CN110331199B - 用于检测cldn18.2基因表达的分子探针及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针及检测方法。所述分子探针优选具有如下结构:5′‑Cy5‑CGUAUGCCCGCAAUCCCAAUCAGUUACG‑BHQ2‑3′。本发明提供的分子探针可用于CLDN18.2 RNA水平的定量研究,也可用于CLDN18.2 RNA在细胞水平定性或半定量的分析。本发明为循环肿瘤细胞检测提供有力手段。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,特别是癌症标志物CLDN18.2检测领域,具体地说,涉及一种用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针及检测方法。
背景技术
RNA对于细胞而言十分重要,经典理论认为RNA是DNA到蛋白的中介。近几十年的研究表明RNA在体内发挥着多种重要功能,比如传递及翻译遗传信息,分子机器的结构支撑,沉默基因表达,催化某些反应。如果能在亚细胞层面实时对RNA进行空间定位,有利于更深入地了解细胞行为,更重要的是,可以从分子水平了解细胞对于外界刺激的反应,研究药物作用机制或者疾病诊断。
分析信标于1996年开始应用于PCR检测;一般为寡聚核苷酸结构,能够和靶向区域互补结合,呈环状,两端各有3-6个核苷酸互补结合,使得两端原有的发光和淬灭基团分子间距离大幅度减少,从而没有任何光发出,当分子信标主题部分与靶向区域结构后,由于两个距离开始增长,发出的光不能被淬灭,可以被荧光接收器识别。分子信标连接靶向核苷酸之后,荧光信号强度可上升10倍。
CLDN18.2蛋白是一种跨膜蛋白,属于Claudins(CLDNs)家族成员之一,是细胞紧密连接的重要结构成分,它在上皮细胞层起渗透调控,屏障,伤害抵抗和极化作用。人类CLDN18基因的第一个外显子存在两个等位基因,可表达CLDN18.1和CLDN18.2两种不同的剪切突变体,导致包括细胞外环1在内的69个氨基酸序列的差异,故两者细胞外抗原表位存在差异。研究发现CLDN18.2蛋白在正常健康组织中表达高度受限,仅在胃粘膜中存在。CLDN18.2蛋白在多种恶性肿瘤发生发展过程中频繁发生异常改变,如胃癌发生后,CLDN18.2表达量大幅度上升。胃癌中CLDN-18的表达是下降的,但CLDN-18.2的表达反而随肿瘤进程大幅度上升,稳定地表达于特定肿瘤组织,参与肿瘤细胞的增殖分化和迁移,这种现象在食管癌、胃癌、胰腺癌、甚至胆管癌中均有体现,由此可见claudin-18.2可作为消化道多种肿瘤的检测和治疗靶点。近年来,其特异性抗体claudiximab(zolbetuximab/IMAB362)在最新的临床试验中取得了显著成功。因此,通过CLDN18.2阳性肿瘤的检测来指导其临床靶向用药就格外重要。由于CLDN 18.1和CLDN 18.2,两者高度同源(氨基酸92%重合),给抗体的研发和临床检测造成了很大的困难,同时如果以RNA作为检测手段能够更好地跟踪CLDN18.2在细胞内的生理反应,了解肿瘤细胞的作用机制。通过将靶向治疗与CTC基因分型的液体活检相结合的个体化治疗方案,将为CLDN18.2恶性肿瘤的诊断和治疗带来新的希望,使恶性肿瘤患者具有更高的生存率。综上,CLDN18.2 RNA水平检测是一个很好的选择。采用分子信标技术可对大量样本进行检测,但对有限数目细胞的检测目前仍存在一定难度,难以保证检测的高覆盖度。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针及检测方法。
本发明构思如下:设计一段具有颈环状结构的寡聚核苷酸,化学本质可以为DNA也可以为RNA或DNA/RNA,在5’末端和3’末端分别有一个荧光发射基团和与之对应的荧光淬灭基团,且5’末端和3’末端各有3-6个核苷酸相互匹配从而以氢键相互吸引,常规环境下成“颈环”结构,此时照射荧光激发光时,由于荧光基团和与之对应的淬灭基团物理距离很近从而引起荧光集团发出的光被淬灭基团所吸收而无法被检测,序列与靶向CLDN18.2特有序列相结合,一旦结合后会引起荧光基团和与之对应的淬灭基团物理距离增大从而引起荧光淬灭机制解除进而被检测到。
