CN114835710B - 双功能大环螯合物、偶联物、金属络合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及螯合剂技术领域，具体而言，涉及双功能大环螯合物、偶联物、金属络合物及其应用。双功能大环螯合物为下述式I所示化合物或其同分异构体，
Figure DDA0003189633450000011
其中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自烷基或长链聚合物基团，R2、R4、R6和R8分别独立地选自功能基团，Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地选自H、取代或未取代烷基、卤素、取代或未取代氰基、取代或未取代酯基、取代或未取代烷氧基、取代或未取代胺基以及取代或未取代芳基中的任意一种，环
Figure DDA0003189633450000012
为
Figure DDA0003189633450000013
或
Figure DDA0003189633450000014
双功能大环螯合物可以螯合绝大多数的核素，扩大了双功能大环螯合物的应用，且螯合不同核素后的金属络合物能够实现治疗诊断一体化。

Description

双功能大环螯合物、偶联物、金属络合物及其应用
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年02月01日提交中国专利局的申请号为CN202110139386.4、名称为“双功能大环螯合物、偶联物、金属络合物及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及螯合剂技术领域，具体而言，涉及双功能大环螯合物、偶联物、金属络合物及其应用。
背景技术
放射性金属核素通常需要通过双功能螯合剂与靶分子相联，构成放射性探针。放射性探针在体内的稳定性是判断其性能的一个重要标准。由于放射性金属核素有其各自的优缺点，理想的放射性核素并不存在，在选择金属核素前，需结合应用目的多方面考虑。现有技术中一般的螯合剂只能特定螯合一种或者几种放射性核素，并不能广谱的螯合放射性核素，例如，DOTA可以螯合诊断核素68Ga(t1/2＝68.1min)、111In和治疗核素177Lu，但是DOTA不能螯合Al[18F](t1/2＝109.8min)和89Zr(t1/2＝78.4h)，因此只能换用其他螯合剂，如用NOTA螯合Al[18F]，DFO螯合89Zr。目前的研究缺少一种通用型的多核素螯合剂。
其次，FDA批准的诊疗一体化放射性药物，如68Ga-DOTATATE&177Lu-DOTATATE，由于68Ga的半衰期比较短，在对177Lu-DOTATATE疗效监测时需要多次给药。和68Ga相比，89Zr的半衰期相对较长，能够实现一次给药后的长效评估监测。同时，89Zr放射性药物通过剂量分析可以计算肿瘤与正常器官的吸收剂量，从而达到精确指导治疗药物剂量的可能性。但是，DOTA螯合89Zr时需要较高温度，会破坏靶分子活性，而89Zr常用的双功能螯合剂为DFO，因此若想尝试使用89Zr评估治疗177Lu等治疗药物的效果就需要更换标记前体(即螯合剂-靶分子)，无法精确实现诊疗一体化的目的。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供双功能大环螯合物、偶联物、金属络合物及其应用。本发明实施例提供的双功能大环螯合物可以广谱螯合绝大多数的核素，扩大了双功能大环螯合物的应用，且螯合不同核素后的金属络合物能够实现诊断治疗一体化。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种双功能大环螯合物，其为下述式I所示化合物或其同分异构体，
Figure BDA0003189633430000021
其中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自取代或未取代烷基或长链聚合物基团，
R2、R4、R6和R8分别独立地选自能与靶分子进行反应且能与金属离子进行配位的功能基团，
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地选自H、取代或未取代烷基、卤素、取代或未取代氰基、取代或未取代酯基、取代或未取代烷氧基、取代或未取代胺基以及取代或未取代芳基中的任意一种，
环
Figure BDA0003189633430000022
为/>
Figure BDA0003189633430000023
第二方面，本发明提供一种偶联物，所述偶联物是通过靶分子与前述实施方式任一项所述的双功能大环螯合物中的R2、R4、R6和R8中的至少一个基团进行偶联形成的化合物。
第三方面，本发明提供一种金属络合物，所述金属络合物是通过前述实施方式任一项所述的双功能大环螯合物或前述实施方式任一项所述的偶联物与金属离子螯合形成的络合物。
第四方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的双功能大环螯合物或前述实施方式任一项所述的偶联物或前述实施方式所述的金属络合物在制备诊断和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
第五方面，本发明提供前述实施方式任一项所述的双功能大环螯合物或前述实施方式任一项所述的偶联物或前述实施方式所述的金属络合物在制备放射性药物中的应用；
优选地，所述放射性药物为分子影像的诊断剂；
优选地，所述放射性药物为可以治疗肿瘤的药物。
本发明具有以下有益效果：本发明实施例提供的双功能大环螯合物具有四个连接臂，可与单个或多个靶分子偶联，实现更精准的靶向性诊断或治疗。同时，双功能大环螯合物对二价、三价或四价金属离子具有较高的选择性和配位能力，可与之形成稳定的金属络合物。形成的金属络合物具有良好的体内外稳定性，能特异性靶向肿瘤，其他组织几乎无摄取，并主要通过肾脏排泄。双功能大环螯合物能络合大多数常用诊断型或治疗型的金属离子，实现放射性诊疗一体化，另外，诊断型半衰期相对较长的放射性药物也可为治疗药物提供临床疗效监测及用药指导的可能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例1提供的检测结果图；
图2为本发明实验例2提供的检测结果图；
图3为本发明实验例3提供的检测结果图；
图4为本发明实验例4提供的检测结果图；
图5为本发明实验例5中实验A提供的检测结果图；
图6为本发明实验例5中实验B提供的检测结果图；
图7为本发明实验例6提供的SPECT扫描结果图；
图8为本发明实验例6提供的肿瘤大小曲线图；
图9为本发明实验例6提供的体重变化曲线图；
图10为本发明实验例7提供的检测结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。其中，抗体KN035由苏州康宁杰瑞生物科技有限公司提供。
本发明提供一种双功能大环螯合物，其为下述式I所示化合物或其同分异构体，
Figure BDA0003189633430000041
