CN114853851B - 靶向pd-l1多肽探针及其在制备pet显像剂中的应用 - Google Patents

靶向pd-l1多肽探针及其在制备pet显像剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及正电子核素标记靶向程序性死亡受体1配体(PD‑L1)多肽探针及其制备方法与用途。靶向PD‑L1多肽探针[X]NOTA‑R‑PDL1P结构式如式1，其中，R＝‑H，4‑甲基苯丁酰基，或4‑碘代苯丁酰基；Xn+＝68Ga3+，[Al18F]2+，64Cu2+或其它放射性金属离子。本发明制备的靶向PD‑L1多肽探针，具有优良体内药代动力学特性，本发明还涉及靶向PD‑L1多肽探针在制备肿瘤PET显像剂中的应用。其中：或Xn+＝68Ga3+，[Al18F]2+，64Cu2+或其它放射性金属离子，式1。

Description

靶向PD-L1多肽探针及其在制备PET显像剂中的应用
【技术领域】
本发明涉及正电子放射性核素标记靶向PD-L1多肽探针及其在制备PET显像剂中的应用，尤其是靶向PD-L1多肽探针、制备方法及其在肿瘤正电子发射断层(PET)显像剂中的应用。
【背景技术】
免疫检查点抗体抑制剂的临床转化应用开辟了肿瘤靶向治疗新方向，引起临床工作者极大的关注[1]。靶向免疫检查点受体细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA-4)受体、程序性死亡受体1(PD1)及其配体PD-L1的癌症免疫疗法改变了常规抗癌免疫疗法[2]。特别是针对PD-1和PD-L1的免疫检查点抗体抑制剂已经在包括黑色素瘤(MM)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)、膀胱癌和霍奇金淋巴瘤在内的十余种癌症中表现出明显的疗效。PD-1/PD-L免疫阻断疗法的预后与体内PD-1/PD-L1表达密切有关，其精准检测有利于筛选对PD-1/PD-L1免疫治疗应答的患者，实现肿瘤精准靶向免疫治疗。由于恶性肿瘤PD-1和PD-L1表达的高度异质性，使用常规活检与免疫组织化学方法不能完全准确和全面评估PD-1/PD-L1的真实异质性表达。放射免疫显像可无创、实时、精准、定量、可视化检测相关免疫检查点PD-1/PD-L1表达水平，以筛选适合PD-1/PD-L1免疫治疗的患者并评估疗效。但是，放射免疫显像使用的抗体具有分子量较大、价格昂贵、标记困难、潜在的免疫原性、体内清除较慢等缺陷[3]。体外研究表明RK-10多肽(RK-10：GSGSGSTYLCGAISLAPKAQIKESL)是一种靶向肿瘤PD-L1小分子肽类配体，但无活体显像研究报道。研制靶向PD-L1多肽探针用于肿瘤PET显像具有巨大应用前景。
参考文献：
[1]Leach DR，Krummel MF，Allison JP.Enhancement of antitumor immunityby CTLA-4blockade.Science，1996，271(5256)：734-1736.
