CN114874989A - 一种循环肿瘤细胞捕获方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种循环肿瘤细胞捕获方法，包括以下步骤：将待测细胞液进行红细胞裂解后，加入设置有细胞芯片的培养容器中，细胞芯片包括基体以及阵列在基体表面的盲孔，待细胞进入盲孔中后加入培养基进行培养，培养过程中待测细胞液中的循环肿瘤细胞可增殖成细胞球，加入与循环肿瘤细胞特异性反应的荧光抗体，根据荧光和细胞增殖情况定位循环肿瘤细胞。利用规律排列的微孔、荧光抗体、细胞形态以及增殖情况可以精准鉴定和定位CTC，解决了现有技术中由于部分抗体假阳性造成的干扰从而引起的CTC捕获准确度不高以及CTC活力低的问题。

Description

一种循环肿瘤细胞捕获方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种循环肿瘤细胞捕获方法。

背景技术

目前，癌症相关疾病是全球主要的健康问题之一，每年导致约800万人死亡，预计未来这一数字将迅速增加。因此，癌症治疗和早期诊断技术的研发至关重要。近年来，由于现代生物学技术的不断发展，癌症患者主要的诊断和治疗方法正逐渐从传统标准模式转向精准的个性化模式。循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的分离和检测是实现肿瘤病人个性化精准医疗的关键研究领域之一。

CTC是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作导致癌细胞从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落并进入循环系统，可以通过简单的血液检测来发现。大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。大量研究资料证实，血液中CTC的快速检测对肿瘤的检测、个体化治疗、疗效评估及预后监测等具有重要应用价值。相对于传统的影像学和病理学的肿瘤诊断方法，CTC检测具有独特优势。首先，采用CTC检测法能一次性同时筛查肺癌、胃癌、肝癌等大部分多种实体肿瘤，具有更大的检测范围；同时，只需验血，避免了穿刺活检操作导致转移风险；另外，在评估肿瘤治疗效果时，传统影像学手段一般需要几个月的时间，而CTC可以快速评估治疗效果，可以提供有关患者分期(转移性与非转移性)和肿瘤分子特征的实时信息。除了治疗监测和预后预测外，预计CTC将在癌症的早期检测和诊断中发挥重要作用，当癌症无症状或没有可用的常规筛查方法时，CTC的发现对于某些癌症类型的早期诊断非常有帮助，最近已经有一些将CTC筛选用于癌症早期诊断的研究报导。多项研究表明，对CTC进行详细的遗传分析可以更具体地描述癌症患者的进展和预后，并提供新信息，例如对某些化疗或生物疗法的敏感性和耐药性等，以进一步优化治疗方案。目前人外周血CTC检测已被临床公认为最优检测手段之一。

近年来多个研究团队和公司提出了多种不同的CTC筛选策略。目前CTC捕获技术主要分为两大类，一类基于免疫亲和方法，通过特异性抗体捕获CTC，此类富集方法主要使用磁分离、基于基板和微芯片的捕获平台，其主要缺点和挑战是：(1)由于CTC的异质性，单一的抗体捕获会导致CTC亚群在富集和捕获过程中丢失；(2)在捕获过程中，CTC被绑定到捕获材料的表面，这会导致细胞损伤和活力恢复困难。另一类方法则是基于CTC的物理性质进行捕获，例如大小、密度等，该类方法主要使用密度梯度离心、膜过滤和基于微芯片的捕获平台，主要缺陷在于分离富集的细胞种类无法确认，只能鉴别有或者无，同时癌症患者体内的免疫细胞本身存在一定的异常，而且容易伴随细菌或病毒感染，异常的单核细胞会影响分离富集的准确性。未来CTC可能用于常规临床测试，理想的CTC检测方法应该具有样本处理快捷、操作步骤简单、CTC无损伤、高纯度、高回收率等特点，除此之外，最重要的是捕获到的CTC细胞要有较高的活力，这样才有利于下游增殖和分析。但由于CTC异质性强、数量稀少、从血液中分离困难等现实问题，目前大部分CTC技术捕获到的CTC纯度和活性较差，严重影响后续的分析准确性和效率。