其中，环/>
Figure BDA0003189633430000042
为/>
Figure BDA0003189633430000043
R1、R3、R5和R7分别独立地选自取代或未取代烷基或长链聚合物基团，R1、R3、R5和R7的主要目的就是为了增加链长，有利于后续靶分子与该双功能大环螯合物作用。
具体地，R1、R3、R5和R7分别独立地选自直链烷基，可以为未取代的直链烷基，例如C1-C20未取代直链烷基，更具体为(CH2)n，n选自1～8，例如为亚甲基。
当然可以理解的其他未取代的直链烷基也在本发明实施例的保护范围内，例如C16直链烷基、C18直链烷基等。同时，也可以是非直链烷基，例如形成的支链并不影响后续靶分子偶联和金属离子络合，支链烷基也可以。进一步地，该烷基可以是被取代的烷基、例如可以是卤素、氰基、酯基、醚等取代基取代的烷基。
长链聚合物基团指的是聚合物形成的基团，且优选为直链长链聚合物基团，可以为含有酰胺基团和/或PEG基团(即聚乙二醇基团)的直链长链聚合物基团中的任意一种，也就是该长链聚合物基团可以是含有酰胺基团的不含PEG链的其他直链长链聚合物基团，也可以是不含有酰胺基团而含有PEG链的直链长链聚合物基团，也可以是同时含有酰胺基团的PEG链的直链长链聚合物基团。且酰胺基团的个数可以是一个，也可以是2个、3个等多个。同时，该长链聚合物基团也可以是其他可扩长其链长，且不影响或者增强该双功能大环螯合物与后续靶分子偶联和金属离子络合作用的聚合物长链。
R2、R4、R6和R8分别独立地选自能与靶分子进行反应且能与金属离子进行配位的功能基团，该功能基团可以是氨基、能形成有机酸的酸根基团、所述氨基的衍生基团和所述酸根基团的衍生基团中的任意一种，该衍生基团指的是该氨基或酸根基团进行进一步取代衍生形成的衍生基团。具体R2、R4、R6和R8分别独立地选自选择为氨基、羧基、磺酸基、磷酸基、巯基、酰胺基、亚磺酸酰胺基、异硫氰酸酯基、四氟苯酚基团和琥珀酰亚胺基团中的任意一种。
当然可以理解的是，功能基团还可以根据靶分子和金属离子进行选择，采用其他的基团也可，只要其具有能与靶分子反应和与金属离子配位的功能。
进一步地，Ra和Rb分别表示对应的苯酚环上任意位置可以被取代，且取代基并不限于1个，即可以是多取代，例如可以是OH的对位和间位中的任意一个被取代，也可以是OH的两个间位都被取代，也可以是对位和一个间位被同时取代，或者是OH的对位和/或2个间位均被取代，且多取代时，各个取代基可以相同也可以不同。
Rc和Rd分别表示环
Figure BDA0003189633430000051
即吡啶环或者联吡啶环中的任意位置可以被取代，且取代基的个数不限于1个，即可以多取代。
进一步地，Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地选自H、取代或未取代烷基、卤素、取代或未取代氰基、取代或未取代酯基、取代或未取代烷氧基、取代或未取代胺基以及取代或未取代芳基中的任意一种。Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地选自H、卤素、C1-C20取代或未取代烷基、取代或未取代C1-C20氰基、取代或未取代C1-C20烷氧基、取代或未取代C2-C20酯基、取代或未取代C2-C20胺基以及取代或未取代C3-C20杂芳基或C4-C20非杂芳基中的任意一种，优选地，Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、甲氧基、乙氧基、取代或未取代苯基、取代或未取代苄基、叔胺基、氰基、取代或未取代噻吩基和取代或未取代苯并呋喃基中的任意一种。
具体地，双功能大环螯合物选自下述结构式所示化合物中的任意一种：
Figure BDA0003189633430000052
Figure BDA0003189633430000061
Figure BDA0003189633430000071
本发明实施例还提供一种偶联物，所述偶联物是通过靶分子与上述双功能大环螯合物中的R2、R4、R6和R8中的至少一个基团进行偶联形成的化合物。具体地，可以与R2、R4、R6和R8中的任意一个基团进行偶联，例如与R6进行偶联，也可以与R2进行偶联、R4进行偶联或者R8进行偶联。也可以与R2、R4、R6和R8中的任意2个基团进行偶联，例如与R2和R6进行偶联，也可以与R2和R4进行偶联、也可以与R2和R8进行偶联、也可以与R4和R6进行偶联、也可以与R4和R8进行偶联或者也可以与R6和R8进行偶联。或者与R2、R4、R6和R8中的任意3个基团进行偶联，例如同时与R2、R4和R6进行偶联、同时与R2、R4和R8进行偶联、同时与R2、R6和R6进行偶联，甚至可以同时与R2、R4、R6和R8进行偶联。
进行偶联的实质就是对应基团与靶分子进行了相关的反应，继而使得靶分子与双功能大环螯合物键合。具体地，偶联的过程包括：将所述双功能大环螯合物与缩合剂、所述靶分子在0-100℃的条件下进行反应；其中，上述反应的反应体系的pH为2-11，且所述缩合剂为HOAt、HOBt、HATU、HBTU、DMAP、PyBOP、EDC、DCC、DIC、NHS中的至少一种；所述溶剂为DMF、THF、DMSO、DCM中的至少一种。采用上述条件有利于偶联的进行。
进一步地，靶分子可以选自抗体、蛋白质、肽、碳水化合物、核苷酸、低聚核苷酸、寡聚糖、维生素、脂质体、小分子药物或片段或衍生物中的任意一种；优选地，靶分子是抗体(例如靶点为PD-L1、PD-1、FAP、PSMA、VEGF、EGFR、CD-X、HER2、HER3和CEA的抗体)、肽(例如可以为RGD肽或靶向PSMA、FAP和SSTR肽)和维生素(例如可以为叶酸)中的任意一种。
本发明实施例还提供一种金属络合物，所述金属络合物是通过上述双功能大环螯合物或前述实施方式任一项所述的偶联物与金属离子螯合形成的络合物。其中，金属离子为放射性离子或非放射性离子；例如，所述放射性离子选自Al[18F]、51Mn、52mMn、52gMn、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、89Zr、86Y、90Y、99mTc、111In、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac和227Th中的任意一种。
且螯合的过程包括：将含有所述偶联物的溶液与含有金属离子的溶液混合，调节溶液pH至3-11，在0-110℃的条件下进行反应。优选地，pH为4-9。采用上述条件有利于形成络合物。
本发明实施例提供上述双功能大环螯合物或上述偶联物或上述金属络合物在制备诊断和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
本发明实施例还提供上述双功能大环螯合物或上述偶联物或上述金属络合物在制备放射性药物中的应用；该放射性药物为分子影像的诊断剂以及可以治疗肿瘤的药物。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种双功能大环螯合物(记为Dar)，其结构式如下所示：
