CN101148666A - 一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用，该核酸适配子包括DNA序列和RNA序列，它能与人乳腺癌组织特异性地结合。因此，本发明核酸适配子可以用来诊断人乳腺癌和用于人乳腺癌的靶向治疗。本发明中的核酸适配子对人乳腺癌具有高的特异性、亲和力，而对正常乳腺组织无反应。本发明还涉及所述核酸适配子序列的衍生序列，包括修饰后的序列。

Description

一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用

(一)技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(即系统进化指数富集技术)制备一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，以及所述核酸适配子衍生的序列和修饰序列用于乳腺癌的诊断和靶向治疗。

(二)背景技术：

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，据权威医学资料统计，全球每13分钟就有一人死于乳腺癌，乳腺癌已经成为严重威胁女性健康的重要疾病。随着国民经济发展和人民生活水平提高，我国乳腺癌的发病率和死亡率亦呈迅猛上升态势。中国抗癌协会的最新统计数字显示，中国妇女乳腺癌死亡率正在以每年3％的速度增长，成为城市中死亡率上升最快的癌症；乳腺癌在我国的发病率趋于年轻化；85％的患者到医院检查时已处于乳腺癌的中晚期，早期发现率极低。更加值得注意的是，乳腺癌可通过直接浸润、淋巴、血液等途径转移，其常见的转移部位依次为肺及胸膜、骨骼、皮肤软组织、肝、脑，好发血行转移是乳腺癌突出的生物学特征，这是本病治疗失败的主要原因所在，也是乳腺癌防治上一个非常棘手的难题，造成数百亿人民币的社会负担。鉴于以上情况，卫生部疾控司在全国范围内开展“百万妇女乳腺普查工程”，科学规范的乳腺筛查方案为其主要目的之一，以最终实现对妇女乳腺癌的早期发现、早期诊断和早期治疗，提高患者生活质量；因此乳腺癌诊治方法的研究对我国有着特殊而重要的社会意义，同时也形成了相关医药产品的巨大市场，蕴藏着不可估量的经济效益。

SELEX技术(即系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制/发展起来的一种新的组合化学技术，其运用大容量的随机寡核苷酸文库，结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得亲和力高、特异性强的核苷酸适配子(aptamers)。该技术已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肤/肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具许多优势：a.本身是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，节约成本。b.具有比抗体更高的亲和性和特异性。c.便于标记，可以在不同部位有选择性的标记。d.重复性好，稳定性好，易于保存，对高温和剧烈条件不敏感。因此，寡核苷酸适配子/SELEX技术具有良好的应用前景，特别是在抗体工程领域。消减SELEX技术是识别癌与非癌细胞间微小差异、筛选癌细胞特异性亲和适配子的有力工具。

研究发现，乳腺癌细胞和正常乳腺细胞有着不同的形态和结构，造成肿瘤细胞特征性形貌的分子基础可能是肿瘤细胞表面的特异分子、受体等，也可能是癌组织特异标志物，或同一蛋白分子的不同修饰状态或构象结构，这些特征不会因肿瘤的转移而丢失。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用，它利用分子生物学技术中的SELEX技术(即系统进化指数富集技术)采用消减-复合靶SELEX技术对乳腺癌组织和正常乳腺组织进行筛选，获得与乳腺癌细胞有特异亲和能力的核酸适配子，并通过对其核酸适配子特异靶标(肿瘤特异)的鉴定，发现肿瘤治疗新的药物作用靶点，由此可以构建乳腺癌特异的靶向药物和早期诊断试剂。

本发明的技术方案：一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，其特征在于其核苷酸序列选自：

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCAAAATACGCTGCTCTACTGGCTATCACTCTCGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCCCAGGCTATTTCCAACTAGCAGCAAGGATAAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCCTCCCAACCTATTCGCATTGCCCGACGTCAGCTACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCGGCTACACTGGTCAGGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTCATTCCACATGTTCTACACCCTAGCCCCGTAGACAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCATCACCGCGTCAGACAAAGACCCACAACACCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTACCCCCTATCACCTCAGTAAATGGGCAGTGTCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTTGCGCCCCCCTCTTTAAAGTCTCTCTACTGACCTGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGCCAGTACGTAACCTCGTCACTCTCCTTCGCCTCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTAACCCCACAACGCCAGACCTCGAAGGGACAACCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCACGCACCCTACGCAAAGACCGTTACCACGCCGAACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCCTCCCAACTGCCCCACGATACCCTCGATTAAGCACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

