CN112920172B - 一种干扰素刺激蛋白靶向化合物、其放射性标记物、及它们的制备方法与应用 - Google Patents

一种干扰素刺激蛋白靶向化合物、其放射性标记物、及它们的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一类二聚的酰胺基苯并咪唑化合物，其结构如下式(I)所示；其中，R0为
Figure DDA0002926736540000011
n取0‑5的整数。本发明还提供基于所述二聚的酰胺基苯并咪唑化合物的一类具有抗肿瘤活性的化合物和一类干扰素刺激蛋白靶向的放射性核素标记化合物。本发明所述二聚的酰胺基苯并咪唑化合物对干扰素刺激蛋白具有高亲和力和高特异性，本发明所述的具有抗肿瘤活性的化合物在体外具有激活STING通路的特性，本发明所述的放射性核素标记化合物不仅靶与非靶摄取对比明显，而且可通过引入不同性质的核素改变脂溶性，极大地拓宽了应用场景，可以跟治疗核素联用进行肿瘤治疗，甚至可用于免疫治疗。

Description

一种干扰素刺激蛋白靶向化合物、其放射性标记物、及它们的 制备方法与应用
技术领域
本发明属于放射性药物及医学影像技术领域，具体涉及一种受体类分子靶向化合物及其制备方法。
背景技术
肿瘤是目前威胁人类健康的首要杀手。近年来肿瘤免疫疗法对于改善某些类型的肿瘤治疗做出了突出的成绩，彻底改变了肿瘤治疗的现状，已经成为继手术、放疗、化疗、靶向治疗癌症的另一有效治疗手段。2018年，诺贝尔生理医学奖的颁发肯定了通过刺激机体免疫系统的先天能力来攻击肿瘤细胞的完全新型的癌症治疗原则，并改变了由免疫增强到免疫正常化的治疗范式。肿瘤免疫疗法主要分为两种：细胞免疫治疗和免疫检查点抑制剂治疗，其中，在免疫检查点抑制上，出现了几个明星靶点，如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4) 和程序性死亡受体1(PD-1)及其配体PD-L1，目前已有6种PD1/PDL1检查点抑制剂抗体获FDA批准用于14种癌症治疗，截止2018年9月有2250项临床试验在进行。
然而，客观的事实是，目前使用的肿瘤免疫疗法仅能帮助少数具有特定癌症类型的患者，并且在某些类型的癌症中，它的成效极低，甚至没有成效。开发新的治疗靶点或者信号通路将会是攻克肿瘤免疫难题的一个突破口，其中干扰素刺激蛋白被激活后能够产生I型干扰素，具有抗肿瘤效应则引起了广泛的关注。
干扰素刺激蛋白(stimulator of interferon genes)，是一种主要定位于内质网膜上的重要接头蛋白，主要分布在免疫相关的组织细胞中，如在胸腺、脾脏及外周血白细胞中高表达，与环鸟腺苷酸合成酶(Cyclic-GMP-AMP synthase,cGAS)组成的天然免疫信号通路 (cGAS-STING)能感知入侵宿主细胞的病原微生物DNA。首先，cGAS识别出细胞内异常的双链DNA后发生构象的改变从而转变为活化状态，产生环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸(cGAMP)；干扰素刺激蛋白与cGAMP结合后产生侵染信号，该信号会传递给下游的激酶并促进转录因子的磷酸化，这些转录因子会进入细胞核诱导I型干扰素(IFN)和其它多种促炎性细胞因子的形成，从而清除入侵的病原微生物。
I型IFN不仅对肿瘤激活的T细胞活化起着关键作用，还是肿瘤微环境中诱导多种免疫细胞激活、成熟、分化的关键细胞因子。此外，干扰素刺激蛋白能激活包括树突状细胞等免疫刺激细胞，改变肿瘤微环境并诱导了肿瘤特异性CD8+T细胞的产生。因此，通过诱导I型IFN基因的表达架起天然免疫和获得性免疫之间的桥梁。
肿瘤细胞会自发下调干扰素刺激蛋白表达由此减少I型IFN的生成，从而达到逃逸免疫反应并不断生长和浸润的目的。研究表明，干扰素刺激蛋白在肝细胞癌、胃癌、结直肠癌以及黑色素瘤中表达明显降低，且与肿瘤体积、TNM分期和总存活率呈负相关，可以作为肝细胞癌与胃癌预后的独立预测因子。干扰素刺激蛋白表达水平联合肿瘤TNM分期对肝细胞癌患者的总体存活率具有更好的预测价值。但是干扰素刺激蛋白并不是对所有肿瘤都发挥抑制作用。最近，有文献报道了cGAS-STING信号通路在18种癌症的7661份样品中的表达水平情况(Xia T,Konno H,Ahn J,Barber GN.Deregulation of STING Signaling inColorectal Carcinoma Constrains DNA Damage Responses and Correlates withTumorigenesis.Cell Rep 2016；14(2):282-97.)。结果表明干扰素刺激蛋白在泛癌组织中高度表达，在某些肿瘤类型中高度上调的cGAS-STING信号与免疫细胞的浸润呈负相关。在特定癌症患者中， cGAS-STING信号高表达预示较差的预后。因此，干扰素刺激蛋白表达在肿瘤免疫中表现出双面性。对于干扰素刺激蛋白表达量的测定不仅能够作为cGAS-STING通路相关免疫治疗的参考依据，还能反映患者预后情况。