Figure BDA0003189633430000081
本实施例还提供一种上述双功能大环螯合物的制备方法，参照下述合成路径进行合成：
Figure BDA0003189633430000091
具体操作如下：
步骤一：
将2，6-双(羟甲基)-4-甲基苯酚(16.8g，0.1mol)溶解在二氯甲烷(20mL)中。加入浓盐酸(100mL)，并在室温下搅拌24h。将反应混合物浓缩至干，得到化合物A。
步骤二：
室温下将乌洛托品(18.9g，0.14mol)的甲醇(380mL)溶液快速加入到剧烈搅拌中的刚溶解的化合物A(0.061mol)中。几秒钟后，分离出细微的微晶无色固体。将混合物室温放置15min，收集固体，用冷甲醇洗涤，并在室温下真空干燥。得到粗制的化合物B20.67g。
将化合物B(10.2g)在乙醇(20mL)和浓盐酸水溶液(14mL，32％)混合物中的混悬液加热至沸点，连续搅拌2h。加入另外的浓盐酸水溶液(10mL，32％)，混合物继续搅拌2h。将混合物真空干燥，得到氯化铵和化合物C的混合物。加入乙醇(83mL)，搅拌过夜。过滤后，将正己烷(83mL)加入滤液中，搅拌过夜。收集白色黄色沉淀物，并真空干燥，得到化合物C1.4g。
步骤三：
向化合物C(482.2mg，1.9mmol)的甲醇(75mL)溶液中加入DIPEA(620μL，3.8mmol)，然后将混合物加热至55℃。在55℃下将2,6-二甲酰基吡啶(253.45mg，1.88mmol)的甲醇(63mL)溶液逐滴加到上述混合物中，搅拌2h。然后将该溶液在室温下搅拌过夜。过滤获得白色沉淀物，真空干燥，得到化合物D374.2mg。
步骤四：
将化合物D(182.6mg)在甲醇(30mL)中的悬浮液加热至45℃。分批加入NaBH4(421.7mg)，并将混合物在45℃下搅拌3h。减压蒸发溶剂，产物用二氯甲烷(CH2Cl2/H2O，2×20mL/20mL)萃取。有机相用无水Na2SO4干燥，然后过滤。在真空下除去二氯甲烷溶剂后，添加约2mL的36％HCl的甲醇溶液。4℃下静置过夜，形成白色沉淀。过滤，干燥沉淀物，得到纯净的化合物E盐酸盐。
步骤五：
将化合物E(716.4mg，0.907mmol，1eq)、溴乙酸苄酯(1430μL，9.0mmol，10eq)、DIPEA(1865μL，11.284mmol，12eq)、乙腈(9.5mL)混合，室温(25℃左右)搅拌2h。旋蒸至干，柱层析处理并旋蒸干燥后得到淡灰色泡沫状固体化合物F。
LC-MS：566.4[M/2+H]+。
步骤六：
将化合物F(1eq)、NaOH溶液(5.3mL，10M，15eq)、去离子水(22mL)、THF(27mL)混合，60℃油浴搅拌过夜，有白色固体析出，抽滤，干燥，得到化合物Ⅰ-a钠盐，经盐酸调pH＝6-7，得化合物Ⅰ-a，即双功能大环螯合物Dar。
该双功能大环螯合物的表征数据如下：
1HNMR(400MHz，D2O)：δ7.48(t，J＝7.8Hz，2H)，7.02(d，J＝7.8Hz，4H)，6.86(s，4H)，3.62(s，8H)，3.55(s，8H)，3.12(s，8H)，2.11(s，6H)。
LC-MS：386.3[M/2+H]+，771.3[M+H]+，793.4[M+Na]+。
实施例2
本实施例提供一种双功能大环螯合物，其结构式如下所示：
Figure BDA0003189633430000101
本实施例还提供一种上述双功能大环螯合物的制备方法，参照下述合成路径进行合成：
Figure BDA0003189633430000111
具体操作如下：
步骤一：
6,6'-二甲基-2,2'-联吡啶(22.1g)，NBS(44.7g)，过氧化苯甲酰(250mg)加入1200mL四氯化碳溶液中，回流6h，热过滤，滤液降温至0-10℃保温，抽滤，所得固体加入100mL甲醇打浆，抽滤，固体烘干，得6.91g化合物1。
LC-MS：340.9[M+H]+。
步骤二：
化合物1(4.25g)溶于160mL氯仿中，加热回流溶解，3.8g六亚甲基四胺溶于100mL氯仿中，回流状态下滴加至反应体系中，滴加完毕，继续回流4h，降至室温后，抽滤，滤饼真空干燥，所得固体溶于30mL水-150mL乙醇-35mL盐酸溶液中，加热回流至全溶，降温至室温析晶，抽滤，烘干，得4.40g化合物2(盐酸盐)。氢氧化钠(48.37g)溶于250mL纯化水中，加20.10g化合物2(盐酸盐)搅拌溶解，水相加3*400mL二氯甲烷萃取，合并有机相饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干得11.97g化合物2。所得化合物2加800mL甲醇溶解备用。
LC-MS：215.1[M+H]+。
步骤三：
醋酸镧(21.34g)和2-羟基-5-甲基间苯二甲醛(10.06g)加入1.8L甲醇升温回流至固体全溶，回流状态下，将化合物2甲醇溶液缓慢滴加至反应体系中，回流过夜。反应液降至室温后抽滤，滤液旋蒸至剩约一半体积，升温至40℃，分批加入氰基硼氢化钠(22.01g)和硼氢化钠(35.28g)，加完后，升温回流反应过夜，反应液旋干，加盐酸(140mL，6M)搅拌均匀，加DTPA溶液(96.30gDTPA溶于1000mL纯化水中)，搅拌过夜。加氢氧化钠溶液调pH＝8-9，水相3*500mL二氯甲烷萃取，收集合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干，得5.89g化合物4。
LC-MS：347.2[M/2+H]+，693.4[M+H]+。
步骤四：
化合物4(3.46g)加50mL二氯甲烷搅拌，加三乙胺(8.15g)，室温条件下，滴加溴乙酸苄酯(5.74g)滴加至反应体系中，室温反应过夜，TLC(MeOH：DCM＝1：10)跟踪，原料基本反应完全，加50mL水分液，水相2*50mL二氯甲烷萃取，合并有机相水洗，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干，所得油状物进行柱层析分离纯化两次(MeOH：DCM＝100：1-100：3)，收集极性较小点合并旋干，得1.06g化合物5。
LC-MS：643.3[M/2+H]+，1285.6[M+H]+。
步骤五：
柱层析所得较纯化合物5(油状物)约150mg，加四氢呋喃(5mL)和氢氧化钠溶液(10mL，2M)升温回流，保温反应，TLC跟踪(MeOH：DCM＝1：10)，原料点消失，旋蒸蒸除四氢呋喃，加盐酸(6M)调pH＝6-7，有白色固体析出，降温至0-10℃，保温2h，抽滤，固体烘干，得47.5mg化合物Ⅰ-b，即双功能大环螯合物。
LC-MS：463.2[M/2+H]+、925.4[M+H]+。
1HNMR(600MHz，D2O)：δ8.26(s，4H)，8.01(s,4H)，7.45(s，4H)，7.14(d，J＝27.0Hz，4H)，4.61(s，8H)，4.43(d，J＝57.2Hz，8H)，4.14(d，J＝70.8Hz，8H)，2.19-1.99(m，6H)。
实施例3
本实施例提供一种双功能大环螯合物(记为Dar-PEG)，其结构式如下所示：