为了实现本发明目的,第一方面,本发明提供一种用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针,所述分子探针为DNA探针、RNA探针或DNA/RNA探针,所述分子探针含有可与CLDN18.2基因编码的RNA第95-114碱基杂交的核酸序列,且所述分子探针不与双链DNA结合。
优选地,所述分子探针含有如下核酸序列:5′-UGCCCGCAAUCCCAAUCAGU-3′或5′-TGCCCGCAATCCCAATCAGT-3′。
本发明分子探针的5′和3′端分别含有3-6个(优选4个)可互补配对的碱基,形成颈环结构中的“颈部”。
更优选地,所述分子探针为RNA探针,序列如下:5′-CGUAUGCCCGCAAUCCCAAUCAGUUACG-3′(SEQ ID NO:1)。
更优选地,所述分子探针为DNA探针,序列如下:5′-CGTATGCCCGCAATCCCAATCAGTTACG-3′(SEQ ID NO:2)。
本发明分子探针的一端带有荧光基团,另一端带有淬灭基团,且所述荧光基团和淬灭基团相互匹配。例如Cy3、Cy5荧光基团与BHQ2、BHQ淬灭基团。
优选地,所述荧光基团选自FAM、HEX、TET、VIC、ROX、CY5、CY3、JOE、ALEX和CAL中的任意一种,所述淬灭基团选自DABYSL、BHQ、ECLIPSE和TAMRA中的任意一种。
优选地,本发明分子探针(特别是RNA探针)上的各碱基第2位碳原子(碳原子上的羟基)被甲基化修饰/取代。
优选地,本发明分子探针中,如下核苷酸的磷酸位点均被硫代硫酸酯化修饰:UGCCCGCAAUCCCAAUCAGU或TGCCCGCAATCCCAATCAGT。
这些修饰可以使分子探针的稳定性增强,与靶分子的结合能力增强。
优选地,所述分子探针在活细胞水平检测时,需通过转染试剂介导。例如,转染试剂可选择链霉素O(SLO)。
优选地,利用本发明的分子探针对血液样本进行检测时,直接将细胞固定后将分子探针加入培养基即可。
优选地,所述分子探针可以与具有光学,磁学性质的金纳米颗粒和氧化铁等纳米材料组合实现更灵敏的检测。
在本发明的一个具体实施方式中,所述分子探针为5′-Cy5-CGUAUGCCCGCAAUCCCAAUCAGUUACG-BHQ2-3′。但不仅限于该序列,同时包括该分子信标结合CLDN18.2 RNA区域上游和下游200个碱基左右的区域,均属于本发明保护范围。
第二方面,本发明提供含有所述分子探针的检测试剂或试剂盒。
进一步地,所述试剂盒还包括转染试剂和缓冲液。
第三方面,本发明提供所述分子探针的以下任一用途:
1)用于样本(如血液样本)中CLDN18.2基因表达水平的检测;
2)用于制备CLDN18.2基因表达检测试剂盒;
3)用于分子RNA定量,细胞RNA检测,用于病人血液中循环肿瘤细胞RNA表达分类,主要针对胃癌,胰腺癌和食管癌等消化系统恶性肿瘤中CLDN18.2基因的表达。
第四方面,本发明提供一种非诊断目的CLDN18.2基因表达的检测方法(非侵入性单细胞水平检测),将所述分子探针与转染试剂混合后,加入待测样本中,孵育一段时间后,根据反应体系的荧光强度,即可测定样本中CLDN18.2基因的表达量。
其中,所述样本可以是RNA单链DNA样本、细胞样本或血液样本。
进一步地,本发明提供上述检测方法在循环肿瘤细胞检测中的应用。
借由上述技术方案,本发明至少具有下列优点及有益效果:
(一)本发明提供了一种人肿瘤细胞标记物特别是胃癌的标志物CLDN18.2 RNA检测方法,该方法以分子探针(分子信标)作为基础骨架,并应用多种修饰方法提高其检测效率和特异性,该方法可以基于循环肿瘤细胞检测方法用于病人血液样本的单细胞水平CLDN18.2特异性检测。
(二)本发明提供的分子信标对CLDN18.2阳性细胞具有靶向识别作用,具有高效、灵敏、特异性强的特点。
(三)本发明提供的分子信标对血液中循环肿瘤细胞内的CLDN18.2有识别作用,可利用荧光值对CLDN18.2的表达强弱进行分类和定量。所得检测结果在患者分型和临床用药等方面具有一定的指导意义。
