CN101773677A - 一种活体肿瘤显像靶分子及其特异性探针 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子显像领域，公开了一种活体肿瘤显像靶分子及其特异性探针。该靶分子是在肿瘤细胞中异常表达的精子蛋白17(Sp17)，该特异性探针由靶向剂和示踪剂组成，其靶向剂是能与Sp17特异性结合的单克隆抗体，其示踪剂是荧光染料或放射性核素。该探针能与活体肿瘤特异性结合，显像效果好，稳定性好，在制备肿瘤分子显像诊断试剂中有良好的应用前景。

Description

一种活体肿瘤显像靶分子及其特异性探针
技术领域
本发明属于分子影像学领域，涉及一种活体肿瘤显像靶分子及其特异性探针。
背景技术
分子影像学(molecular imaging)是运用影像学手段显示器官水平、组织水平和细胞水平的特定分子，反映活体状态下分子水平变化，对其生物学行为在影像方面进行定性和定量研究的科学。分子影像学是近年来分子生物学和细胞生物学技术空前发展，以及转基因动物模型、新兴而高效的成像探针和药物的应用的结果，是将分子生物学技术和现代医学影像学相结合而产生的一门新兴的边缘学科。经典的影像诊断(CT、MRI等)主要显示的是一些分子改变的终效应，具有解剖学改变的疾病；而分子影像学通过发展新的工具、试剂及方法，探查疾病过程中细胞和分子水平的异常，在尚无解剖学改变的疾病前检出异常，为探索疾病的发生、发展和转归，评价药物的疗效，为分子水平疾病的治疗开启了一片崭新的天地。
分子影像学具有独特的优势，能够早期发现疾病(如肿瘤)的分子变异及病理改变过程，可在分子水平上评估被治疗靶目标的效果[1]。例如就癌症而言，当前检测疾病的参数只能了解肿瘤体积大小和解剖定位，分子影像技术可获得许多新的检测参数，如肿瘤生长动力学评估、恶变前的分子异常检测、血管发生生长因子、肿瘤细胞标记物、基因改变等，活体分子成像可允许无损生物体微环境的状况下进行发病机制的研究，此外，分子影像有可能通过活体实时分子靶目标评估来促进药物发展。分子成像与影像导引治疗系统结合，使我们有可能在识别疾病的同时即进行直接治疗。
分子影像可以提高临床诊治疾病的水平，许多疾病始于基因和基因表达异常，继而代谢失常、功能障碍，最后才表现出组织形态变化和症状体征，只有在分子水平发现疾病，才能真正达到早期诊断并针对性治疗，如基因治疗。另外，分子影像可提示肿瘤的恶性程度和预后，分子影像还可提供独特的诊断能力，通过观察代谢改变，可以在肿瘤化疗开始数天内，明确化疗是否有效，以便及时调整用药。分子影像技术是影像医学近年来最大的进步，也代表了今后医学影像技术发展的方向。
传统的影像学技术，如断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)，依靠物理学和组织学的改变来发现和诊断疾病。分子影像学则是利用分子探针和现有的成像技术发现分子水平或细胞水平的异常。目前常用的分子影像学技术有核医学成像技术，尤以正电子断层成像(PET)和单光子发射断层成像(SPECT)的分子显像研究最受关注，而且在临床上已经得到一些应用，比如用SPECT显示癌症的骨转移等等。目前需要进一步开发新的探针扩大其应用范围；磁共振成像技术，包括MRI和MR波谱成像都应用于分子影像学的研究。MRI系统现在可达到或接近显微镜的分辨率(数十微米范围)，可对小动物成像，能够进行生理和分子标记物的分析。啮齿动物或其特殊器官的MR成像通常在微小MR(Micro-MR)仪上进行，这种仪器有高磁场和梯度场，其信噪比和空间分辨率显著提高。用磁共振技术进行分子成像的探针是用超顺磁性的纳米粒子作为示踪剂与特异靶分子的配体偶联而成[2]。光学成像技术，种类繁多，目前以荧光成像、生物发光成像、近红外荧光成像的研究较多[3]。光学成像的示踪剂与磁性纳米粒子比较，分子量和粒径都小得多，更易于到达靶点部位。与MRI和SPECT相比，光学成像的限制在于发光探针的穿透力有限，为数毫米到十厘米，以前主要用于小动物疾病模型的研究。但光学成像与内窥镜技术和可视导管技术的联合应用，扩展了其应用范围，可用于人体内肿瘤早期诊断、以及辅助微创外科手术切除肉眼不可分辨的微小病灶，是目前研究的热门[4]。
