CN102732606A - 基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒，由下列独立包装的组分组成：肝癌核酸适配子溶液；聚丙烯酰胺凝胶母液；过硫酸铵；四甲基二乙胺；50%甘油溶液I；50%甘油溶液II；1.25M氯化钠溶液；GelRed染料溶液；阳性对照血清；阴性对照血清。本发明的试剂盒具有如下特点：（1）诊断价值大，敏感度、特异度和准确度达到85%左右；（2）简便实用，只需常规的垂直电泳及凝胶图像分析系统即可完成；（3）成本低廉，附加值高。肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一，将本试剂盒投入临床应用，不但用量大，而且能有效提高肝癌的诊断水平，产生良好的经济效益和社会效益，应用前景良好。

Description

基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒

技术领域

本项发明属医学诊断技术领域。 

背景技术

原发性肝癌（下称肝癌）是常见恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年上升趋势。近年来肝癌的治疗手段有了长足的进步，但是5年生存率仍不理想。据国内大样本多中心临床资料统计显示，住院肝癌患者的5年生存率只有32.5%，晚期肝癌1年生存率仅14.7%，3年生存率为0.3%，5年生存率为0，而早期肝癌患者及时治疗后，1、3、5 年生存率分别达到93.5 %、70.1 %和59.1 %。因此，尽早诊断并尽早治疗是目前改善肝癌患者预后最有效的手段，探索并建立有效的肝癌诊断新技术具有十分重要的意义。 

目前影像学检查是肝癌定位诊断的主要手段，血清标志物检测是肝癌定性诊断主要的手段。影像学诊断肝癌后，还需要进一步检测肝癌血清标志物进行印证，对于像影学诊断困难的小肝癌，标志物检测是唯一的无创性诊断手段。甲胎蛋白（AFP）是目前全世界应用最广泛的肝癌血清标志物，已经用了数十年，但其敏感性（40%~65%）、特异性（76%~96%）并不理想。因此，寻找更加敏感、更加特异的肝癌诊断新方法一直是各国学者的研究热点。 

核酸适配子（aptamer）是一种生物靶分子的人工单链寡核苷酸配体，通过SELEX（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）技术从随机单链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子筛选的基本步骤如下：设计并合成随机单链寡核苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核苷酸与靶标形成复合物，分离复合物并洗脱寡核苷酸，以洗脱的寡核苷酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育-分离-扩增，与靶标高特异性和高亲和力结合的核酸序列将留在文库中并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克隆、测序，长度及两端序列与文库相符的单链寡核苷酸序列即为核酸适配子；测定各核酸适配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于靶标的检测分析。 

核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点：①高特异性和高亲和力：核酸适配子能够分辨出靶分子结构上的细微差别，亲和力可强于天然配体；②靶标广泛：从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选核酸适配子的靶标；③稳定性好：核酸适配子可长期保存，人工合成而无批间差异，可在常温下运输；④改建和修饰容易：可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换；⑤应用优势：核酸适配子无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。 

核酸适配子在人类疾病的诊断方面显示出良好的应用前景。Golden等用核酸适配子检测碱性成纤维生长因子（bFGF），其敏感性高于商业化ELISA试剂盒近20倍，且特异性良好。Liu等用核酸适配子纳米传感器可以快速、敏感、特异地检出循环血液中的肿瘤细胞。McCauley等研制出核酸适配子传感器阵列，能特异且定量检测出与血清或细胞提取物混合的3种肿瘤标志物。Hicke等用放射性核素标记黏韧素-C的核酸适配子，成功应用于人胶质母细胞瘤和乳腺癌动物模型的肿瘤显像。 

外周血标本具有易采集、侵入性小、易重复等优点，是目前疾病的临床诊断中应用最广泛的检材。筛选肝癌血清特异的核酸适配子，籍于其在诊断应用方面的优势，建立更为特异和敏感的以血清标本为检材的肝癌诊断方法，研发出基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒，应用于肝癌的临床诊断，对于提高肝癌的诊疗水平具有十分重要的价值。 

发明内容

本发明的目的：研发一种以核酸适配子为探针、血清为标本的肝癌诊断试剂盒，为肝癌的临床诊断、疗效评估和预后判断提供新方法。 

本发明采用的技术方案：通过SELEX技术筛选肝癌血清特异性核酸适配子，采用常规聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度测定方法进行基于核酸适配子的血清分析，优选出诊断肝癌敏感性和特异性俱佳的核酸适配子，采用正交试验进一步优化实验条件，最终研发出基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒。 