[2]Smyth MJ，Ngiow SF，Ribas A，Teng MWL.Combination cancer immunothe-rapies tailored to the tumour microenvironment.Nat Rev Clin Oncol，2016，13(3)：143-158
[3]Caldwell Jr C，Johnson CE，Balaji VN，Balaji GA，Hammer RD，KannanR.Identifcation and validation of a PD-L1 binding peptide for determinationof PDL1 expression in tumors.Scientific Reports，2017，7：13682.DOI：10.1038/s41598-017-10946-2
【发明内容】
本发明目的是为了提供一种标记简单、可实现自动化高产率放射合成、具有优良药代动力学特性的靶向程序性死亡受体1配体(PD-L1)正电子发射断层(PET)多肽探针(显像剂)；本发明也提供这些显像剂及其前体原料的制备方法；本发明还进一步提供这些多肽探针作为肿瘤显像剂的用途。
本发明是这样实现的。本发明的多肽探针为正电子核素标记靶向程序性死亡受体1配体(PD-L1)多肽探针[X]NOTA-R-PDL1P，由药效基团多肽、联结基团(如赖氨酸基)、结合血浆白蛋白基(R＝H，4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基)、结合金属螯合基团-1，4，7-三氮杂环九烷基-N’，N”-二乙酸基-N-乙酰基(-NOTA)类似物【如2-S-(4-异硫氰基苄基)-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸，p-SCN-Bn-NOTA等】以及正电子放射性金属核素(Xn+)构成。其中，R＝-H，4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基；PDL1P＝GSGSGSTYLCGAISLAPKAQIKESL；Xn+＝68Ga3+，[Al18F]2+，64Cu2+或其它放射性金属离子。引入4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基结合血浆白蛋白基，可赋予[X]NOTA-R-PDL1P具有更优药代动力学特性，在肿瘤中滞留更长时间，有利于肿瘤诊疗。
其结构为式1，
其中：
Xn+＝68Ga3+，[Al18F]2+，64Cu2+或其它放射性金属离子，
式1。
本发明所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1多肽探针，联结基团为赖氨酸基。
本发明所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1多肽探针，结合金属螯合基团为1，4，7-三氮杂环九烷基-N’，N”-二乙酸基-N-乙酰基，即-NOTA或1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N’，N”N”’-三乙酸基-N-乙酰基，即-DOTA。
本发明还涉及靶向PD-L1的正电子核素(如68Ga3+，18F-，64Cu2+等)标记NOTA-R-PDL1P多肽化合物的制备方法。由于68Ga半衰期较短(67.71min)，不适于长距离运输；而18F半衰期(109.8min)较长和64Cu半衰期(12.7h)长，适于长距离运输和延迟显像。
本发明所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1多肽探针的制备方法，以NOTA-R-PDL1P或DOTA-R-PDL1P为前体原料，分别与Xn+发生螯合反应并经小柱分离纯化，制成靶向程序性死亡受体1配体PD-L1多肽探针[X]NOTA-R-PDL1P或[X]DOTA-R-PDL1P。
放射合成靶向PD-L1多肽探针[X]NOTA-R-PDL1P的关键是其前体NOTA-R-PDL1P的制备。前体原料NOTA-R-PDL1P可以采用固相多肽合成方法制备，PDL1P经修饰双功能基(如赖氨酸基)后进一步修饰结合血浆白蛋白基(R＝4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基)和结合金属螯合基团(如-NOTA类似物)即可获得，尽管制备过程较繁琐，但制备产率尚可。
[X]DOTA-R-PDL1P前体原料DOTA-R-PDL1P用以下方法制备：PDL1P修饰-Lys后形成PDL1P-Lys，分别与-DOTA和结合血浆白蛋白基R在微碱性溶液中室温下反应1-2小时，生成[X]DOTA-R-PDL1P，用制备型HPLC分离纯化收集产品峰，即可获得纯化前体产品。
本发明还涉及靶向PD-L1多肽探针[X]NOTA-R-PDL1P在肿瘤正电子发射断层(PET)显像中的应用，包括[X]NOTA-R-PDL1P应用于乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌等多种实体瘤PET显像，并可进一步应用于乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌等多种实体瘤疗效评价。