对于活体肿瘤分子显像学来说，内源性分子表达的显像是目前各个影像技术的难题，但真正的内源性分子表达显像却具有极为重要的意义。如果能够方便地对内源性异常表达的分子显像，我们就有可能在疾病的早期阶段发现并进行治疗而得以根治疾病。
寻找肿瘤特异性靶点，制备高亲和力、高稳定性的成像探针对靶点进行确认是活体内成像的关键。当前，寻找新的靶分子，开发新的探针和影像技术吸引大家的注意。由于肿瘤细胞是由正常细胞突变而来，其基因构成和所表达的蛋白质绝大多数在数量和质量上都与正常组织相同，到目前为止，尚未找到肿瘤细胞绝对特异的分子标志。已经发现的肿瘤相关标志物有很多，例如甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异抗原(PAS)以及众多的肿瘤相关糖基化抗原(CA125，CA199等等)，这些对于临床肿瘤性疾病的血清学辅助诊断、疗效评估及判断复发起到了重要作用。但这些标志物由肿瘤细胞产生后，大量释放到血循环中，虽有利于血清学检测，但不宜用作体内肿瘤的显像定位及导向治疗的靶点。而肿瘤分子影像学领域研究最多得是肿瘤新生血管分子靶标和转铁蛋白受体[5]、叶酸受体等。这些靶分子在肿瘤中的表达比在正常组织中明显增高，可以用作分子成像的靶点，但并不是肿瘤特异性的，在很多正常组织中也有相当数量的表达，会影响活体肿瘤显像的特异性，干扰成像结果的判断。
据文献报道，人精子蛋白17(Sp17)是一个肿瘤相关抗原[6]。人的Sp17分子由151个氨基酸组成，在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的表观分子质量为24.5kDa。在正常情况下，Sp17仅出现在睾丸组织和成熟精子中。Sp17的生物学功能尚未明了，可能参与受精过程中精子顶体与卵子透明带反应。但在恶性肿瘤组织中，Sp17基因被异常激活，从而呈现大量异常表达。Dong等[7]最先报道了Sp17在恶性细胞中表达。他们发现鼠Sp17强烈表达于转移的鳞状细胞癌中。又通过Northern印迹分析在多种人癌细胞系中发现Sp17mRNA表达[8]，这些细胞包括基底细胞癌(HaCat)、腺癌(Hela S3)，前列腺癌(LnCaP，Du145，PC3)、骨肉瘤(143TK)和肺癌(A549，Calu 1)。骨髓瘤细胞系(ARP-1，ARK-B)系中，既可检测到Sp17mRNA，也检测到蛋白的表达。在26％多发性骨髓瘤(MM)患者的肿瘤细胞中发现Sp17mRNA和Sp17蛋白的异常表达。对卵巢癌患者进行调查，发现43％-70％的原发卵巢癌细胞有Sp17蛋白的表达[9，10]。以后陆续有在食管癌[11]、神经系统肿瘤[12]中发现Sp17表达的报道。国外学者还进行了Sp17正常组织表达的研究。2001年Lim等用Northern印迹和RT-PCR分析方法，表明Sp17在正常组织中呈局限性表达[13]。测定的组织包括骨髓、脑、结肠、心、肾、肝、肺、胰腺、前列腺、骨骼肌、脾和睾丸，结果Sp17转录产物在正常睾丸组织中检测到了很强的表达信号，在前列腺中微弱表达，其他组织无表达。2003年，Chiriva-Internati等[14]报道用免疫组化法在健康男性和女性的生殖道、气管、咽喉和肺的纤毛上皮细胞中也检测出了Sp17的表达，因此对Sp17作为肿瘤免疫治疗靶点提出了质疑。为了证明Sp17作为肿瘤治疗靶点的可用性，2004年Zhang等进行了研究，分别应用实时定量RT-PCR和组织微阵列作免疫组化检测正常组织中Sp17表达情况，结果表明，20种正常组织虽然检出Sp17mRNA的表达，但水平仅为睾丸的0-2％；在30种正常组织中均未检出Sp17蛋白的表达。这一结果显示，Sp17虽然不是肿瘤特异的，但由于其在正常组织表达分布局限，除睾丸外，其他正常组织表达量很小，而且该蛋白没有重要的生物学功能，可以作为免疫治疗的靶分子。