当今热门的PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂需要提前对患者体内蛋白表达情况进行定量筛查，以实现精准治疗的目的，常规活检或者免疫组织化学(IHC)由于肿瘤组织存在异质性无法完全准确及全面的评估PD-1/PD-L1的真实表达。在核医学影像技术中：单光子计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射断层扫描(PET)具有穿透能力强，灵敏度高，只需要微量的显像剂即可无创伤成像等特点。可以从整体上直观且无创性地监测受体或者靶点的表达情况。Heskamp等在2015年首次用铟-111(111In)标记人源单克隆抗体PD-L1，并使用表达PD-L1的人源乳腺癌细胞，通过在具有不同PD-L1表达水平的异种移植小鼠模型进行SPECT/CT成像，显示111In-PD-L1.3.1在肿瘤内部不均匀的分布，证明了111In-PD-L1.3.1 在PD-L1表达的活体显像中的特异性摄取。作为免疫治疗抗体较早的核素标记研究，充分证明了核医学成像检测PD-L1表达的可能性。(Heskamp S,Hobo W,Molkenboerkuenen J D, etal.Noninvasive imaging of tumor PD-L1 expression using radiolabeled anti-PD-L1 antibodies[J].Cancer Research,2015,75(14):2928-2936)，随后经过优化改良的PD-1/PD-L1靶向放射性探针相继出现，实验结果表明核医学成像技术可以对蛋白进行定量检测从而预估免疫治疗的潜在能力。
PET/SPECT技术在PD-1/PD-L1分子定量的成功应用，促使我们开始考虑采用相同的方式实时动态定量肿瘤微环境中干扰素刺激蛋白表达，精准指导癌症免疫治疗具有重要的借鉴意义。在PET/SPECT成像技术中，一种特异性好，亲和力强的放射性显像剂是成像的关键，基于此，有必要提出一种靶向干扰素刺激蛋白的放射性分子探针，利用PET/SPECT成像技术，用于肿瘤免疫微环境中干扰素刺激蛋白信号的无创、精准可视化检测。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一类具有优良靶向性能的干扰素刺激蛋白靶向化合物。
本发明的另一个目的在于提供所述干扰素刺激蛋白靶向化合物的核素标记物。
本发明的再一个目的在于提供上述靶向化合物及其标记物的合成和标记方法。
本发明的再一目的是提供所述靶向化合物及其放射性核素标记物在制备肿瘤或炎症的诊断或治疗药物中的应用。
本发明的具体技术方案如下：
首先，本发明提供一类二聚的酰胺基苯并咪唑化合物，其结构如下式(I)所示：
Figure BDA0002926736520000031
其中，R0为
Figure BDA0002926736520000032
n取0-5的整数；优选1-5的整数，更优选1-3的整数。
本发明优选的一种二聚的酰胺基苯并咪唑化合物，其结构如下式(I-1)所示,其中n取 0-5的整数；优选1-5的整数，更优选1-3的整数：
Figure BDA0002926736520000041
本发明优选的另一种二聚的酰胺基苯并咪唑化合物，其结构如下式(I-2)所示，其中 n取0-5的整数；优选1-5的整数，更优选1-3的整数：
Figure BDA0002926736520000042
本发明所述的二聚的酰胺基苯并咪唑化合物对人源和鼠源的干扰素刺激蛋白具有极好的靶向性能。此外，本发明所述化合物的二聚体上连接的R0结构为调节分子的脂溶性提供了良好的基础，本发明所述化合物可通过该结构连接不同性质和类型的功能性基团，使靶向化合物获得不同的脂溶性，使其在产业上的应用范围得到有效拓展。
在此基础上，本发明还提供一类具有抗肿瘤活性的化合物，其结构如下式(I-3)所示，
Figure BDA0002926736520000043
其中，R0为
Figure BDA0002926736520000051
n取0-5的整数；优选1-5的整数，更优选1-3的整数；R为功能性基团，选自以下任意一种：
Figure BDA0002926736520000052
本发明进一步提供一类干扰素刺激蛋白靶向的放射性核素标记化合物，其结构通式如下式(II)：
Figure BDA0002926736520000053
其中，R1为带有放射性核素的基团；R2为干扰素刺激蛋白靶向基团，R3为小分子连接链段；
所述的干扰素刺激蛋白靶向基团结构如下式(I-4)所示：
Figure BDA0002926736520000054
本发明的一种实施方式中，所述的小分子连接链段R3选自
Figure BDA0002926736520000055
其中n 为0-5的整数，优选1-5的整数，更优选1、2或3；则所述的标记物结构如下式(II-1)所示：
Figure BDA0002926736520000061
本发明的另一种实施方式中，所述的小分子连接链段R3选自碳原子数为偶数的烷基链；所述的烷基链进一步优选C2、C4、C6、C8或C10的烷基链，则所述的标记物结构如下式(II-2)所示，其中n为0-5的整数，优选1、2或3：
Figure BDA0002926736520000062
本发明所述的方案中，所述的R1是带有放射性核素的基团，可以是现有的多种带核素基团中的任意一种，例如可以选自利用配体螯合放射性核素的基团，或是自带放射性核素的基团。
所述的利用配体螯合放射性核素的基团，包括但不限于以下任意一种与放射性核素配位形成的基团：HYNIC基团、NOTA基团、DOTA基团或DTPA基团，它们的结构分别如下：
Figure BDA0002926736520000063
所述的放射性核素包括但不限于99mTc、111In、89Zr、18F、177Lu、64Cu、131I、125I、124I、67Ga或68Ga中的任意一种。
所述的自带放射性核素的基团，包括但不限于以下任意一种基团：
Figure BDA0002926736520000071
同时，本发明还提供一种制备式(II-1)所示的干扰素刺激蛋白靶向放射性核素标记化合物的方法，所述的R1是利用配体螯合放射性核素的基团，记作方法一，包括如下步骤：
(1)合成式(I-1)所示结构的二聚的酰胺基苯并咪唑化合物，记作R2-PEGn-NH2 (n＝0～5的整数)；
Figure BDA0002926736520000072
(2)制备R1-NHS溶液：将核素螯合物(HYNIC、NOTA、DOTA和DTPA中的一种或多种)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)混合反应过夜，过滤即得；
