CN108265055A

CN108265055A - 特异性结合人乳腺癌细胞mcf-7的dna核酸适配体及其应用

Info

Publication number: CN108265055A
Application number: CN201810237603.1A
Authority: CN
Inventors: 何农跃; 刘梅; 王志飞; 杨通
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2018-03-21
Filing date: 2018-03-21
Publication date: 2018-07-10
Anticipated expiration: 2038-03-21
Also published as: CN108265055B

Abstract

本发明公开特异性识别和结合人乳腺癌细胞MCF‑7的DNA核酸适配体，核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中的任意一条或几条序列所示；或者在SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中的任意一条序列的基础上进行化学修饰、化学标记或碱基的改变。本发明还公开了核酸适配体或核苷酸序列在诊断试剂、分子影像探针或者靶向介质中的应用。本发明还涉及一种人乳腺癌检测和诊断试剂盒，在乳腺癌的检测、诊断和治疗中具有非常广阔的应用前景。本发明所涉及的核酸适配体具有亲和性高、特异性强、分子量小、稳定性好、合成简单、成本低、易修饰、无免疫原性等优点，可满足目前人乳腺癌快速诊断的要求。

Description

特异性结合人乳腺癌细胞MCF-7的DNA核酸适配体及其应用

技术领域

本发明属于生物医学与临床医学技术领域，涉及特异性结合人乳腺癌细胞MCF-7的DNA核酸适配体及其应用，具体还涉及该核酸适配体在制备人乳腺癌的检测和诊断试剂以及在人乳腺癌的治疗性药物或者制剂中的应用。

背景技术

近年来，我国乳腺癌的发病率呈现逐渐升高的态势，其防治局势不容乐观。在我国尤其是偏远贫困地区，妇女乳腺癌的发病率达到了24.20每100000人。而在世界范围内，女性乳腺癌已成为仅次于肺癌的第二大肿瘤疾病，给人们的生命财产带来了巨大的威胁。作为一种高度异质化的肿瘤，乳腺癌具有四种典型的分子亚型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2过表达型和三阴性/基底样型，每种分子亚型的乳腺癌对药物的敏感性差异很大。目前，临床上对乳腺癌的诊断主要依赖于分子影像技术和免疫组织化学技术(IHC)。而这两种技术由于灵敏速度等原因均不能很好地满足乳腺癌早期快速诊断的要求。因此，研发一种高效、快速、特异和灵敏的人乳腺癌的早期诊断和治疗方法对提高乳腺癌病人的生存率和促进其有效防治具有十分重要的意义。

核酸适配体(aptamer)是在体外通过指数富集的配基系统进化技术(SELEX)从一个随机核酸文库中筛选得到的一段能够和相应的靶标特异性结合的短寡核苷酸片段。核酸适配体具有许多与现有抗体类似的功能，因而被形象地称为“化学抗体”。与抗体相比，核酸适配体与靶物质的结合具有亲和力强、特异性高、稳定性好、易修饰、易合成和成本低等优点，在生物医学、环境监测、食品安全等领域具有非常广泛的应用前景。Cell-SELEX是以活细胞为靶标筛选核酸适配体的新技术，其可以在具体靶标未知的情况下筛选得到能够和相应的肿瘤细胞特异性结合的核酸适配体，用于肿瘤的诊断和治疗。与此同时，这种核酸适配体也可以用来发现新的肿瘤分子标志物。此外，由于活细胞表面的靶标大多处于自然的原位状态，通过Cell-SELEX得到的核酸适配体在临床研究中具有更多的先天优势，具有更高的应用价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一类特异性高、亲和性强、稳定性好和实用性广的人乳腺癌细胞株MCF-7特异性核酸适配体及其衍生物。

本发明还要解决的技术问题是提供了一类与所述的核苷酸序列的同源性在60％以上的核苷酸序列。

本发明还要解决的技术问题是提供了一类用于检测和诊断人乳腺癌的试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供了一类分子探针。

本发明还要解决的技术问题是提供了所述的核酸适配体所述核苷酸序列在诊断试剂、分子影像探针或者靶向介质中的应用以及在制备检测、诊断和治疗人乳腺癌制剂中的应用。

技术方案：本发明提供了一类特异性识别和结合人乳腺癌细胞MCF-7的DNA核酸适配体，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4中的任意一条或几条序列所示；或者在SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4中的任意一条序列的基础上进行化学修饰、化学标记或碱基的改变。