在了解国外研究背景的基础上，我们设想将Sp17用作活体内肿瘤的分子成像靶点，在国家自然科学基金(项目编号30670599)资助下，开展了一系列研究工作。我们首先利用基因重组技术对人的Sp17进行了基因克隆和体外高效表达，制备出高质量单克隆抗体(已经获得国家发明专利授权，专利号200510094178.8)。利用单克隆抗体和免疫组化技术，我们发现Sp17在卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈腺癌等肿瘤细胞中呈高水平异常表达，而且其异常表达特性在转移癌细胞仍然保留而且稳定[9]。这些研究工作为本发明奠定了基础。
主要参考文献
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发明内容
本发明的目的是提供一种活体肿瘤显像靶分子。
本发明的另一个目的是提供一种作用于上述靶分子的特异性的分子显像探针。
本发明还有一个目的是提供上述探针在制备分子显像诊断试剂中的应用。
本发明建立异常表达Sp17的肿瘤的动物模型，以Sp17作为活体内肿瘤显像靶分子，利用抗Sp17单克隆抗体(anti-Sp17 mAb)作为特异靶向剂，将多种示踪剂如超顺磁性纳米粒子、近红外染料(例如吲哚花箐素衍生物)、放射性核素(例如99mTc)与抗体偶联制备成特异性探针，用MRI、光学成像技术和SPECT和进行活体内肿瘤分子显像，获得理想结果。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种活体肿瘤显像靶分子，该靶分子是在肿瘤细胞中异常表达的精子蛋白17(Sp17)。
一种分子显像探针，该探针由靶向剂和示踪剂组成，其靶向剂是能与Sp17特异性结合的单克隆抗体，其示踪剂是磁性纳米材料、荧光染料或放射性核素。
所述的探针，其中Sp17的单克隆抗体是保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
所述的探针，其中磁性纳米材料为Silane@MNPs或CS@MNPs：荧光染料为吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)及其衍生物；放射性核素为99mTc。
所述的探针，其中吲哚菁绿衍生物为ICG-Der-02。
所述的探针在制备肿瘤分子显像诊断试剂中的应用。
本发明的有益效果：
1.用磁性纳米粒子(MNP)与anti-Sp17 mAb偶联，制备出免疫磁性纳米探针(IMNP)用于MRI成像。离体细胞磁共振成像显示IMNP对Sp17+肿瘤具有明显靶向作用。用该探针进行小动物在体Sp17+肿瘤的MRI成像(使用小动物专用磁共振成像仪)，与MNP相比，更多IMNP在肿瘤内聚集，数小时后，探针显示的信号消减。
2.用近红外染料吲哚菁绿衍生物(ICG-Der-02)与anti-Sp17 mAb偶联，形成特异性光学探针anti-Sp17-ICG-Der-02，用于在体肿瘤光学成像。结果显示，经静脉注射后，anti-Sp17-ICG-Der-02很快就能靶向到达肿瘤部位，发出强烈的荧光信号，随着时间推移，因染料在内脏器官(肝、肾等)代谢和排泄而产生的非特异荧光信号逐渐消褪，仅肿瘤组织结合的特异性探针发出荧光信号，清晰显示出肿瘤的部位及大小。更重要的是，肿瘤组织的荧光信号在实验观察的第7天仍然没有明显衰减。以上结果证明：anti-Sp17-ICG-Der-02探针在体内对肿瘤的靶向作用优异，无非特异结合；探针中靶向剂(抗体)与示踪剂(荧光染料)通过共价键稳定偶联，在体内复杂环境下基本没有脱落；探针可以稳定结合于在体肿瘤，滞留时间长，有利于择期、多次观察活体内肿瘤的存在与变化。
3.用放射性同位素99mTc与anti-Sp17偶联，制备放射性显像探针anti-Sp17-99mTc，用于在体肿瘤的SPECT成像。经体外检定，探针99mTc-anti-Sp17的放射化学纯度为96～99％，形成探针后8小时内是稳定的，说明探针质量好。经静脉注射小鼠肿瘤模型，用SPECT扫描仪进行在体肿瘤和离体肿瘤成像。由于所用SPECT扫描仪是适用于临床病人检查的大型仪器，其空间分辨率不足以分辨小鼠在体肿瘤部位的信号与其他部位的干扰信号，但是将肿瘤离体后扫描，并测定肿瘤组织的放射量，结果显示出探针良好的靶向作用。
4.综上所述，我们发现并证实了Sp17适合作为活体内肿瘤显像靶分子，以anti-Sp17mAb作为靶向剂的探针在制备肿瘤分子显像诊断试剂中有良好的应用前景。
附图说明