(3)合成R1-PEGn-R2(n＝0～5的整数)：将(2)所得R1-NHS与(1)所得R2-PEGn-NH2溶于DMF，加入适量的三乙胺，室温搅拌过夜，粗产物用高相液相色谱HPLC纯化，真空干燥得干扰素刺激蛋白靶向放射性探针标记前体R1-NH-PEGn-R2(n＝0～5的整数)；
(4)用放射性金属核素与(3)所得标记前体R1-NH-PEGn-R2混合配位，即可得到所述的一种干扰素刺激蛋白靶向放射性核素标记化合物。
在本发明的一个优选实施方案中，制备所述式(II-1)所示的化合物时，所述步骤(1) 包括如下具体步骤：
a、4-氯-3硝基-5甲氧基苯甲酰胺(化合物1)与(4-氨基丁-2-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯(化合物2)经芳香族亲核取代反应，得到化合物3；化合物3经水解得到化合物4；
b、4-氯-3硝基-5羟基苯甲酰胺(化合物5)与N-BOC-乙醇胺或羟基聚乙二醇氨基-Boc (化合物6，HO-PEGn-NH-Boc，其中n取0-5的整数)经双分子亲核取代反应，得化合物7；
c、b所得的化合物7与a所得的化合物4得经芳香族亲核取代反应，到化合物8；
d、将c所得的化合物8的硝基还原为氨基，得化合物9；
e、d所得的化合物9与5-异硫氰酸基-1,3-二甲基-1H-吡唑(化合物10)在缩合剂的催化下成环后得化合物11；化合物11脱去氨基保护基，得化合物12，即R2-PEGn-NH2 (n＝0～5的整数)。
合成上述R2-PEGn-NH2(n＝0～5的整数)的反应路线可参考如下过程：
Figure BDA0002926736520000081
Figure BDA0002926736520000091
本发明还提供另一种制备式(II-1)所示的干扰素刺激蛋白靶向放射性核素标记化合物的方法，所述的R1是自带放射性核素的SIB基团、SFB基团或IPBA基团中的任意一种，记作方法二，包括如下步骤：
[1].制备SIB、SFB或IPBA的标记前体；
[2].对[1]所得标记前体进行标记，得到带有放射性核素的R1，如131IPBA；
[3].将[2]所得R1与所述方法一(1)所得R2-PEGn-NH2溶于DMF，加入适量的三乙胺，60℃反应1h，用高相液相色谱HPLC纯化，即可得到干扰素刺激蛋白靶向放射性核素标记化合物R1-PEGn-R2(n＝0～5的整数)；如131IPBA-PEGn-DABI。
以制备131IPBA-PEGn-DABI为例，其反应示意式，其中n＝0～5的整数：
Figure BDA0002926736520000092
本发明还提供所述式(I)所示的干扰素刺激蛋白靶向化合物、所述式(I-3)所示的具有抗肿瘤活性的化合物或所述式(II)所示的放射性核素标记化合物在制备肿瘤或炎症的诊断或治疗药物中的应用；优选的应用是在制备用于肿瘤或炎症诊断的显像药剂中的应用，或者是在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
本发明以干扰素刺激蛋白为靶点，以高亲和力酰胺基苯并咪唑为母体，经过结构优化，首次开发出一类干扰素刺激蛋白靶向的放射性探针，为基于核医学影像的肿瘤免疫微环境中干扰素刺激蛋白信号无创、精准可视化检测打下了良好的基础，通过使用本发明所述的放射性标记物作为探针，可对干扰素刺激蛋白表达实现实时动态评估，有望精准指导靶向治疗人群的选择。
在CT26模型和Panc02胰腺癌模型成像中，实验结果展示出本发明所述的放射性标记物具有良好的特异性，靶与非靶摄取对比明显，充分说明本发明所述的靶向化合物及其放射性标记物具有对干扰素刺激蛋白进行定量分析的潜力。在此基础上，引入不同性质的核素会极大地拓宽该类探针的应用场景，可以跟治疗核素联用进行肿瘤治疗，甚至可用于免疫治疗。此外，本发明所述靶向化合物及其标记物的制备方法相对简单，更容易向临床推广。
本发明的突出有益效果具体说明如下：
(1)本发明以二聚的胺基苯并咪唑为主体开发一类具有高亲和力，高特异性的干扰素刺激蛋白靶向的放射性核素标记化合物，该放射性示踪剂选择的配位基团具有标记能力强、标记时间短、标记产率高等特点，无须后续纯化即可使用，更加有利于标记物的商业化应用与临床推广。
(2)本发明的干扰素刺激蛋白的放射性核素标记化合物在靶向基团以及配位结构之间引入小分子链，可以增加靶向基团到配位结构之间的距离，避免相互之间的影响，同时，本发明所述标记物中的小分子链结构为调节分子的脂溶性提供了良好的基础，该结构可以与不同类型的核素引入基团连接，不同的核素引入基团会改变放射性探针的脂溶性，从而可以获得不同脂溶性的标记物，使本发明所述的标记物在产业上的应用范围得到有效拓展。此外，还可改善标记配合物的药代动力学性质，加快示踪剂在非靶组织中的清除速度，增加靶/非靶比值，增强配体与受体之间的亲和力，提高标记配合物的肿瘤摄取，使得显像更加清晰，通过提高显像质量达到更好的诊断效果。
(3)本发明所述的干扰素刺激蛋白靶向化合物及其放射性核素标记物具有优良的体内生物学性能。在干扰素刺激蛋白高表达的肿瘤或炎症中具有较高的特异性摄取，靶与非靶比值较高，非特异性背景低，较低的非靶脏器摄取可以减少不必要的放射性损伤；应用广泛，除了用于肿瘤或者炎症的诊断，也可以结合治疗核素如177Lu进行核素治疗，也可以利用核素与STING激动剂和其它免疫检查点抑制剂联用，进行肿瘤免疫治疗。
(4)本发明所述的应用创造性地将潜在的免疫治疗靶点干扰素刺激蛋白(人源，鼠源) 作为一个成像靶点，通过核医学成像手段，对肿瘤中干扰素刺激蛋白的动态表达进行可视化定量分析，克服了传统检测方法存在取样错误、精确度较差的不足。
(5)本发明所述的应用通过影像学的分析，可精准探索干扰素刺激蛋白在肿瘤演变过程中的动态表达，揭示干扰素刺激蛋白表达对于在肿瘤进程中扮演的角色，对于针对cGAS-STING通路的免疫治疗研究奠定了坚实的基础，能够推动cGAS-STING通路的研究。
