CN104830316A - 一种用于核素标记的靶向探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于核素标记的靶向探针及其制备方法和应用，该配合物的结构通式如下：或其中R’为核素螯合基团，R为靶向基团，D_n是以炔丙胺为初始反应物、通过反复的迈克尔加成反应和酰胺化反应形成的分子骨架，其外围基团为氨基，n代表不同代数且其数值为大于等于0的整数，m＝2ⁿ。本发明的用于核素标记的靶向探针中的多聚体有利于提高比活度，通过仪器扫描能够得到高质量的显像结果，起到有效监测肿瘤或炎症疾病的作用。同时，形成多聚体有利于在一个分子上携带更多的核素，提高病灶部位的核素浓度，起到更好的治疗效果。

Description

一种用于核素标记的靶向探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医学影像技术领域，具体涉及一种用于核素标记的靶向探针及其制备方法和应用。

背景技术

分子影像是一被誉为21世纪的医学影像学，因其能够为疾病的早发现、早诊断、早治疗提供强有力的保证。靶向性好、特异性强的显像探针是分子影像的关键，只有获得性能良好的显像剂，才能更好地诊断和治疗疾病。

一般来说，显像探针包含两个主体部分：靶向基团和标记基团。靶向基团和标记基团之间以某种化学形式相连。好的靶向基团可以将分子顺利带到疾病部位，从能起到定为效果。以叶酸为例，近来多项研究以叶酸作为靶向分子，实现药物的靶向运输，究其原理，主要是利用叶酸受体(FR)在某些肿瘤部位的过度表达而在正常组织低水平表达的特性。叶酸受体在许多肿瘤组织中高表达，如卵巢癌、肾癌、子宫癌、睾癌、脑瘤、结肠癌、肺腺癌等等。叶酸分子对这些肿瘤具有很高的选择性。将叶酸修饰到一些分子结构中，可提高显像探针在靶组织中的摄取并最终获得高质量的显像效果。在过去很长的一段时间里，一系列用于PET及SPECT显像的叶酸靶向分子探针应运而生。

然而，只有¹¹¹In-DTPA-folate和^99mTc-EC20两种探针实现了临床。正如下表中所显示的那样，对于^mTc(CO)₃-DTPA-folate，其在肝脏及肌肉中有明显的摄取，从而导致了瘤/肝及瘤/肉比值不甚理想；^99mTc-DTPA-folate在荷KB肿瘤小鼠上进行了叶酸靶向实验，实验证明在4h肿瘤部位有很高的放射性摄取，但是其稳定性需要建立在高浓度DTPA-folate上。正如所描述的那样，多数的小分子显像探针的设计思路为一个靶向分子连接一个显像基团，但对于一些比活度要求高或是需要局部组织高核素浓度的受体类探针而言，一个分子中只含有一个显像基团往往不能满足需求。故在一个分子上连接多个核素，同时保障其对靶向部分的高亲和力，对于提高图像质量具有重要作用。

CN101925367A公开了一种治疗性标记的萘并二蒽酮或菲并[1,10,9,8-opqra]苝-7,14-二酮化合物,该化合物包含具有不稳定核的化学元素或同位素，在其衰变成稳定态期间可发射辐射,这种辐射足以破坏临近的细胞或组织以用于靶向性放射治疗，从而提高接受坏死诱导抗肿瘤治疗的温血动物的治愈可能性。

CN102284069A公开了一种荧光和放射性核索双标记的靶向显像剂的制备方法与应用，所述化合物是111In-DTPA-Bz-NH-SA-K(IR-783-S-Ph-CO)-c(CGRRAGGSC)NH2,称之为白介素11受体α链双标显像剂，由荧光显像剂IR-783-S-Ph-COOH、放射性核素铟-111和循环多肽三部分构成。循环多肽(1)是一种理想的造影剂的载体,能够靶向得定位到IL-11R-α链。

CN101035565A公开了一种FDG替代物，它们由二成分系统组成,所述系统一方面包含与叠氮化物、炔或膦相连的结构单元如葡萄糖，而另一方面包含与叠氮化物、炔或膦相连的可检测标记物，所述可检测标记物是施陶丁格连接反应或[3+2]环加成反应中与葡萄糖相连的基团的对应部分。

CN102600489A公开了一种含iRGD序列的多肽放射性药物，所述多肽(peptide)的序列中含有或或者该多肽经偶联放射性金属核素或者正电子核素标记而成，其具有分子靶向整合素αvβ3受体、Neuropilin-l受体和细胞转导三重功能，其作为诊断药物会大大提高靶/非靶比。

