CN108866064B - 一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用。所述核酸适配体序列为5’‑AAGGAGCAGCGTGGAGGATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT‑3’。本发明所述核酸适配体具有高特异性、高亲和力以及良好的血浆稳定性，在4℃,25℃,37℃均能保持良好活性。本发明所述核酸适配体可作为分子探针，对转移性乳腺癌细胞进行特异性成像和检测；可作为捕获探针，进行外周血循环肿瘤细胞的特异性捕获分析。在乳腺癌转移的预测和诊治方面具有良好的应用前景。

Description

一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用。
背景技术
乳腺癌是高发的女性恶性肿瘤，转移是患者致死的主要原因。发展高灵敏度、高特异性的分子探针，对于准确预测乳腺癌的转移和复发，进而改善治疗的有效性，提高患者的生存率具有重要意义。
核酸适配体（aptamer）是采用指数富集的配基系统进化技术（SystematicEvolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX）从大容量RNA/单链DNA随机文库中筛选得到的能与靶标物质特异性结合的寡核苷酸序列，被称为化学抗体。与传统的抗体相比，具有特异性强，亲和力高，稳定性好，易于进行化学修饰形成各种形式的分子探针等特点。消减Cell-SELEX是以完整细胞作为靶标进行核酸适配体筛选的技术，由于使用具有功能表型差异的靶细胞和非靶细胞进行消减筛选，可获得针对特定功能表型细胞的核酸适配体。由于筛选出的核酸适配子主要与细胞表面分子结合，特别适合用来制备分子探针进行靶细胞的特异性捕获、成像分析以及作为靶向载体等。有研究将低分化细胞与高分化细胞进行消减筛选，得到能与低分化细胞特异性结合的核酸适配体；有研究将病毒感染细胞与非感染细胞进行消减筛选，制备了可以特异性检测病毒感染的核酸适配子分子探针。但目前未见以转移性乳腺癌细胞为靶细胞，以非转移性乳腺癌细胞为非靶细胞，筛选转移性人乳腺癌细胞特异性核酸适配体的报道。
发明内容
本发明提供了一种以转移性人乳腺癌细胞MDA-MB-231为靶细胞，以非转移性人乳腺癌细胞MCF7为非靶细胞，经过消减Cell-SELEX技术筛选得到的能够与转移性人乳腺癌细胞特异性结合的核酸适配体，可以制备成分子探针进行转移性人乳腺癌细胞的靶向成像以及循环肿瘤细胞的捕获等应用。
本发明采用如下技术方案：一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列为：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’ （ SEQ ID No.1）。
进一步的，本发明提供所述核酸适配体的应用：
所述的核酸适配体在转移性人乳腺癌细胞特异性成像中的应用，可作为制备转移性人乳腺癌细胞特异性成像的分子探针使用。
所述的核酸适配体在特异性捕获外周血循环肿瘤细胞中的应用，可作为制备捕获外周血循环肿瘤细胞的分子探针使用，所述肿瘤包括乳腺癌、转移性乳腺癌。
所述的核酸适配体在鉴定核酸适配体靶标中的应用，可作为制备鉴定所述核酸适配体靶标的试剂或试剂盒中使用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.提供了一种新的能够靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体序列。所述核酸适配体具有高亲和力和高特异性：对靶细胞的解离常数Kd值为纳摩尔级（45.6 ± 1.2 nM）；对靶细胞及其它转移性人乳腺癌细胞结合能力强，对非靶细胞及其它非转移性乳腺癌细胞结合能力弱或不结合，对正常细胞不结合。
2.由于识别的靶标为细胞表面分子，并对靶细胞的结合具有高亲和力和高特异性，以及良好的血浆稳定性，所述核酸适配体特别适合作为捕获探针进行外周血中循环肿瘤细胞的特异性捕获。采用基于所述核酸适配体建立的捕获系统进行乳腺癌患者外周血中循环肿瘤细胞的捕获，结果显示了明显的转移特异性，细胞捕获数量及阳性捕获率为远端转移＞淋巴结转移＞非转移。对比分析显示，该系统的特异性明显优于广泛使用的基于EpCAM作为靶标的捕获系统。
附图说明
图1为实施例1中流式细胞术检测所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的特异性结合结果。
图2为实施例2中荧光显微技术分析所述核酸适配体与靶细胞MDA-MB-231的特异性结合结果。
图3为实施例3中流式细胞术测定所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的解离常数结果。
图4为实施例5中流式细胞术检测所述核酸适配体在不同温度下与靶细胞的结合活性结果。
图5为实施例6中酶处理实验分析所述核酸适配体所识别的靶标性质结果。
图6为实施例7中琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术分析所述核酸适配体血浆稳定性结果。
图7为实施例8中所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的特异性捕获结果。
图8为实施例9中所述核酸适配体捕获临床血样中的循环肿瘤细胞结果。
具体实施方式