(6)本发明所述的干扰素刺激蛋白靶向化合物或者与稳定核素配位的靶向化合物在药用剂量下能够诱导IFN-β干扰素产生，具有成为抗肿瘤药物的潜力。
附图说明
图1体现的是实施例5制备的[68Ga]Ga-DOTA-PEG2-DABI和实施例4制备的 [177Lu]Lu-DOTA-PEG2-DABI在PBS(pH＝7.4)与鼠血清共孵育的稳定性。对于 [68Ga]Ga-DOTA-PEG2-DABI来说，用HPLC分析共孵育后2h后化合物的稳定性，对于 [177Lu]Lu-DOTA-PEG2-DABI来说，用HPLC分析共孵育后24h后化合物的稳定性。
图2体现的是实施例3制备的[18F]F-NOTA-PEG2-DABI在PBS(pH＝7.4)与鼠血清共孵育下不同时间点的稳定性。
图3体现的是实施例3制备的[18F]F-NOTA-PEG2-DABI在Panc02肿瘤鼠体内组织器官分布情况，不同组织器官摄取值以每克组织百分注射剂量率(％ID/g)的形式表示；图中每个器官对应的5组数据从左到右分别是5分钟、30分钟、60分钟、120分钟以及240分钟的摄取值。
图4是实施例3制备的[18F]F-NOTA-PEG2-DABI在Panc02肿瘤鼠中体内30分钟、60分钟、120分钟、240分钟的PET显像图。
图5体现的是实施例4制备的[177Lu]Lu-DOTA-PEG2-DABI在CT26肿瘤鼠体内的组织器官分布情况，不同组织器官摄取值以每克组织百分注射剂量率(％ID/g)的形式表示；图中每个器官对应的4组数据从左到右分别是1小时、4小时、24小时、48小时的摄取值。
图6是实施例4制备的[177Lu]Lu-DOTA-PEG2-DABI在CT26肿瘤鼠中体内1小时、4 小时、24小时、48小时、72小时的SPECT显像。
图7是实施例4制备的DOTA-PEG2-DABI、实施例3制备的NOTA-PEG2-DABI及实施例1制备的DABI-PEG2-NH2与raw264.7细胞共孵育4小时后测定IFN-β浓度的结果柱状图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1.二聚的酰胺基苯并咪唑化合物——DABI-PEG2-NH2(化合物12-1)
合成路线如下：
Figure BDA0002926736520000121
具体包括以下步骤：
1)化合物3的合成
将4-氯-3硝基-5甲氧基苯甲酰胺(化合物1)和(4-氨基丁-2-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯(化合物2)按照1:1.2摩尔比溶于适量异丙醇，再往反应瓶滴加与化合物1等摩尔比的DIPEA，室温搅拌反应过夜，进行芳香族亲核取代反应，TLC监测反应进程，反应结束后旋干溶剂，粗产品过硅胶柱进行纯化，得到化合物3。
2)化合物4的合成
将1)所得化合物3用适量的甲醇溶解，转移至反应瓶中，再于冰浴搅拌下往反应瓶缓慢滴加50mL盐酸/二氧六环混合液，进行水解反应，反应液在室温搅拌4小时，过滤得到沉淀，用乙酸乙酯洗涤固体(3×100mL),真空干燥得到化合物4。
3)化合物7-1的合成
称取等摩尔量的化合物5(4-氯-3硝基-5羟基苯甲酰胺)和化合物6-1(2-[2-(2-T-BOC- 氨基乙氧基)乙氧基]乙醇，即HO-PEG2-NH-Boc)以及三苯基膦(PPh3)溶于THF，在冰浴条件下加入2倍摩尔量的偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，进行双分子亲核取代反应，室温反应24小时，反应结束后除去溶剂，粗产品通过硅胶柱纯化得到化合物7-1。
4)化合物8-1的合成
将3)所得的化合物7-1与2)所得的化合物4等摩尔比溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再往反应物滴加4倍摩尔量的DIPEA，进行芳香族亲核取代反应，在120℃温度下反应过夜， TLC监测反应进程，反应结束后旋蒸除掉溶剂，粗产品过硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝20:1)进行纯化可得到目标产物化合物8-1。
5)化合物9-1的合成
将4)所得的化合物8-1先溶于(3.455g，5mmol)15mL甲醇，再转移至含有25mL 硫代硫酸钠水溶液(3.16g)室温反应15分钟后，加入碳酸氢钠(1.68g)中和，继续搅拌 10分钟，过滤，用甲醇洗涤滤渣(20mL×3)，再把滤液浓缩用硅胶柱进行纯化，得到化合物9-1。
6)化合物11-1的合成
称取5)所得的化合物9-1溶于一定量的DMF中，在冰浴条件下加入适量0.6M的5-异硫氰酸基-1,3-二甲基-1H-吡唑(化合物10)的二氧六环溶液，控制化合物9-1和化合物10的摩尔比为1；随后加入等摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)缩合剂，最后加入三乙胺，进行环合反应，投料后转移至室温反应过夜，通过柱层析纯化得到化合物11-1。
7)化合物12-1的合成
称取6)所得的化合物11-1溶于甲醇于反应瓶中，再冰浴条件下往反应瓶缓慢滴加适量盐酸/二氧六环混合液，反应液在室温下进行脱除氨基保护基的反应，搅拌至反应完全，减压除去溶剂，过硅胶柱纯化得到目标产物化合物12-1，记作“DABI-PEG2-NH2”。(1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ7.94(d,J＝10.0Hz,2H),7.65(d,J＝1.5Hz,2H),7.36–7.27(m,4H),6.53(d,J＝14.5Hz,2H),5.90–5.79(m,2H),4.96–4.86(m,4H),4.52(q,J＝7.5Hz,4H),4.07(d,J＝5.0Hz,2H),3.72(d,J＝5.5Hz,3H),3.53(t,J＝5.0Hz,2H),3.40–3.37(m,4H),3.27(d,J＝6.0Hz,2H),2.62(t,J＝5.5Hz,2H),2.11(d,J＝11.0Hz,6H),1.29–1.24(m,6H).)ESI-MS:m/z 853.5[M]+，calculated 853.4