WO2003/097105A1公开了一种可以被双特异性抗体或抗体片段结合的靶向构建体，所述抗体或抗体片段有至少一个特异性结合靶组织的臂，和至少另外一个特异性结合靶向构建体的臂。靶向构建体含有载体部分，所述载体部分包含或携带至少一个可被所述双特异性抗体或抗体片段的至少一个臂识别的表位。

WO2006/038185A1公开了一种用于靶向医学显像或治疗的试剂盒，其包括：至少一个寻靶探针，其包括一级寻靶部分和二级靶标；和至少一个另外的探针，其选自：包括二级寻靶部分和标记的显像探针；或包括二级寻靶部分和药物活性化合物的治疗探针，其特征在于，所述寻靶探针或所述显像或治疗探针中的任一个包括至少一个叠氮基，分别作为二级靶标和二级寻靶部分，而另一个探针包括至少一个膦基团，所述膦和所述叠氮基是施陶丁格连接用的反应配偶子。

“放射性核素标记多肽在肿瘤应用研究进展”，张丽等，肿瘤学杂志，2010年06期综述了用不同的放射性核素对RGD肽进行标记的方法，综述了对RGD结构的改进修饰中以及存在的问题，同时就不同放射性核素标记RGD肽的应用现状与研究进展作一综述。

为了解决现有技术中存在的这些问题，本发明人经过深入研究和大量实验，在此提出靶向基团多聚体化合物的概念，其中在用于核素标记的靶向探针在靶向基团以及配位结构之间引入PEG链，在制备方法中将配位结构及靶向基团通过click反应相连接。这样的设计方式在现有技术中尚未见报导，同时现有技术中就这样的设计方式也未给出设计思路启示或教导。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于核素标记的靶向探针。

本发明的另一目的在于提供上述用于核素标记的靶向探针的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述用于核素标记的靶向探针的应用

本发明的具体技术方案如下：

一种用于核素标记的靶向探针，其结构通式如下：

其中R’为核素螯合基团，R为靶向基团，D_n是以炔丙胺为初始反应物、通过反复的迈克尔加成反应和酰胺化反应形成的分子骨架，其外围基团为氨基，n代表不同代数且其数值为大于等于0的整数，m＝2ⁿ。n优选为0，优选为1，更优选为2或3。所述R’可以彼此独立地相同或不同。

在本发明的一个优选实施方案中，所述R’为选自HYNIC、NOTA、DOTA和DTPA中的一种或多种。其结构如下：

在本发明的一个优选实施方案中，所述核素为^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F、¹⁷⁷Ru、¹⁵⁷Gd、⁶⁴Cu和/或^67/68Ga。

在本发明的一个优选实施方案中，所述R为衍生自叶酸、表皮生长因子、RGD或乳糖酸的靶向基团。

一种上述用于核素标记的靶向探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)制备R-NHS或R-PEG-NHS溶液；

(2)合成R-N₃或R-PEG-N₃：将3-叠氮丙胺滴加到上述R-NHS或R-PEG-NHS溶液中，反应完全后滴入乙醚中析出沉淀，收集沉淀并干燥，得R-N₃或R-PEG-N₃；

(3)制备R’-NHS溶液：将核素螯合物(HYNIC、NOTA、DOTA和DTPA中的一种或多种)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳二亚胺(DCC)混合反应过夜，过滤即得；

(4)分子骨架的合成：以炔丙胺为初始反应物、通过反复的迈克尔加成反应和酰胺化反应形成的分子骨架。

(5)将R’连接至所述分子骨架：将分子骨架溶于DMF，滴加到上述R’-NHS溶液中，反应完全后将反应液浓缩，得到固体，该固体经HPLC纯化或将该淡黄色固体分散到乙酸乙酯中，加热回流，热过滤得淡黄色固体，真空干燥的即得连接有R’的分子骨架；