其中，上述化学修饰或碱基的改变包括氨基化、羧基化、巯基化或同位素化中的一种或几种。

其中，上述化学标记包括生物素、亲和素、荧光基团、酶、抗体、蛋白、多肽、高分子、纳米材料或其他任何治疗性物质中的一种或几种。

其中，上述核酸适配体的核苷酸序列与SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4中的任意一条序列的同源性在60％以上。

本发明内容还包括一种与所述的核苷酸序列SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:4中的任意一条序列的同源性在60％以上的核苷酸序列。

本发明内容还包括一种用于检测和诊断人乳腺癌的试剂盒，包含所述的核酸适配体或所述核苷酸序列。

本发明内容还包括一种分子探针，包含所述的核酸适配体或所述核苷酸序列。

本发明内容还包括所述的核酸适配体或所述核苷酸序列在诊断试剂、分子影像探针或者靶向介质中的应用。

本发明内容还包括所述的核酸适配体或所述核苷酸序列在设计和制备检测、诊断和治疗人乳腺癌制剂中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所涉及的核酸适配体具有亲和性高、特异性强、分子量小、稳定性好、合成简单、成本低、易修饰、无免疫原性等优点，可满足目前人乳腺癌快速诊断的要求。本发明中的各条适配体均能在30min内与靶细胞MCF-7稳定结合，而不与其对照细胞：人乳腺癌细胞MDA-MD-231、SK-BR-3和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A结合。通过对该核酸适配体进行适当的修饰或者标记，可用于人乳腺癌的快速检测和诊断。同时，由于所选择的靶细胞和对照细胞分别代表了人乳腺癌的三种不同分子亚型和人正常乳腺组织，因此，该核酸适配体不仅能够鉴别乳腺癌组织和正常组织还能够很好的鉴别不同分子亚型的乳腺癌，可用于人乳腺癌的临床分子分型。同时，由于该核酸适配体靶标的未知性，其可以用来发现新型的乳腺癌分子标志物，用于人乳腺癌的早期筛查和诊断。此外，该核酸适配体其本身还可以作为药物或者药物载体，通过负载相应的抗肿瘤药物可以实现人乳腺癌的精准治疗。综上所述，本发明所涉及的新DNA核酸适配体对人乳腺癌的临床检测、诊断和治疗都具有非常重要的意义。

附图说明：

图1为本发明实施例2中利用DNAMAN软件模拟的四条DNA核酸适配体的二级结构示意图；

图2为本发明实施例2中四条核酸适配体与靶细胞MCF-7以及三种对照细胞SK-BR-3，MDA-MB-231和MCF-10A的激光显微共聚焦显微图像；

图3为本发明实施例2中四条核酸适配体与靶细胞MCF-7以及三种对照细胞SK-BR-3、MDA-MB-231和MCF-10A结合的流式结果对比图；

图4为本发明实施例2中采用流式细胞仪测定序列1～4核酸适配体与靶细胞MCF-7结合的解离常数绘制的曲线图；

图5为本发明实施例3中采用序列3构建的核酸适配体传感器用于人乳腺癌细胞MCF-7的检测结果。

图6为本发明实施例4中序列3载阿霉素核酸适配体对不同细胞株的抑制作用结果。

图7为本发明实施例5中Cy5荧光素修饰的序列3核酸适配体在人乳腺癌细胞MCF-7移植瘤小鼠体内的荧光成像实验结果。

具体实施方式：

提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用材料和试剂如无特殊说明均为实验室常规材料和试剂，均可从市场上购买。

以下实施例中的单链DNA随机文库，引物序列和后续的核酸适配体序列均由上海生工生物有限公司合成。

细胞来源：以下实施例中所用的细胞株MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、MCF-10A、A375、A549、HepG2、GES-1和SGC-7901均购自美国ATCC细胞库。

