CN114410638B - 一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用 - Google Patents

一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用，核酸适配体，为一段长度为40bp的核苷酸序列，具体如下：A2序列：5’‑CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC‑3’，应用于肿瘤检测，肿瘤为食管癌相关癌症细胞所致肿瘤，食管癌相关癌症细胞为KYSE410细胞。本发明基于Cell‑SELEX技术，筛选获得了一条可与食管癌活细胞高特异性、高亲和力结合的核酸适配体，基于本发明及进一步的相关分子探针的深入开发，可为食管癌的临床诊断与治疗奠定一定技术基础。

Description

一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用
技术领域
本发明属于癌症的生物医学诊治技术领域，具体涉及一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用。
背景技术
食管癌属于一种世界范围内高发的高侵袭性肿瘤，每年确诊人数超50万例，是世界上最致命的癌症之一。临床中，食管癌有食管鳞癌和食管腺癌两种组织分型，由于食管癌早期病症不明显且易在早期发生全身扩散，所以患者一般确诊时即为晚期，且半数以上患者在确诊时已发生转移。由于其预后较差，确诊后食管癌患者的5年生存率只有30%左右。因此，食管癌的早期诊断和及早发现对于控制肿瘤发展具有十分重要的生命意义。食管癌作为一种高发癌症，临床中主要通过相关病理切片方式进行确诊，但这种诊断方式多属于发病后的“事后诊断”。因此，从基因工程技术角度而言，如能开发相关诊断位点及治疗靶点，可为该病的及时预防和治疗奠定一定的技术基础。
生物学研究中，核酸适配体是一段具有与靶标特异性结合功能的单链DNA或RNA，因其结构简单、体积小、易于合成、修饰可控且化学稳定性好，尤其是适配体不能被免疫系统直接识别所以几乎无免疫原性，对人体无毒性，加上其易于穿透组织屏障并易于被靶细胞内化，且易于与各种材料偶联，因此在肿瘤成像、诊断治疗等方面有广泛的应用前景。例如，通过将适配体与荧光团、放射性同位素等材料偶联后，可用于特定类型细胞的富集与成像，从而用于提示肿瘤类型和病变程度等信息。为此，针对食管癌，我们提出一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用，可为食管癌的早期诊断和靶向治疗提供一种分子识别工具。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用，筛选获得了一条可与食管癌活细胞高特异性、高亲和力结合的核酸适配体，为食管癌的早期诊断和治疗奠定一定的技术基础，可以有效解决背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种核酸适配体，为一段长度为40bp的核苷酸序列，具体如下：
A2序列（SEQ ID）：
5’-CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC-3’。
一种核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一 文库的构建及相关引物设计
筛选所用文库为单链DNA文库，每条单链DNA总长度为80nt，中间为40nt的随机序列，5’端与3’端各有20nt的引物序列，每条DNA单链可表示为：
5’-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-40nt-TATCAGTGGTCGGTCGTCAT-3’；
文库制备过程中，所有DNA单链正向引物的5’端均带有FAM染料，以便后续使用流式细胞仪测定结合情况，可表示为：
5’-FAM-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-3’；
所有DNA单链反向引物的5’端均带有生物素标记，以便于通过链霉亲和素修饰的琼脂糖微珠分离正义链与反义链，从而用于后续筛选，可表示为：
5’-Biotin-ATGACGACCGACCACTGATA-3’；
文库构建及引物合成均由生工生物技术有限公司(中国上海)完成和提供；
步骤二 Cell-SELEX筛选
第一轮至第三轮的初步筛选过程中，首先将单链DNA文库溶解于结合缓冲液（Binding Buffer，BB）中，95℃加热5 min使其变性，之后与靶细胞KYSE410在4℃孵育60min；孵育完成后，使用洗涤缓冲液（Washing Buffer，WB）洗脱未与靶细胞结合的DNA单链，收集结合的DNA单链；