实施例2.二聚的酰胺基苯并咪唑化合物——DABI-Et3-NH2(化合物12-2)
合成路线如下：
Figure BDA0002926736520000141
具体包括以下步骤：
1)化合物3的合成
操作步骤同实施例1的步骤1)。
2)化合物4的合成
操作步骤同实施例1的步骤2)。
3)化合物7-2的合成
称取等摩尔量的化合物5(4-氯-3硝基-5羟基苯甲酰胺)和化合物6-2(6-(N-叔丁氧羰基氨基)-1-己醇，即HO-Et3-NH-Boc)以及三苯基膦(PPh3)溶于THF，在冰浴条件下加入2倍摩尔量的偶氮二甲酸二异丙酯(DIAD)，进行双分子亲核取代反应，室温反应24小时，反应结束后除去溶剂，粗产品通过硅胶柱纯化得到化合物7-2。
4)化合物8-2的合成
将3)所得的化合物7-2与2)所得的化合物4等摩尔比溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，再往反应物滴加4倍摩尔量的DIPEA，进行芳香族亲核取代反应，在120℃温度下反应过夜， TLC监测反应进程，反应结束后旋蒸除掉溶剂，粗产品过硅胶柱(二氯甲烷:甲醇＝20:1)进行纯化可得到目标产物化合物8-2。
5)化合物9-2的合成
将4)所得的化合物8-2先溶于(3.27g，5mmol)15mL甲醇，再转移至含有25mL 硫代硫酸钠水溶液(3.16g)室温反应15分钟后，加入碳酸氢钠(1.68g)中和，继续搅拌 10分钟，过滤，用甲醇洗涤滤渣(20mL×3)，再把滤液浓缩用硅胶柱进行纯化，得到化合物9-2。
6)化合物11-2的合成
称取5)所得的化合物9-2溶于一定量的DMF中，在冰浴条件下加入适量0.6M的5-异硫氰酸基-1,3-二甲基-1H-吡唑(化合物10)的二氧六环溶液，控制化合物9-2和化合物10的摩尔比为1；随后加入等摩尔量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)缩合剂，最后加入三乙胺，进行环合反应，投料后转移至室温反应过夜，通过柱层析纯化得到化合物11-2。
7)化合物12-2的合成
称取6)所得的化合物11-2溶于甲醇于反应瓶中，再冰浴条件下往反应瓶缓慢滴加适量盐酸/二氧六环混合液，反应液在室温下进行脱除氨基保护基的反应，搅拌至反应完全，减压除去溶剂，过硅胶柱纯化得到目标产物化合物12-2，记作“DABI-Et3-NH2”。(1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ7.91-8.14(m,2H),7.69((d,J＝0.9Hz,1H),7.66–7.35(m,4H),6.53(d, J＝14.5Hz,2H),5.90–5.79(m,2H),4.96–4.86(m,4H),4.47-4.58(m,4H),4.07(d,J＝5.0Hz,2H),3.57(s,2H),3.22(br d,J＝11.8Hz,2H),3.40–3.37(m,4H),3.27(d,J＝
6.0Hz,2H),2.62(t,J＝5.5Hz,2H),2.11(d,J＝11.0Hz,6H),1.24–1.33(m,6H).)ESI-MS: m/z 822.6[M]+，calculated 821.4。
实施例3.干扰素刺激蛋白靶向的放射性核素标记化合物——[18F]F-NOTA-PEG2-DABI
合成路线如下：
Figure BDA0002926736520000161
具体包括以下步骤：
1)NOTA-PEG2-DABI的合成
称取实施例1制备的DABI-PEG2-NH2与NOTA-NHS等摩尔比溶于适量DMF，再加入三乙胺，反应48h，反应结束后，加入适量盐酸酸化后用高效液相色谱纯化(HPLC)，流动相条件：半制备色谱柱(250×10mm,5μm,Thermo)，A相：水+0.1％三氟乙酸(TFA)，B 相：乙腈+0.1％TFA。梯度淋洗条件：0-5min：20％-28％B相；5-15min：28％B相；15-20 min：28％-39％B；20-25min：39％-95％B；25-40min：20％B相，流速：3mL/min，紫外波长：254nm。纯化后的溶液真空干燥得到目标产物。
2)[18F]F-NOTA-PEG2-DABI冻干药盒的制作
取适量的本实施例步骤1)制得的NOTA-PEG2-DABI溶于0.5mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝4.2)，配成0.5mg/mL溶液，再称取适量的氯化铝(AlCl3)溶于醋酸-醋酸钠溶液(pH＝4.2)得到终浓度为0.008mg/mL，将上述两种溶液等体积均匀混合，经无菌过滤后分装于1.5mL Axygen无挂壁冻存管中，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，加塞密封，得到冻干药盒。根据药盒产量以及对每支药盒中组分含量要求的不同，可调节化合物 NOTA-PEG2-DABI以及氯化铝的用量，使它们的重量比落在(20～100)：1范围内。
3)[18F]F-NOTA-PEG2-DABI的标记
a、取一只本实施例步骤2)制得的冻干药盒，先加入0.5mL 0.5mol/L的醋酸-醋酸盐缓冲液(pH 4.2)，全部溶解后加入约37～3700兆贝可(MBq)18F-靶水(加速器直接获得18O水)，密闭60-100℃反应15min，冷却。