图1是MRI检测体外IMNPs对肿瘤细胞的靶向作用的图像效果。
图2是MRI检测体外IMNPs对肿瘤细胞的靶向作用的数据条形图。
图3是荷瘤小鼠磁共振成像结果。
T2WI显示肿瘤感兴趣区域探针注射后不同时间点的信号变化。A，B，C分别为注射Anti-Sp17-Silane@MNPs前、注射后2小时和6小时；D，E，F分别为注射Anti-Sp17-CS@MNPs前、注射后2小时和6小时。
图4是荷瘤动物在体近红外光学成像效果。
A.实验组，注射免疫近红外荧光探针。1天后肿瘤部位荧光信号突显，随着时间延长，近红外染料经由肝、肾代谢排出体外，正常组织器官荧光信号逐渐消失，至第7天仅肿瘤部位有信号；
B.对照组，注射游离近红外染料。肿瘤部位未显现荧光信号，至第2天，除肝脏外，体内荧光信号基本消失。
图5是用于SPECT成像实验的荷瘤动物模型及离体肿瘤。
A.注射99mTc-anti-Sp17探针，B.注射游离99mTc。
图6是动物模型及离体肿瘤SPECT图像。
图7是ELISA法检测IMNPs的活性结果。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
一般性说明：本发明采用的抗精子蛋白17单克隆抗体(anti-Sp17 mAb)是保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体及其制备方法已经于2006年6月7日由专利文献CN1781944A公开。该单克隆抗体具有高特异性、高亲和力、高稳定性，使得利用该单克隆抗体制备的探针特异性高，而且结果清晰，容易判断，并且有高度的可重复性。
实施例1  抗精子蛋白17单克隆抗体(anti-Sp17 mAb)的制备
1、anti-Sp17mAb制备：将液体石蜡(0.5ml/只)注射到小鼠腹腔中，14天后将保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞(0.5ml/只)注入小鼠腹腔中。当小鼠腹部明显膨大，用8号针头抽取小鼠腹水，每隔4天同法抽取，直至小鼠死亡。3000rpm离心腹水10分钟，弃上层油脂和不溶物以及下层各种细胞和不溶物，吸取淡黄色上清，加入等体积的甘油(含20g/L的Na2HPO4)，分装后-20℃冰箱保存。
2、anti-Sp17mAb纯化
1)硫酸铵盐析：500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的饱和硫酸铵用量，用氨水调pH至7.0。吸取上述保存的腹水溶液(含anti-Sp17 mAb)移入50ml塑料管中，向管中逐滴加入等量的饱和硫酸铵溶液，边加边混匀，4℃过夜。10000rpm离心15min，弃上清，沉淀物溶于1.5ml PBS(0.01M，pH7.0)。
2)透析法脱盐：将透析袋于200mmol/L NaHCO3，5mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用。将盐析样品装入透析袋中，1L PBS缓冲液4℃透析24小时，其间更换5次透析液。用萘氏试剂(碘化汞11.5g，碘化钾8g，加蒸馏水50ml，待溶解后，再加20％NaOH 50ml)检测，直至透析外液无黄色物形成为止。
3)G蛋白亲和层析柱纯化：10倍柱体积的PBS缓冲液洗柱，将透析后溶液上样，再用PBS缓冲液洗柱至无蛋白流出，甘氨酸-HCl(0.1M，pH2.7)洗脱，流速1ml/min，电脑核酸蛋白检测仪自动绘制出样品分离的图谱。准备含有60μl Tris-HCl(1M，pH9.0)的收集管，出现第一个蛋白吸收峰时开始收集，得到的为纯化的IgG溶液，即纯化的anti-Sp17 mAb。
3、常规方法进行anti-Sp17 mAb蛋白质定量。将标准蛋白溶液BSA(1mg/ml)倍比稀释为1000，500，250，125，62.5，31.25μg/ml六个浓度，待测定anti-Sp17 mAb溶液用PBS溶液1∶5稀释。取100μl标准液、待测液和PBS分别加入2ml考马斯亮蓝G-250染液中，制备标准管、测定管和空白管。在紫外分光光度计上测定OD595值，绘制标准曲线，根据测定管的OD值计算出相应浓度(μg/ml)，推算anti-Sp17mAb中所含蛋白的量。