由于具有小型化、便携性、成本效益以及在线分离/检测和单细胞分析能力等诸多优势，微流控设备已成为CTC富集和检测的主流平台之一，目前已经基于亲和力、尺寸或其他物理特性开发了许多微芯片平台。中国专利CN202011479571.X公开了一种分离神经母细胞瘤CTC的微流体芯片及其捕获方法，所述微流体芯片内设有微柱阵列用于对样品内的大尺寸细胞进行富集的细胞富集区，以及和该细胞富集区连通的用于对神经母细胞瘤CTC进行特异性捕获的细胞捕获区，该细胞捕获区的基底上修饰有GD2抗体，制备该微流体芯片的聚合物盖片由聚二甲基硅氧烷、聚碳酸酯、硅树脂、聚丙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚醚醚酮中的至少一种材料制成。捕获神经母细胞瘤CTC时，将外周血以小于18mL/h的流速从入口孔通入芯片，外周血首先经细胞富集区，对大尺寸细胞富集，汇集于中间通道内，而后进入细胞捕获区内通过按临界分选尺寸(7-10微米)错位排列的微柱阵列和GD2抗体双重捕获作用对神经母细胞瘤CTC进行原位捕获，其他的红细胞和白细胞等则会随着流体冲走。但该专利中仍然存在CTC亚群丢失、CTC活性较差以及分离富集准确度低的问题，以及与现有的微流控芯片一样，存在不利于后续的测序和培养的问题；中国专利CN201780025297.9公开了一种使用贴片进行CTC诊断的方法和装置，所述贴片以具有形成微腔的网状结构的凝胶形式提供并且含有用于检测癌症的试剂(与肿瘤细胞特异性反应的抗体、用于培养细胞的营养试剂、靶向肿瘤细胞细胞核或细胞质或DNA的染色试剂、和/或用于移除肿瘤细胞的细胞膜以提取DNA的试剂)，该贴片固定于板上，获取放置有待测样品的板的图像(如荧光图像)，实现对肿瘤细胞的诊断，但上述方法会由于假阳性的干扰影响定位的准确性。因此，仍需寻找一种新的循环肿瘤细胞捕获方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种循环肿瘤细胞捕获方法，利用规律排列的微孔、荧光抗体、细胞形态以及增殖情况可以精准鉴定和定位CTC，解决了现有技术中由于部分抗体假阳性造成的干扰从而引起的CTC捕获准确度不高以及CTC活力低的问题。

本发明的第一个目的是提供一种循环肿瘤细胞捕获方法，包括以下步骤：

将待测细胞液进行红细胞裂解后，加入至设置有细胞芯片的培养容器中，所述细胞芯片包括基体以及阵列在基体表面的盲孔，细胞芯片可为细胞提供一个弱黏附的亲和微环境，既可以防止不同异质性细胞的聚集，又可以为细胞提供3D培养增殖的微环境；

待细胞进入细胞芯片的盲孔中后加入培养基进行培养，在培养过程中大部分血细胞会凋亡，而循环肿瘤细胞可存活并增殖成细胞球，加入与循环肿瘤细胞特异性反应的荧光抗体，根据荧光和细胞增殖情况定位所述循环肿瘤细胞；具体地，循环肿瘤细胞在特定培养条件下培养后会增殖并形成球状细胞聚集体(球状细胞聚集体指增殖成多个肿瘤细胞或增殖成肿瘤球)，随后成球的循环肿瘤细胞与荧光抗体进行特异性结合，可观察到较明显的显示荧光的球状细胞聚集体，即为所述循环肿瘤细胞；

培养基为DMEM/F12培养基，还含有5-15wt％胎牛血清、1-3wt％青链霉素混合溶液、0.2-0.8wt％庆大霉素、0.1-0.3wt％两性霉素B、20-50ng/mL表皮细胞生长因子、1-2μML-谷氨酰胺、2-30ng/mL胃泌素、80-180ng/mL Wnt3a蛋白、200-400ng/mL R-spondin1蛋白、50-150ng/mL Noggin蛋白、1-2μM TGFl 3受体抑制剂和5-15mM烟酰胺。