b、Radio-TLC验证纯度，放化纯＞95％,反应液即可直接使用，此外，可以使用Sep-Pak C18色谱柱分离纯化：依次以10mL无水乙醇及10mL纯水活化柱子，用空气吹干，将反应液注入到柱子中，以缓冲液或水冲洗色谱柱除去未反应的18F离子，再以60％-80％的乙醇溶液淋洗柱子，收集淋洗液并浓缩，再用缓冲液或生理盐水稀释，即得18F标记探针注射液。
c、上述合成步骤中的所使用的其它化学物质为市售商品。
实施例4.干扰素刺激蛋白靶向的放射性核素标记化合物——[177Lu]Lu-DOTA-PEG2-DABI
合成路线如下：
Figure BDA0002926736520000171
具体包括以下步骤：
1)DOTA-PEG2-DABI的合成
DOTA-PEG2-DABI的制备步骤与实施例3基本相同，仅用DOTA-NHS替换NOTA-NHS。
称取一定量实施例1制备的DABI-PEG2-NH2与DOTA-NHS溶于DMF中，加入三乙胺反应过夜，反应结束后，加入适量盐酸酸化后用高效液相色谱纯化(HPLC)，流动相条件：半制备色谱柱(250×10mm,5μm,Thermo)，A相：水+0.1％三氟乙酸(TFA),B相：乙腈+0.1％TFA。梯度淋洗条件：0-5min：20％-28％B相；5-15min：28％B相；15-20min： 28％-39％B；20-25min：39％-95％B；25-40min：20％B相，流速：3mL/min，紫外波长： 254nm。纯化后的溶液真空干燥得到DOTA-PEG2-DABI。
2)DOTA-PEG2-DABI冻干药盒的制作
取适量的DOTA-PEG-DABI约1mg溶于生理盐水中,配成0.5mg/mL溶液并转移至10mL规格青霉素瓶，每个瓶子装100μL上述溶液，再一起冻干压盖密封保存，得冻干药盒。
3)取一个本实施例步骤2)制得的冻干药盒，先后加入1mL醋酸铵缓冲液(0.4M, pH＝5.52)和37～3700MBq177Lu溶液，在100℃下反应30min，冷却。
4)Radio-TLC验证纯度，放化纯＞95％,反应液即可直接使用，此外,可以使用Sep-Pak C18色谱柱分离纯化：依次以10mL无水乙醇及10mL纯水活化柱子，用空气吹干，将反应液注入到柱子中，以缓冲液或水冲洗色谱柱除去未反应的177Lu离子，再以无水乙醇淋洗柱子，收集淋洗液并浓缩，再用缓冲液或生理盐水稀释，即得177Lu标记探针注射液。
5)也可以选择用半制备反相色谱柱进行纯化：色谱柱信号(250×10mm,5 μm,Thermo)，A相：水+0.1％三氟乙酸(TFA),B相：乙腈+0.1％TFA。梯度淋洗条件：0-5 min：20％-28％B相；5-15min：28％B相；15-20min：28％-39％B；20-25min：39％-95％ B；25-40min：20％B相.流速：3mL/min，紫外波长：254nm。
实施例5.干扰素刺激蛋白靶向的放射性核素标记化合物——[68Ga]Ga-DOTA-PEG2-DABI
1)取一只实施例4步骤2)制备的DOTA-PEG2-DABI冻干药盒，先加入1mL 0.25M 醋酸钠溶液，再加入4mL的68Ga淋洗液，密闭60-100℃反应20min，冷却。
2)Radio-TLC验证纯度，放化纯＞95％,反应液即可直接使用，此外,可以使用Sep-Pak C18色谱柱分离纯化：依次以10mL无水乙醇及10mL纯水活化柱子，用空气吹干，将反应液注入到柱子中，以缓冲液或水冲洗色谱柱除去未反应的68Ga2+离子，再以 60％-80％的乙醇溶液淋洗柱子，收集淋洗液并浓缩，再用缓冲液或生理盐水稀释，即得68Ga 标记探针注射液。
实施例6.干扰素刺激蛋白靶向的放射性核素标记化合物——131IBA-PEG2-DABI
合成路线如下：
Figure BDA0002926736520000191
1)具体包括以下步骤：称取少量IPBA标记前体(1mg，3μmol)与1.5mL反应瓶中，加入50μL含有氧化亚铜(0.4μmol)和1,10-邻菲咯啉(0.8μmol)的乙腈溶液，最后加入 5-10μL131I溶液(约185MBq)于反应瓶中，室温密闭反应1h，反应结束后，通过硅胶板纯化得到131IPBA。
2)将131IPBA溶液加入至含有0.5mg的实施例1制备的DABI-PEG2-NH2的反应瓶中，再加入30μL三乙胺，在60℃密闭反应1h，反应结束，冷却，通过高效液相色谱纯化：色谱柱(4.6×250mm,5μm,
Figure BDA0002926736520000192
Thermo)，液相条件：A相：水+0.1％三氟乙酸(TFA),B 相：乙腈+0.1％TFA。梯度淋洗条件：0-20min：5％-95％B相；20-25min：95％B相；25-40 min：5％B相，流速：1mL/min，紫外波长：254nm。
实验例
以下对实施例3-6所制备的放射性核素标记化合物的性能测定进行描述：
脂水分布系数
1.化合物的脂水分布系数
脂水分布系数(log P)的计算公式为：
P＝(Ia-I)/(Ib-I)
其中Ia代表油相中测定的放射性计数、Ib代表水相中测定的放射性计数、I代表背景计数。
将100μL(约有0.74MBq活度)加入到含有1mL PBS(0.05mol/L,pH＝7.4)和0.9mL正辛醇混合液的1号离心管中，涡旋震荡3min之后，10000rpm离心3min，使两相明显分层，从PBS相及正辛醇相中各取100μL液体并通过γ-counter放射性计数。实验重复三次取平均值，计算的P1
用移液枪从1号离心管取油相0.3mL转移至2号离心管，再往2号离心管加入1mL的PBS、0.7mL正辛醇，先震荡后离心，重复第一次分配的操作，得到第二次分配值P2,
重复上述的操作，指导前后两次计算的Px非常接近，取最后一次计算的P值作为化合物4的正辛醇-PBS缓冲溶液(pH＝7.4)的最终结果，通过计算可得logP的值
表1.脂水分布系数
探针 酯水分配系数
[<sup>18</sup>F]F-NOTA-PEG<sub>2</sub>-DABI -0.31±0.02(n＝8)