(6)将R-N₃或R-PEG-N₃搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合液中，再加入上述连接有R’的分子骨架、催化剂CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠进行反应，整个反应体系处于氮气保护中，反应完全后用碱调节直到反应液变澄清后过滤，滤液用酸调节产生大量沉淀，收集沉淀，真空干燥得所述用于核素标记的靶向探针。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将靶向物质溶解于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及二环己基碳二亚胺(DCC)，避光反应完全后过滤，即得R-NHS溶液。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)包括如下步骤：

a、将靶向物质(叶酸、表皮生长因子、RGD或乳糖酸)溶解于溶剂中，加N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，避光反应完全后过滤，得R-NHS溶液

b、将不同分子量的PEG溶于溶剂中，滴加到上述R-NHS溶液中，反应完全后将反应液滴加到二氯甲烷中产生黄色沉淀，固液分离得固体，再用二氯甲烷及乙醚洗涤并真空干燥，得R-PEG固体；

c、将上述R-PEG固体溶解于有机溶剂中，加入2倍当量的丁二酸酐及0.5倍当量4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下反应完成后将反应液滴加到二氯甲烷中产生黄色沉淀，固液分离得固体，再用二氯甲烷及乙醚洗涤并真空干燥，得R-PEG-COOH；

d、将上述R-PEG-COOH溶解于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，室温避光反应完全后将反应液过滤得到R-PEG-NHS溶液；

e、将等摩尔量的3-叠氮-丙胺滴加到上述R-PEG-NHS溶液中，加入等摩尔量N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应完全后滴入乙醚中析出沉淀，收集沉淀并干燥，得R-PEG-N₃。

在本发明的一个优选实施方案中，所述分子骨架的制备反应式如下所示：

所述分子骨架的端部的氨基可以与R’连接，所述分子骨架的端部的炔基可与化合物分子的其它部分连接。

一种上述用于核素标记的靶向探针作为肿瘤及炎症性相关疾病显像剂的应用。

本发明的突出的有益效果是：

1、本发明的用于核素标记的靶向探针选择的配位基团具有标记能力强、标记时间短、标记产率高等特点，无须后续纯化即可使用，更加有利于标记物的商业化应用与临床推广。

2.本发明的用于核素标记的靶向探针中的多聚体有利于提高比活度，通过仪器扫描能够得到高质量的显像结果，起到有效监测肿瘤或炎症疾病的作用。同时，形成多聚体有利于在一个分子上携带更多的核素，提高病灶部位的放射性浓度，起到更好的治疗效果。这样的结构设计在现有技术中没有记载在，也没有给出相应的技术启示或教导，是本领域技术人员不容易想到的。

3、本发明的用于核素标记的靶向探针在靶向基团以及配位结构之间引入PEG链，可以增加靶向基团到配位结构之间的距离，避免相互之间的影响，同时也增加配合物的水溶性，改善标记配合物的药代动力学性质，加快示踪剂在非靶组织中的清除速度，增加靶/非靶比值，使得显像更加清晰，通过提高显像质量达到更好的诊断效果。这样的效果是先前所没预料到的。

4、本发明的用于核素标记的靶向探针的制备思路扩展性强，靶向基团和配位基团均可任意替换为其他常用靶向分子和配体，从而获得不同靶向功能的可用于不同核素标记的分子靶向探针。

5、本发明的制备方法将配位结构及靶向基团通过click反应相连接，反应高效，纯化简单，利于大规模生产。

附图说明

图1为本发明的实施例4中不同代数分子骨架分子骨架(D_n)红外及核磁分析结果图

图2为本发明的实施例4中叶酸靶向的单体及多聚体红外分析图及紫外分析图(请在

图3为本发明的实施例6中^99mTc-FA-D_n-HYNIC_m及^99mTc-FA-PEG-D_n-HYNIC_m的细胞摄取实验结果；

图4为本发明的实施例6中^99mTc标记得叶酸靶向HYNIC单体及多聚体探针在荷KB瘤裸鼠2h的SPECT/CT显像图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1——叶酸靶向的HYNIC单体的合成

1)FA-N₃的合成

I)FA-NHS的合成：将叶酸溶于二甲基亚砜后，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及二环己基碳二亚胺(DCC)，避光活化后过滤。

II)FA-N₃的合成：将3-叠氮丙胺滴加到上述FA-NHS滤液中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应完全后滴入乙醚中析出沉淀，收集沉淀并干燥，得FA-N₃。

3)D₀-HYNIC的合成

I)HYNIC-NHS的合成：将6-氯-尼古丁酸加到适量85％的水合肼中，在高温加热使之完全反应后冷却浓缩得到淡黄色固体。将固体溶解在水中，用酸调节pH为弱酸性，出现沉淀后过滤，所得固体用95％乙醇和乙醚洗涤，真空干燥。将干燥后的产物溶于一定量的DMF中，加入对应摩尔量N,N-二甲基苯甲醛，室温搅拌6-10h，再加入适量NHS和DCC，室温搅拌过夜。反应完成后过滤除去不溶物，得到含有HYNIC-NHS的滤液，低温保存。