细胞培养基：以下实施例中所用的DMEM不完全培养基、1640不完全培养基和胎牛血清均够自Gibco公司，MEGM无血清培养基购自Lonza公司。

其它试剂：霍乱毒素购自Sigma公司，阿霉素购自上海生工生物有限公司。bindingbuffer结合液：4.5g/L葡萄糖，5mM氯化镁，1mg/mL BSA，0.1mg/mL酵母tRNA，溶于1*PBS溶液当中。washing buffer清洗液：4.5g/L葡萄糖，5mM氯化镁，溶于1*PBS溶液当中。链酶亲和素磁珠MNPs@SA购自无锡百迈格生物科技有限公司。

实施例1：人乳腺癌细胞株MCF-7特异性核酸适配体的筛选

设计与合成以下单链DNA文库和引物序列：

随机ssDNA文库：(N40代表的是有40个随机碱基)

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAG-N40-GAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

上游引物：5'-FAM-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAG-3'

下游引物：5'-biotin-CTGCGACGATTGGTATGTAACTC-3'

1.通过Cell-SELEX获得人乳腺癌细胞株MCF-7特异性核酸适配子：

2.1细胞培养：采用1640不完全培养基加10％胎牛血清培养人乳腺癌细胞MCF-7和SK-BR-3；DMEN加10％胎牛血清培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231；MEGM加100ng/ml的霍乱毒素培养人正常乳腺上皮细胞MCF-10A。所有细胞均在37℃，5％CO₂条件下培养。

2.2筛选前细胞预处理：培养MCF-7细胞生长至铺满直径100mm培养皿底的90％以上，用4℃预冷的washing buffer清洗三次，每次5mL。

2.3随机文库与靶细胞孵育：将10nmol合成好的随机ssDNA文库10000rpm离心2min后加入纯水溶解，95℃变性5min后，立即冰浴10min，然后将纯水溶解的随机文库加入等体积的2×binding buffer中，充分混匀后加入到washing buffer清洗好的细胞培养皿中，于4℃摇床上轻摇孵育60min，使随机文库DNA与靶细胞充分结合。

2.4核酸适配体与细胞解离：随机文库与细胞孵育好后，吸弃所有结合液，用37℃预热的清洗液3～5ml于37℃摇床上轻摇清洗3～5遍。然后向培养皿中加入500μl TE缓冲溶液，用细胞刮刀刮取收集所有细胞至1.5ml离心管中，震荡混匀后，沸水浴煮沸10min，然后立即15000rpm离心5min，吸取上清。

2.5核酸适配体次级文库的制备：取2.4中的上清100μl作为PCR反应的模板，进行普通PCR扩增。PCR反应体系如下：

PCR反应的基本条件为：95℃5min，95℃30sec，64℃30sec，72℃30sec，72℃5min。扩增结束后，取链酶亲和素磁珠(MNPs@SA)1mL，0.5×SSC清洗三遍，然后将所有PCR产物加入到MNPs@SA中震荡室温孵育30min。结束后，磁分离后，用0.5×SSC缓冲液清洗MNPs@SA两遍，纯水清洗一遍。随后向MNPs@SA中加入50μl 0.2M的NaOH溶液变性5min，磁分离后取上清，用0.2M HCl中和溶液至pH 7.0。除盐处理后，获得次级文库。

2.6重复筛选：以2.5得到的次级文库重复上述2.2、2.3、2.4、2.5各两次。

2.7阴性筛选：分别以人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SK-BR-3和人正常乳腺上皮细胞株MCF-10A为对照细胞进行反筛，以去除与靶细胞非特异性结合的序列。具体步骤如下：用4℃预冷的清洗液分别清洗三种培养好的对照细胞3次，每次5mL，接着向其中一种对照细胞中加入用bindingbuffer溶解的次级文库，4℃轻摇孵育；结束后再取上清加入到第二种对照细胞中，4℃轻摇孵育；然后再次取上清加到第三种对照细胞中，4℃轻摇孵育。最后取上清加入到靶细胞MCF-7中，4℃轻摇孵育。重复2.4和2.5。

2.8多轮筛选：将得到的次级文库进行多轮筛选，依次重复2.7、2.4和2.5。多轮筛选过程中，采用流式细胞仪对筛选过程中核酸适配体次级文库的富集情况进行监测，经过连续17轮筛选后，文库富集度不再继续增加，基本达到饱和。以第17轮筛选得到的次级文库为模板，经PCR扩增和克隆、测序分析后得到实施例2中的四条人乳腺癌细胞MCF-7特异性核酸适配体。