制备一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体，所述核酸适配体序列为：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’ （ SEQ ID No.1）。
实施例1流式细胞术检测所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的特异性结合。
分别取处于对数生长期的人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7，用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。然后加入含250nM核酸适配体的结合缓冲液200µl，于4℃摇床上轻摇孵育30min，1000rpm离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。最后加入300µl PBS用于流式细胞仪检测，随机文库序列作为对照。
核酸适配体与靶细胞MDA-MB-231和反筛细胞MCF-7的流式细胞仪检测结果如图1所示，核酸适配体能与靶细胞MDA-MB-231稳定结合，而不能与反筛细胞有效结合，说明所述的核酸适配体具有较强的靶细胞结合特异性。
实施例2 荧光显微技术分析所述核酸适配体与靶细胞MDA-MB-231的特异性结合。
将人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7分别培养于共聚焦培养皿中。培养24h后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，然后将含有250nM生物素标记核酸适配体的结合缓冲液与上述两种细胞在4℃条件下轻摇孵育30min。孵育后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，然后加入量子点标记的链霉亲和素QD-SA，室温中孵育15min。孵育后，吸尽培养皿中的所有液体，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次，最后加入300µl PBS用于检测，随机文库序列作为对照，结果如图2所示。
共聚焦荧光显微镜下观察显示，MDA-MB-231细胞表面呈现明显的荧光，而MCF-7细胞表面未见荧光显示，提示所述核酸适配体具有较强的靶细胞结合特异性，具有作为分子探针进行靶细胞特异性成像的能力。
实施例3 流式细胞术测定所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的解离常数。
合成并配制不同浓度的所述核酸适配体，分别与等量的靶细胞进行孵育，依实施例1操作分别进行流式细胞术检测，测定不同核酸适配体浓度下靶细胞的荧光强度。以核酸适配体的浓度为横坐标，相应的荧光强度值为纵坐标，按照公式Y=BmaxX/(Kd+X)拟合曲线，得到核酸适配体的解离曲线，如图3所示。由解离曲线得到的核酸适配体的解离常数Kd为45.6 ± 1.2 nM。
结果表明：所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231具有高亲和结合特性。
实施例4 流式细胞术检测所述核酸适配体对不同细胞的结合选择性。
取处于对数生长期的不同种类细胞系，包括肿瘤细胞系MDA-MB-231，MCF7，SK-BR-3，BT474，ZR-75-30，MDA-MB-436，LoVo，CL187，SGC-7901，BGC823，A549，C6，HepG2，HeLa和正常细胞系 HEK293，NIH3T3和CHO, 分别与所述核酸适配体孵育，依实施例1操作，采用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，依据荧光强度划分核酸适配体与细胞的结合强度，如表1所示。
结果表明：所述核酸适配体与转移来源的细胞系具有较强的结合能力，对转移活性低或非转移细胞系具有不同程度的结合，而与被检的正常细胞均无结合活性。结果提示，所述核酸适配体具有良好的转移性细胞特异结合活性，具有应用前景。
Figure 591207DEST_PATH_IMAGE001
实施例5流式细胞术检测所述核酸适配体在不同温度下与靶细胞的结合活性。
将处于对数生长期的转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-231用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，与所述核酸适配体分别在不同温度（4 ℃，25℃和37℃）下孵育，依实施例1操作，流式细胞仪检测细胞的荧光强度，结果如图4所示，在所使用的不同温度条件下，核酸适配体均显示了与靶细胞的结合能力，为在不同条件下进行核酸适配子的应用提供了可能。
实施例6酶处理实验分析所述核酸适配体所识别的靶标性质。
将处于对数生长期的乳腺癌细胞MDA-MB-231，用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次。然后加入0.25%胰酶，于37℃中分别孵育3min和10min, 孵育后直接加入含10%胎牛血清的培养液中和胰酶的作用，1000rpm离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次。然后加入核酸适配体进行孵育，依实施例1操作，采用流式细胞仪检测，结果如图5所示。相对于未处理细胞，经胰酶处理的细胞其荧光强度明显降低，提示所述核酸适配体的靶标可能位于细胞表面，适合作为捕获探针用于循环肿瘤细胞的捕获。