进一步地，青链霉素混合溶液中，青霉素的含量为50-100U/mL，链霉素的含量为0.1-0.5mg/mL。

进一步地，TGFl 3受体抑制剂为SB43142和/或A83-01。

进一步地，加入培养基后在30-40℃、2-10％CO₂条件下培养5-10天，以确保循环肿瘤细胞成球。

进一步地，细胞芯片的材质为水凝胶，形成水凝胶的材料选自海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、明胶、胶原、壳聚糖、层黏连蛋白、纤连蛋白、甲基纤维素、弹性蛋白样多肽、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和丙烯酸酯聚合物中的至少一种。当然，本领域技术人员可以理解，此处关于形成水凝胶的材料为列举而非穷举，其他可以实现循环肿瘤细胞捕获的软基质芯片与本发明均属于同一构思。

进一步地，上述高分子材料通过交联剂交联、酶交联或光交联。

进一步地，进行化学交联时，根据水凝胶材料种类选择合适的交联剂，如壳聚糖使用戊二醛作为交联剂、明胶使用戊二醛作为交联剂、海藻酸盐(如海藻酸钠)使用二价阳离子作为交联剂、胶原使用戊二醛、京尼平作为交联剂。

进一步地，所述细胞芯片的制备方法包括以下步骤：构建三维微结构的掩膜版，将PMDS的混合单体和固化剂以5-15：1的重量比混合后，置于掩膜版上，55-65℃烘烤1-5小时，取出PMDS，即为模板。在模板上滴加水凝胶1-2mL至水凝胶完全覆盖模具，常温下静置5-10min，待水凝胶凝固后取下即可。

进一步地，水凝胶涂层为matrigel、琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、明胶、胶原、壳聚糖、层黏连蛋白、纤连蛋白、甲基纤维素、弹性蛋白样多肽、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和丙烯酸酯聚合物中的至少一种物质形成的水凝胶。

进一步地，水凝胶涂层的厚度为2-10μm，优选为5μm。

进一步地，所述细胞芯片表面的修饰方式为水凝胶涂层修饰、聚乙烯亚胺修饰、聚赖氨酸修饰、多巴胺修饰和等离子处理中的一种。经上述修饰后，盲孔内壁处于细胞弱粘附状态，保证细胞在盲孔内2D水平的阵列，防止细胞在2D水平的平铺延展，防止在3D培养环境下的细胞聚集。

进一步地，等离子处理的方法包括：将水凝胶保持35℃于真空干燥箱中干燥，得干凝胶，将干凝胶置于等离子体处理仪，抽真空至7Pa，用质量流量计控制氩气流量为0.8L/min，待气压稳定后进行高频放电。凝胶材料在功率为70W、特定时间下进行等离子体处理后，取出凝胶膜暴露于大气中10min。

进一步地，聚乙烯亚胺修饰、聚赖氨酸修饰和多巴胺修饰的方法为：将细胞芯片浸泡在相应的盐溶液中，避光孵育，清洗后得到修饰后的细胞芯片。

进一步地，盲孔的尺寸可以根据需求进行设计，本发明中优选直径为10-200μm，深度为10-200μm，密度为10³-10⁸微孔/每个细胞芯片。

进一步地，所述培养基中含有胶原、甲基纤维素或琼脂糖。

进一步地，所述胶原、甲基纤维素或琼脂糖的浓度为0.5-2.5wt％，优选为1.5wt％，目的是维持培养基粘度为20-50mPa·s，保证单个细胞在体外存活以及增殖，又防止不同的异质性细胞的3D聚集。

进一步地，当待测循环肿瘤细胞为人乳腺癌细胞时，荧光抗体选自荧光Anti-CD45抗体、荧光Anti-EPCAM抗体和荧光Anti-Cytokeratin 8+18+19抗体中的至少两种。

本发明的第二个目的是提供一种微小病灶残留(MRD)检测的方法，将收集到的患者血液样本按上述方法进行处理，在显微镜下可观察到血液中是否含有CTC细胞。

目前，循环肿瘤细胞CTC的培养方式仍为传统的2D贴壁培养，虽然2D培养可以快速增殖CTC，但随着传代次数的增加和培养时间的延长，体外扩增的CTC细胞存活能力变差，并且人为建立的培养环境并不是细胞生长的天然状态，培养微环境与机体内微环境差异太大，会影响细胞的自身特性。而本发明中创新性地将CTC进行3D培养，形成球状细胞聚集体，这种在体外生长的过程更加接近体内生存条件的微环境，更有利于细胞的增殖和存活以及自身特性的保持。