Figure BDA0003189633430000121
本实施例双功能大环螯合物由实施例1双功能大环螯合物Dar(1.1eq)与化合物G(1eq)通过Fmoc固相合成反应制备，使用的缩合剂为HOAt(2.2eq)和DIC(2.2eq)，再经脱保护制得。其中，化合物G的结构式如下：
Figure BDA0003189633430000131
LC-MS：509.9[M/2+H]+、1018.7[M+H]+。
实施例4
本实施例提供一种双功能大环螯合物(记为Dar-4PEG)，其结构式如下所示：
Figure BDA0003189633430000132
本实施例双功能大环螯合物由实施例1双功能大环螯合物Dar(1eq)与化合物H(12eq)反应，使用的缩合剂为HOAt(1eq)和DIC(1eq)，再经脱保护制得，产率51.37％，纯度98.10％。其中，化合物H的结构式如下：
Figure BDA0003189633430000133
LC-MS：880.8[M/2+H]+。
实施例5
本实施例提供一种偶联物，将化合物X与实施例1的双功能大环螯合物进行偶联，其中，化合物X的结构式如下：
Figure BDA0003189633430000134
操作如下：
将实施例1的化合物Ⅰ-a的钠盐(5mg，55μmol，1eq)于无水DMF(1mL)中室温搅拌，加入HATU(8.37mg，22μmol，4eq)，搅拌1h后加入化合物X(6.61mg，11μmol，2eq)，控制pH为7～10，反应过夜，得到中间体。
经预处理-高效液相色谱(A：0.1％TFA的H2O溶液，B：MeOH)纯化，冻干后得到无色粘稠状体(1.06mg，0.55μmol，收率10％，纯度97.3％)。
LC-MS：969.1[M/2+H]+。
化合物中间体(1mg)和HCl(200μL，6M)于60℃反应10min，体系由浑浊变澄清。反应结束将反应液中和至pH～5，得到偶联物。
经预处理-高效液相色谱(A：0.1％TFA的H2O溶液，B：MeOH)纯化，冻干后得到无色粘稠状体(0.784mg，0.49μmol，收率95％，纯度96.5％)。
LC-MS：800.7[M/2+H]+。
实施例6
本实施例提供一种偶联物(记为Dar-PSMA-617)，将化合物Y与实施例1的双功能大环螯合物进行偶联，参照下述合成路线进行合成：
Figure BDA0003189633430000141
常温下，将实施例1的化合物I-a(78.0mg，101μmol，1.0eq)，HOAt(20.7mg，152μmol，1.5eq)和DIC(19.2mg，152μmol，1.5eq)的DMF溶液(6.0mL)滴加入化合物Y(79.1mg，101μmol，1.0eq)的DMF(2.0mL)溶液中，pH在8左右，然后将反应液在25℃下搅拌12h。
反应完成后，将反应液50℃浓缩干燥，然后用7.0mL裂解液(92.5％TFA/2.5％3-MPA/2.5％tis/2.5％H2O)处理2h。用冷异丙醚(50mL)沉淀，3000rpm离心2min，用异丙醚洗涤2次。将粗品在真空下干燥2h。用ACN(3.0mL)溶解，用H2O(7.0mL)稀释。将1mol/LNaOH调至pH11～12。然后在25℃搅拌2h。混合物被冻干，得到粗品。
经预处理-高效液相色谱(A：0.075％TFA的H2O溶液，B：ACN)纯化得到白色固体Dar-PSMA-617(8.1mg，5.48μmol，收率5.41％，纯度95.27％)。
LC-MS：705.1[M/2+H]+。
实施例7
本实施例提供一种金属络合物，将实施例5制备得到的偶联物与89Zr进行络合，具体操作如下：
取偶联物溶液(28μL，7mg/mL)和89Zr(200μCi，50μL)充分混合，调节反应液pH保持在5～6。室温反应15min，将反应液过C18柱，再用10mL水清洗C18柱，1mL 20％乙醇淋洗C18柱得89Zr-偶联物，HPLC测放化纯100％。
鉴定：
标准品制备：将氯化锆(51μg，0.219μmol，1eq)、实施例5制备得到的偶联物(350μg，0.219μmol，1eq)、醋酸钠缓冲液(0.02M，20μL)混合，室温反应18h，得到稳定金属Zr标记的金属络合物标准品。
LC-MS：867.3[M/2+Na]+。
HPLC：标准品UV峰Rt＝11.468min，放射性峰Rt＝11.589min，与标准品出峰位置相对应。
将标记产物89Zr-偶联物在室温下放置48h后，放射性化学纯度为100％；将其分别置于小鼠血清和生理盐水中，于37℃水浴箱中孵育48h后，放射性化学纯度分别为97％和99％，表明其具有良好的体外稳定性。
实施例8
本实施例提供一种金属络合物，将实施例5制备得到的偶联物与68Ga进行络合，具体操作如下：
取偶联物溶液(10μL，3mg/mL)和68GaCl2的醋酸钠缓冲溶液(1522μCi，50μL)充分混合，调节反应液pH保持在6～7。室温反应10min，将反应液过C18柱，再用10mL水清洗C18柱，1mL20％乙醇淋洗C18柱得68Ga-偶联物，测放化纯97.2％。
鉴定：
标准品制备：取50μL偶联物溶液(265μg，0.166μmol)，调节pH 5～6。加入20μL溶于0.02M、pH7的醋酸钠缓冲液的硝酸镓水合物(20μg，0.073μmol)，室温反应2h，过滤膜，得到稳定金属Ga标记的金属络合物标准品。
LC-MS：834.3[M/2+H]+。
HPLC：标准品UV峰Rt＝9.566min，放射性峰Rt＝9.847min，与标准品出峰位置相对应。
将标记产物68Ga-偶联物在室温下放置48h后，放射性化学纯度为97％；将其分别置于小鼠血清和生理盐水中，于37℃水浴箱中孵育48h后，放射性化学纯度分别为96％和97％，表明其具有良好的体外稳定性。
实施例9
本实施例提供一种金属络合物(记为89Zr-Dar-PSMA-617)，将实施例6制备得到的偶联物与89Zr进行络合，具体操作如下：
取偶联物溶液(20μL，1mg/mL)和89Zr(400μCi，50μL)充分混合，调节反应液pH保持在6～7。室温反应15min，将反应液过C18柱，再用10mL水清洗C18柱，1mL 20％乙醇淋洗C18柱得89Zr-偶联物，测放化纯98％。
鉴定：
标准品制备：取实施例6的偶联物的甲醇溶液(0.231μmol，50μL，6.5mg/mL)，调节pH 5～6，加入氯化锆的甲醇溶液(0.060μmol，14μL，1mg/mL)，室温反应2h，过滤膜，得到稳定金属Zr标记的金属络合物标准品。
LC-MS：748.9[M/2+H]+。
HPLC：标准品UV峰Rt＝10.548min，放射性峰Rt＝10.892min，与标准品出峰位置相对应。
将标记产物89Zr-偶联物在室温下放置48h后，放射性化学纯度为98％；将其分别置于小鼠血清和生理盐水中，于37℃水浴箱中孵育48h后，放射性化学纯度分别为96％和98％，表明其具有良好的体外稳定性。
实施例10
本实施例提供一种金属络合物(记为68Ga-Dar-PSMA-617)，将实施例6制备得到的偶联物与68Ga进行络合，具体操作如下：