[<sup>68</sup>Ga]Ga-DOTA-PEG<sub>2</sub>-DABI -1.15±0.09(n＝8)
[<sup>177</sup>Lu]Lu-DOTA-PEG<sub>2</sub>-DABI -0.57±0.04(n＝8)
[<sup>131</sup>I]IBA-PEG<sub>2</sub>-DABI 2.96±0.08(n＝8)
由实验结果可知，不同的核素引入基团对于整个化合物的脂溶性有一定的影响，不同脂溶性的化合物具有更加广阔的应用范围。
体外稳定性
移取20μL实施例3-5所制备的放射性核素标记化合物，约有3.7MBq活度)分别加入含有100μL PBS(pH＝7.4)和鼠血清的离心管中，在37℃共孵育12小时，孵育结束后，取适量的共孵育溶液，经过处理后进HPLC，分析放射化学纯度，对于PBS共孵育溶液，移取适量的活度，过0.22μm针式滤膜，再进样，对于血清共孵育溶液，先移取适量的血清共孵育溶液，再加入过量的乙腈使蛋白析出来，进HPLC前先经过0.22μm针式滤膜过滤。HPLC 流动相条件：C18柱(250×4.6mm，5μm，Thermo)，流动相A相为水+0.1％TFA，B相为乙腈+0.1％TFA：梯度条件：0-25min，B相：5％-95％；25-30min，B相：95％；30-40min， B相：5％，流速为1mL/min。
由图1、2可知，无论是[68Ga]Ga-DOTA-PEG2-DABI还是[177Lu]Lu-DOTA-PEG2-DABI或者是[18F]F-NOTA-PEG2-DABI在PBS和鼠血清中于37℃条件下孵育不同的时间。标记化合物保持完整，未见分解，放射化学纯度大于95％，说明这三种化合物的体外稳定性良好。
生物分布
选用8周左右的Balb/c雌鼠(体重约20g)，在其右腿注射1×105CT26细胞或者Panc02 细胞，当皮下瘤长直径为0.5-1.0cm时，通过小鼠尾静脉注射约0.74MBq实施例3、4制备的标记化合物，在注射后不同时间将小鼠断头处死(每组时间点3只)，取其血、脑、心、肝、肺、肾、肠、脾、肌肉以及骨等感兴趣的器官与组织，分别称重后测量其放射性计数，结果以每克组织或器官的百分摄取剂量表示(％ID/g)。
如图3的[18F]F-NOTA-PEG2-DABI生物分布结果所示，30min的时间点，肿瘤组织的信号值达到最大值，％ID/g大于10，明显高于肌肉组织,随着时间的推移，血液和非靶器官的％ID/g值会逐步下降，而肿瘤部位的摄取保持在一定水平，具有较好的特异性。
如图5的生物分布结果所示，[177Lu]Lu-DOTA-PEG2-DABI在小鼠体内的分布情况与[18F]F-NOTA-PEG2-DABI的类似，值得注意的是，在24小时的时间点，除肝脏之外其它的脏器的％ID/g都降到了1以下，而肿瘤组织维持较为稳定的摄取，％ID/g值均在10以上，。该生物分布的结果说明该177Lu-DOTA-PEG2-DABI是可以特异性识别并且滞留在肿瘤部位。
PET/SPECT显像
选用8周左右的Balb/c雌鼠(体重约20g)，在其右腿注射1×105CT26或者Panc02细胞，当皮下瘤长至0.8-1.0cm时，即可进行成像，将肿瘤鼠(每组3只)麻醉后俯卧于SPECT/CT或PET/CT床位上，通过经尾静脉注射0.1mL约7.4MBq的实施例3-4制备的标记化合物。根据探针的不同，在注射后不同的时间点进行成像。在肿瘤或主要脏器等部位画ROI，计算相应的靶与非靶比值。探讨分子探针在肿瘤模型中图像清晰度、肿瘤摄取率、肿瘤中滞留时间以及在正常组织特别是肾脏、肝和肌肉中的摄取情况。计算相应的靶与非靶比值。
以[18F]F-NOTA-PEG2-DABI为例子，如图4所示，在给药30分钟后的PET成像来看，探针在肿瘤有明显的富集，在30分钟到60分钟之间会维持较好的摄取值，该结果与生物分布结果相一致(图3)，1小时后，探针会慢慢从肿瘤部位代谢出去，具有合适的清除速率，具备一种优良的成像探针的特性。
对于SPECT成像来说，以[177Lu]Lu-DOTA-PEG2-DABI为例，如图6所示，在给药后1小时SPECT/CT成像，小鼠肿瘤部位有明显的信号。在之后的时间点的显像结果表明，非特异性摄取的器官或者组织信号会被代谢清除掉，而探针在肿瘤部位富集程度进一步增加，在24小时的时间点，肿瘤的信号特别明显，除了肝脏有部分摄取之外，其余的背景十分干净，显像的结果与生物分布的结果(见图5)是相一致的，充分说明[177Lu]Lu-DOTA-PEG-DABI 不仅能够作为一种显像探针，对于干扰素刺激蛋白的可视化，而且其治疗核素的性质，可用于放射性治疗或者与免疫治疗相结合。
ELISA(酶联免疫吸附剂测定)细胞IFN-β表达
将1x105鼠源腹膜巨噬细胞raw264.7铺于24孔板细胞培养板中，待细胞贴壁生长后，去除培养基，随机分为3个实验组和1个对照组，3个实验组分别加入0.5μM实施例4制备的DOTA-PEG2-DABI、实施例3制备的NOTA-PEG2-DABI和实施例1制备的 DABI-PEG2-NH2至铺好的细胞板中，对照组不加入任何试剂；各组均在37℃孵育4小时，每个浓度三个平行实验。
孵育结束后，用移液枪取出上清液，做好标记，用商业化的ELISA试剂盒测定上清液中 IFN-β的浓度。
从ELISA结果可知(见图7)，相比较于对照组，DOTA-PEG2-DABI、NOTA-PEG2-DABI、DABI-PEG2-NH2均能够诱导细胞产生IFN-β因子，具有统计学上的差异(p<0.001)IFN-β的产生标志着STING通路的激活，而该通路的激活与抗肿瘤效应息息相关，因此，上述化合物因具有激活STING通路的特性，有望成为一种抗肿瘤药物。

Claims (11)

1.一类二聚的酰胺基苯并咪唑化合物，其结构如下式(I)所示：
Figure FDA0003499377720000011
其中，R0为
Figure FDA0003499377720000012
n取1-3的整数。