上述所说的核酸适配子，包括DNA序列和RNA序列，其序列的结构形式是下面12种二级结构之一。

上述所说的核酸适配子具有至少60％以上同源序列，且是具有相同功能的核酸适配子。

上述所说的核酸适配子，删除部分或增加部分核酸适配子残基，得到的具有相同功能的核酸适配子序列。

上述所说的核酸适配子，进行碱基取代或部分修饰后，得到具有相同功能的核酸适配子序列。

上述所说的核酸适配子有相应的衍生的核酸适配子序列。

上述所说的核酸适配子有相应的能与其序列进行杂交的核酸序列。

上述所说的核酸适配子通过对其核酸适配子肿瘤特异靶标的鉴定，发现肿瘤治疗新的药物作用靶点，由此构建乳腺癌特异的靶向药物和早期诊断试剂。

本发明中用于SELEX(即系统进化指数富集)筛选的单链DNA随机文库及引物由invitrogen公司合成，两端为固定序列，中间为35个碱基的随机序列：5′-ATCCGCCTGATTAGCGATACT-(N35)-ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGG GG-3′，库容量为10¹⁵，引物1：5′-ATCCGCCTGATTAGCGATACT-3′，引物2：5′-biotin-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3′，引物3：5′-biotin-ATCCGCCTGATTA GCGATACT-3′，引物4：5′-CCCCTGCAGGTGATTTTGCTCAAGT-3′。人乳腺癌组织来源于医院确诊乳腺癌病人病人病理组织切片，核酸适配子的纯化试剂购于宝生物公司，PCR试剂盒、链霉亲和素磁珠与pGEM^-T载体购于Promega公司。

一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子的制备方法，它是筛选和鉴定核酸适配子的技术路线，包括以下步骤：

(1)ssDNA随机核酸文库的制备——利用消减SELEX方法进行筛选；

(2)扩增与人乳腺癌组织特异结合的核酸适配子——进行下一轮筛选；

(3)不少于12轮筛选后获得目的核酸适配子序列；

(4)克隆测序；

(5)与人乳腺癌组织的特异结合活性检测。

本发明的优越性在于：1、本发明采用的技术可以高通量的筛选与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的一组核酸适配子；2、核酸适配子具有比抗体不可比拟的优势，如体外筛选、合成，易于标记、稳定性高等优点；3、所获得的针对人乳腺癌组织的核酸适配子通过对其核酸适配子肿瘤特异靶标的鉴定，可以发现肿瘤治疗新的药物作用靶点，由此用于人乳腺癌的靶向治疗的乳腺癌特异靶向药物和人乳腺癌临床诊断的早期诊断试剂。

(四)附图说明：

附图1为本发明所涉一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用中的核酸适配子T载体阳性克隆的质粒琼脂糖凝胶电泳图(如图所示：在分子量3000bp左右有明显的质粒条带，而且以超螺旋为主)。

附图2为本发明所涉一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用中的质粒PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图(我们的目标条带的分子量大小为81bp，如图所示有分子量为81bp的目标条带，将有目标条带的阳性克隆进行测序)。

附图3为本发明所涉一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用中的核酸适配子的特异性鉴定结果(如图所示：空白对照的病理切片上没有棕黄色颗粒的出现，而乳腺癌组织切片上的乳腺癌变部位显示明显的棕黄色颗粒，表明我们筛选得到的DNA适配子与人乳腺癌组织有特异反应)。

附图4为本发明所涉一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用中的获得的一个核酸适配子的检测乳腺癌的结果(如图所示：空白对照组无明显棕黄色沉淀，而乳腺癌组织显示明显的棕黄色沉淀，表明筛选得到的核酸适配子能与乳腺癌组织特异结合，从而在临床上可用于乳腺癌的检测和诊断。