本发明的技术原理：肝癌血清核酸适配子因能特异性结合肝癌血清，当其与血清标本反应时，与肝癌血清结合者明显多于非肝癌血清，而不与肝癌血清结合的游离者则明显少于非肝癌血清。将核酸适配子与血清的反应物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，因结合和游离的核酸适配子泳动速度不同，核酸染色后在凝胶上可显示出结合核酸适配子带和游离核酸适配子带。与结合核酸适配子带相比，游离核酸适配子带带型整齐，背景单纯，其强弱在一定范围内与核酸适配子量呈线性关系，因而通过目测游离适配子带的强弱可定性观察肝癌与非肝癌血清标本之间的差异，通过凝胶分析软件测定游离适配子带的灰度值可定量检测肝癌与非肝癌血清标本之间的差异，从而对肝癌作出诊断。 

本试剂盒的研发步骤和主要结果如下。 

a. 收集受试者的血清标本：收集诊断明确的肝癌、肝硬化、乙型肝炎及正常人的外周血标本并分离血清。随机选取10~20例肝癌血清标本等量混合制备肝癌混合血清，同法制备正常混合血清。 

b. 筛选肝癌血清核酸适配子：设计并合成随机单链寡核酸文库[5′-ACC GAC CGT GCT GGA CTC T（N40）ACT ATG AGC GAG CCT GGC G-3′]及其配套的引物（上游引物：5′-ACC GAC CGT GCT GGA CTC T-3′；下游引物：5′-CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3′）；将文库与步骤a制备的正常混合血清孵育，分离纯化不与血清结合的游离核酸并进行不对称PCR扩增，制备出新文库用于下一轮筛选；将第3轮筛选后制备的文库与步骤a制备的肝癌混合血清孵育，分离纯化与血清结合的核酸并进行不对称PCR扩增，制备出新文库用于一下轮筛选；以第9轮筛选后制备的文库为模板进行对称PCR扩增，将扩增产物送生物工程公司克隆、测序，分离出单个核酸适配子；应用RNA Structure 4.6软件模拟分析各核酸适配子的二级结构，应用Clustal X软件对各适配子进行同源性分析和家族划分，从各家族中选出代表性核酸适配子；采用聚丙烯酰胺凝胶电泳及灰度分析技术分别测定各代表性适配子与肝癌混合血清和正常混合血清的结合程度，优选出与肝癌混合血清特异性结合最佳的核酸适配子AP-HCS-9-90用于试剂盒研发，其核酸序列为5′-ACC GAC CGT GCT GGA CTC TTG ACT GCT TGA GAG TGA TAG CTT CAC TCG CTA TAG TTT GGA GTA TGA GCG AGC GTT GCG-3′。 

c. 合成肝癌血清核酸适配子：将步骤b优选出的肝癌血清核酸适配子AP-HCS-9-90送生物工程公司合成，用结合缓冲液配制成核酸适配子溶液。 

d. 确定核酸适配子的合适用量：将步骤c配制的核酸适配子溶液配成最低量为2pmol的等差梯度溶液，上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，采集紫外滤光图像并使用凝胶分析软件测定核酸适配子带的灰度，以灰度值保持在线性范围内的最大摩尔量确定为核酸适配子的合适用量。 

e. 确定血清的合适用量：以步骤d确定的核酸适配子合适用量分别与最低量为2μl的等差梯度体积的肝癌混合血清混合孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，并采集紫外滤光图像。凝胶图像上可见结合核酸适配子带和游离核酸适配子带，使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度，以灰度值保持在线性范围内的最小灰度值者所对应的标本体积确定为血清的合适用量。 

f. 优化核酸适配子和血清用量：以步骤d确定的核酸适配子合适用量和步骤e确定的血清合适用量为中心，上下各增加一个单位，设计两因素3水平正交实验表。根据正交表，每种实验条件同步进行核酸适配子与肝癌混合血清和正常混合血清混合孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，并采集紫外滤光图像，使用凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度，计算每种实验条件下正常混合血清与肝癌混合血清的游离核酸适配子带灰度比值。重复实验3次，汇总数据进行统计分析，确定核酸适配子和血清的优化用量。 