更重要的是，不同于现有的CTC捕获技术以及其他细胞筛选技术将细胞进行捕获，再从设备上释放进行计数，但释放过程会损伤细胞的活性，无法判断捕获到的细胞是否存活，而本发明在CTC捕获的过程中不包括释放的步骤，而是进行原位3D培养，这就避免了细胞活性的降低；另一方面，现有技术中仅仅通过抗体特异性结合、物理特性或其结合来筛选目标细胞，通常会混杂入其他非目标细胞，本发明将细胞沉降至盲孔中后，根据荧光标记以及细胞增殖情况来定位和挑取目标细胞，而以此确保目标细胞的存活和纯度。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

(1)本发明为了捕获到高纯度和高活性的CTC，建立了一种基于芯片细胞高通量二维(2D)阵列和三维(3D)培养的CTC捕获方法，在盲孔内阵列和培养细胞，并进一步优化培养环境，可以高通量筛选血液中有活力的循环肿瘤细胞，且方便观察，可以在显微镜下清晰看到细胞增殖情况，以及可以根据盲孔中细胞的形态和荧光抗体标记精准识别和定位高纯度的CTC，运用单细胞挑取设备可以获取CTC细胞团以进行培养、PCR、测序等后续分析。

(2)本发明的捕获方法由于不涉及释放步骤，捕获到的CTC细胞具有较高的增殖能力，细胞活性较好，可以在芯片上长时间存活和增殖，更有利于找出增殖成球或呈团状聚集，相较于现有的筛选和捕获方法，准确性大大提高，假阳性概率也显著降低。

(3)相较于目前制备复杂的微流控芯片，本发明采用的芯片制备方便，捕获方法也更为简便，成本降低，更具实用性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。

图1为本发明实施例1的循环肿瘤细胞捕获方法的流程图；

图2为本发明使用的芯片结构图；

图3为对加入MCF-7细胞的健康小鼠血液样本进行CTC捕获后的结果图；

图4为对荷瘤小鼠血液样本进行CTC捕获后的结果图；

图5为对临床血液样本进行Hoechest 33342染色的结果图；

图6为分别对乳腺癌患者和健康人血液样本进行CTC细胞捕获的结果图；

图7为对本发明捕获的CTC细胞进行基因水平分析的结果；

图8为不同培养条件进行捕获CTC细胞的结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

1、血液样本：

(1)健康雌性小鼠，眼球取血500μL，加入带GFP的MCF-7细胞500个，模拟肿瘤病人外周血，

(2)带GFP的MCF-7细胞悬液注射到雌性NCR裸鼠乳房，建立荷瘤小鼠模型，心脏末端穿刺采血500μL，

(3)临床肿瘤病人血液，静脉采血2mL；

2、红细胞裂解：将血液样本转移到15mL离心管中，加入三倍体积的红细胞裂解液(购自Solarbio公司，货号为R1010)，混匀，4℃静置15分钟，离心，去上清，培养基重悬细胞；

3、培养：芯片放入6mm培养皿，将重悬的细胞液铺上芯片，细胞自然沉降进入微盘(即上述盲孔)，加入培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养6-8天。

其中：

(1)芯片的制备方法为：

采用软光刻技术构建三维微结构的掩膜版，将PMDS的混合单体和固化剂以10：1的重量比混合后，置于掩膜版上，60℃烘烤3小时，取出PMDS，即为模板。将模板放入超净台中进行紫外消毒，使用时将模板放在培养皿中，在模板上滴加琼脂糖水凝胶1-2mL至水凝胶完全覆盖模具，常温下静置10min，待水凝胶凝固后取下放入另一培养皿中即可使用；

多巴胺修饰：使用ph8.5的10mM的tris buffer配置成2mg/mL的多巴胺PDA溶液，将芯片浸泡在PDA溶液中，避光室温过夜孵育，第二天清洗，得到用于培养的芯片。

(2)培养基的组成为(使用流变仪测得培养基的粘度为50mPa·s)：

DMEM/F12+10wt％FBS+3wt％Pen/Strep(其中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为0.1mg/mL)+0.2wt％gentamicin+0.3wt％Amphotericinb+EGF(50ng/mL)+L-glutamine(2μM)+Gastrin(5ng/mL)+Wnt3a(150ng/mL)+R-spondin1(400ng/mL)+Noggin(50ng/mL)+SB43142(1μM)+Nicotinamide(15mM)+0.8wt％Methylcellulose。

