CN111876424A - 一种特异识别乳腺浸润性导管癌血清的核酸适配体idc-31分子探针及应用 - Google Patents

一种特异识别乳腺浸润性导管癌血清的核酸适配体idc-31分子探针及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异识别乳腺浸润性导管癌血清的核酸适配体IDC‑31分子探针及应用，属于分子生物医学领域。所述核酸适配体IDC‑31的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明设计的IDC‑31特异性的序列，采用5’端或3’端修饰、标记(如同位素、生物素、荧光素或者地高辛等)的方法能够特异识别乳腺浸润性导管癌血清。IDC‑31作为探针分子或者检测指标，用于乳腺浸润性导管癌的辅助诊断、治疗或者监测预后的基础研究等，作为非侵入性的检测分子，适用于临床乳腺浸润性导管癌血清标本的辅助诊断、肿瘤生物导向治疗。本发明的方法简单，迅速，灵敏，具有广泛临床应用和基础应用前景。

Description

一种特异识别乳腺浸润性导管癌血清的核酸适配体IDC-31分 子探针及应用
技术领域
本发明涉及一种特异识别乳腺浸润性导管癌血清的核酸适配体IDC-31分子探针及应用，属于分子生物医学领域。
背景技术
乳癌腺是女性最常见的恶性肿瘤之一，在过去20多年中，全球乳腺癌绝对数量上升1.4倍，世界上大多数国家和地区乳腺癌的发病率上升了30％～40％。浸润性乳腺癌是一组具有累及周围组织和转移到其他部位倾向的上皮性肿瘤，根据其不同形态学表型、预后及临床特征分为不同组织学类型，其中最常见的是浸润性导管癌，占50％～80％。由于肿瘤具有易扩散的特点，所以早期对疾病作出诊断，从而尽快进行相应的治疗是降低其死亡率的重要方法之一。尤其乳腺癌具有肿瘤隐匿性高、患者临床症状不明显等特点，并且乳腺癌的治疗主要基于疾病的病理分期及分型，故早期诊断分型、确定治疗方案就显得尤为重要。
核酸适配体作为一类新型的疾病诊断和治疗分子探针，近年来受到了广泛关注。核酸适配体是用指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands byexponential enrichmen，SELEX)在体外筛选获得的单链寡核苷酸(DNA或RNA)，借其自身形成的空间结构与靶标分子特异性识别，又被称为化学抗体。与传统的抗体探针相比，适配体具有许多明显的优势，如易于合成和修饰、没有免疫原性、长期稳定性、快速组织渗透和不同批次之间的低变异性。由于这些优点，适配体在临床诊断、药物开发和治疗中显示出巨大的应用前景。尤其是近年来改进的靶标消减SELEX技术，通过引入消减靶标去除与共有靶标分子结合的寡核苷酸，使得对未知靶分子的复合靶标进行筛选成为可能，并能以该寡核苷酸分子为探针反过来对差异靶分子进行研究，这就为开发新型分子探针以及鉴定生物标志物开辟了新的途径。
目前，针对癌症相关的核酸适配体的研究靶标主要是已知的肿瘤标志物或者癌细胞，然而由于蛋白和细胞的非天然结构，使筛选得到的核酸适配体在临床应用中受到了很大限制。故本发明直接以临床乳腺浸润性导管癌血清为靶标，筛选乳腺浸润性导管癌血清核酸适配，在未知血清蛋白的情况下，通过靶标消减SELEX技术获得了一个核酸适配体IDC-31。经验证，IDC-31与乳腺浸润性导管癌血清有很好的亲和力，并能够特异识别乳腺浸润性导管癌血清，且能区分正常血清与其他癌症血清，目前尚未见能特异结合乳腺浸润性导管癌血清的核酸适配体的相关研究报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种特异识别乳腺浸润性导管癌核酸适配体IDC-31的序列，具有良好的亲和力和特异性，作为非侵入性的检测分子，适用于临床乳腺浸润性导管癌血清标本的辅助诊断、肿瘤生物导向治疗，以及IDC-31作为载体递送药物靶向乳腺浸润性导管癌细胞方面的应用。