(四)本发明从检测温度、打孔、选择不同转染方式等多重手段优化反应条件,从而得到一个具有高覆盖度和高专一性的检测方法,弥补了现有方法的不足。
附图说明
图1为本发明实施例1中分子信标的结构式。
图2为本发明实施例1分子信标的RNA分子检测速度评估结果。
图3为本发明实施例1分子信标的线性及灵敏度评估结果。
图4为本发明实施例1分子信标的温度耐用性评估结果。
图5为本发明实施例1分子信标的在CLDN18.2基因上的起止位置。
图6为本发明实施例1分子信标的专一性评估结果。
图7为本发明实施例1分子信标在循环肿瘤细胞中的应用示例。
图8为本发明实施例2中8名胃癌患者CTCs中CLDN18.2表达丰度统计及分类结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
本发明提供一种高灵敏检测CLDN18.2 RNA水平表达的分子信标,该信标不能与双链的DNA结合,且与靶标结合必须快速,有效,能够耐受不同的温度环境。该方法还进一步适配于循环肿瘤细胞标准方法流程。
具体方案如下:
设计一个CLDN18.2 RNA专一结合的分子信标及在分子水平对其进行验证以证明其有效性和特异性,包括方法适用性,是否能够对靶标进行定量,最低定量限,反应速度等研究。并将该试剂应用于细胞水平验证以考察该方法的可靠性,最后将该方法应用于循环肿瘤细胞的研究。
所述试剂为一段寡聚核糖核苷酸序列,该序列在5’末端加入荧光基团,比如Cy3(550nm激发,570nm发射),在3’末端加入荧光淬灭基团。其中每一个核糖核苷酸都需要进行修饰以防止降解和自然开环。包括2-O位甲基化,磷酸基团上修饰硫代硫酸酰化修饰。
所述试剂分子水平的方法验证,方法适用性检测该分子信标仅能与靶向单链核酸分子结合,而不与靶向双链分子结合,以避免该试剂在细胞核内被染色从而造成假阳性发生。靶标定量研究RNA含量与检测荧光强度之间的线性关系,最低定量限检测试剂可区分靶向RNA和非靶向RNA的最低浓度;反应速度研究其结合反应所需的最短检测时间。
所述试剂应用于细胞水平验证,分析其在CLDN18.2高表达/低表达细胞中的检测能力,分别利用荧光显微分析和流式细胞分析等不同的检测方法进行验证。
本发明还提供了一种检测方法,该方法应用于循环肿瘤细胞检测,分析循环肿瘤细胞中CLDN18.2的表达,在标准检测方法中加入分子信标检测步骤并使其适配。验证在实际胃癌患者检测中,患者间以及患者各个CTCs之间的结果是否存在差异,用以验证其有效性,在此基础上,对各个患者的CTCs结果进行汇总并统计CLDN18.2的表达,用于对CLDN18.2的分类研究。
作为本发明的优选方案,所述分子信标检测试剂5’和3’末端加入Cy5和BHQ2试剂,分别作为荧光的激发基团和淬灭基团。
可选地,所述的荧光基团和淬灭基团在能能够精准配对的情况下可随意更改。
可选地,所述分子信标的核苷酸五碳糖链的2位C端的-OH键进行甲基化修饰。
可选地,所述分子信标的在颈环结构中的环部所有核苷酸上的磷酸基团进行硫代硫酸酰基化修饰。
可选地,所属分子信标可以进行LNA化修饰。
所谓本发明的优选方案,所述分子信标检测试剂在应用于细胞检测方法中,需要对细胞膜进行链霉素O(Streptolysin O,SLO)法打孔之后加入分子信标检测。
可选地,所述分子信标检测试剂在应用于循环肿瘤细胞检测方法中,在细胞进行固定之后任何一个环节均可以直接加入该试剂30分钟即可进行检测。
本发明还提供一种用于检测人血液样本循环肿瘤细胞中CLDN18.2表达的试剂盒,包括前述分子信标和转染试剂。
实施例1分子信标的设计与合成
本实施例提供的分子信标以RNA作为基础骨架,5’端修饰Cy5荧光,3’端修饰BHQ2淬灭基团;
结构如下:5′-Cy5-CGUAUGCCCGCAAUCCCAAUCAGUUACG-BHQ2-3′
近5’端和近3’端核苷酸序列互补,导致整体分子在常规环境中5’端和3’以氢键形式结合,呈现“颈环状”结构,对RNA分子的所有的2位碳原子上的羟基进行甲基化修饰,对环状区域的磷酸位点进行硫代硫酸酯化修饰。