实施例2  肿瘤动物模型的建立
BALB/C裸鼠(雌雄不限，4～6周龄，20～25g)。过量表达Sp17的卵巢癌细胞系HO8910或肝癌细胞系SMMC-7721用RPMI1640培养液培养。细胞铺满瓶底80％以上时，以0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化细胞1min，用含10％小牛血清的RPMI1640培养液终止反应，吹打分散细胞，1000rpm离心5min，弃上清，以PBS调整细胞数量，2×106/0.2ml，将细胞接种于20～25g裸鼠肩部或臀部皮下，约10～20天后，肿瘤逐渐长出。
实施例3  免疫磁性纳米探针(IMNPs)制备
利用化学偶联剂EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺N-羟基琥珀酰亚胺)，将二种不同表面修饰的磁性纳米粒(纳米级γ-Fe2O3颗粒，由东南大学生物科学与医学工程学院用共沉淀法制备)与anti-Sp17mAb偶联，制备免疫磁性纳米探针(anti-Sp17IMNPs，以下简称IMNPs)，比较二者对肿瘤的靶向作用。
1、Anti-Sp17-Silane@MNPs探针制备：取硅烷修饰表面的磁性纳米粒(Silane@MNPs)0.2mg，加入100μg经过EDC/NHS活化的anti-Sp17mAb，混匀，室温振荡2h。然后将混合物用PBS缓冲液磁分离洗涤3次除去游离抗体，最后用PBS(0.01M，pH7.4)缓冲液悬浮沉淀至200μl，4℃保存。
2、Anti-Sp17-CS@MNPs探针制备：取壳聚糖修饰表面的磁性纳米粒(CS@MNPs)0.2mg，用双蒸水磁分离洗三遍，用1ml MES(4-Morpholineethanesulfonic acid)缓冲液(0.1M，pH4.7)重悬并超声分散，加入100μg经EDC/NHS活化的anti-Sp17 mAb，混匀，室温振荡2h。将混合物用MES缓冲液磁分离洗涤3次以除去游离抗体，然后将磁性纳米颗粒重悬于经过EDC/NHS活化的1％PEG(聚乙二醇)溶液中，室温振荡2h。同上进行磁分离洗涤除去游离分子，最后重悬于200μl的PBS(0.01M，pH7.4)中，4℃保存。
实施例4 ELISA法检测IMNPs的活性
用包被液(50mM NaHCO3-Na2CO3，pH 9.6)稀释重组人Sp17蛋白至终浓度为1μg/ml，包被聚苯乙烯板，每孔100μl，置4℃吸附过夜；洗板3次，洗涤液为含0.05％Tween-20的PBS(0.1M，pH 7.4)；1∶100稀释相同抗体浓度的四个样品(分别是：IMNPs，如Anti-Sp17-CS@MNPs、煮沸5min后的IMNPs、MNPs与anti-Sp17mAb混合物、纯anti-Sp17mAb，每样品每孔100μl，平行两孔，稀释液为含10％小牛血清、0.05％Tween-20的PBS，另设纯MNPs作为阴性对照及稀释液作空白对照。37℃水浴45min后洗板3次；每孔加入1∶2000稀释度的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG 100μl，37℃水浴30min后洗板5次；每孔加100μl显色剂四甲基联苯胺(TMB)，37℃水浴10分钟；每孔加50μl 2M的硫酸终止显色；用酶标仪在波长450nm处测定OD值。结果见图7，证明IMNPs保持很高的免疫活性，与同浓度的原抗体溶液无明显差别，而且对照实验组未出现非特异反应。
实施例5  MRI检测体外IMNPs对肿瘤细胞的靶向作用