4、加入荧光抗体：培养6-8天，可以明显观察到细胞在芯片上成球或增殖后，通常在第7天的时候更换培养基，在新的培养基中加入荧光抗体，每mL的培养基中加入各1μL的Alexa

488荧光Anti-CD45抗体、Alexa

594荧光Anti-EPCAM抗体和Alexa

594荧光Anti-Cytokeratin 8+18+19抗体(抗体：培养基＝1：1000)，混匀，滴加在芯片上直至培养基浸没芯片，在37℃、5％CO₂的培养箱中过夜。

5、观察定位CTC：在荧光纤维镜下观察，在明场下可以看到CTC成小的细胞球或者有多细胞增殖，在荧光下CTC为Alexa

荧光阴性，Alexa

荧光阳性，根据明场和荧光定位CTC细胞。(活的细胞可以观察到完整的细胞形态，成圆球形；而死亡的细胞没有完整细胞形态，成碎片样)

结果如下：

(1)健康雌性小鼠血液100μL加入500个带GFP的MCF-7细胞→红细胞裂解→芯片上培养8天→加入Alexa

594荧光Anti-EPCAM抗体，结果见图3。

从图3中可以看到，在显微镜下，肿瘤细胞会增殖或者形成小的肿瘤球，加入EPCAM荧光抗体可以确认增殖以及成球的细胞确实为肿瘤细胞。根据这两个特征我们可以精准筛选出血液中的CTC。图3中，Day1是将细胞液第一天铺上芯片的视野，Day8是加入Alexa

594荧光Anti-EPCAM荧光抗体后的视野。从Day8的第一行视野中可以看出，此时MCF-7细胞增殖成多个，第二行视野中显示MCF-7细胞增殖形成一个较大的小球，可以确定，显示荧光的部分为循环肿瘤细胞。具体地，经过3D培养后的CTC细胞，除了荧光抗体这一个标志定位CTC以外，我们还可以根据肿瘤细胞具有强的自我增殖能力，会增殖成多个细胞或增殖成细胞球这一特征来定位CTC；既带有荧光又增殖能力很强的细胞可以确定认为是CTC细胞，识别CTC的准确性大大提高。

(2)荷瘤小鼠：给小鼠一侧乳房注射带GFP的MCF-7细胞→小鼠成瘤→取小鼠血液600μL→红细胞裂解后铺上芯片→培养8天→加入Alexa

荧光anti-EPCAM抗体，结果见图4。

从图4可以观察到CTC细胞形成肿瘤小球，较大于白细胞，并且EPCAM呈阳性。

(3)临床病人样本

①鉴别活死细胞：对血液样本进行Hoechst 33342染色(染活细胞核)，结果见图5。

从图5中可以看到，Hoechst 33342染色结果可以观察到活细胞细胞形态比较完整，呈圆形，而死细胞呈碎片样，明场下也可以看到活死细胞形态完全不同，在芯片上可以很明显的区分活死细胞，判断细胞状态能够方便挑取合适的细胞进行后续分析。