II)D₀-HYNIC的合成：将炔丙胺(D₀)溶解在DMF中，滴加到含有HYNIC-NHS的滤液，室温反应2d。将反应液减压浓缩，得到淡黄色固体。将固体分散到乙酸乙酯中，加热回流，将其热过滤得淡黄色固体，真空干燥的D₀-HYNIC。

4)FA-D₀-HYNIC₁的合成

将FA-N₃搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合液中，搅拌中加入1eq.D₀-HYNIC(合成步骤参见实施例1)，整个反应体系处于氮气保护中。注入少量CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠。反应在加热条件下避光进行。结束反应后，用碱调节直到溶液变澄清，然后过滤。将滤液用酸调节得沉淀，离心并用乙醚洗涤沉淀3次。真空干燥得叶酸靶向的单体探针FA-D₀-HYNIC₁。

实施例2——PEG修饰的叶酸靶向HYNIC单聚体的合成

1)FA-PEG-N₃的合成

I)FA-NHS的合成：FA-NHS的合成参考实施例1。

II)FA-PEG的合成：将FA-NHS的滤液缓慢滴加到2,2'-(乙烯二氧)双(乙胺)的DMSO中，加入N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温下反应2d。将反应液滴加到大量的二氯甲烷中产生大量黄色沉淀，离心或用砂芯漏斗过滤得固体，并用二氯甲烷及乙醚洗涤，真空干燥箱中干燥，得黄色粉末状固体FA-PEG。

III)FA-PEG-COOH的合成：将1eq.FA-PEG溶解于DMSO中，加入2eq.的丁二酸酐及0.5eq.4-二甲氨基吡啶(DMAP)，室温下反应2d。将反应液滴加到大量的二氯甲烷中产生大量黄色沉淀，离心或用砂芯漏斗过滤得固体，并用二氯甲烷及乙醚洗涤，真空干燥箱中干燥，得黄色粉末状固体FA-PEG-COOH。

IV)FA-PEG-NHS的合成：FA-PEG-NHS的合成过程可参考FA-NHS的制备。。

V)FA-PEG-N₃的合成：将等摩尔量的3-叠氮丙胺滴加到上述FA-PEG-NHS滤液中，加入等摩尔量N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，反应完全后滴入乙醚中析出沉淀，收集沉淀并干燥，得FA-PEG-N₃。

2)D₀-HYNIC的合成

D₀-HYNIC的合成可参考实施例1的合成步骤。

3)FA-PEG-D₀-HYNIC₁的合成

将1eq.FA-PEG-N₃搅拌溶解于t-BuOH/H₂O(V:V＝1:1)，搅拌中加入1eq.D₀-HYNIC，整个反应体系处于氮气保护中。用针注入CuSO₄·5H₂O(0.1eq.)及抗坏血酸钠(0.2eq.)。加热避光反应，反应结束后冷却到室温。搅拌中缓慢滴加NaOH溶液直到溶液变澄清，然后过滤。将滤液用HCl溶液调节pH到酸性，离心得沉淀，并用乙醚洗涤3次。真空干燥得得淡黄色固体FA-PEG-D₀-HYNIC₁。

实施例3——叶酸靶向HYNIC多聚体的合成

1)分子骨架D_n的合成

I)D_0.5的合成：在冰水浴中，将溶有炔丙胺(D₀,)的甲醇溶液缓慢滴加到过量的丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，氮气保护下室温反应3d，减压浓缩得到黄色液体(D_0.5)。