(五)具体实施方式：

实施例1：体外筛选与人乳腺癌特异结合的核酸适配子

利用引物1、引物2扩增单链DNA文库：引物1和引物2的浓度为100pmol，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性40s，65℃退火1min，72℃延伸2min，循环30次，最后72℃延伸7min。将扩增5’端带有生物素标记的dsDNA产物与链酶亲和素磁珠结合，室温30min，然后用0.15mol/L的NaOH作用15min使dsDNA变性解链，磁分离得到ssDNA，将ssDNA于95℃作用5min，于冰中2min，室温放置10min，既为ssDNA文库。病理切片常规脱蜡至水，将制备ssDNA文库与正常乳腺组织反筛后，与人乳腺癌组织孵育。用洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，4mol/L异硫氰酸呱，1mmol/L DTT)将ssDNA从人乳腺癌组织上洗脱下来，用作扩增的模板，进行下一轮筛选。共进行12轮筛选以便得到预期具有高亲和力的寡聚核苷酸。

以第12轮筛选所得文库为模板，以引物1和引物4进行PCR，琼脂糖电泳后回收81bp处片断，与T载体4℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂板(Amp+，IPTG诱导，X-gal为底物)，37℃培养16h后，挑取单克隆白斑，置Amp+液体培养基摇菌过夜，提取质粒，如图1所示质粒电泳图。以质粒为模板，以引物1，引物4扩增，如图2所示在81bp左右处有扩增出的目标条带，将有目的条带的阳性克隆进行序列测定。

以第12轮筛选所得文库为模板，以引物3和引物4进行不对称PCR，反应产物主要为5’生物素标记的DNA适配子于95℃作用5min，于冰中2min，室温放置10min，人乳腺癌病理切片常规脱蜡至水，3％H₂O₂作用20min封闭内源性过氧化物酶，PBS洗5min，与制备好DNA适配子室温孵育1h，PBS洗3×5min。切片与辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育30min，DAB显色，镜下观察并照相，如图3所示：空白对照的病理切片上没有棕黄色颗粒的出现，而乳腺癌组织切片上的乳腺癌变部位显示明显的棕黄色颗粒。

实施例2：体外筛选与人乳腺癌特异结合的核酸适配子

利用引物1、引物2扩增单链DNA文库：采用不对称PCR，引物1/引物2浓度比100∶1，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，65℃退火45s，循环35次，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。将获得的产物主要为ssDNA，于95℃作用3min，于冰中2min，室温放置10min，既为ssDNA文库。乳腺癌病理切片常规脱蜡至水，将制备ssDNA文库与正常乳腺组织反筛后，与人乳腺癌组织孵育。用洗脱缓冲液(20mmol/LTris-HCl，4mol/L异硫氰酸呱，1mmol/L DTT)将ssDNA从人乳腺癌组织上洗脱下来，用作扩增的模板，进行下一轮筛选。共进行12轮筛选以便得到预期具有高亲和力的寡聚核苷酸。

以第12轮筛选所得文库为模板，以引物1和引物4进行PCR，3％琼脂糖凝胶电泳后回收81bp处目的片断，与T载体4℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，涂板(Amp⁺，IPTG诱导，X-gal为底物)，37℃培养18h后，挑取单克隆白斑，置Amp⁺液体培养基摇菌16h，提取质粒以质粒为模板，以引物1，引物4扩增，在81bp左右处有扩增出的目标条带，将有目的条带的阳性克隆进行序列测定。

以第12轮筛选所得文库为模板，以引物3和引物4进行不对称PCR，引物3/引物4浓度比100∶1反应产物主要为5’生物素标记的DNA适配子于95℃作用5min，于冰中2min，室温放置10min备用。人乳腺癌病理切片常规脱蜡至水，设立空白对照组，0.3％H₂O₂-甲醇溶液作用20min封闭内源性过氧化物酶，TBS洗5min，与制备好DNA适配子室温孵育1h，TBS洗3×5min。切片与辣根过氧化物酶标记的亲和素孵育30min，DAB显色，镜下观察，空白对照组无明显棕黄色沉淀，而乳腺癌组织显示明显的棕黄色沉淀，表明筛选到的核酸适配子与乳腺癌组织特异结合。