2.一类具有抗肿瘤活性的化合物，其结构如下式(I-3)所示，
Figure FDA0003499377720000013
其中，R0为
Figure FDA0003499377720000014
n取1-3的整数；R为功能性基团，选自以下任意一种：
Figure FDA0003499377720000015
3.一类干扰素刺激蛋白靶向的放射性核素标记化合物，其结构通式如下式(II)：
Figure FDA0003499377720000021
其中，R2为干扰素刺激蛋白靶向基团，R3为小分子连接链段；所述的R1是利用配体螯合放射性核素的基团，或是自带放射性核素的基团；
所述的利用配体螯合放射性核素的基团选自：HYNIC基团、NOTA基团、DOTA基团或DTPA基团中的任意一种利用配体螯合放射性核素形成的基团；所述的放射性核素选自99mTc、111In、89Zr、18F、177Lu、64Cu、131I、125I、124I、67Ga或68Ga中的任意一种；
所述的自带放射性核素的基团自以下任意一种：
Figure FDA0003499377720000022
所述的干扰素刺激蛋白靶向基团结构如下式(I-3)所示：
Figure FDA0003499377720000023
所述的小分子连接链段R3选自
Figure FDA0003499377720000024
其中n为1-3的整数；
则所述的标记物结构如下式(II-1)所示：
Figure FDA0003499377720000025
4.权利要求3所述的放射性核素标记化合物，其特征在于：所述式(II-1)中的n为1、2或3。
5.权利要求3-4任意一项所述的放射性核素标记化合物，其特征在于：所述的R1选自HYNIC基团、NOTA基团、DOTA基团或DTPA基团中的任意一种利用配体螯合放射性核素形成的基团；所述的放射性核素选自99mTc、111In、89Zr、18F、177Lu、64Cu、131I、125I、124I、67Ga或68Ga中的任意一种。
6.权利要求3-4任意一项所述的放射性核素标记化合物，其特征在于：所述的R1选自以下任意一种：
Figure FDA0003499377720000031
7.一种制备权利要求5所述的放射性核素标记化合物的方法，包括如下步骤：
(1)合成式(I-1)所示结构的二聚的酰胺基苯并咪唑化合物，记作R2-PEGn-NH2，其中R2是权利要求3所述的干扰素刺激蛋白靶向基团，n＝1～3的整数；
Figure FDA0003499377720000032
(2)制备R-NHS溶液，其中R选自HYNIC基团、NOTA基团、DOTA基团或DTPA基团中的任意一种：将选自HYNIC、NOTA、DOTA或DTPA中的一种或多种的核素螯合物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺混合反应过夜，过滤即得；
(3)合成R-PEGn-R2：将(2)所得R-NHS与(1)所得R2-PEGn-NH2溶于DMF，加入适量的三乙胺，室温搅拌过夜，粗产物用高相液相色谱HPLC纯化，真空干燥得干扰素刺激蛋白靶向放射性探针标记前体R-NH-PEGn-R2，其中，R是HYNIC基团、NOTA基团、DOTA基团或DTPA基团中的任意一种，R2是权利要求3所述的干扰素刺激蛋白靶向基团，n＝1～3的整数；
(4)用放射性金属核素与(3)所得标记前体R-NH-PEGn-R2混合配位，即可得到所述的一种干扰素刺激蛋白靶向放射性核素标记化合物；所述的放射性金属核素选自99mTc、111In、89Zr、18F、177Lu、64Cu、131I、125I、124I、67Ga或68Ga中的任意一种。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的合成式(I-1)所示结构的二聚的酰胺基苯并咪唑化合物，包括如下具体步骤：
a、4-氯-3硝基-5甲氧基苯甲酰胺与(4-氨基丁-2-烯-1-基)氨基甲酸叔丁酯经芳香族亲核取代反应，得到化合物3；化合物3经水解得到化合物4；
b、4-氯-3硝基-5羟基苯甲酰胺与羟基聚乙二醇氨基-Boc经双分子亲核取代反应，得化合物7；所述的羟基聚乙二醇氨基-Boc结构记作HO-PEGn-NH-Boc，其中n取1-3的整数；
c、b所得的化合物7与a所得的化合物4得经芳香族亲核取代反应，到化合物8；
d、将c所得的化合物8的硝基还原为氨基，得化合物9；
e、d所得的化合物9与5-异硫氰酸基-1-乙基-3-甲基-1H-吡唑在缩合剂作用下环合反应后得化合物11；化合物11脱去氨基保护基，得化合物12，即R2-PEGn-NH2，其中R2是干扰素刺激蛋白靶向基团，定义与权利要求3所述的R2相同，n＝1～3的整数。
9.一种制备权利要求6所述的放射性核素标记化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[1].制备4-碘苯甲酸、4-氟苯甲酸、4-碘苯基丁酸作为标记前体；
[2].对[1]所得标记前体进行标记，得到带有放射性核素的化合物；所述的放射性核素为18F或131I；
[3].将[2]所得带有放射性核素的化合物与权利要求7所述步骤(1)所得R2-PEGn-NH2溶于DMF，加入适量的三乙胺，60℃反应1h，用高相液相色谱HPLC纯化，即可得到干扰素刺激蛋白靶向放射性核素标记化合物R1-PEGn-R2，其中R1为带有放射性核素的基团，定义与权利要求6所述R1相同，R2为干扰素刺激蛋白靶向基团，定义与权利要求3所述的R2相同，n＝1～3的整数。
10.权利要求3所述的放射性核素标记化合物在制备肿瘤或炎症的诊断或治疗药物中的应用。
11.权利要求10所述的应用，其特征在于：所述的应用是在制备用于肿瘤或炎症诊断的显像药剂中的应用，或者是在制备用于肿瘤免疫治疗的药物中的应用。
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