本发明涉及靶向PD-L1多肽探针[X]NOTA-R-PDL1P，具有以下优势：(1)[X]NOTA-R-PDL1P可由正电子核素(如68Ga3+，[Al18F]2+，64Cu2+等)与NOTA-R-PDL1P一步反应和小柱分离纯化制得。其制备方法简单，可用简单合成仪实现其高产率和高纯度自动化合成，满足临床PET显像需要。(2)[X]NOTA-PDL1P在体内表现出优良药代动力学特性，给药后15min时即可在肿瘤中具有较高摄取，便于肿瘤早期显像，但在肿瘤中滞留时间较短；(3)PDL1P修饰结合血浆白蛋白基(R＝4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基)，对肿瘤组织具有亲血浆白蛋白特性，可赋予[X]NOTA-R-PDL1P(R＝4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基)在肿瘤中具有更长滞留时间，提高肿瘤/本底放射性摄取比值。(4)NOTA-R-PDL1P不仅可用核素68Ga标记，且可用半衰期较长的核素18F标记，并可进一步用半衰期更长核素如64Cu2+等标记，更有利于商业化运输和延迟成像。(4)[X]NOTA-R-PDL1P可望取代靶向PD-L1抗体大分子探针，为恶性肿瘤早期诊断和靶向治疗评估提供优良性能的靶向PD-L1多肽探针和靶向PD-L1核医学显像新技术，为靶向PD-L1核素治疗奠定基础。
初步试验表明，本发明公开的[X]DOTA-R-PDL1P多肽探针也具有类似的化学和生物学功能。
本发明制备方法详述。
本发明以NOTA-R-PDL1P为前体原料，分别与68Ga3+、[Al18F]2+、64Cu2+或其它放射性金属离子反应，调节反应溶液至合适pH，完成68Ga3+、[Al18F]2+、64Cu2+或其他金属离子的螯合反应后，经小柱分离纯化，即可制成[X]NOTA-R-PDL1P多肽探针，其中R＝-H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基；Xn+＝68Ga3+，[Al18F]2+，64Cu2+或其它放射性金属离子。
本发明涉及[X]NOTA-R-PDL1P多肽探针前体NOTA-R-PDL1P的制备。PDL1P通过固相肽合成方法制备后，在碱性二甲亚砜中与L-赖氨酸-BOC反应生成PDL1P-Lys-BOC。PDL1P-Lys-BOC与R-OH(R＝4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基)反应生成PDL1P-R-Lys-BOC后，除去保护基-BOC后在含二异丙基乙胺的二甲亚砜微碱性溶液中再与p-SCN-Bn-NOTA反应得初产品NOTA-R-PDL1P(R＝4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基)。PDL1P-Lys-BOC除去保护基-BOC后，在含二异丙基乙胺的二甲亚砜微碱性溶液中再与p-SCN-Bn-NOTA反应得初产品NOTA-R-PDL1P(R＝-H)。初产品用制备型HPLC分离纯化收集产品峰，经冷冻干燥后获得多肽前体NOTA-R-PDL1(R＝-H，4-甲基苯丁酰基，4-碘代苯丁酰基)。NOTA-R-PDL1化学产率较高，纯度大于95％。本发明专利的实施解决了多肽前体NOTA-R-PDL1制备难题，为进一步解决一步法自动化合成[X]NOTA-R-PDL1P多肽探针奠定了基础。
本发明还涉及[X]NOTA-R-PDL1多肽探针的放射合成。[X]NOTA-R-PDL1P多肽探针，其中R＝-H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基；Xn+＝68Ga3+，[Al18F]2+，64Cu2+或其它放射性金属离子。以NOTA-R-PDL1P为前体，在弱酸性(pH 3.5-4.5)和90-110℃条件下，优选条件在pH 4.0和100℃时，与68GaCl3发生螯合反应后，经Sep-Pak plus C18小柱或HLB小柱分离纯化，可制备[68Ga]NOTA-R-PDL1P注射液，反应式示于合成路线1；以NOTA-R-PDL1P为前体，在弱酸性(pH 3.6-4.4)和90-100℃条件下，优选条件在pH4.0和95℃时，与Al18F发生螯合反应后，经Sep-Pak plus C18小柱或HLB小柱分离纯化，可获得[18F]AlF-NOTA-R-PDL1P注射液，反应式示于合成路线2；以NOTA-R-PDL1P为前体，也可制备其它[X]NOTA-R-PDL1P注射液，如合成路线3。
PET显像结果表明：[18F]AlF-NOTA-PDL1P(18F-PD-L1)在MDA-MB-231乳腺癌模型中具有较高摄取，免疫组化结果显示PD-L1表达阳性，在H22肝癌模型中也具有较高摄取，而在SUM149人乳腺癌模型中则几乎没有摄取。[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在HCT116结肠癌和PC3前列腺肿瘤模型中具有较高摄取，从30分钟开始到120分钟，肿瘤一直维持着比较高的摄取，而且免疫组化结果也显示PD-L1表达阳性。可见，[18F]AlF-NOTA-PDL1P和[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌等多种实体瘤中均有较高摄取，可用于PD-L1高表达PET显像，但后者在肿瘤中滞留时间更长。