实施例3：筛选的核酸适配子用于乳腺癌的检测

以筛选的所测序列为ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCGGCTACACTGGTCAGGGACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG阳性克隆质粒为模板，以引物3和引物4进行不对称PCR，引物3(100pmol)/引物4浓度比200∶1，扩增条件为：94℃预变性3min，然后94℃变性30s，65℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸7min，。将获得的产物主要为biotin-ssDNA，于95℃作用3min，于冰中2min，室温放置10min，作为检测试剂备用。人乳腺癌病理切片常规脱蜡至水，设立空白对照组，0.3％H₂O₂-甲醇溶液作用30min封闭内源性过氧化物酶，TBS洗5min，与制备好DNA适配子室温孵育1h，TBS洗3×5min。切片与辣根过氧化物酶标记的亲和素(1∶1000稀释)孵育30min，DAB显色液(50mg溶于100ml TB液中，临用前加入10μl 30％H₂O₂)中显色5-10min，镜下观察控制显色程度。如图4所示：空白对照组无明显棕黄色沉淀，而乳腺癌组织显示明显的棕黄色沉淀，表明筛选得到的核酸适配子能与乳腺癌组织特异结合，从而在临床上可用于乳腺癌的检测和诊断。

Claims (9)

1.一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，特征在于其核苷酸序列选自：

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCAAAATACGCTGCTCTACTGGCTATCACTCTCGGA

    CTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCCCAGGCTATTTCCAACTAGCAGCAAGGATAAA

    CTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTGCCTCCCAACCTATTCGCATTGCCCGACGTCAGCTA

    CTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTGACTCCCTCCATCTTCCCGGCTACACTGGTCAGGGA

    CTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTCATTCCACATGTTCTACACCCTAGCCCCGTAGACAAC

    TTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTTCCCATCACCGCGTCAGACAAAGACCCACAACACC

    ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTACCCCCTATCACCTCAGTAAATGGGCAGTGTCCGA

    ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTTGCGCCCCCCTCTTTAAAGTCTCTCTACTGACCTGA

    CTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTGGCCAGTACGTAACCTCGTCACTCTCCTTCGCCTC

    ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTAACCCCACAACGCCAGACCTCGAAGGGACAACCGA

    ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCACGCACCCTACGCAAAGACCGTTACCACGCCGA

    ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

●  ATCCGCCTGATTAGCGATACTCCCTCCCAACTGCCCCACGATACCCTCGATTAAGC

    ACTTGAGCAAAATCACCTGCAGGGG

2.根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，其特征在于它包括DNA序列和RNA序列，其其序列的结构形式是下面12种二级结构之一。

3.根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子具有至少60％以上同源序列，且是具有相同功能的核酸适配子。

4.根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子，删除部分或增加部分核酸适配子残基，得到的具有相同功能的核酸适配子序列。

5.根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子，进行碱基取代或部分修饰后，得到具有相同功能的核酸适配子序列。

6.根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子有相应的衍生的核酸适配子序列。

7.根据权力要求1所述的一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子，其特征在于所说的核酸适配子有相应的能与其序列进行杂交的核酸适配子序列。

8.一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子的应用，其特征在于所说的核酸适配子通过对其核酸适配子肿瘤特异靶标的鉴定，发现肿瘤治疗新的药物作用靶点，由此构建乳腺癌特异的靶向药物和早期诊断试剂。

9.一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子的制备方法，它是筛选和鉴定核酸适配子的技术路线，包括以下步骤：

(1)ssDNA随机核酸适配子库的制备——利用消减SELEX方法进行筛选；

(2)扩增与人乳腺癌组织特异结合的核酸适配子——进行下一轮筛选；

(3)不少于12轮筛选后获得目的核酸适配子序列；

(4)克隆测序；

(5)与人乳腺癌组织的特异结合活性检测。

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