II)D₁的合成：在冰水浴中，将D_0.5溶于甲醇，在氮气保护下缓慢滴加到含有过量乙二胺的甲醇溶液中，后在室温下搅拌3d，浓缩得淡黄色液体D₁。

III)D_1.5的合成：在冰水浴中，将溶有D₁的甲醇溶液缓慢滴加到过量丙烯酸甲酯的甲醇溶液中，氮气保护下室温反应4d，减压浓缩得到黄色液体(D_1.5)。

IV)D₂的合成：在冰水浴中，将D_1.5溶于甲醇，在氮气保护下缓慢滴加到含有过量乙二胺的甲醇溶液中，后在室温下搅拌4d，浓缩得淡黄色液体D₂。

V)D_n的合成：D_n(n>1)树状分子的合成可参考D_0.5及D₁的制备过程。

2)FA-D_n-HYNIC_m的合成

I)D_n-HYNIC_m的合成：D_n-HYNIC_m的合成可参考实施例1中D₀-HYNIC的合成步骤。

II)FA-N₃的合成：FA-N₃的合成可参考实施例1中的合成步骤。

III)FA-D_n-HYNIC_m的合成：FA-D_n-HYNIC_m的合成可参考实施例1中FA-D₀-HYNIC₁的合成。将1eq.FA-N₃搅拌溶解于t-BuOH/H₂O(V:V＝1:1)，搅拌中加入1eq.D_n-HYNIC_m，整个反应体系处于氮气保护中。用针注入CuSO₄·5H₂O(0.1eq.)及抗坏血酸钠(0.2eq.)。加热避光反应，反应结束后冷却到室温。搅拌中缓慢滴加NaOH溶液直到溶液变澄清，然后过滤。将滤液用HCl溶液调节pH到酸性，离心得沉淀，并用乙醚洗涤3次。真空干燥得得淡黄色固体FA-D_n-HYNIC_m。

实施例4——PEG修饰的叶酸靶向HYNIC多聚体的合成

FA-PEG-N₃的合成

FA-PEG-N₃的合成可参考实施例2的合成步骤。

D_n-HYNIC_m的合成

D_n-HYNIC_m的合成可参考实施例3中的合成步骤。

FA-PEG-D_n-HYNIC_m的合成

FA-PEG-D_n-HYNIC_m的合成可参考实施例1中FA-D₀-HYNIC₁的合成。将1eq.FA-PEG-N₃搅拌溶解于t-BuOH/H₂O(V:V＝1:1)，搅拌中加入1eq.D_n-HYNIC_m，整个反应体系处于氮气保护中。用针注入CuSO₄·5H₂O(0.1eq.)及抗坏血酸钠(0.2eq.)。加热避光反应，反应结束后冷却到室温。搅拌中缓慢滴加NaOH溶液直到溶液变澄清，然后过滤。将滤液用HCl溶液调节pH到酸性，离心得沉淀，并用乙醚洗涤3次。真空干燥得淡黄色固体FA-PEG-D_n-HYNIC_m。

此外，DOTA、DTPA、NOTA等双功能螯合剂亦可在活化羧基之后与分子骨架结合；对于靶向分子，GRD等靶向分子可修饰叠氮基团；分子骨架和靶向基团通过click反应连接。

合成部分相关核磁、红外、紫外表征可参见图1、图2。

实施例5

1、^99mTc冻干药盒的制备

1)将适量单体或多聚体配体溶于生理盐水中；

2)配制一定浓度的TPPTS、tricine、氯化亚锡、甘露醇溶液，优选浓度为2-10mg/mL的TPPTS溶液、30-100mg/mL的甘露醇溶液、1-5mg/mL氯化亚锡溶液及40-160mg/mL的tricine溶液；

3)在10mL青霉素小瓶中依次加入500μL tricine溶液、200μL TPPTS溶液、适量配体、300μL甘露醇溶液以及20μL氯化亚锡溶液；

4)将上述混合液冻干后压盖密封保存，得冻干药盒；

2、^99mTc标记的叶酸靶向单体及多聚体探针(含PEG修饰)的制备

A湿法标记方案：

1)将适量叶酸靶向单体及多聚体探针(含PEG修饰)配体溶于生理盐水中；

2)配制一定浓度的TPPTS、tricine、氯化亚锡、甘露醇溶液，优选浓度为2-10mg/mL的TPPTS溶液、1-5mg/mL氯化亚锡溶液及40-160mg/mL的tricine溶液；

3)在10mL青霉素小瓶中依次加入500μL tricine溶液，200μL TPPTS溶液、适量配体以及20μL氯化亚锡溶液；

4)加入新鲜淋洗的^99mTcO₄ ^-溶液，密闭60-100℃反应30min，冷却；

5)反应液可直接使用，也可经Sep-Pak C18色谱柱分离纯化：依次以10mL水及10mL无水乙醇活化柱子，用空气吹干，将反应液注入到柱子中，以缓冲液或水冲洗色谱柱除去未反应的^99mTcO₄ ^-离子，再以60％-80％的乙醇溶液淋洗柱子，收集淋洗液并浓缩，再用缓冲液或生理盐水稀释，即得^99mTc标记注射液。