取实施例6制备得到的偶联物的溶液(30μL，1mg/mL)和预处理后的68GaCl2的醋酸钠缓冲溶液(1522μCi，50μL)充分混合，调节反应液pH保持在4～5。室温反应10min，将反应液过C18柱，再用10mL水清洗C18柱，1mL 20％乙醇淋洗C18柱得68Ga-偶联物，测放化纯97％。
鉴定：
标准品制备：取实施例6制备得到的偶联物的甲醇溶液(0.231μmol，50μL，6.5mg/mL)调节pH 5～6，加入硝酸镓的甲醇溶液(0.117μmol，32μL，1mg/mL)，室温反应2h，过滤膜，得到稳定金属Ga标记的金属络合物的标准品。
LC-MS：738.7[M/2+H]+。
HPLC：标准品UV峰Rt＝10.548min，放射性峰Rt＝10.809min，与标准品出峰位置相对应。将标记产物68Ga-偶联物在室温下放置48h后，放射性化学纯度为96％；将其分别置于小鼠血清和生理盐水中，于37℃水浴箱中孵育48h后，放射性化学纯度分别为95％和96％，表明其具有良好的体外稳定性。
实施例11
本实施例提供一种金属络合物(记为177Lu-Dar-PSMA-617)，将实施例6制备得到的偶联物与177Lu进行络合，具体操作如下：
取实施例6制备得到的偶联物的溶液(50μL,0.05mg)和177Lu(15mCi)充分混合，常温反应20min。将反应粗品稀释10mL用C18柱吸附，用10mL灭菌注射用水水洗，再用0.5mL80％乙醇淋洗C18柱，洗脱得到13mCi产品，用生理盐水稀释至4mL。测放化纯100％。
鉴定：
标准品制备：将氯化镥(62μg，0.219μmol，1eq)、实施例6制备得到的偶联物的甲醇溶液(350μg，0.219μmol，1eq)、醋酸钠缓冲液(0.02M，20μL)混合，室温反应2h，得到稳定金属Lu标记的金属络合物标准品。
LC-MS：792.3[M/2+H]+。
HPLC：标准品UV峰Rt＝9.012min，放射性峰Rt＝9.238min，与标准品出峰位置相对应。
将标记产物177Lu-偶联物在室温下放置48h后，放射性化学纯度为100％；将其分别置于小鼠血清和生理盐水中，于37℃水浴箱中孵育48h后，放射性化学纯度分别为98％和99％，表明其具有良好的体外稳定性。
实施例12
本实施例提供一种偶联物(记为Dar-Avastin)，将Avastin与实施例1的双功能大环螯合物Dar进行偶联，操作如下：
取Avastin注射液(450μL,11.25mg)，用NaOAc Buffer(3.2mL,0.1M,pH 6.5)稀释，离心置换buffer得到Avastin溶液(1.8mL,5.74mg/mL)。
取84.1mg的实施例1的Dar钠盐溶于3mL去离子水中，用0.1M HCl调节pH至5.5～6.0。加入20.6mg Sulfo-NHS、2.0mg EDC·HCl，摇匀。4℃静置30min。
加入1.219mL Avastin溶液，摇匀，用0.1M Na2CO3溶液调节溶液pH至7.5～8.0，摇匀。4℃静置过夜。
在得到的Dar-Avastin偶联溶液中加入NaOAc Buffer(0.1M,pH 6.5)进行高速离心(离心机参数：7000r，12min)，拿下滤液收集管，将滤液倒出，重复2～4次。得到1.5mLDar-Avastin溶液，浓度1.438mg/mL。
实施例13
本实施例提供一种金属络合物(记为89Zr-Dar-Avastin)，将实施例12制备得到的偶联物与89Zr进行络合，具体操作如下：
取89Zr原液(草酸锆，60μL，1.22mCi)，加入到实施例12制备得到的Dar-Avastin溶液中，摇匀，加入0.1M Na2CO3溶液调节pH至7.0，室温反应过夜。然后加入适量生理盐水进行高速离心(离心机参数：7000r，12min)，取下滤液收集管，将滤液倒出，重复操作2～4次。得到270μL89Zr-Dar-Avastin溶液，活度172μCi，TLC放化纯100％，HPLC放化纯86.7％，浓度4.5728mg/mL。
实施例14
本实施例提供一种偶联物(记为Dar-PEG-Avastin)，操作如下：
将抗体Avastin与实施例3的Dar-PEG进行偶联，操作如下：
6.87mg Dar-PEG溶于1mL去离子水，用0.1M NaOH溶液调节pH至5.5～6.0。加入1.5mg Sulfo-NHS，摇匀。加入EDC·HCl(9.6μL,13.5mg/mL)，摇匀。4℃静置30min。然后加入Avastin溶液(400μL,2mg)，摇匀，用0.1M NaOH溶液调节pH至7.5～8.0，摇匀。4℃静置过夜。
得到的Dar-PEG-Avastin偶联溶液中加入适量的NaOAc Buffer(0.1M,pH 6.5)进行离心(离心机参数：7000r，12～15min)，取下滤液收集管，将滤液倒出。重复上述操作2～4次。最后，加入400μL NaOAc Buffer(0.1M,pH 6.5)进行稀释，得到Dar-PEG-Avastin溶液，浓度1.49mg/mL。
实施例15
本实施例提供一种金属络合物(记为177Lu-Dar-PEG-Avastin)，将实施例14制备得到的偶联物与177Lu进行络合，具体操作如下：
取550μL的实施例14制备得到的Dar-PEG-Avastin溶液(1.49mg/mL)，用500μL0.1M NaOAc Buffer稀释。
在NaOAc Buffer(400μL,0.2M,pH 4.64)中加入177Lu原液(35μL,21.4mCi)，摇匀，得到177Lu溶液，测TLC，显示几乎无胶体产生。
向Dar-PEG-Avastin溶液中加入215μL 177Lu溶液，摇匀，测得pH 6.0。室温反应30min，取样测TLC，显示标记率100％，停止反应。
反应溶液过PD-10柱，用生理盐水淋洗，500μL×5，收集第二管，得到500μL，2.05mCi，取样测HPLC，放化纯100％。
实施例16
本实施例提供一种偶联物，操作如下：
利用实施例1的双功能大环螯合物Dar，形成Dar-NCS，参照下述合成路径进行合成：
Figure BDA0003189633430000181
具体操作如下：
步骤一：
在化合物I-a(即Dar)(260mg,269μmol,纯度80％,1.00eq)和化合物1A(42.1mg,216μmol,39.0μL,0.80eq,2HCl)的DMF(15.0mL)悬浮液中加入TEA(410mg,4.05mmol,563μL,15.0eq)，搅拌至反应物完全溶解。随后在20℃下分批加入HBTU(102mg,270μmol,1.00eq)的DMF(5.00mL)溶液，1h内加完。20℃搅拌14h得到中间体I。
LC-MS：875.1[M+H]+。
步骤二：
将中间体I粗品(300mg,274μmol,1.00eq,6HCl)在甲醇(20.0mL)中溶解，溶液冷却至-5℃，然后加入二氯化亚硫(6.56g,55.1mmol,4.00mL,201eq)，将反应混合物在25℃下搅拌1h后在45℃下加热1h。LC-MS检测反应完成，将反应混合物真空浓缩后溶于水(5mL)中，用碳酸氢钠水溶液碱化沉淀出白色固体，用乙酸乙酯(5mL)萃取，分离有机相并真空浓缩，得到的残余物用制备型HPLC纯化，随后冻干得到白色固体的中间体II(80mg,87.24μmol)，产率31.8％，纯度100％。