实施例2：四条核酸适配体二级结构、特异性、亲和性和解离常数的考察

一种人乳腺癌细胞株MCF-7特异性核酸适配体，该实施例中核酸适配体主要包括以下5'端FAM修饰的四条核苷酸序列中任意一条DNA序列：

序列1：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGCGGCGATCGCATTCTTCTAGACGGTAGCGACTTGAGACATGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列2：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGCCAGCACTGTGAGGGGAATGCGGCCCGAAGTGGTCTAGACGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列3：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGTGCATTAGCACGTCCGAGAAAGGCCAGACGAGGTCACACAGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

序列4：

5'-AGCAGAGTTCACGACCCGATAAGTCAGTTCGAAATCTGGTACTGCACGGAAATCAGGGGTAGGAGTTACATACCAATCGTCGCAG-3'

1.用DNAMAN软件模拟以上四条核酸适配体的二级结构，结果如图1所示。

2.激光扫描共聚焦显微镜考察四条核酸适配体与靶细胞MCF-7的结合效果及其特异性。

在激光扫描共聚焦培养皿中分别培养人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A。培养24h后，吸尽培养皿中的培养基，4℃预冷的washingbuffer清洗三遍，然后将含250nM上述核酸适配体的binding buffer分别与上述4种细胞在4℃恒温条件下轻摇孵育30min。孵育好后，吸尽培养皿中的所有液体，用washing buffer清洗三遍，最后加入200μl washing buffer用于检测，结果如图2所示。激光扫描共聚焦显微镜检测结果表明：以上各核酸适配体均能与人乳腺癌细胞MCF-7特异性结合，而均不能与对照细胞SK-BR-3、MDA-MB-231和MCF-10A结合。

3.流式细胞仪检测四条核酸适配体对靶细胞MCF-7的特异性。

将处于对数生长期的细胞，包括MCF-7、MDA-MB-231、SK-BR-3、MCF-10A、A375、A549、HepG2、GES-1和SGC-7901共9种，分别用无酶消化液消化吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用5ml 4℃预冷的washing buffer，反复吹打清洗两次，每次1000rpm离心5min后，去上清。然后分别加入含250nM核酸适配体的binding buffer 200μl，4℃恒温摇床上轻摇孵育30min，1000rpm离心5min，去上清，加入1ml 37℃预热的washingbuffer清洗三遍。最后1000rpm离心5min后，去上清，再加入300μl washing buffer用于流式细胞仪检测。结果如图3所示，乳腺癌细胞MCF-7分别结合四条核酸适配体后，其荧光强度均明显增强(发生右侧位移，其中以结合序列3的细胞荧光位移最大)。而对照细胞MDA-MB-231、SK-BR-3、MCF-10A、A549、GES-1和SGC-7901分别与四条核酸适配体结合后，细胞的荧光强度没有明显增强(没有明显位移)。但是，序列1和序列2在与A375和HepG2结合后也使这两种细胞的荧光强度增强，说明序列1和序列2能与A375和HepG2结合。由此证明，这四条核酸适配体在乳腺癌的鉴别性诊断方面都具有较大的应用价值。其中，序列3和序列4的特异性优于序列1和序列2。

4.流式细胞仪测定四条核酸适配体与靶细胞MCF-7的结合解离常数。

流式细胞仪测定四条核酸适配体与靶细胞MCF-7的结合解离常数，具体操作与流式细胞仪检测核酸适配体与靶细胞结合特异性的操作相同。将合成上述四条核酸适配体分别平行配置成0nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM和500nM。分别与5×10⁵个靶细胞进行孵育，测定不同核酸适配体浓度下靶细胞的荧光强度。以核酸适配体的浓度为横坐标，相应的荧光强度值为纵坐标，按照公式：

Y＝Bmax*X/(Kd+X)拟合曲线，得到四条核酸适配体的解离曲线。各条核酸适配体的解离曲线如图4所示。由以上四条解离曲线得到各条核酸适配体的结合解离常数Kd大小如表1所示。结果表明：本实例中的四条核酸适配体与靶细胞MCF-7的亲和力均在纳摩尔水平，其中序列2和序列3与靶细胞MCF-7结合的kd均小于100nM，显示出其与靶细胞MCF-7的强结合能力。