分子信标化学本质为核苷酸,合成时多采用β-乙腈亚磷酰胺化学合成法,合成时从3’→5’方向进行,通常3’端的第一个碱基结合在微孔玻璃小球,例如BHQ2修饰好的DMT修饰核苷酸G首先结合在微孔玻璃小球,首先进行脱保护,使用TCA试剂将五碳糖羟基上的DMT保护剂去除,之后进行活化,将下一个DMT和亚磷酰化预先修饰的核苷酸中亚膦酰基的氮活化,之后与上一个修饰在微孔玻璃小球上的核苷酸进行偶联,此时CG-BHQ2已经合成,将未发生反应的核苷酸C通过乙酸酐进行封闭,最后将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯,也可以采用取代反应合成硫代硫酸酯。此时一个核苷酸已经成功加入,这样反复进行即可合成分子信标。以上反应可由核苷酸自动合成仪合成,可由试剂生产商代为加工。将合成好的分子信标通过高效液相色谱(HPLC)进行纯化。
本实施例制备的分子信标的结构式见图1。
实施例2分子信标的性能评估
评估包括结合速度、线性、温度耐用性、专一性和最低检测限等几个指标。
1、结合速度检测为常规温度下分子信标和靶向RNA结合能力的验证
具体方法为:方法操作在荧光分光光度计中进行,将分子信标置于荧光比色皿,将荧光值归零,之后分别加入CLDN18.1 RNA、CLDN18.2 RNA、binding buffer等试剂并在试剂加入后立刻检测其荧光强度,以Cy3为例,设置550nm激发光波长和570nm发射光波长,检测平频率为0.2-1point/s,检测时长为10-20min。实结表明只有CLDN18.2 RNA的荧光能够快速上升,而CLDN18.1 RNA和binding buffer无荧光快速上升现象。
2、线性为同浓度分子信标与不同浓度靶向RNA结合的相关性分析(最低检测限研究在定量的基础上寻求该试剂的极限检测能力)
具体方法为:方法操作在荧光多功能酶标仪进行,将50μL浓度为100nM的分子信标置于96孔板,加入不同浓度的分子信标进行室温(25℃)孵育30min,之后检测荧光值,以Cy5为例,设置550nm激发光波长和570发射光波长。对结果进行统计计算,使用直线线性相关进行线性评价,实际结果表明,在一定浓度范围内分子信标的荧光值与加入的CLDN18.2 RNA浓度存在极强的相关性(R2=1.00)。说明该分子信标可以对靶向RNA分子进行定量。
在最低定量限研究中,主要目标为找出样品定量的最低上样浓度,实验CLDN18.2RNA样品浓度浓度范围为5-100nM,5nM即可以有效区分CLDN18.1和CLDN18.2 RNA,可认为对低定量限为该浓度的上一浓度即10nM。当前采用96孔板模式每孔最低100μL上样量计算,每孔目标RNA为1pmol。
可选地,采用诸如384孔板、微流控芯片等微量检测样品槽,或者采用多次曝光,长时长曝光等提高荧光检测能力的方法,均可以有效提高分子信标的检测能力。理论上可以检测下限到fmol级别的RNA。
3、温度耐用性分析该试剂在不同温度下对靶向RNA的结合能力评价
具体方法为:方法操作在荧光定量PCR仪中进行,在PCR管内将分子信标分别与CLDN18.1/CLDN18.2/binding buffer进行充分混合,将PCR管中放入仪器,设置温度从35℃逐级上升至80℃,每个温度下记录其荧光强度。实际结果表明,在单独分子信标环境中,常规环境(40℃以下)中其荧光强度与温度无关,当温度上升到一定程度,随着温度的升高,势必会引起分子信标荧光颈环结构的打开从而使荧光强度上升,分子信标与CLDN18.1 RNA结果表现与binding buffer结果一致,表明分子信标不与非靶向RNA结合,CLDN18.2RNA在低温时表现高强度荧光,随温度上升荧光值大幅度下降。但是在40℃以内荧光值不低于最大荧光的80%,换言之,常规使用温度下能够保证该检测试剂的正常运行。
4、专一性分析该检测试剂对其他RNA和双链靶向DNA的结合能力从而评价该试剂是否专一性的与靶向RNA结合
首先从生物信息学角度保证该序列的覆盖度高,之后考虑该检测试剂立足于细胞内RNA检测,所以应该极力避免核内染色,需要对细胞核内的靶向核酸进行评价,换言之,需要评价分子信标与双链DNA(主要存在于细胞核)、单链DNA和单链RNA之间的关系。