第四轮以及之后的复筛过程中，首先使用对照细胞EC109进行反筛选，与DNA文库在4℃孵育30 min，之后使用WB洗脱与对照细胞结合的DNA单链，收集未结合的DNA单链；筛选产物得到富集后，将筛选出的DNA单链进行克隆并测序；
步骤三 筛选富集过程中的监测
筛选富集过程中，对于筛选或富集结果的监测，利用流式细胞检测技术，通过检测文库与细胞结合的FAM荧光值来进行监测判定；
步骤四 筛选富集结果
随着正筛选和反筛选的逐步进行，在筛选富集轮数增加的同时，与KYSE410细胞特异性结合的ssDNA也逐渐在文库中富集，在筛选富集至第9轮时，对部分轮次筛选富集产物与KYSE410和EC109细胞结合的情况作图，根据图中数据判断文库中与食管癌KYSE410细胞结合的ssDNA富集是否达到饱和。
进一步地，步骤二中，为了获得高亲和力高特异性的核酸适配体，实验过程中逐步增加筛选压力，增加筛选压力方法为减少正筛选孵育时间，从60min逐步减少到30 min、增加反筛选孵育时间，从30min逐步增加到60 min或增加洗涤时间，从30 s逐步增加到80 s。
进一步地，步骤三中，当需要判定筛选或富集效果时，将靶细胞KYSE410与对照细胞EC109分别与250 nM的DNA文库在4℃孵育45 min，之后洗脱于结合缓冲液中，以初始文库的荧光值为对照，然后流式检测文库与细胞结合的FAM荧光值。
进一步地，将筛选富集产物进行高通量测序，得到测序结果后，通过重复数分析、同源性分析和进化树分析，综合挑选确定A2（核酸适配体），具体序列如下：
A2（40bp）：5’-CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC-3’。
进一步地，利用mFold软件对确定的A2的结构进行分析模拟。
一种核酸适配体的应用，应用于肿瘤检测。
进一步的，所述肿瘤为食管癌相关癌症细胞所致肿瘤。
进一步的，所述食管癌相关癌症细胞为KYSE410细胞。
利用一种核酸适配体的癌症细胞检测方法，包括如下步骤：
步骤S1 样品处理，对待测样品进行预处理；
步骤S2 孵育和检测判定，将核酸适配体与处理后待测样品进行共孵育，孵育结束后，流式检测或共聚焦成像。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用，具有以下好处：
1，基于Cell-SELEX技术，筛选获得了一条可与食管癌活细胞高特异性、高亲和力结合的核酸适配体。
2，基于本发明及进一步的相关分子探针的深入开发，可为食管癌的临床诊断与治疗奠定一定技术基础，也为其他类似疾病的诊断和治疗提供了新的技术思路和参考。
附图说明
图1为本发明中文库富集情况监测图；
图2为本发明中A2的二级结构示意图；
图3为本发明中流式分析考察A2与靶细胞KYSE410和对照细胞EC109结合能力区别示意图；
图4为本发明中共聚焦成像考察A2与靶细胞KYSE410和对照细胞EC109的结合能力区别示意图；
图5为本发明中A2与靶细胞KYSE410的解离常数Kd变化示意图；
图6为本发明中不同孵育温度下A2与靶细胞KYSE410的结合能力对比图；
图7为本发明中A2与不同细胞的结合特异性考察示意图；
图8为本发明中A2与病人食管癌组织的结合情况示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-8，本实施例提供一种技术方案：
本发明的一个方面，一种核酸适配体，为一段长度为40bp的核苷酸序列，具体如下：
A2序列（SEQ ID）：
5’-CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC-3’。
其中，一种核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
步骤一 文库的构建及相关引物设计
筛选所用文库为单链DNA文库，每条单链DNA总长度为80nt，中间为40nt的随机序列，5’端与3’端各有20nt的引物序列，每条DNA单链可表示为：
5’-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-40nt-TATCAGTGGTCGGTCGTCAT-3’；
文库制备过程中，所有DNA单链正向引物的5’端均带有FAM染料，以便后续使用流式细胞仪测定结合情况，可表示为：
5’-FAM-AGAAGGAAGGAGAGCGACAC-3’；
所有DNA单链反向引物的5’端均带有生物素标记，以便于通过链霉亲和素修饰的琼脂糖微珠分离正义链与反义链，从而用于后续筛选，可表示为：