LC-MS：917.5[M+H]+，459.4[M/2+H]+。
步骤三：
在THF水溶液(50％,4mL)中加入中间体II(30.0mg,32.7μmol,1.00eq)并溶解，然后分批加入一水合氢氧化锂(27.5mg,654μmol,20.0eq)，25℃下搅拌14h。除去THF并用1M盐酸水溶液将残余物酸化至pH＝5。酸化的水溶液通过制备型HPLC纯化，得到中间体I(15mg,13.7μmol,6HCl)，产率41.9％，为白色固体。
LC-MS：875.4[M+H]+。
步骤四：
在中间体I(15.0mg,13.7μmol,1.00eq,6HCl)的二氯甲烷溶液中加入二氯硫化碳(15.7mg,137μmol,10.5μL,10.0eq)，在15℃下搅拌4h。反应混合物用二氯甲烷(5.00mL x3)萃取除去过量的二氯硫化碳，水层直接冻干得到Dar-NCS(5mg,4.22μmol,6HCl)，产率30.7％，纯度95.8％，为白色固体。
LC-MS：917.5[M+H]+，459.4[M/2+H]+。
1HNMR(400MHz，D2O)：δ:7.88-7.78(m,2H),7.45-7.37(m,3H),7.34-7.28(m,1H),7.25-7.15(m,4H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.92(d,J＝8.4Hz,2H),4.61-4.37(m,16H),4.13(s,2H),3.98(s,2H),3.91-3.79(m,6H),2.15(s,6H)。
将抗体Avastin与Dar-NCS进行偶联，操作如下：
取Avastin注射液(450μL,11.25mg)，用NaOAc Buffer(3.2mL,0.1M,pH 6.5)稀释，离心置换buffer得到Avastin溶液(1.8mL,5.74mg/mL)。取Avastin溶液(350μL,5.74mg/mL)加入Dar-NCS溶液(350μL,0.01224mg/mL)，微微摇匀。用0.1M Na2CO3溶液缓慢调节溶液pH至8.5，微微摇匀。然后将离心管置于37℃加热板中加热1h，再静置冷藏过夜。得到的Dar-NCS-Avastin偶联溶液加去离子水进行离心(离心机参数：6500r，15min)，重复2～4次。
实施例17
本实施例提供一种偶联物(记为Dar-KN035)，将KN035与实施例1的双功能大环螯合物Dar进行偶联，操作如下：
取KN035注射液(450μL,11.25mg)，用NaOAc Buffer(3.2mL,0.1M,pH 6.5)稀释，离心置换buffer得到KN035溶液(1.8mL,5.74mg/mL)。
取84.1mg的实施例1的Dar钠盐溶于3mL去离子水中，用0.1M HCl调节pH至5.5～6.0。加入20.6mg Sulfo-NHS、2.0mg EDC·HCl，摇匀。4℃静置30min。
加入1.219mL KN035溶液，摇匀，用0.1M Na2CO3溶液调节溶液pH至7.5～8.0，摇匀。4℃静置过夜。
在得到的Dar-KN035偶联溶液中加入NaOAc Buffer(0.1M,pH 6.5)进行高速离心(离心机参数：7000r，12min)，拿下滤液收集管，将滤液倒出，重复2～4次。得到1.5mL Dar-KN035溶液，浓度1.438mg/mL。
实施例18
本实施例提供一种金属络合物(记为89Zr-Dar-KN035)，将实施例17制备得到的偶联物与89Zr进行络合，具体操作如下：
取89Zr原液(草酸锆，60μL，1.22mCi)，加入到实施例17制备得到的Dar-KN035偶联溶液中，摇匀，加入0.1M Na2CO3溶液调节pH至7.0，室温反应过夜。然后加入适量生理盐水进行高速离心(离心机参数：7000r，12min)，取下滤液收集管，将滤液倒出，重复操作2～4次。得到270μL89Zr-Dar-KN035溶液，活度172μCi，HPLC放化纯96％，浓度4.5728mg/mL。
实验例1：PET显像
方法：对LNCap荷瘤鼠尾静脉注射实施例9制备得到的络合物89Zr-Dar-PSMA-617(200μCi)，在给药的同时进行动态扫描60min，并于给药后2～216h不同时间点进行静态全身扫描10min。小鼠PET扫描图像见图1。
结论：①LNCap荷瘤鼠单次静脉给予89Zr-Dar-PSMA-617后，放射性物质主要分布在膀胱和肾脏，其放射性摄取值在2h内迅速下降；其它组织(肺、肝、心等)分布均较少；②肿瘤的放射性摄取值在4h达到峰值，随后随时间逐渐下降。动物试验研究表明，89Zr-Dar-PSMA-617具有良好的诊断效果，为治疗药物的开发及用药指导提供了可能。
实验例2：PET显像
方法：参见实验例1，区别在于注射的络合物为实施例7制备得到的络合物，小鼠PET扫描图像见图2。
结论：①LNCap荷瘤鼠单次静脉给予实施例7制备得到的络合物后，放射性物质主要分布在膀胱和肾脏，其放射性摄取值在2h内迅速下降；其它组织(肺、肝、心等)分布均较少；②肿瘤的放射性摄取值在15min达到峰值，随后随时间逐渐下降。动物试验研究表明，本产品具有良好的临床应用前景。
实验例3：PET显像
方法：参见实验例1，区别在于注射的络合物为实施例10制备得到的络合物68Ga-Dar-PSMA-617，小鼠PET扫描图像见图3。
结论：给药1h后可见明显的肿瘤摄取，其他非靶器官摄取较低。68Ga-Dar-PSMA-617主要通过肾脏排泄。可见，本产品具有较好的体内稳定性和靶向性，有望成为新型靶向诊断试剂。
实验例4：药代动力学研究
对比例1(记为89Zr-Dar)制备过程如下：将5mCi89Zr(草酸锆)和Dar(50μL,0.05mg)混合,常温反应2h；得到的反应粗品稀释至10mL用C18柱吸附，用10mL灭菌注射用水水洗；然后用0.5mL80％乙醇淋洗C18柱，洗脱得到的4mCi89Zr-Dar用生理盐水稀释至4mL。
方法：SD大鼠用于药代动力学实验，分别静脉注射约80μCi 89Zr-Dar和实施例9制备得到的89Zr-Dar-PSMA-617，每组12只雄鼠。实验动物于给药后5min，15min，30min，1h，2h，3h，4h，5h，6h，8h，12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h经颈静脉丛采血约0.1～0.2mL，称重后用于后续检测。每个时间点各组各采集6雄，12只动物交叉采血。每个样品进行伽马计数检测，计数时间为30s。
结果如下：
(1)动物临床观察：实验期间动物状态未见异常。
(2)药时曲线见图4，由图可知，89Zr-Dar在血液中的半衰期为12.6min，89Zr-Dar-PSMA-617在血液中的半衰期为4.57h。
实验例5：
对比例2(记为177Lu-Dar)：制备过程参考对比例1，区别在于标记的核素为177Lu。