②分别对乳腺癌患者和健康人血液样本进行CTC细胞捕获：

实验组：临床乳腺癌患者血液样本2mL，红细胞裂解，芯片上培养8天，加入CD45、EPCAM、CK荧光抗体，共聚焦显微镜拍照；

对照组：健康人血液样本2mL，红细胞裂解，芯片上培养8天，加入CD45、EPCAM、CK荧光抗体，共聚焦显微镜拍照，结果见图6。

从图6可知，显示临床病人样本CTC呈CD45阴性、EPCAM和CK阳性。在EPCAM荧光抗体和CK荧光抗体的视野中均可看见较大的增殖后的细胞聚集体。

实施例2

挑取CTC细胞：利用细胞挑取设备挑取CTC细胞，挑取的CTC可以进行后续的分析。

挑取6个病人CTC进行PCR：利用细胞挑取设备，精准挑取出CD45阴性、EPCAM/CK阳性的CTC细胞进行PCR，结果见图7。

从图7中可以看到挑选出的细胞肿瘤相关的基因HER2、EPCAM、CK等呈高表达，而CD45不表达，可见本发明的循环肿瘤细胞捕获方法得到的细胞均为CTC细胞。

实施例3

为验证培养条件的影响，将实验分为三组，第一组培养基的组成为RPMI1640培养基+10wt％FBS+1wt％青霉素/链霉素，第二组培养基的组成为RPMI1640+30ng/mL上皮生长因子EGF+50ng/mL碱性纤维生长因子(FGF2)+1wt％青霉素/链霉素，第三组培养基的组成为DMEM/F12+10wt％FBS+1wt％Pen/Strep(其中，青霉素的含量为100U/mL，链霉素的含量为0.1mg/mL)+0.5wt％gentamicin+0.1wt％Amphotericinb+EGF(20ng/mL)+L-glutamine(1μM)+Gastrin(15ng/mL)+Wnt3a(100ng/mL)+R-spondin1(200ng/mL)+Noggin(100ng/mL)+A83-01(2μM)+Nicotinamide(10mM)+1wt％胶原，其余条件同实施例1。培养后的CTC捕获结果如图8所示。

从图8可见，用第一组和第二组的培养基培养后，与培养前相比，CTC的增殖情况没有发生明显的改变，而可以明显观察到配方3(培养基的粘度为30mPa·s)培养的CTC的增殖能力更强。另外，从图6和图8(配方3)的对比中可看出，对同一患者的血液样本在培养基成分不同、其他条件均相同的情况下进行培养，本实施例培养得到的CTC细胞球体积更大，在显微镜下观察时表征更明显，说明本实施例培养得到的CTC增殖能力更强，活性更高，更好地解决了现有捕获技术导致的细胞损伤和活力恢复困难的问题。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：

将待测细胞液进行红细胞裂解后，加入设置有细胞芯片的培养容器中，所述细胞芯片包括基体以及阵列在所述基体表面的盲孔；

待细胞进入所述盲孔中后加入培养基进行培养，培养过程中待测细胞液中的循环肿瘤细胞增殖成细胞球，加入与所述循环肿瘤细胞特异性反应的荧光抗体，根据荧光和细胞增殖情况定位所述循环肿瘤细胞；

所述培养基为DMEM/F12培养基，所述DMEM/F12培养基还含有5-15wt％胎牛血清、1-3wt％青链霉素混合溶液、0.2-0.8wt％庆大霉素、0.1-0.3wt％两性霉素B、20-50ng/mL表皮细胞生长因子、1-2μM L-谷氨酰胺、2-30ng/mL胃泌素、80-180ng/mL Wnt3a蛋白、200-400ng/mL R-spondin1蛋白、50-150ng/mL Noggin蛋白、1-2μM TGFl 3受体抑制剂和5-15mM烟酰胺。

2.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述TGFl 3受体抑制剂为SB43142和/或A83-01。

3.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述青链霉素混合溶液中，青霉素的含量为50-100U/mL，链霉素的含量为0.1-0.5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述培养基中还包括0.05-5wt％的胶原、甲基纤维素或琼脂糖。

5.根据权利要求4所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述培养基的粘度为20-50mPa·s。

6.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：加入培养基后在30-40℃、2-10％CO₂条件下培养5-10天。

7.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述细胞芯片的材质为水凝胶。

8.根据权利要求7所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：形成水凝胶的材料选自海藻酸盐、透明质酸、琼脂糖、明胶、胶原、壳聚糖、层黏连蛋白、纤连蛋白、甲基纤维素、弹性蛋白样多肽、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和丙烯酸酯聚合物中的至少一种。

9.根据权利要求1所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述细胞芯片经过表面修饰，所述表面修饰的方式为水凝胶涂层修饰、聚乙烯亚胺修饰、聚赖氨酸修饰、多巴胺修饰和等离子处理中的一种。

10.根据权利要求9所述的循环肿瘤细胞捕获方法，其特征在于：所述水凝胶涂层为matrigel、琼脂糖、海藻酸盐、透明质酸、明胶、胶原、壳聚糖、层黏连蛋白、纤连蛋白、甲基纤维素、弹性蛋白样多肽、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠和丙烯酸酯聚合物中的至少一种物质形成的水凝胶。

Images