g. 标本检测及灰度测定：以步骤f确定的核酸适配子和血清的优化用量为条件，将核酸适配子分别与肝癌、肝硬化、乙型肝炎和正常人的血清标本混匀后孵育，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和核酸染色，采集紫外滤光图像。用凝胶分析软件打开所采集的图像，以约23.0mm×11.5mm的矩形框选各标本的游离核酸适配子带，获取所框条带的灰度（INT）、平均灰度（INT/mm²）及其标准差、平均背景（INT/mm²），并计算出变异系数（标准差/平均灰度）、平均净灰度（平均灰度－平均背景）、平均信噪比（平均灰度/平均背景）。冻存核酸适配子游离带几乎消失的肝癌血清标本和核酸适配子游离带浓密且带型整齐的非肝癌血清标本，用作阳性对照血清和阴性对照血清，供装配试剂盒时所用。 

h. 诊断价值分析：将步骤g测定和计算的各标本的灰度相关指标（灰度、平均灰度、标准差、平均背景、变异系数、平均净灰度、平均信噪比）进行多因素二值Logistic逐步回归分析，建立Logistic回归方程，求得各标本的组别概率预测值。以概率预测值为指标进行受试者工作特征（ROC）曲线分析，观察曲线下面积（AUC）的大小并确定最佳诊断界值，以最佳诊断界值计算核酸适配子诊断肝癌的敏感度、特异度、准确度、预测值和似然比。 

共检测219例标本，其中肝癌106例，非肝癌113例（肝硬化35例，乙型肝炎43例，正常人35例）。根据检测结果建立的Logistic回归方程为Logit(P)= 5.001－1.880×平均灰度－11.286×变异系数＋7.161×平均信噪比，据方程换算得出的组别概率预测值的AUC达0.939（图1），以≥0.5为诊断界值，诊断肝癌的敏感度为84.9%、特异度为85.8%、准确度为85.4%、阳性预测值为85.8%、阴性预测值为84.9%、阳性似然比为5.69、阴性似然比为0.17，显示出良好的诊断效果。 

若选用不同的诊断界值（表1），可满足不同的诊断需求。例如，某标本的P值为0.891，＞0.5，诊断为肝癌，根据表1，当P≥0.884，特异度为100%，即误诊率为0，故该标本诊断为肝癌理论上100%可靠。又如，某标本的P值为0.157，＜0.5，诊断为非肝癌，根据表1，当P＜0.201，肝癌漏诊率为5.7%，故该标本诊断为非肝癌理论上可靠性达94.3%以上。 

  

表1 不同诊断界值时肝癌血清核酸适配子对肝癌的诊断价值

  

将肝癌与非肝癌各亚组的游离核酸适配子带的平均灰度、变异系数和平均信噪比分别进行多因素Logistic回归分析，以所建方程换算的组别概率预测值为指标进行ROC曲线分析，AUC分别为0.950（肝癌vs肝硬化）、0.955（肝癌vs乙型肝炎）和0.907（肝癌vs正常血清）。

若以单项指标进行单因素Logistic回归分析，建立回归方程并换算出组别概率预测值，再进行ROC曲线分析，对肝癌的诊断效率低于多因素分析（表2）。 

 表2 肝癌血清核酸适配子游离带灰度相关的单项指标分析对肝癌诊断价值 

 

注：各项单指标的诊断界值均为≥0.5诊断为肝癌。

i. 试剂盒的组装：将上述使用核酸适配子检测血清标本各步骤中的有关试剂进行独立包装，组装成试剂盒。试剂盒可按不同规格进行组装。以配制10块8.3×7.3×1.0mm聚丙烯酰胺凝胶、检测100人份血清（包括阳性和阴性对照）为例，试剂盒中各独立包装的组分及其数量如下： 