本发明提供了一种核酸适配体IDC-31，所述核酸适配体IDC-31的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，上述技术方案中，所述核酸适配体IDC-31可以特异识别乳腺浸润性导管癌血清。
进一步地，上述技术方案中，所述核酸适配体IDC-可以是体外化学合成的，也可以是通过PCR或其他分子生物学方法制备的。
进一步地，上述技术方案中，所述核酸适配体IDC-的5’端或3’端可以经同位素、生物素、地高辛、荧光物质或者纳米材料进行标记。
进一步地，上述技术方案中，所述核酸适配体IDC-31的核苷酸序列还包括如下三种序列中的一种：
(1)与所述核酸适配体IDC-31同源性在80％以上的寡核苷酸序列；
(2)与所述核酸适配体IDC-31进行杂交的序列；
(3)所述核酸适配体IDC-31转录的RNA序列。
本发明还提供了一种分子探针，包含上述的核酸适配体IDC-31。
本发明还提供了核酸适配体IDC-31在制备用于乳腺浸润性导管癌辅助诊疗或治疗用试剂盒以及生物传感器中的应用。
经过应用研究，鉴定了核酸适配体IDC-31与乳腺浸润性导管癌血清的亲和力和特异性。
本发明的另一个目的是提供核酸适配体IDC-31作为试剂盒的组成部分、制备生物传感器或者检测指标，用于乳腺浸润性导管癌的辅助诊断或治疗。
本发明所述核酸适配体IDC-31在肿瘤研究领域、临床血清样本的检测、肿瘤生物导向治疗领域中有广泛应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)在未知血清蛋白的情况下，以临床血清样本为靶标，筛选乳腺浸润性导管癌血清适配体，不受蛋白构象和癌细胞系限制，为适配体在癌症临床诊断与治疗中提供新思路和新方法。
(2)与抗体相比，筛选得到的核酸适配体IDC-31分子量小，为27159.59，且是体外化学合成，故生产周期短，生产成本低于抗体，无免疫原性，无毒性，易于标记修饰(体外化学合成，即非体内合成更易于在合成过程中在碱基上修饰和标记)，利于作为分子信标和药物载体；与抗体相比，核酸适配体IDC-31更稳定(核酸适配体相对于蛋白抗体，更稳定，能常温运输和保存)所以适配体IDC-31更具有作为乳腺浸润性导管癌分子诊断探针信标的优势。
本发明证明核酸适配体IDC-31能特异识别乳腺浸润性导管癌血清，可以成为诊断乳腺浸润性导管癌的分子探针，简化实验方法，降低成本，因此，核酸适配体IDC-31在临床医学与基础医学的肿瘤研究相关领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。
附图说明
图1为第12轮筛选PCR监测结果。
图2为PCR法检测适配体IDC-31与乳腺浸润性导管癌血清结合的亲和力。
图3为PCR法验证适配体IDC-31与乳腺浸润性导管癌血清识别的特异性。
图4为ELISA法验证适配体IDC-31与乳腺浸润性导管癌血清识别的特异性。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
以下将参考附图详细说明本发明的示例性实施例、特征和性能方面。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。
本发明通过以下技术方案实现：
实施例1核酸适配体IDC-31的制备
(1)构建初始寡核苷酸文库
5'-CTATAGCAATGGTACGGTACTTCC-(40N)-CAAAAGTGCACGCTACTTTGC TAA-3'
其中N代表A，T，C，G中任意碱基。所述的寡核苷酸文库两端固定序列为PCR扩增引物结合区，中间为40个碱基的随机序列。
(2)血清的处理