B干法标记方案：

1)取一只冻干药盒，加入新鲜淋洗的^99mTcO₄ ^-溶液，密闭60-100℃反应30min，冷却；

2)反应液可直接使用，也可经Sep-Pak C18色谱柱分离纯化：依次以10mL水及10mL无水乙醇活化柱子，用空气吹干，将反应液注入到柱子中，以缓冲液或水冲洗色谱柱除去未反应的^99mTcO₄ ^-离子，再以60％-80％的乙醇溶液淋洗柱子，收集淋洗液并浓缩，再用缓冲液或生理盐水稀释，即得^99mTc标记探针注射液。

上述合成步骤中的所使用的其它化学物质为市售商品。

实施例6

以下对按本发明上述实施例的方法所制备的单体、多聚体配体及其^99mTc标记的靶向探针的性能测定描述：

1.脂水分布系数测定

^99mTc标记的单体及多聚体探针(含PEG修饰)的脂水分布系数(log P)测定通过以下步骤完成：

将100μL稀释后的放射性注射液加入到含有0.9mL PBS(0.05mol/L,pH＝7.4)和1ml正辛醇混合液的离心管中(PBS和正辛醇在实验前一天混合并静置，以供第二天进行实验时使用)，涡旋震荡2min之后，6000rpm离心5min，从PBS相及正辛醇相中各取100μL液体并通过γ-counter放射性计数。实验重复三次取平均值。脂水分布系数(log P)的计算公式为：

P＝(I_a-I)/(I_b-I)

其中I_a代表油相中测定的放射性计数、I_b代表水相中测定的放射性计数、I代表背景计数。

通过计算，最终测定各放射性标记的靶向探针的脂水分布系数。

由表可知，叶酸靶向的HYNIC单体及多聚体探针都呈现水溶性性质，对于^99mTc-FA-Dn-HYNICm来说，单体到多聚体的水溶性有轻微的降低，这可能是与HYNIC糟糕的水溶性有关；对于^99mTc-FA-Dn-PEG-HYNICm来说，单体和多聚体之间的水溶性没有太大的差别；与叶酸多聚体类型，总体比较而言，有PEG修饰的标记探针的水溶性要比没有PEG修饰的好一些，证明PEG结构的引入确实可以增加溶解性。

结果可参见表1。

2.细胞结合实验

实验所选取的细胞为KB细胞。将其培养于RPMI 1640培养基中，(含有10％灭活的胎牛血清，L-谷氨酸以及抗生素)。培养箱恒温37℃且处于5％CO₂的环境中以利于细胞生长。实验前24h，将KB细胞培养于24孔板中(约5×10⁵细胞/孔)，用乏叶酸培养基FFRPMI 1640进行培养。细胞摄取实验的步骤为：

(1)将放射性标记液加入到处理好的乏叶酸培养基中，使放射性量稀释为大约1～3μCi/mL。

(2)将已经形成贴壁细胞的24孔板取出，吸走培养基，再向每个孔中加入约0.5mL的乏叶酸培养基，随后吸出以洗去死去或是脱落的细胞。

(3)依次向每孔加入100μL含有标记探针的培养基，再补充约200μL乏叶酸培养基，加盖后放置于培养箱中培养。对于抑制组，应提前加入10uL叶酸(1mg/mL)进行抑制。

(4)到达每个实验时间点时，及时将孔中的培养基吸出，加入约0.5mL PBS(含0.2％BSA)洗两次，再加入0.5mL pH值为4.0的stripping buffer洗1次，收集stripping buffer洗液于试管中；最后再用0.5mL 1M NaOH将细胞洗脱，室温下放置5-10min，然后用移液器吸头轻刮板孔底部，使细胞完全脱离，吸取孔板内所有NaOH溶液和细胞于小试管中。测量计数。

(5)取3份100μL含有标记物的binding medium作为total added activity,在计数器上进行计数。

从实验中可以看出，向KB细胞中加入^99mTc标记的单体及多聚体探针之后，随着时间的延长，细胞总结合和内化值都在不断的增加。同样，提前往细胞中加入叶酸抑制效果明显，说明叶酸竞争性地结合了KB细胞表面的叶酸受体；以上数据可以看出各个标记探针和叶酸受体是靶向性结合的。通过比较可以发现，加入PEG修饰的标记探针比未加PEG修饰的标记探针在结合律上更具优势。这可能缘于PEG的加入改善了其水溶性并且增加了其生物相容性。PEG链在一定程度上也拉长了靶向基团和放射性核素之间的距离，避免相互影响。