（1）核酸适配子溶液550μl；

（2）聚丙烯酰胺凝胶母液26ml；

（3）过硫酸铵10mg（10mg×10）；

（4）四甲基二乙胺（TEMED）55μl；

（5）50%甘油溶液I 13ml；

（6）50%甘油溶液II 300μl；

（7）1.25M氯化钠溶液50ml；

（8）GelRed染料溶液160μl；

（9）阳性对照血清55μl；

（10）阴性对照血清55μl。

上述试剂中过硫酸铵为分析纯的市售固体试剂，使用前用蒸馏水配成10%的溶液，其他组分均为配制好的即用型试剂。50%甘油溶液I用蒸馏水配制而成，50%甘油溶液II用结合缓冲液配制而成。 

j. 试剂盒的诊断价值验证：收集临床确诊的肝癌、肝硬化、乙型肝炎和正常人的外周静脉血标本，分离血清备测。准备检测所需的自备试剂（蒸馏水、5×TBE）和仪器设备（垂直电泳系统、凝胶图像采集和分析系统），然后根据试剂盒使用流程（图2），完成血清标本检测：使用试剂盒中的有关试剂组分及自备试剂制备含10%甘油的12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（以BioRad Mini-PROTEAN Tetra电泳槽为例，灌制一块8.3×7.3×1.0mm聚丙烯酰胺凝胶需配制凝胶液6ml，包含聚丙烯酰胺凝胶母液2.4ml，蒸馏水1.745ml，50%甘油溶液Ⅰ1.2ml，5×TBE 0.6ml，新鲜配制的10%过硫酸铵溶液50μl，TEMED 5μl），并装配好垂直电泳系统；取5μl核酸适配子溶液加热变性后与5μl血清混合，4℃孵育30min；上样电泳，200V，30min；取下凝胶于GelRed染液中室温下染色10min；紫外光下观察结果，并采集紫外滤光图像；凝胶分析软件测定游离核酸适配子带的灰度、平均灰度及其标准差、平均背景，并计算变异系数、平均信噪比，将有关指标的具体数值带入方程Logit(P)= 5.001－1.880×平均灰度－11.286×变异系数＋7.161×平均信噪比，求出Logit(P)值后代入方程P=[e^logit(P)]/[1+e^logit(P)]求出组别概率预测值，当P≥0.5时判为肝癌，否则为非肝癌。 

k. 试剂盒及检测操作的质控：紫外光下观察凝胶中的阳性血清对照和阴性血清对照的游离核酸适配子带，若阳性血清对照条带微弱近于消失且阴性血清对照条带浓密，两者差异明显，则可定性判断试剂盒质量及实验操作可靠。测定游离核酸适配子带的灰度，获取上述灰度相关指标，代入上述Logistic回归方程，获取阳性血清对照和阴性对照的组别概率预测值，如前者P≥0.5，后者P＜0.5，则可定量判断试剂盒质量及实验操作可靠。 

其中上述步骤中所述的血清标本为空腹状态下抽取受试者的非抗凝外周静脉血，自然凝固后常规离心分离的血清成分。 

其中上述步骤中所述的核酸染色为使用核酸染料对凝胶中的核酸适配子进行染色，优选使用GelRed染料。 

其中上述步骤中所述的采集紫外滤光图像是在紫外透射仪上借助其紫外滤光照相附件和数码相机拍摄数码图像，或通过凝胶电泳分析系统采集图像。 

其中上述步骤中所述的Logistic回归分析通过统计软件（如SPSS）完成，因变量为结果变量（诊断），自变量为灰度相关指标。 

其中上述步骤中所述的受试者工作特征（ROC）曲线分析通过统计软件完成，因变量为结果变量（诊断），自变量为单项灰度相关指标（单因素分析）或根据Logistic回归方程计算结果换算的标本组别概率预测值（多因素分析）。 

本发明的有益效果：本发明以通过SELEX技术筛选出的肝癌血清特异性核酸适配子为分子探针，以非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和灰度分析技术定量测定核酸适配子与肝癌和非肝癌临床血清标本的结合程度，以Logistic回归分析建立多指标诊断模型，通过优化实验条件和诊断模型，研发出基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒，对肝癌具有良好的诊断价值。本发明公开的试剂盒具有如下特点：（1）诊断价值大，敏感度、特异度和准确度达到85%左右；（2）简便实用，只需常规的垂直电泳及凝胶图像分析系统即可完成，不涉及昂贵仪器设备和复杂的实验技术，一般的医疗机构均能使用；（3）成本低廉，附加值高，核酸适配子人工合成简单，其他试剂均为市售常用试剂，每人份成本价在4元以内，如以目前血清AFP检测的收费标准（80元/人份）定价，试剂盒的附加值可达1500%；（4）效益良好，肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，将本试剂盒投入临床应用，不但用量大，而且能有效提高肝癌的诊断水平，将产生良好的经济效益和社会效益。总而言之，本试剂盒具有良好的应用前景。 