高表达Sp17的细胞系与IMNP或MNP共孵育，铁浓度为20μg/ml，孵育时间分为2h和16h。同时设立不表达Sp17的细胞对照组。用PBS彻底清洗后，将细胞消化重悬于含0.5ml 1％琼脂糖的离心管中，随后进行MRI成像检测。采用1.5TMR仪(Philip公司，Eclipse机型)，表面线圈，内径12.7cm；视野(FOV)14cm×14cm；激励次数2-4；层厚2mm；矩阵384×256；测量信号强度，感兴趣区(ROI)取20mm2。成像序列为梯度回波序列T2 *WI，TR 620ms，TE 15.7ms，反转角35°。结果表明IMNP组孵育时间从2h增加到16h，T2 *值明显降低，说明IMNP随时间的延长与细胞特异性结合增加，而没有偶联抗体的MNP组信号有少许降低(图1，图2)。图中Anti-Sp17IMNPs+Sp17是一个检查反应特异性的步骤，Anti-Sp17IMNPs中先加上Sp17，抗原、抗体即可发生反应，能阻断Anti-Sp17 IMNPs与肿瘤细胞上表达的Sp17的反应，即可证明实验的特异性。我们的结果证明了预期。
实施例6  MRI对荷瘤动物在体肿瘤分子显像
实施例2得到的荷瘤动物分为Anti-Sp17-Silane@MNPs探针组和Anti-Sp17-CS@MNPs探针组，每只鼠分别经尾静脉注射约100μg IMNPs。在注射前1h，注射后2h、6h进行MRI扫描，观察肿瘤部位的信号变化。
磁共振成像参数：小动物磁共振成像仪(7T MR imager，BrukerBioSpin MRI GmbH，German)。成像序列：常规T2WI：TR＝4200ms TE＝36ms，FOV＝4cm×4cm；层厚＝1mm；激励次数＝4；扫描矩阵＝256×256；T2-map：采用多层多回波SE序列，TR＝3000ms，TE＝20ms，FOV＝4cm×4cm；层厚＝1mm；扫描矩阵＝256×256；回波链＝8，激励次数＝3。
信号测量采用感兴趣区(ROI)技术，在肿瘤成像最大层面选取20mm2大小实体瘤部分作为ROI进行信号测量(图3)。体内动物模型肿瘤部位的T2WI磁共振扫描结果如图3所示。注射探针后2h后，所选肿瘤感兴趣部位(ROI)的T2信号强度相对于注射前明显降低；6h后仍可见肿瘤ROI区域的低信号，但较2h时信号有所增高。
两种探针注射后不同时间点T2值的变化见表1。比较发现，2h时Anti-Sp17-CS@MNPs探针组比Anti-Sp17-Silane@MNPs探针组导致T2信号强度降低更明显，即前者的特异靶向作用强于后者。
表1两种探针注射后不同时间点T2值的变化
Figure GSA00000045494100101
实施例7  anti-Sp17-ICG-Der-02探针的制备
取10mg吲哚花菁绿(indocyanine green，ICG)的衍生物ICG-Der-02(来自公开号为CN101440282A(即专利申请号为200810244796.X)的专利文献)溶解于0.5ml水中，与一定量的催化剂EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺，2.90mg，0.015mmol)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺N-羟基琥珀酰亚胺，1.73mg，0.015mmol)混合，室温4小时，活化羧基基团。活化的ICG-Der-02溶液滴加到50μl anti-Sp17 mAb(2.8mg/ml)中，4℃避光搅拌10小时。加入200μl 5％醋酸终止反应。最后，混合物装入透析袋(分子量筛截10kDa)中，对0.1mol/L，pH＝8.3的PBS透析，直至无游离染料透析出。留在透析袋中的即为纯化的anti-Sp17-ICG-Der-02探针，分装后避光储存在4℃备用。
实施例8  荷瘤动物在体近红外光学成像
将荷瘤小鼠分为2组，分别经尾静脉注射anti-Sp17-ICG-Der-02探针和游离ICG-Der-02染料，注射后间隔不同时间(1h，2h，4h，6h，1d，2d，3d)对2组动物进行近红外摄像，曝光时间为1秒。另外注射探针组的2只动物观察到第7天。结果显示，经静脉注射后，anti-Sp17-ICG-Der-02很快就能靶向到达肿瘤部位，发出强烈的荧光信号，随着时间推移，因染料在内脏器官(肝、肾等)代谢和排泄而产生的非特异荧光信号逐渐消褪，仅肿瘤组织结合的特异性探针发出荧光信号，清晰显示出肿瘤的部位及大小。更重要的是，肿瘤组织的荧光信号在实验观察的第7天仍然没有明显衰减(图4)。