结果详见图3。

3.^99mTc标记配合物在荷瘤裸鼠体内的生物分布

实验选用18-20g的裸鼠，每只裸鼠前肢腋下注射约5×10⁶量的KB细胞液。大约两星期之后肿瘤长到直径0.5-1cm时，即可进行生物分布实验。在实验的前一周应改用乏叶酸的食物进行喂食。实验时，每只小鼠通过尾静脉注射的注射剂量为10μCi/100μL，在时间点2h，4h即断头处死，取血和心、肝、肺、肾等主要脏器，称重并计数。在叶酸抑制实验中，在注射放射性标记物之前10min注射100μg叶酸进行抑制，并在相应时间点将小鼠处死，取主要脏器称重计数。

标记探针除了在肿瘤中摄取较高之外，在肾脏中也有更高的富集，这与肾脏器官高度表达叶酸受体有关。单体、二聚体及四聚体在2h的摄取值分别为：18.01、12.77、6.597；在4h的摄取值分别为：15.04、13.44、11.59。抑制实验中，提前10min注射100μg叶酸抑制效果明显，三个标记探针在肿瘤中2h的摄取值降低为1.43、1.63、1.45，相比正常组分别抑制了90.5％，87.9％，87.5％。肾脏的摄取在所有的脏器中是最高的，直接导致的结果就是瘤/肾的比值较低。单体、二聚体、四聚体在4h的瘤/肾比值分别为：0.14、0.14、0.10。相比较而言，^99mTc-FA-PEG-D₀-HYNIC₁在三个探针中具有一定优势。

结果详见表2、表3。

4.肿瘤模型鼠MicroSPECT显像

实验选用18-20g的裸鼠，每只裸鼠前肢腋下注射约5×10⁶量的KB细胞液。大约两星期之后肿瘤长到直径0.5-1cm时，即可进行显像实验。所有显像小鼠在实验前一周喂食乏叶酸食物以避免食物中含有的叶酸成分对实验结果造成的影响。每只小鼠通过尾静脉注射的注射计量约为18MBq(250μL,～7nmol)。在注射放射性标记物之后的不同时间点进行成像。

从图中可以看出，不论是否经过PEG修饰，单体及多聚体探针在肿瘤与肾脏中的摄取都较高，体现了良好的肿瘤亲和力。而在其他的非靶器官中都没有观察到明显的放射性滞留，能够获得较高的靶与非靶比值。

结果详见图4。

从化学合成的角度来说，本实验设计充分利用了click反应高效便捷的特点，有利于合成生产；对于分子影像探针而言，好的靶向性、高标记率和比活度是关键。本实验在在靶向分子探针的研究中引入了多聚体概念，实现创新的同时得到了良好的生物评价效果；探讨了冻干药盒的工艺，冻干药盒化简化了标记及纯化过程，更有利于临床推广。

本发明所使用的核素除^99mTc外，还可能为¹¹¹In、¹⁸F、¹⁷⁷Ru、¹⁵⁷Gd、⁶⁴Cu或^67/68Ga等；所用的靶向基团除叶酸外，还可能为RGD、表皮生长因子或乳糖酸等具有靶向功能的分子结构；所用的螯合剂除HYNIC外，还可能为NOTA、DOTA以及DTPA等双功能螯合结构。

上述所涉及的表格如下：

表1两个系列的单体及多聚体的脂水分布系数

标记探针	logP
		99mTc-FA-D0-HYNIC1	-2.39±0.14
99mTc-FA-D1-HYNIC2	-2.32±0.17
		99mTc-FA-D2-HYNIC4	-2.21±0.03
99mTc-FA-PEG-D0-HYNIC1	-2.57±0.15
		99mTc-FA-PEG-D1-HYNIC2	-2.53±0.05
99mTc-FA-PEG-D2-HYNIC4	-2.52±0.20

表2^99mTc标记的HYNIC单体及多聚体探针(^99mTc-FA-PEG-D_n-HYNIC_m)在荷KB瘤裸鼠体内的生物分布结果(％ID/g,mean±SD,n＝5)

表3^99mTc标记的叶酸靶向HYNIC单体及多聚体(^99mTc-FA-PEG-D_n-HYNIC_m)在荷KB瘤裸鼠体内的靶/非靶值

在过去很长的一段时间里，一系列用于PET及SPECT显像的叶酸靶向分子靶向探针应运而生。然而，只有¹¹¹In-DTPA-folate和^99mTc-EC20两种靶向探针实现了临床。与其他的核素相比，^99mTc具有诸多的优势，所以多种^99mTc标记的叶酸靶向分子靶向探针被合成并进行了体内外的评价。相比于其他核素标记的叶酸靶向靶向探针，本研究中的单体及多聚体均具有综合优势：HYNIC用于放射性标记是一种更为理想的手段(标记时HYNIC的量往往更少，同时标记效率更高)；更为简单的合成途径(click反应)；在靶向分子靶向探针的研究中引入了多聚体概念，实现创新的同时得到了良好的生物评价效果；冻干药盒化简化了标记及纯化过程，更有利于临床推广。