附图说明

图1为根据核酸适配子检测219例肝癌与非肝癌血清标本的结果建立的Logistic回归方程换算出的组别概率预测值的ROC曲线图。 

图2 为基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒的使用流程图。 

图3为使用Quantity One凝胶分析软件测定核酸适配子游离带灰度时使用矩形工具框选的目标条带。 

图4~图7为使用本试剂盒检测临床血清标本的聚丙烯酰胺电泳及核酸染色结果图。图中泳道“＋”为阳性血清对照，泳道“－”为阴性血清对照，泳道1~32为血清标本，其中泳道1、7、12、14、19、26、28、31为肝癌血清标本，泳道3、6、10、17、20、22、24、29为肝硬化血清标本，泳道2、9、13、16、18、21、25、30为乙型肝炎血清标本，泳道4、5、8、11、15、23、27、32为正常血清标本。 

具体实施方式

以下通过使用本试剂盒进行临床血清标本的检测过程，对本发明作进一步说明。 

一、临床标本收集。 

收集就诊于南昌大学第一附属医院的诊断明确的原发性肝癌、肝硬化、乙型病毒性肝炎患者以及参加健康体检的正常健康人的外周静脉血非抗凝标本，自然凝固后常规离心分离血清备测。 

上述4种受试者的诊断标准如下。 

原发性肝癌：符合下列条件之一：（1）血清AFP>400μg/L，影像学检查发现肝占位性病变并诊断为原发性肝癌，排除妊娠、生殖系肿瘤及转移性肝癌等；（2）血清AFP<400μg/L，两种影像学检查发现肝占位性病变并诊断为原发性肝癌，排除妊娠、生殖系肿瘤及转移性肝癌等；（3）手术和/或病理组织学证实为原发性肝癌。 

肝硬化：符合下列条件（1）~（3）和/或（4）：（1）可有病毒性肝炎、长期饮酒、血吸虫感染等相关病史；（2）有肝功能减退的临床表现及实验室检查结果；（3）有门脉高压症的临床表现及医学影像学检查结果；（4）肝活检见假小叶形成。 

乙型病毒性肝炎：符合下列全部条件：（1）HBsAg阳性；（2）有肝炎的临床表现，肝功能检查符合肝炎改变；（3）排除肝硬化、肝癌、消化道肿瘤。 

正常人：肝功能、肾功能、血糖、血脂均正常，乙肝表面抗原和HCV抗体阴性，肿瘤标志物AFP、CEA、CA19-9均在正常范围，B超肝、胆、脾、双肾未见异常，胸片、心电图正常。 

二、标本检测与结果判读。 

以下以制备一块凝胶检测10个血清标本（含阳性、阴性血清对照）为例介绍试剂盒的使用步骤。 

1、自备适量双蒸水、5×TBE。 

2、取过硫酸铵1支，加入100μl蒸馏水溶解，即配即用，用后弃去。 

3、取三角烧瓶1个，依次加入聚丙烯酰胺凝胶母液2.4ml，蒸馏水1.745ml，50%甘油溶液Ⅰ1.2ml，5×TBE 0.6ml，上述新鲜配制的过硫酸铵溶液50μl，TEMED 5μl，混匀后立即注入胶模（与BioRad Mini-PROTEAN Tetra电泳槽配套），插入10孔梳子，室温下静置60min以上待胶液凝固。凝固完好后将胶模装配于上述垂直电泳槽中，加入适量的0.5×TBE，冲洗加样孔，200V预电泳15min。 

4、取0.5ml的Ependorf离心管10只，各加入核酸适配子溶液5μl，95℃加热5min，取出立即置冰浴5min。 

5、各管依次加入5μl阳性对照血清、阴性对照及待测血清标本，振荡混匀，瞬时离心，置4℃孵育30min。 

6、各管分别加入50%甘油溶液Ⅱ2.5μl，振荡混匀，瞬时离心，用微量注射器上样于上述聚丙烯酰胺凝胶加样孔中，接通电源，200V电泳30min。 

7、取下凝胶，置φ14.7cm培养皿中，加50ml蒸馏水洗涤一次，弃去蒸馏水，加入核酸染液（取1.25M氯化钠溶液4ml，加入46ml蒸馏水，15μl核酸染液，混匀）中室温下染色10min，弃去染液，加50ml蒸馏水洗涤一次。 