5’-Biotin-ATGACGACCGACCACTGATA-3’；
具体文库构建及引物合成均由生工生物技术有限公司(中国上海)完成和提供；
步骤二 Cell-SELEX筛选
第一轮至第三轮的初步筛选过程中，首先将单链DNA文库溶解于结合缓冲液（Binding Buffer，BB）中，95℃加热5 min使其变性，之后与靶细胞KYSE410在4℃孵育60min；孵育完成后，使用洗涤缓冲液（Washing Buffer，WB）洗脱未与靶细胞结合的DNA单链，收集结合的DNA单链；
第四轮以及之后的复筛过程中，首先使用对照细胞EC109进行反筛选，与DNA文库在4℃孵育30 min，之后使用WB洗脱与对照细胞结合的DNA单链，收集未结合的DNA单链；筛选产物得到富集后，将筛选出的DNA单链进行克隆并测序；为了获得高亲和力高特异性的核酸适配体，实验过程中逐步增加筛选压力，增加筛选压力方法为减少正筛选孵育时间，从60min逐步减少到30 min、增加反筛选孵育时间，从30min逐步增加到60 min或增加洗涤时间，从30 s逐步增加到80 s；
步骤三 筛选富集过程中的监测
筛选富集过程中，对于筛选或富集结果的监测，利用流式细胞检测技术，通过检测文库与细胞结合的FAM荧光值来进行监测判定；当需要判定筛选或富集效果时，将靶细胞KYSE410与对照细胞EC109分别与250 nM的DNA文库在4℃孵育45 min，之后洗脱于结合缓冲液中，以初始文库的荧光值为对照，然后流式检测文库与细胞结合的FAM荧光值；
步骤四 筛选富集结果
随着正筛选和反筛选的逐步进行，在筛选富集轮数增加的同时，与KYSE410细胞特异性结合的ssDNA也逐渐在文库中富集，在筛选富集至第9轮时，对部分轮次筛选富集产物与KYSE410和EC109细胞结合的情况作图，根据图中数据判断文库中与食管癌KYSE410细胞结合的ssDNA富集是否达到饱和，如图1所示，随着筛选轮数增加，文库与KYSE410细胞结合测得的荧光值不断增加，在第5轮时已有明显升高，但在7轮时已达到饱和，而文库与EC109对照细胞基本不结合，这说明在筛选过程中，与KYSE410细胞结合的核酸适配体已经得到了充分富集，基于上述第7轮筛选富集后结果，可以基本认为文库中与食管癌KYSE410细胞结合的ssDNA富集已经达到饱和。
将筛选富集产物进行高通量测序，得到测序结果后，通过重复数分析、同源性分析和进化树分析，综合挑选确定A2（核酸适配体），具体序列如下：
A2（40bp）：5’-CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC-3’；利用mFold软件对上述确定的A2的结构进行分析模拟，其二级结构如图2所示。
本发明中，生物材料：KYSE410细胞（人低分化食管鳞癌细胞)、EC109细胞(人高分化食管鳞癌细胞)以及实施例中其他类型细胞。食管癌细胞KYSE410、EC109及实施例中其他类型细胞系均由郑州大学基础医学院病理生理学系提供。癌细胞的高低分化主要与肿瘤的恶性程度相关，即高分化癌细胞所致肿瘤恶性程度较低，而低分化癌细胞所致肿瘤恶性程度较高。本实验以低分化的KYSE410细胞系和高分化的EC109细胞系作为对比，筛选符合预期的核酸适配体。
作为本发明的另一方面，一种核酸适配体的应用，应用于肿瘤检测，肿瘤为食管癌相关癌症细胞所致肿瘤，食管癌相关癌症细胞为KYSE410细胞。
利用一种核酸适配体的癌症细胞检测方法，包括如下步骤：
步骤S1 样品处理，对待测样品进行预处理；
步骤S2 孵育和检测判定，将核酸适配体与处理后待测样品进行共孵育，孵育结束后，流式检测或共聚焦成像。
实验例一
对核酸适配体A2的具体性能进行了进一步测定分析，相关实验过程及结果简介如下。
（一）A2与随机序列结合能力的区别
参考实施例1中的筛选富集监测方法，对实施例1中确定的A2及随机序列Random与细胞的结合能力进行进一步检测，流式检测结果如图3所示，从图3可以看出，与随机链Random进行对比，A2与KYSE410细胞结合的荧光强度显著升高，而与EC109细胞结合的荧光强度基本不变，说明A2能与KYSE410靶细胞特异性结合，这一结果说明我们筛选出的核酸适配体A2具有识别食管癌细胞KYSE410的能力，可以用于后续的实验。
（二）激光共聚焦实验的直观验证
将细胞传代至激光共聚焦培养皿中培养24h，用PBS洗涤两遍后，分别与250nM的Random、A2在结合缓冲液中于冰上孵育45min，孵育完成后，用PBS洗涤两次以去除未结合的Random、A2，随后进行共聚焦成像。
利用激光共聚焦显微镜（FV1000, Olympus，Japan）可以清晰显示和观察A2和对照链Random与KYSE410和EC109细胞结合情况，结果如图4所示。