本发明所使用的核素除^99mTc外，还可能为¹¹¹In、¹⁸F、¹⁷⁷Ru、¹⁵⁷Gd、⁶⁴Cu或^67/68Ga等；所用的靶向基团除叶酸外，还可能为RGD、表皮生长因子或乳糖酸等具有靶向功能的分子结构；所用的螯合剂除HYNIC外，还可能为NOTA、DOTA以及DTPA等双功能螯合结构。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种用于核素标记的靶向探针，其特征在于：其结构通式如下：

其中R’为核素螯合基团，R为靶向基团，D_n是以炔丙胺为初始反应物、通过反复的迈克尔加成反应和酰胺化反应形成的分子骨架，其外围基团为氨基，n代表不同代数且其数值为大于等于0的整数，m＝2ⁿ。

2.如权利要求1或2所述的一种用于核素标记的靶向探针，其特征在于：所述R’为选自HYNIC、NOTA、DOTA和DTPA中的一种或多种。

3.如权利要求3所述的一种用于核素标记的靶向探针，其特征在于：所述核素为^99mTc、¹¹¹In、¹⁸F、¹⁷⁷Ru、¹⁵⁷Gd、⁶⁴Cu和/或^67/68Ga。

4.如权利要求1或2所述的一种用于核素标记的靶向探针，其特征在于：所述R为衍生自叶酸、表皮生长因子、RGD或乳糖酸的靶向基团。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的用于核素标记的靶向探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备R-NHS或R-PEG-NHS溶液；

(2)合成R-N₃或R-PEG-N₃：将等摩尔量的3-叠氮丙胺滴加到上述R-NHS或R-PEG-NHS溶液中，反应完全后滴入乙醚中析出沉淀，收集沉淀并干燥，得R-N₃或R-PEG-N₃；

(3)制备R’-NHS溶液：将核素螯合物、N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺混合反应过夜，过滤即得；

(4)分子骨架的合成：以炔丙胺为初始反应物、通过反复的迈克尔加成反应和酰胺化反应形成的分子骨架，该分子骨架的制备反应式如下所示：

(5)将R’连接至所述分子骨架：将分子骨架溶于DMF，滴加到上述R’-NHS溶液中，反应完全后将反应液浓缩，得到固体，该固体经HPLC纯化或将该淡黄色固体分散到乙酸乙酯中，加热回流，热过滤得淡黄色固体，真空干燥的即得连接有R’的分子骨架；

(6)将R-N₃或R-PEG-N₃搅拌溶解于t-BuOH/H₂O混合液中，再加入上述连接有R’的分子骨架、催化剂CuSO₄·5H₂O及抗坏血酸钠进行反应，整个反应体系处于氮气保护中，反应完全后用碱调节直到反应液变澄清后过滤，滤液用酸调节产生大量沉淀，收集沉淀，真空干燥得所述用于核素标记的靶向探针。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)为：将靶向物质溶解于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，避光反应完全后过滤，即得R-NHS溶液。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)包括如下步骤：

a、将靶向物质溶解于溶剂中，加N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，避光反应完全后过滤，得R-NHS溶液；

b、将不同分子量的PEG溶于溶剂中，滴加上述R-NHS溶液，反应完全后将反应液滴加到二氯甲烷中产生黄色沉淀，固液分离得固体，再用二氯甲烷及乙醚洗涤并真空干燥，得R-PEG固体；

c、将上述R-PEG固体溶解于有机溶剂中，加入适量的丁二酸酐及4-二甲氨基吡啶，室温下反应完成后将反应液滴加到二氯甲烷中产生黄色沉淀，固液分离得固体，再用二氯甲烷及乙醚洗涤并真空干燥，得R-PEG-COOH；

d、将上述R-PEG-COOH溶解于溶剂中，加入N-羟基琥珀酰亚胺及二环己基碳二亚胺，室温避光反应完全后将反应液过滤得到R-PEG-NHS溶液。

8.一种权利要求1至4中任一权利要求所述的用于核素标记的靶向探针作为肿瘤及炎症性相关疾病显像剂的应用。