到准备好的芯片中，然后利用水平冷冻离心机在500g，4℃条件下离心5分钟，细胞接种完成后，用PBS将未进入深井的多余细胞冲洗干净。将装有芯片的培养装置放入37℃培养箱中培养。
5、静置培养1天后，用蠕动泵设置流速为25μL/h，将芯片放入培养箱进行灌流培养，使用含有1mg/mL的DMEM培养基进行药物测试。每天将聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片装置放置于显微镜下，根据顺序依次进行成像。为了观察细胞的活性，利用Calcein-AM和PI，分别对活细胞和死细胞染色。将芯片在无血清培养基中加入1∶1000稀释过的Calcein-AM(终浓度2μmol/L)和PI(终浓度4μmol/L)溶液孵育90分钟。在激光共聚焦显微镜下，活细胞在488nm的激发光照射下，发出绿色荧光((517nm)，而死细胞在533nm激光照射下发出红色荧光(617nm)。经过fiji软件分析每个细胞团块的荧光用以判断细胞毒性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“某些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合所述实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本公开的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种利用微阵列深井培养高通量类器官的装置，其特征在于，包括细胞培养基底、聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统，其中：
所述细胞培养基底，粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之下，用于安置所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片；
所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片，粘合于所述微流体控制系统之下，同时粘合于所述细胞培养基底之上，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片中的微井阵列与所述微流体控制系统相连通，用于实现与所述微流体控制系统的管道中的物质进行交换；
所述微流体控制系统，粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之上，所述微流体控制系统中的微流体管道与所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片相连通，在进行物质交换的同时对微流体进行控制；
其中，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片中的微井阵列直径为150μm-800μm，高度为100μm-300μm；所述微流体控制系统中的微流体管道是宽度为150μm-800μm，高度为10μm-40μm的长方体的微流体管道；
所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片在与所述微流体控制系统的管道中的物质进行交换的同时，在所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行类器官的培养，并且以物理方式控制类器官大小，从而实现类器官的均一培养；
所述在进行物质交换的同时对微流体进行控制，具体包括：进行细胞或组织的灌入、培养基的灌入及更换、药物测试时药物流入及排出、以及实验所需的微流体的控制。
2.根据权利要求1所述的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置，其特征在于，所述细胞培养基底以物理粘合的方式粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之下，所述细胞培养基底与所述微流体控制系统或所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片均不进行物质交换。
3.根据权利要求1所述的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片以热封装后的化学键链接方式粘合于所述微流体控制系统之下，同时以物理粘合的方式粘合于所述细胞培养基底之上。
4.根据权利要求1所述的利用微阵列深井培养高通量类器官的装置，其特征在于，所述微流体控制系统以热封装后的化学键链接方式粘合于所述聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片之上。
5.一种采用权利要求1至4中任一项所述的装置培养高通量类器官的方法，其特征在于，该方法包括：
对类器官培养所需要的细胞或组织以及培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理；
在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种；
清洗未进入深井的多余细胞或组织，并将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官。
6.根据权利要求5所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述对类器官培养所需要的细胞或组织以及培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理，包括：
调整细胞或组织的浓度至1×104～1×107个细胞每毫升细胞悬液；
对培养装置中的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行表面亲水性处理，所述表面亲水性处理包括表面等离子处理、亲疏水改性、以及表面活性剂浸润处理中的至少一个。
7.根据权利要求6所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述细胞或组织包括正常组织原代细胞、多能干细胞或组织、以及肿瘤细胞系或组织。
8.根据权利要求5所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种之前，还包括：采用紫外或高压灭菌的方式对聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行灭菌处理。
9.根据权利要求5所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述在含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中进行细胞接种，包括：
细胞或组织自微流体控制系统的入口进入聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片上，采用静置或离心的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，完成细胞接种。
10.根据权利要求9所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，
所述采用静置的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，静置时间为30分钟至1小时，温度为4℃，细胞或组织落入含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中；
所述采用离心的方式将细胞或组织接种到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中，离心条件为：离心转速400rpm-1200rpm，离心时间1-10分钟，离心温度4℃，细胞或组织落入含有基质胶的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的深井中。
11.根据权利要求5所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述清洗未进入深井的多余细胞或组织，并将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官，是采用磷酸盐缓冲溶液PBS将未进入深井的多余细胞或组织清洗干净，以保证实验效果，然后将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入37℃的培养箱中培养类器官。
12.根据权利要求5所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述将具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置放入培养箱中培养类器官之后，还包括：
类器官培养箱中培养完成后，将类器官组织导出或在聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片上原位实施疾病建模、药物开发和筛选、精准医疗实验。
13.根据权利要求5所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述对类器官培养所需要的细胞或组织以及聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片进行预处理之前，还包括：
制作具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置。
14.根据权利要求13所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述制作具有聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片的培养装置，包括：
制作微阵列深井模板，并利用微阵列深井模板制作聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片；
制作微流体控制系统模版，并利用微流体控制系统模版制作微流体控制系统；
将制作的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统对准拼接，热封装，并在微流体控制系统出入口制作出入口，然后将封装后的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片贴合在细胞培养基底上。
15.根据权利要求14所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述制作微阵列深井模板，并利用微阵列深井模板制作聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片，包括：
首先利用光刻蚀技术，制作出直径为150μm-800μm，高度为100μm-300μm的光刻微柱模板，其中所述光刻微柱模板任意两个微柱之间的圆心距为两个圆柱直径；
将聚二甲基硅氧烷PDMS液体和凝固剂充分混合并在真空中除气后，浇注在所述光刻微柱模板上，在固化后将所述光刻微柱模板与聚二甲基硅氧烷分离，得到聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片。
16.根据权利要求14所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述制作微流体控制系统模版，并利用微流体控制系统模版制作微流体控制系统，包括：
利用光刻蚀技术，制作出宽度150μm-800μm，高度为10μm-40μm的长方体柱模版；
将聚二甲基硅氧烷PDMS液体和凝固剂充分混合并在真空中除气后，浇注在所述长方体柱模版上，在固化两小时后将所述长方体柱模版与聚二甲基硅氧烷分离，得到微流体控制系统。
17.根据权利要求14所述的培养高通量类器官的方法，其特征在于，所述将制作的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统对准拼接，热封装，并在微流体控制系统出入口制作出入口，然后将封装后的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片贴合在细胞培养基底上，包括：
采用胶带粘除聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统表面的灰尘，将聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片和微流体控制系统对准拼接，在40℃-60℃下热封装2-3小时；
封装完成后，在微流体控制系统出入口利用打孔器打出出入口用以进行后续实验；
将封装后的聚二甲基硅氧烷微阵列深井微流控芯片贴合在细胞培养基底上。
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