实施例7 所述核酸适配体血浆稳定性分析。
所述核酸适配体（0.025nmol）加入人新鲜血浆中，于37℃中分别孵育0，0.5，1，2，3h。配制3%琼脂糖凝胶，电泳分离不同时间点孵育后的样品，紫外光下成像，分析核酸适配体的片段降解情况，结果如图6A所示，在血浆中孵育2h以内，核酸适配体仍然保持其完整性，提示具有良好的血浆稳定性。依实施例1操作，流式细胞术分析与血浆孵育后的核酸适配体与靶细胞的结合情况。结果如图6B所示，在血浆环境下，所述核酸适配体保持了与靶细胞的结合活性，为应用核酸适配体进行循环肿瘤细胞的捕获提供了实验依据。
实施例8 所述核酸适配体对靶细胞MDA-MB-231的特异性捕获。
首先构建基于核酸适配体的循环肿瘤细胞靶向捕获系统，即将生物素化的核酸适配体包被于链霉亲和素化的96孔板，加入被检细胞，在孔板中孵育一定的时间，PBS洗掉不结合的细胞，能够被核酸适配体识别的细胞则被捕获于孔板中。为区分靶细胞与非靶细胞，使用活体荧光染料，将靶细胞MDA-MB-231染成绿色，非靶细胞MCF-7染成红色，取5000个靶细胞和非靶细胞分别加入已包被核酸适配体的96孔板各孔中，室温孵育30min后，吸尽孔板中的液体，PBS洗涤孔板三次，荧光显微镜下观察孔板中捕获的细胞，如图7所示，加入靶细胞的孔板中捕获到大量绿色细胞，而加入非靶细胞的孔板中基本上观察不到红色的非靶细胞，表明所述核酸适配体可以特异性捕获靶细胞。
实施例9 所述核酸适配体捕获临床血样中的循环肿瘤细胞。
利用EDTA-K2处理的抗凝血管收集志愿者和乳腺癌患者的外周血，每个样本量为5ml。采用实施例8中构建的基于核酸适配体的循环肿瘤细胞靶向捕获系统对临床血样中循环肿瘤细胞进行靶向捕获。将血样直接加入已包被核酸适配体的96孔板中，孵育30min后，吸尽孔板中的液体，PBS洗涤孔板三次。然后向96孔板中加入DAPI，FITC标记的CD45抗体和PE标记的EpCAM抗体进行染色，最后在荧光显微镜下计数捕获到的循环肿瘤细胞数量。结果如图8所示，没有任何染色的细胞为红细胞（RBC），DAPI和CD45阳性的细胞是白细胞（WBC），而DAPI阳性和CD45阴性的细胞是循环肿瘤细胞（CTCs）。成像及细胞计数结果显示，除了WBC和RBC外，6例健康志愿者的血样标本中均未发现CTC，而在乳腺癌患者的血样中，转移性乳腺癌患者中CTC的阳性检出率（10/14，71.4%）远远高于非转移性乳腺癌患者（1/11，9.1%）。更值得关注的是，诊断为远端转移的8例乳腺癌患者血样中均捕获到了CTC，远远高于仅为淋巴结转移的乳腺癌患者（2/6，33.3%），提示所述核酸适配体能够捕获到具有转移活性的功能性CTC，具有预测转移复发的应用前景。
实施例10 所述核酸适配体与抗EpCAM抗体的细胞结合特异性分析。
取处于对数生长期的不同细胞系MDA-MB-231，MCF-7，MDA-MB-436，LoVo，CL187，SGC-7901，A549和HEK293，用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤两次。然后分别加入PE-EpCAM抗体和核酸适配体进行孵育，依实施例1操作，采用流式细胞仪检测细胞的荧光强度，依据荧光强度划分核酸适配体或EpCAM抗体与细胞的结合强度。结果如表2所示，所述核酸适配体对于高转移潜能细胞的结合能力明显优于低转移潜能细胞，表现出明显的转移细胞识别特异性，而EpCAM抗体在所检测的细胞范围内未显示明显的转移细胞特异性识别倾向。在实施例9中的图8A中亦可见所述核酸适配体在转移病人的血样中捕获到了EpCAM阴性细胞，显示其更加优良的转移细胞识别特异性。
Figure 654978DEST_PATH_IMAGE002
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国医科大学
<120> 一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaggagcagc gtggaggata tacaccgtca tcagagggag catctctagt caggactgtg 60
atgaattagg gtgtgtcgtc gtggt 85

Claims (5)

1.一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为：5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATACACCGTCATCAGAGGGAGCATCTCTAGTCAGGACTGTGATGAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’（ SEQ ID No.1）。
2.一种转移性人乳腺癌细胞特异性成像中的分子探针，其特征在于：所述分子探针为核酸适配体，所述核酸适配体序列为如权利要求1所示序列。
3.一种特异性捕获外周血循环肿瘤细胞中的分子探针，其特征在于：所述分子探针为核酸适配体，所述核酸适配体序列为如权利要求1所示序列。
4.如权利要求3所述的一种特异性捕获外周血循环肿瘤细胞中的分子探针，其特征在于，所述循环肿瘤细胞包括乳腺癌、转移性乳腺癌。
5.一种如权利要求1所述的一种靶向转移性人乳腺癌细胞的核酸适配体的应用，其特征在于，所述应用为制备鉴定所述核酸适配体靶标的试剂或试剂盒。
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