表1：四条核酸适配体的解离常数

序列	Kd(nM)
		序列1	107.49±35.22
序列2	62.50±25.76
		序列3	82.25±25.14
序列4	179.95±73.35

实施例3：基于核酸适配体的荧光传感器在人乳腺癌细胞MCF-7检测中的应用

由于序列3在四条核酸适配体序列中的特异性最优(如图3)，故本实施例以序列3为例，构建了基于核酸适配体的荧光传感器用于人乳腺癌细胞MCF-7的体外检测。首先，在序列3的3'端和5'分别修饰Biotin分子和TAMRA淬灭基团，同时设计一段修饰FAM荧光基团的长为16个碱基与核酸适配体的5'端部分互补的核酸序列作为的报告探针(Probe：5'-FAM-GGTCGTGAACTCTGCT-3')。检测前先将核酸适配体与报告探针杂交形成复合体Aptamer-Probe，此时由于FAM荧光基团和TAMRA淬灭基团相互靠近而不能产生荧光信号。然后将该复合体连接到链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒MNPs@SA上形成MNPs@SA-Aptamer-Probe杂合体，用于乳腺癌细胞MCF-7的检测。检测时，先将人乳腺癌细胞MCF-7用PBS溶液稀释成不同浓度的样品，具体如下：0个/mL、10个/mL、50个/mL、100个/mL、500个/mL、1000个/mL、5000个/mL和1000个/mL，每个浓度设置3个复孔。将MNPs@SA-Aptamer-Probe杂合体清洗干净后分别加入到上述样品中，于4℃摇床上反应30min，磁分离取上清。用荧光酶标仪于480/520波长检测上清的荧光强度。以细胞数目为横坐标，平均荧光强度为纵坐标作图，得到其检测限为72个/mL，低于目前现有技术中已有的基于MUC1核酸适配体的MCF-7细胞的检测限(100个/mL)，如图5。

实施例4：载阿霉素核酸适配体对人乳腺癌细胞MCF-7的靶向抑制作用

本实施例以序列3核酸适配体为例，测定载阿霉素核酸适配体对人乳腺癌细胞MCF-7的靶向抑制作用。同时，上海生工生物有限公司合成文献中广泛报道的MCF-7人乳腺癌细胞特异性的核酸适配体MUC1，负载化疗药物阿霉素后作为阳性对照。首先，在96孔细胞培养板中分别接种MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231和MCF-10A四种细胞。每种细胞分为A、B、C、D四组，A组为阴性对照组，B组为加阿霉素组(Dox)，C组为加载阿霉素核酸适配体组(序列3-Dox)，D组为载阿霉素MUC1核酸适配体组(MUC1-Dox)。以上四种细胞每种、每组、每孔各接种5000个细胞，每组细胞均做六个重复孔，在37℃恒温培养箱中培养24h。然后去掉培养基，向A组各培养孔中加入100μl完全培养基，B组加入100μl完全培养基溶解的500nM的阿霉素，C组加入100μl完全培养基溶解的500μM序列3-Dox，D组加入100μl完全培养基溶解的500μMMUC1-Dox。37℃孵育1h后，去掉各孔培养基，用PBS清洗三遍，然后每孔加入100μl完全培养基，继续培养24h。每孔加入MTT 50μl，37℃孵育4h，小心去掉所有培养基，向每孔加入150μlDMSO，在脱色摇床上轻摇10min，用酶标仪测定各孔在490nm波长处的吸收值。然后以各细胞种类为横坐标，细胞相对活力为纵坐标作图。如图6所示，Dox组对四种细胞均表现出极强的抑制作用。序列3-Dox组对靶细胞MCF-7的抑制作用稍低于Dox组，但是要高于MUC1-Dox组。同时，序列3-Dox对其他三种对照细胞的抑制作用显著低于MUC1-Dox组，显示出序列3-Dox优良的特异性和对靶细胞的高效抑制作用，在人乳腺癌的靶向治疗方面具有很大的应用潜力。