具体方法为:该方法操作在荧光酶标仪中进行,在96孔板中的每孔加入100nM分子洗标,上样样品为CLDN18.2 RNA、CLDN18.1 RNA、CLDN18.2 single strain DNA和CLDN18.2质粒,对样品进行多级稀释,两者室孵育后进行加测。结果表明,与分子信标结合的试剂不仅有CLDN18.2 RNA也有CLDN18.2 ssDNA,这表明分子信标仅能与单链靶向核苷酸结合,但是不与双链靶向核苷酸结合,众所周知,细胞核内的核苷酸分子几乎都为双链形式,分子信标表现出的阴性结果极大程度上避免了由于核内染色导致的假阳性出现。
5、分子信标细胞检测能力评估
由于该分子信标主要应用于CTCs水平检测,即需要在细胞水平进行检测,所以需要对分子信标在细胞水平的检测能力进行评估。
具体方法为:方法操作在荧光显微镜上进行,将分子信标转染进入细胞后孵育10-30min,去掉培养基中的残存分子信标后继续培养1h即可检测。
优选地,采用三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,TCEP)预先激活的SLO进行细胞打孔从而将外源的分子信标转染进入细胞内,这样可以有效避免传统转染试剂介导的细胞内吞通路,降低分子信标在溶酶体等降解类细胞器的分布,从而降低背景噪声。
实施例3分子信标在循环肿瘤细胞中的应用及试剂盒的制备
分子信标应用于循环肿瘤细胞检测,联合方法用于肿瘤细胞中CLDN18.2 RNA表达测定和分类。首先采用标准分子信标检测方法,主要流程为:将EPCAM多肽磁珠(购自北京中科纳泰生物科技有限公司)与样本孵育,之后采用磁力架吸附磁珠用于阳性细胞的富集,之后对细胞进行洗涤和固定,最后为染色步骤,分为抗体染色、分子信标染色和核染色。在抗体检测步骤加入分子信标进入细胞后孵育60min,去掉培养基中的残存分子信标后即可检测。
优选地,在抗体加入步骤之前单独加入分子信标检测30min,再加入抗体检测其他信号,可提高检测信噪比。
具体方法为:方法操作在荧光显微镜上进行,首先应用EpCAM多肽纳米磁珠抓取上皮样的肿瘤细胞,37℃孵育1小时,经过多次清洗和孵育步骤后将其吸附于玻璃板底,对细胞进行多聚甲醛固定30min,在乙醇洗涤步骤后加入分子信标孵育30min,后更换为pan-CK和CD45抗体染色60min,之后Hoechst33342染色2min并洗涤后上机拍照,采用20或40倍镜检测每一个视野。最后将所有图片进行汇总分析。
试剂盒包括:CLDN18.2 RNA检测试剂(内含分子信标),稀释液(含0.05%Tween-20的PBST液,pH7.4),CTCs标准方法试剂(hoechst33342,pan-CK抗体,CD45抗体,多肽纳米磁珠)。
实施例1提供的分子信标与性能一般的分子信标对RNA分子检测速度对比评估结果见图2。
实施例1分子信标的线性及灵敏度评估结果见图3。
实施例1分子信标的温度耐用性评估结果见图4。
实施例1分子信标的在CLDN18.2基因上的起止位置以及专一性评估结果见图5和图6。
综上,本发明提供的分子信标可用于CLDN18.2 RNA水平的定量研究,也可用于CLDN18.2 RNA在细胞水平定性或半定量的分析。本发明涉及检测试剂、试剂优化、分子水平检测方法及细胞水平检测方法,所述应用为CLDN18.2 RNA定量检测,在此基础上在循环肿瘤细胞检测中加入本检测试剂可进行联合检测,能够对循环肿瘤细胞内的CLDN18.2 RNA进行识别和含量分类。该方法简单快速,利用荧光定量检测,因此在CTCs标准检测方法的基础上无需增加任何设备,大大降低了检测成本和分析难度。该方法可高度适配于CTCs标准方法。
实施例4分子信标在循环肿瘤细胞中的应用
实施例1分子信标在循环肿瘤细胞中的应用,具体如下:
采用分子信标试剂盒和实施例3的步骤对8名胃癌患者的血液样本进行检测,对所获得的CTCs(hoechst33342+,pan-CK+,CD45-)数据进行汇总,分析并统计其分子信标的荧光值。
对所有的荧光值进行聚类,选择Agglomerative Clustering算法将结果分为三类。应用结果见图7。