8、开启紫外透射仪电源预热1~2min，将凝胶移置紫外透射仪上，紫外光下观察，阳性血清对照应有微弱的游离核酸适配子带，而阴性血清对照应有浓密的游离核酸适配子带，否则实验不成功。 

9、如果实验成功，则通过紫外透射仪的紫外滤光照相配件，用具有手动功能的数码相机拍摄紫外滤光照片，光圈置于最大，调整曝光时间，以阳性血清对照的条带微弱可见为标准。 

10、在Quantity One 4.6.2凝胶分析软件中打开上述紫外滤光照片。如果照片倾斜用软件的“Image-Rotate-Custom Rotation”功能将其调正。如果打开图像时呈“条带白、背景黑”模式，采用“Image-Invert Data”功能将其变为“条带黑、背景白”模式。适当放大图像，用矩形工具框选第一泳道的游离核酸适配子带，将矩形框调整为23.0mm×11.5mm左右，并通过“拷贝-复制”矩形框的方式框选其余泳道的核酸适配子游离带（图3）。打开“Volume-Volume Analysis Report”功能，在“Volume Objects To Report”选项栏中勾选“All objects”；在“Data to Display”选项栏中勾选“Name”、“Volume”、“Mean Value”、“Std Deviation”、“Mean Background”；在“Background Subtraction Method”选项栏中勾选“Local”；点击“Done”按钮，读取相关数据并导入Microsoft Excel电子表中，并计算变异系数和平均信噪比。 

11、将各标本游离适配子带的平均灰度、变异系数和平均信噪比代入下列方程：Logit(P)＝5.001－1.880×平均灰度－11.286×变异系数＋7.161×平均信噪比，求出各标本的Logit(P)值。 

12、将各标本的Logit(P)值分别代入下列方程：P=[e^logit(P)]/[1+e^logit(P)]，求出各标本的组别概率预测值P，如果P≥0.5，判为肝癌，否则为非肝癌。 

三、试剂盒诊断效果验证分析 

使用本试剂盒检测了连续收集的肝癌、肝硬化、乙型肝炎患者和正常人的血清标本共32例（每类受试者8例），检测结果见表3。

目测4块凝胶的阳性对照血清均可见微弱游离核酸适配子带，阴性对照血清均有浓密的游离核酸适配子带（图4~图7）；4块凝胶的阳性对照血清的灰度值相近，且概率值P均≥0.7，而4块凝胶的阴性对照血清的灰度值也相近，且概率值P均≤0.1，表明检测符合质量控制要求（表3）。 

32例血清标本的检测结果显示，8例肝癌血清标本中有7例P值≥0.5（0.852~0.976），只有1例＜0.5（0.410），24例非肝癌血清标本中，23例P值＜0.5（0.001~0.243），只有1例≥0.5（0.531），总准确度为93.8%。表明本试验盒对肝癌有良好的诊断价值。 

表3 基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒对肝癌诊断效果的验证分析 

注：*为错判标本 。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  南昌大学

 

<120>  基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒

 

<130> 

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  78

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

accgaccgtg ctggactctt gactgcttga gagtgatagc ttcactcgct atagtttgga     60

 

gtatgagcga gcgttgcg                                                   78

Claims (2)

1.一种基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒，其特征在于试剂盒由下列独立包装的组分组成：

（1）肝癌核酸适配子溶液；

（2）聚丙烯酰胺凝胶母液；

（3）过硫酸铵；

（4）四甲基二乙胺（TEMED）；

（5）50%甘油溶液I；

（6）50%甘油溶液II；

（7）1.25M氯化钠溶液；

（8）GelRed染料溶液；

（9）阳性对照血清；

（10）阴性对照血清；

所述的50%甘油溶液I用蒸馏水配制而成，50%甘油溶液II用结合缓冲液配制而成。

2.根据权利要求1所述的肝癌诊断试剂盒，其特征在于：所述的肝癌核酸适配子序列为：5′-ACC GAC CGT GCT GGA CTC TTG ACT GCT TGA GAG TGA TAG CTT CAC TCG CTA TAG TTT GGA GTA TGA GCG AGC GTT GCG-3′。

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