实施例5：基于核酸适配体的移植瘤小鼠活体荧光成像

为了进一步验证该核酸适配体在体内的诊断和治疗价值。本实施例以Cy5荧光染料修饰的序列3为例(由上海生工生物有限公司合成和修饰)，考察了其在人乳腺癌细胞MCF-7移植瘤小鼠体内的靶向作用。于南京源端生物科技有限公司购买5-6周龄，Balb/c雌性裸鼠4只，于肩背部皮下分别接种人乳腺癌细胞MCF-7，每只接种5×10⁶个细胞，于SPF条件下饲养。待肿瘤体积长到100-150mm³时，开展移植瘤小鼠体内成像试验。将实验小鼠随机分为A、B两组，A组尾静脉注射200μl生理盐水溶解的1nmol Cy5-序列3；B组尾静脉注射200μl生理盐水溶解的1nmol Cy5-随机文库。分别在注射前0h、注射后0.5h、1h、3h和5h拍摄肿瘤部位的荧光强度。结果如图7所示：尾静脉注射Cy5-序列3的小鼠肿瘤部位在0.5h内就显示出较强的荧光信号并持续到1h。此后，肿瘤部位的荧光逐渐减弱，到注射后5h荧光基本消失。同时，尾静脉注射Cy5-随机文库的阴性对照组的肿瘤部位自始至终均没有明显荧光信号。以上结果说明，该核酸适配体在体内具有良好的靶向作用，在临床乳腺癌的造影和靶向治疗方面具有极大的应用和开发前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 东南大学

<120> 特异性结合人乳腺癌细胞MCF-7的DNA核酸适配体及其应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcagagttc acgacccgat aagcggcgat cgcattcttc tagacggtag cgacttgaga 60

catgagttac ataccaatcg tcgcag 86

<210> 2

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agcagagttc acgacccgat aagccagcac tgtgagggga atgcggcccg aagtggtcta 60

gacgagttac ataccaatcg tcgcag 86

<210> 3

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcagagttc acgacccgat aagtgcatta gcacgtccga gaaaggccag acgaggtcac 60

acagagttac ataccaatcg tcgcag 86

<210> 4

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcagagttc acgacccgat aagtcagttc gaaatctggt actgcacgga aatcaggggt 60

aggagttaca taccaatcgt cgcag 85

<210> 5

<211> 86

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcagagttc acgacccgat aagnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60

nnngagttac ataccaatcg tcgcag 86

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 上游引物(Artificial Sequence)

<400> 6

agcagagttc acgacccgat aag 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 下游引物(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgcgacgat tggtatgtaa ctc 23

Claims

1.一种特异性识别和结合人乳腺癌细胞MCF-7的DNA核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中的任意一条或几条序列所示；或者在SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中的任意一条序列的基础上进行化学修饰、化学标记或碱基的改变。

2.根据权利要求1所述的特异性识别和结合人乳腺癌细胞MCF-7的DNA核酸适配体，其特征在于，所述化学修饰或碱基的改变包括氨基化、羧基化、巯基化或同位素化中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的特异性识别和结合人乳腺癌细胞MCF-7的DNA核酸适配体，其特征在于，所述化学标记包括生物素、亲和素、荧光基团、酶、抗体、蛋白、多肽、高分子、纳米材料或其他任何治疗性物质中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的特异性识别和结合人乳腺癌细胞MCF-7的DNA核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的核苷酸序列与SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中的任意一条序列的同源性在60%以上。

5.一种与权利要求1~4任一项所述的核苷酸序列SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4中的任意一条序列的同源性在60%以上的核苷酸序列。

6.一种用于检测和诊断人乳腺癌的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~4任一项所述的核酸适配体或权利要求5所述核苷酸序列。

7.一种分子探针，其特征在于，包含权利要求1~4任一项所述的核酸适配体或权利要求5所述核苷酸序列。

8.权利要求1~4任一项所述的核酸适配体或权利要求5所述核苷酸序列在诊断试剂、分子影像探针或者靶向介质中的应用。

9.权利要求1~4任一项所述的核酸适配体或权利要求5所述核苷酸序列在设计和制备检测、诊断和治疗人乳腺癌制剂中的应用。