分析可以看出，与Random相比，A2链与KYSE410细胞特异性结合，而不与EC109细胞结合。
（三）A2与KYSE410细胞解离常数Kd（即，A2的亲和力）测定
将KYSE410细胞与八个不同浓度（浓度梯度分别为：0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、500nM）的A2核酸适配体分别在4℃孵育45 min；孵育完成后使用流式细胞术对荧光值进行检测。
以流式细胞仪测出的Mean-FI值为纵坐标，浓度为横坐标，利用单点吸附方程Y=BmaxX/(Kd+X）模拟解离曲线，测出A2与靶细胞结合的平衡解离常数。
具体解离曲线图和Kd值结果如下（如图5所示）：
A2与KYSE410细胞结合拟合出的方程为Y=4183*X /（129.7+X），解离常数Kd值为129.7±30.5nM。
（四）A2结合温度考察
实验过程中，孵育温度也会对细胞与核酸适配体A2的结合情况构成直接影响，为此，发明人对A2与KYSE410细胞结合时的孵育温度进行了考察。
现有技术中（如前所示筛选富集过程），细胞与核酸适配体孵育时，通常是在4℃孵育以避免内吞现象的发生，本实验中，我们将细胞收集到离心管中后，加入核酸适配体A2，在4℃、25℃、37℃以及40℃条件下进行孵育，45min后离心洗去没有结合的A2，在流式细胞仪上测量荧光强度，计算出信背比。
对不同孵育温度（4℃、25℃、37℃及40℃）情况下流式细胞检测信背比结果进行作图，结果如图6所示。
可以看出，随着温度上升，A2与细胞结合的信背比整体有所下降，与4℃相比，在25℃、37℃、40℃，信背比分别下降了29%、14%、9%，尤其是在37℃下，A2仍与KYSE410细胞有较好的结合能力，这一结果表明，该核酸适配体具有活体应用的潜力。
（五）A2与不同细胞的结合特异性考察
选取一系列的食管癌细胞（KYSE410、KYSE150、EC109、TE-1、KYSE70、KYSE30）和肝癌细胞SMMC-7721、胃癌细胞HGC-27、肺癌细胞EBC-1、乳腺癌细胞MCF-7、结肠癌细胞LOVO以及正常食管上皮细胞HET-1A和肝细胞HL-7702，对A2的特异性进行考察，即将食管癌细胞和其他细胞于培养箱中培养，生长至90%时，用无酶消化液消化细胞，收集至离心管中，每种细胞都与A2于4℃孵育45min，离心后洗涤两次去除未结合的A2，使用流式细胞仪测定荧光强度并计算出信背比。
结果如图7所示，A2具有与食管癌细胞KYSE410、KYSE150和TE-1结合的能力，而A2与其他癌种细胞和正常细胞均无明显结合，结果表明所得A2核酸适配体具备较好的食管癌细胞特异性。
（六）A2与病人食管癌组织结合考察
以15对病人食管癌组织和癌旁组织为检测对象，以Cy5标记的A2为检测探针，Cy5标记的Random为对照探针，对A2与病人食管癌组织的检测能力进行考察，即将病人石蜡组织切片进行预处理，以修复抗原，然后与A2在结合缓冲液中于4℃孵育45min，用PBS洗涤两次去除未结合的A2，使用共聚焦显微镜进行成像检测，并利用ImageJ软件统计图像荧光值。
结果如图8所示，A2可明显地结合食管癌组织，而基本不结合癌旁组织，荧光值统计结果也显示A2染色的食管癌组织的荧光值显著高于癌旁组织以及对照链染色的组织，表明A2核酸适配体具备良好的病人食管癌组织检测能力，在食管癌的临床诊断应用中具有巨大的潜力。
实验过程中，所用细胞系均使用RIMP1640培养基（根据实验设计及需要，常规添加10%胎牛血清和/或100U/mL青霉素和/或链霉素），均在含5% CO2的培养箱中37℃条件下培养。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 郑州大学
<120> 一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC 40

Claims (2)

1.一种KYSE410肿瘤细胞的核酸适配体，其特征在于，为一段长度为40bp的核苷酸序列，具体如下：
A2序列：5’-CACCACGCGAATGCTATCGGGGCTAAGTATCAAAATGAGC-3’。
2.根据权利要求1所述的一种核酸适配体在制备肿瘤检测产品的应用，所述肿瘤为KYSE410细胞所致肿瘤。
CN202210081254.5A 2022-01-24 2022-01-24 一种核酸适配体及其在食管癌检测中的应用 Active CN114410638B (zh)

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