对比例3(记为177Lu-DOTA)：制备过程如下：将5mCi 177Lu和DOTA(50μL,0.05mg)混合，90℃下反应1h；得到的反应粗品稀释至10mL用C18柱吸附，用10mL灭菌注射用水水洗；然后用0.5mL 80％乙醇淋洗C18柱，洗脱得到的4mCi 177Lu-DOTA用生理盐水稀释至4mL。
对比例4(记为177Lu-DOTA-PSMA-617)：制备过程参考对比例3，区别在于将DOTA换成DOTA-PSMA-617。
对比例5(记为DOTA-PSMA-617)：制备过程参照：参考文献10.1021/acs.jmedchem.5b01210。
实验准备：LNCap细胞培养至对数生长期，胰酶消化后，使用完全培养基将细胞密度调整为1*106～2*106cells/mL的细胞悬液。按照每孔0.5～1.0mL，每孔细胞数为1*105cells将其接种于24孔板中(提前2d接种后用于细胞实验)。177Lu-Dar，177Lu-Dar-PSMA-617，177Lu-DOTA和177Lu-DOTA-PSMA-617分别使用基础培养基(添加1％HSA)将其稀释为10μCi/mL备用。
未标记配体Dar、DOTA、Dar-PSMA-617和DOTA-PSMA-617分别使用基础培养基(添加1％HSA)配置为10μg/mL和25μg/mL备用。
实验A：
将细胞置于37℃培养箱孵育1h，4h和24h。
摄取实验：在细胞摄取实验中设置阻断组，未标记配体的加入量为标记受试物的200倍。孵育结束后，收集细胞悬液，1500rpm离心5min收集细胞沉淀，去除上清，用0.5mL预冷PBS洗涤1次，收集细胞沉淀。
内化实验：孵育结束后，收集细胞悬液，加入0.5mL预冷酸洗液，室温孵育1min后去除；再用0.5mL PBS洗涤1次，收集细胞沉淀。
流出实验：孵育结束后，收集细胞悬液，用0.5mL完全培养基洗涤1次，加入0.5mL完全培养基于重悬后放入原孔，37℃孵育24h后收集上清液，并用0.5mL PBS洗涤1次。上清液和PBS洗涤液离心后收集细胞沉淀；原孔用0.5mL 1M消化裂解细胞，并与细胞沉淀合并。
实验B：
将细胞置于37℃培养箱孵育4h和24h。
摄取实验：在细胞摄取实验中设置阻断组，未标记配体的加入量为标记受试物的600倍。其余操作参考实验A。
内化实验和流出实验设计和操作参考实验A。
数据处理：
收集细胞沉淀进行伽马计数。每次检测时同时检测空白管和标准管。
细胞结合率(％)＝细胞裂解液CPM/标准管CPM*100
细胞内化率(％)＝酸洗后细胞裂解液CPM/摄取实验细胞裂解液CPM*100
细胞流出率(％)＝流出实验细胞裂解液CPM/摄取实验细胞裂解液CPM*100
实验结果：
实验A：根据图5可知，摄取实验：177Lu-受试物与LNCap细胞的摄取率随着时间逐渐升高。177Lu-Dar与LNCap细胞1h，4h和24h的摄取率分别为0.21％，0.65％和3.35％；阻断组的摄取率分别为0.40％，0.28％和1.72％。177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞1h，4h和24h的摄取率分别为1.88％，5.51％和9.96％；阻断组的摄取率分别为1.45％，1.73％和2.01％。177Lu-DOTA与LNCap细胞1h，4h和24h的摄取率分别为0.22％，0.20％和2.01％；阻断组的摄取率分别为0.26％，0.24％和1.97％。177Lu-DOTA-PSMA-617与LNCap细胞1h，4h和24h的摄取率分别为0.45％，0.82％和2.88％；阻断组的摄取率分别为0.29％，0.28％和2.36％。
内化实验：177Lu-Dar与LNCap细胞1h，4h和24h的内化率分别为53.31％，83.64％和12.25％。177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞1h，4h和24h的内化率分别为261.51％，47.07％和38.92％。177Lu-DOTA与LNCap细胞1h，4h和24h的内化率分别为35.46％，165.46％和8.33％。177Lu-DOTA-PSMA-617与LNCap细胞1h，4h和24h的内化率分别为43.33％，90.03％和29.70％。
流出实验：177Lu-Dar与LNCap细胞1h，4h和24h的流出率分别为96.57％，29.87％和17.49％。177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞1h，4h和24h的流出率分别为97.32％，31.93％和41.87％。177Lu-DOTA与LNCap细胞1h，4h和24h的流出率分别为76.83％，63.22％和9.38％。177Lu-DOTA-PSMA-617与LNCap细胞1h，4h和24h的流出率分别为66.48％，41.44％和25.75％。
实验B：根据图6可知，摄取实验：177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞4h和24h的摄取率分别为9.50％和10.59％；阻断组的摄取率分别为1.95％和0.92％。177Lu-DOTA-PSMA-617与LNCap细胞4h和24h的摄取率分别为3.60％和3.87％；阻断组的摄取率分别为0.39％和0.31％。177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞的摄取率相比177Lu-DOTA-PSMA-617高，且两个时间点无显著差异。
内化实验：177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞4h和24h的内化率分别为51.92％和57.22％。177Lu-DOTA-PSMA-617与LNCap细胞4h和24h的内化率分别为60.43％和53.41％。177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞的内化率随时间升高，而177Lu-DOTA-PSMA-617随时间降低。
流出实验：177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞4h和24h的流出率分别为43.59％和44.60％。177Lu-DOTA-PSMA-617与LNCap细胞4h和24h的流出率分别为39.01％和39.05％。177Lu-Dar-PSMA-617与LNCap细胞的流出率与177Lu-DOTA-PSMA-617相当。
实验例6：177Lu-Dar-PSMA-617治疗研究
采用LNCap荷瘤鼠动物模型。分组：
实验组：(A)177Lu-Dar-PSMA-617低剂量0.25mCi(n＝7)；
(B)177Lu-Dar-PSMA-617中剂量0.5mCi(n＝10)；
(C)177Lu-Dar-PSMA-617高剂量1mCi(n＝10)
阳性对照组：(D)177Lu-DOTA-PSMA-617 0.5mCi(n＝7)；
(E)177Lu-DOTA-PSMA-617 1mCi(n＝10)