血清来自秦皇岛市第一医院非抗凝标本，自然凝固后常规离心分离血清，-80℃保存备用。随机取20例乳腺浸润性导管癌血清样本，每例取500μL混匀后分装，-20℃保存备用。筛选前，按血清：水：乙腈＝2：4：1(体积比)配制，水浴超声5min，15000g，离心30min，弃去沉淀，收集上清，用于磁珠孵育。浸润性乳腺导管癌血清和消减靶标正常血清均需要做相同处理。
(3)磁珠与血清的偶联
正筛：已经处理过的浸润性导管癌血清和磁珠(PuriMag Biotech，PMAG016)37℃旋转孵育2h，形成磁珠-血清复合物。
反筛：已经处理过的消减靶标血清与磁珠37℃旋转孵育2h，形成磁珠-血清复合物。
(4)文库的处理
步骤(1)所述的寡核苷酸文库用DEPC水溶解，95℃变性10min后立即冰浴5min使ssDNA恢复三维空间结构。
(5)靶标消减替换筛选
步骤(3)所述反筛磁珠用PBS洗3遍，加入封闭液(蔗糖0.2g，酪蛋白0.025g，BSA0.025g溶于20mL PBS)封闭，PBS洗3遍，加入步骤(4)所述处理好的寡核苷酸文库，37℃孵育30min，收集不结合的上清，保留磁珠，即处理后的反筛磁珠。
步骤(3)所述正筛磁珠用PBS洗3遍，加入封闭液(蔗糖0.2g，酪蛋白0.025g，BSA0.025g溶于20mL PBS)封闭，PBS洗3遍，加入上述收集不结合的上清，37℃孵育30min，得到处理后的正筛磁珠磁珠。
将处理后的正筛磁珠和处理后的反筛磁珠分别同时用PBS洗涤，然后分别加入DEPC水95℃变性5min，收集带有寡核苷酸的上清，得到阴、阳性模板，进行PCR反应(37℃5min，94℃7min，95℃5s，60℃34s)。监测阴性模板和阳性模板的PCR扩增结果。
(6)链霉亲和素磁珠法制备次级库
阳性模板PCR产物为5'端带有生物素的dsDNA，将阳性模板PCR产物与链霉亲和素磁珠(PuriMag G-streptavidin)37℃孵育30min，通过碱变性收集正义链，制得下一轮筛选的次级库。
(7)使用步骤(6)制备的次级库重复步骤(2)-(6)的筛选流程，共进行12轮筛选，第12轮筛选PCR监测结果如图1所示，表示寡核苷酸与阳性靶标(浸润性导管癌血清)的结合能力强于阴性靶标(消减靶标血清)。最后高通量测序第12轮的寡核苷酸库，挑选得到核酸适配体IDC-31，所述核酸适配体IDC-31的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2通过PCR法检测核酸适配体IDC-31与乳腺浸润性导管癌血清的结合能力
(1)根据实施例1所述的方法将处理过的乳腺浸润性导管癌血清与磁珠偶联，形成血清-磁珠复合物。
(2)PBS洗涤，加入封闭液(蔗糖0.2g，酪蛋白0.025g，BSA 0.025g溶于20mL PBS)，封闭多余的结合位点。
(3)适配体IDC-31溶液95℃变性10min，立即冰浴5min，PBS洗涤磁珠(PuriMagBiotech，PMAG016)后分别加入0-400nm浓度的核酸适配体IDC-31，37℃孵育30min，使适配体与靶标分子完全结合。
(4)洗去未结合的适配体，加入DEPC水变性洗脱，保留含有适配体分子的上清溶液进行PCR扩增(同实施例1中PCR条件)。
(5)记录不同浓度适配体PCR扩增曲线Ct值，根据Y＝BmaxX/(Kd+X)，计算出核酸适配体与靶标(乳腺浸润性导管癌血清)相互作用的亲和力常数Kd值，结果如图2所示，核酸适配体IDC-31与乳腺浸润性导管癌血清结合的Kd值，约为16.05±2.19nM。
实施例3通过PCR法验证核酸适配体IDC-31对乳腺浸润性导管癌血清的特异识别