8名胃癌患者CTCs中CLDN18.2表达丰度统计及分类结果见图8。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 国家纳米科学中心
<120> 用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针及检测方法
<130> KHP191113237.8
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cguaugcccg caaucccaau caguuacg 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgtatgcccg caatcccaat cagttacg 28
Claims (8)
1.用于检测CLDN18.2基因表达的分子探针,其特征在于,所述分子探针为DNA探针或RNA探针,所述分子探针含有可与CLDN18.2基因编码的RNA第95-114碱基杂交的核酸序列,且所述分子探针不与双链DNA结合;
所述分子探针含有如下核酸序列:5′-UGCCCGCAAUCCCAAUCAGU-3′或5′-TGCCCGCAATCCCAATCAGT-3′;
所述分子探针的5′和3′端分别含有3-6个可互补配对的碱基。
2.根据权利要求1所述的分子探针,其特征在于,所述分子探针为RNA探针,序列如下:5′-CGUAUGCCCGCAAUCCCAAUCAGUUACG-3′;或者,
所述分子探针为DNA探针,序列如下:5′- cgtaTGCCCGCAATCCCAATCAGTtacg-3′。
3.根据权利要求1或2所述的分子探针,其特征在于,所述分子探针的一端带有荧光基团,另一端带有淬灭基团,且所述荧光基团和淬灭基团相互匹配。
4.根据权利要求3所述的分子探针,其特征在于,所述分子探针上的各碱基第2位碳原子被甲基化修饰。
5.根据权利要求3所述的分子探针,其特征在于,所述分子探针中,如下核苷酸的磷酸位点均被硫代硫酸酯化修饰:UGCCCGCAAUCCCAAUCAGU或TGCCCGCAATCCCAATCAGT。
6.含有权利要求1-5任一项所述分子探针的检测试剂或试剂盒。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括转染试剂和缓冲液。
8.非诊断目的CLDN18.2基因表达的检测方法,其特征在于,将权利要求3-5任一项所述分子探针与转染试剂混合后,加入待测样本中,孵育一段时间后,根据反应体系的荧光强度,即可测定样本中CLDN18.2基因的表达量;
其中,所述样本来自RNA单链样本、细胞样本或血液样本。
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CN104321345A (zh) * | 2012-05-09 | 2015-01-28 | 加尼梅德药物公司 | 用于癌症诊断的针对密蛋白18.2的抗体 |
Non-Patent Citations (2)
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In situ detection of CLDN18.2 RNA in circulating tumor cells in gastrointestinal cancer;Chong Xiaoyi 等;《CANCER RESEARCH》;20200831;第80卷(第16期);全文 * |
Ultrasensitive Gastric Cancer Circulating Tumor Cellular CLDN18.2 RNA Detection Based on a Molecular Beacon;Fan Linyang 等;《Analytical chemistry》;20201214;第93卷(第2期);665-670页 * |
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