阴性对照组：(F)177LuCl3 1mCi(n＝10)；
(G)生理盐水(n＝10)
方法：给药当天记为D-0，每天或隔天对进行体重和肿瘤大小检测。给予177Lu-Dar-PSMA-617(Group C)后，于给药后4h、24h、72h、120h、240h进行SPECT扫描；对照组177Lu-DOTA-PSMA-617(Group E)和177LuCl3(Group F)分别于2h、24h、72h、120h(240h)进行SPECT扫描(见图7，从上至下依次为C组、E组和F组)。保持动物固定不动，在SPECT扫描前/后完成CT扫描。扫描前采用异氟烷通过麻醉机对动物进行呼吸麻醉，将完成麻醉诱导的动物摆放在SPECT/CT床位上，在扫描过程中动物将持续吸入异氟烷以维持麻醉效果。每个床位静态扫描10～30min，并记录扫描时间。
实验结果：
(1)动物临床观察：177Lu-Dar-PSMA-617低剂量组(Group A)实验期间动物状态未见异常。177Lu-DOTA-PSMA-617中剂量组(Group D)实验期间动物状态未见异常。177LuCl3组(Group F)实验期间，从D-5开始，部分动物出现消瘦，弓背现象，到实验后期所有动物均呈现消瘦和弓背现象，对Group F死亡小鼠进行大体解剖发现，出现骨骼暗红，骨髓淤血现象。
(2)根据图8可知，与对照组生理盐水组(Group G)相比，实验组A～C和阳性对照组D、E动物肿瘤大小增长缓慢，甚至在实验后期，出现肿瘤逐渐下降的趋势(177Lu-Dar-PSMA-617中剂量组(Group B))，这说明177Lu-Dar-PSMA-617具有显著抑制LNCap肿瘤生长的作用，且明显优于177Lu-DOTA-PSMA-617。根据图9可知，体重逐渐降低，其中C组和F组下降迅速。其他组未观察到快速体重减轻、腹泻、毛发脱落等不良反应。
实验例7：89Zr-Dar-KN035显像研究
方法：对MC38/MC38-hPDL1双侧荷瘤鼠尾静脉注射89Zr-Dar-KN035(100μCi)，其中MC38为低表达PDL1肿瘤，MC38-hPDL1为高表达PDL1肿瘤。在给药的同时进行动态扫描60min，并于给药后1～168h不同时间点进行静态全身扫描10min。小鼠PET扫描图像见图10，其中，左侧为MC38，右侧为MC38-hPDL1。
根据图10可知，89Zr-Dar-KN035在高表达肿瘤组织中有明显摄取，在低表达肿瘤组织中几乎无摄取，说明89Zr-Dar-KN035有良好的肿瘤选择性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (14)

1.一种双功能大环螯合物，其特征在于，其为下述式I所示化合物，
Figure QLYQS_1
式I，
其中，R1、R3、R5和R7分别独立地选自(CH2)n、
Figure QLYQS_2
和/>
Figure QLYQS_3
中的任意一种，n选自1~8，
R2、R4、R6和R8分别独立地选自羧基或磷酸基，
Ra、Rb、Rc和Rd分别独立地选自H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、卤素、甲氧基和乙氧基的任意一种，
环
Figure QLYQS_4
为/>
Figure QLYQS_5
或/>
Figure QLYQS_6
。
2.根据权利要求1所述的双功能大环螯合物，其特征在于，所述双功能大环螯合物选自下述结构式所示化合物中的任意一种：
Figure QLYQS_7
、/>
Figure QLYQS_8
、
Figure QLYQS_9
、
Figure QLYQS_10
、
Figure QLYQS_11
和
Figure QLYQS_12
。
3. 一种双功能大环螯合物，其特征在于，所述双功能大环螯合物选自下述结构式所示化合物中的任意一种：
Figure QLYQS_13
、/>
Figure QLYQS_14
、
Figure QLYQS_15
、
Figure QLYQS_16
、
Figure QLYQS_17
、
Figure QLYQS_18
、/>
Figure QLYQS_19
、
Figure QLYQS_20
和
Figure QLYQS_21
。
4.一种偶联物，其特征在于，所述偶联物是通过靶分子与权利要求1或2所述的双功能大环螯合物中的R2、R4、R6和R8中的至少一个基团或权利要求3所述的双功能大环螯合物中的R2、R4、R6和R8相应位置上的基团进行偶联形成的化合物；所述靶分子可以选自抗体、肽和小分子药物中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的偶联物，其特征在于，所述的双功能大环螯合物中的R2、R4、R6和R8中的任意一个基团或任意两个基团或所述的双功能大环螯合物中的R2、R4、R6和R8相应位置上的任意一个或任意两个基团与所述靶分子进行偶联。
6.根据权利要求4所述的偶联物，其特征在于，R6与所述靶分子进行偶联或者R2和R6同时与所述靶分子进行偶联。
7.根据权利要求4-6任一项所述的偶联物，其特征在于，偶联的过程包括：将所述双功能大环螯合物与缩合剂、所述靶分子在0-100℃的条件下进行反应，其中，上述反应的反应体系的pH为2-11；
其中，所述缩合剂为HOAt、HOBt、HATU、HBTU、DMAP、PyBOP、EDC、DCC、DIC、NHS中的至少一种。
8.一种金属络合物，其特征在于，所述金属络合物是通过权利要求1-3任一项所述的双功能大环螯合物或权利要求4-7任一项所述的偶联物与金属离子螯合形成的络合物，所述金属离子为放射性离子或Al[18F]、51Mn、52mMn、52gMn、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、89Zr、86Y、90Y、99mTc、111In、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi、212Pb、213Bi、223Ra、225Ac和227Th中的任意一种。
9.根据权利要求8所述的金属络合物，其特征在于，螯合的过程包括：将含有所述偶联物的溶液与含有金属离子的溶液混合，调节溶液pH至3-11，在0-110℃的条件下进行反应。
10.根据权利要求9所述的金属络合物，其特征在于，pH为4-9。
11.权利要求1-3任一项所述的双功能大环螯合物或权利要求4-7任一项所述的偶联物或权利要求8-10任一项所述的金属络合物在制备诊断和/或治疗肿瘤的药物中的应用。
12.权利要求1-3任一项所述的双功能大环螯合物或权利要求4-7任一项所述的偶联物或权利要求8-10任一项所述的金属络合物在制备放射性药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述放射性药物为分子影像的诊断剂。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述放射性药物为可以治疗肿瘤的药物。
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