为了检测筛选到的核酸适配体IDC-31与靶标结合的特异性，用核酸适配体IDC-31分别与乳腺浸润性导管癌血清和消减靶标正常血清包被的磁珠(制备方法同实施例1中磁珠-血清复合物的制备方法，区别为将乳腺浸润性导管癌血清替换成正常血清)在终体积为200μL的PBS中37℃旋转孵育30min，洗液洗涤，加DEPC水95℃变性洗脱结合的核酸适配体IDC-31，PCR扩增进行分析。以初始文库作为对照，以验证核酸适配体IDC-31与乳腺浸润性导管癌血清结合的特异性。实验结果如图3所示，核酸适配体IDC-31组的PCR扩增曲线Ct值差大于2，初始文库组没有明显差值，证明了核酸适配体IDC-31识别乳腺浸润性导管癌血清的特异性。
实施例4通过ELISA验证核酸适配体IDC-31对乳腺浸润性导管癌血清的特异识别
(1)分别制备磁珠与乳腺浸润性导管癌血清、健康人血清、胃癌血清、肺癌血清的磁珠-血清复合物，方法为：将磁珠与血清(制备方法同实施例1中磁珠-血清复合物的制备方法)37℃旋转孵育2h，形成磁珠-血清复合物。
(2)洗涤，加入封闭液(蔗糖0.2g，酪蛋白0.025g，BSA 0.025g溶于20mL PBS)，封闭多余的结合位点。
(3)核酸适配体IDC-31溶液95℃变性10min，立即冰浴5min，加入步骤(2)所得磁珠-血清复合物中，37℃旋转孵育1h，使适配体与靶标分子结合。
(4)弃去未结合的适配体溶液，PBS洗涤，加入1：20000(体积比)稀释的链霉亲和化的辣根过氧化物酶(SA-HRP)，37℃旋转孵育1h。
(5)弃去未结合的SA-HRP，PBS洗涤，加入TMB底物溶液，避光显色10min，加入2MH2SO4终止液，终止颜色反应，吸取200μL上清置于酶标板中，使用酶标仪检测450nM吸光度。
结果如图4所示，通过比较吸光度OD450发现，适配体IDC-31识别乳腺浸润性导管癌血清，与健康人血清、胃癌血清、肺癌血清相比，差异显著(P<0.01)，证明了适配体IDC-31能特异识别乳腺浸润性导管癌血清。
SEQUENCE LISTING
<110> 燕山大学
<120> 一种特异识别乳腺浸润性导管癌血清的核酸适配体IDC-31分子探针及应用
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
ctatagcaat ggtacggtac ttcctatcta gttccggaat aggatttgat tatcagcttg 60
taatcaaaag tgcacgctac tttgctaa 88

Claims (7)

1.一种核酸适配体IDC-31，其特征在于，所述核酸适配体IDC-31的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的核酸适配体IDC-31，其特征在于，所述核酸适配体IDC-31可以特异识别乳腺浸润性导管癌血清。
3.根据权利要求1所述的核酸适配体IDC-31，其特征在于，所述核酸适配体IDC-31可以是体外化学合成的，也可以是通过PCR或其他分子生物学方法制备的。
4.根据权利要求1所述的核酸适配体IDC-31，其特征在于，所述核酸适配体IDC-31的5’端或3’端可以经同位素、生物素、地高辛、荧光物质或者纳米材料进行标记。
5.根据权利要求1所述的核酸适配体IDC-31，其特征在于，所述核酸适配体IDC-31的核苷酸序列还包括如下三种序列中的一种：
(1)与所述核酸适配体IDC-31同源性在80％以上的寡核苷酸序列；
(2)与所述核酸适配体IDC-31进行杂交的序列；
(3)所述核酸适配体IDC-31转录的RNA序列。
6.一种分子探针，其特征在于，包含权利要求1～5中任意一项所述的核酸适配体IDC-31。
7.核酸适配体IDC-31在制备用于乳腺浸润性导管癌辅助诊疗或治疗用试剂盒以及生物传感器中的应用。
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