结果表明：anti-Sp17-ICG-Der-02探针在体内对肿瘤的靶向作用优异，无非特异结合；探针中靶向剂(抗体)与示踪剂(荧光染料)通过共价键稳定偶联，在体内复杂环境下基本没有脱落；探针可以稳定结合于在体肿瘤，滞留时间长，有利于择期、多次观察活体内肿瘤的存在与变化。
实施例9  利用anti-Sp17放射性核素探针进行ECT分子显像研究
1、99mTc-anti-Sp17探针的制备
1)试剂：
anti-Sp17，浓度为2.8mg/ml；
磷酸缓冲液：由磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制(上海试剂二厂生产)，浓度为0.1Mol/L，pH7.4；
0.4％氯化亚锡溶液：称取一定量的氯化亚锡(含2个结晶水)，适量0.05mol/L的盐酸使其全溶，配制成浓度为4.0mg/ml的溶液；
2)抗Sp17-Sn+2药盒的制备
分别取0.4％氯化亚锡300μl和磷酸缓冲液3.0ml加入一合适容器，混合；在上述容器充氮气10分钟，0.22μm的无菌过滤器过滤；将上溶液以0.2ml每瓶分装，密封后置4℃保存，备用。
3)99mTc-anti-Sp17的制备
取抗Sp17-Sn+2药盒一只，室温全溶后加100μl anti-Sp17 mAb，然后加高锝[99mTc]酸钠液适量，摇匀即成，备用。
4)99mTc-anti-Sp17放射化学纯度的测定
层析条件：新华1#层析纸(1.2*12cm)，丙酮为展开剂；
采用上行展开法展开一定距离(大约10cm)后，取出吸除多余展开液，将其由原点到前沿分为10等分，分别测量每份的放射量，见99mTc-anti-Sp17的Rf值为0.0到0.1，而高锝[99mTc]酸钠的Rf值为1.0。检测本品的放射化学纯度为96～99％。
5)99mTc-anti-Sp17放射标记稳定性的检测
采用样品在制备后不同时间的放射化学纯度作为检测其体外稳定性指标。
本品在制备后10分钟、2、3、4、6、8小时检测其放射化学纯度，其结果分别为(％)：99.6，98.7，99.0，94.0，90.0和90.0。由此可见99mTc-anti-Sp17在标记后8小时内是稳定的。
2、用SPECT技术对荷瘤动物在体和离体肿瘤进行分子显像
实施例2得到的荷瘤动物分为99mTc-anti-Sp17探针组和99mTc组，每只鼠经尾静脉注射0.2ml探针或未标记抗体的99mTc，放射剂量约为7400kBq。在注射后不同时相(0.5h、1h、2h、4h、6h与8h)，荷瘤裸鼠分别进行SPECT扫描显像。显像仪为GE公司MPR型SPECT仪。扫描条件：采用平行孔、低能高分辨率准直器，能峰设置140keV，窗宽20％，矩阵为256×256，放大倍数2.0，定数采集100K。由于小鼠体积过小，仪器的分辨率不能满足分辨在体肿瘤产生的信号和循环同位素产生的背景信号。将位于肩部的肿瘤取下，置于体侧约1cm处，再进行扫描。结果可见注射探针组显示的信号明显高于99mTc对照组。数据显示，探针组肿瘤部位计数为2.37Kc，对照组肿瘤部位计数为1.06Kc，前者高于后者2.24倍。每一像素计数前者高于后者2.26倍，证明了探针在体内对肿瘤的靶向作用。结果见图5，图6。

Claims (6)

1.一种活体肿瘤显像靶分子，其特征在于该靶分子是在肿瘤细胞中异常表达的精子蛋白17(Sp17)。
2.一种分子显像探针，其特征在于该探针由靶向剂和示踪剂组成，其靶向剂是能与Sp17特异性结合的单克隆抗体，其示踪剂是荧光染料或放射性核素。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于Sp17的单克隆抗体是保藏号为CGMCC No.1434的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。
4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于所述的荧光染料为吲哚菁绿及其衍生物；放射性核素为99mTc。
5.根据权利要求4所述的探针，其特征在于吲哚菁绿衍生物为ICG-Der-02。
6.权利要求2所述的探针在制备肿瘤分子显像诊断试剂中的应用。
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