其中：R＝-H，
其中：
(1)[68Ga]NOTA-PDL1P，R＝H；
(2)[68Ga]NoTA-MPB-PDL1P，
(3)[68Ga]NoTA-IPB-PDL1P，
合成路线1：[68Ga]NOTA-R-PDL1P的合成。
其中：R＝-H，
其中：
(4)[18F]AlF-NOTA-PDL1P，R＝H；
(5)[18F]AlF-NOTA-MPB-PDL1P，
(6)[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P，
合成路线2：[18F]AlF-NOTA-R-PDL1P的合成。
其中：R＝-H，
其中：
(7)[64Cu]NOTA-PDL1P，R＝H；
(8)[64Cu]NoTA-MPB-PDL1P，
(9)[64Cu]NoTA-IPB-PDL1P，
合成路线3：[64Cu]NOTA-R-PDL1P的合成。
【附图说明】
图1为[18F]AlF-NOTA-PDL1P注射液的HPLC分析图谱。上图为放射性图谱，下图为紫外图谱。
图2为[18F]AlF-NOTA-PDL1P注射液在血清中不同时间内HPLC分析色谱图。
图3为[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P注射液的HPLC分析图谱(上图)及NOTA-IPB-PDL1P的HPLC紫外图(下图)。
图4为[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P注射液在PBS缓冲液2h稳定性。2.6min时存在放射性小峰，可能是由于分离不完全残留18F-引起的。
图5为[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P注射液在HCT116结肠癌细胞中的摄取图。
图6为[18F]AlF-NOTA-PDL1P在小鼠体内的生物分布图。
图7为[18F]AlF-NOTA-PDL1P(18F-PD-L1)在PD-L1高表达的MDA-MB-231乳腺癌模型中60时小动物PET/CT图、竞争抑制显像图以及肿瘤病灶免疫组化图，并与[18F]FDG比较。
图8为[18F]AlF-NOTA-PDL1P(18F-PD-L1)在H22肝癌模型中30分钟时小动物PET/CT图，并与[18F]FDG比较。
图9为[18F]AlF-NOTA-PDL1P(18F-PD-L1)在PD-L1低表达的SUM149人乳腺癌模型中60分钟时小动物PET/CT显像以及竞争抑制显像图，并与[18F]FDG比较。
图10为[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在HCT116结肠癌模型中不同时间的小动物PET/CT图(上图)及肿瘤病灶免疫组化图(下图)。
图11为[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在PC3前列腺肿瘤模型中不同时间小动物PET/CT图(上图)及肿瘤病灶免疫组化图(下图)。
【具体实施方式】
实施例1前体NOTA-R-PDL1P的制备
PDL1P用固相肽合成方法制备。PDL1P通过固相肽合成方法制备后，在碱性二甲亚砜中与L-赖氨酸-BOC反应生成PDL1P-Lys-BOC。PDL1P-Lys-BOC与R-羧酸(R＝4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基)反应生成PDL1P-R-Lys-BOC后，除去保护基-BOC后在含二异丙基乙胺的二甲亚砜微碱性溶液中再与p-SCN-Bn-NOTA反应得初产品NOTA-R-PDL1P(R＝4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基)；或者PDL1P-Lys-BOC除去保护基-BOC后，在含二异丙基乙胺的二甲亚砜微碱性溶液中再与p-SCN-Bn-NOTA反应得初产品NOTA-R-PDL1P(R＝-H)。上述3种反应产品分别用制备型HPLC分离纯化收集产品峰，产品峰溶液经冷冻干燥后获得多肽前体NOTA-R-PDL1P(R＝-H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基)，或NOTA-R-PDL1P(R＝-H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基)化学产率较高，纯度大于95％。
原料PDL1P和前体NOTA-R-PDL1P经HPLC分析其化学纯度大于95％。GSGSGSTYLCGAISLAPKAQIKESL(PDL1P)保留时间为tR＝10.55min，NOTA-GSGSGSTYLCGAISLAPKAQIKESL(NOTA-PDL1P)tR＝9.83min，4-碘苯丁酰基-Lys(NOTA)-GSGSGSTYLCGAISLAPKAQIKESL(NOTA-IPB-PDL1P)tR＝11.42min，4-甲基苯丁酰基-Lys(NOTA)-GSGSGSTYLCGAISLAPKAQIKESL(NOTA-MPB-PDL1P)tR＝12.31。质谱MS(m/z)测定PDL1P分子量(Mr.)为2438.8，NOTA-PDL1P分子量(Mr.)为2724.06，NOTA-IPB-PDL1P分子量(Mr.)为3289.42，NOTA-MPB-PDL1P分子量(Mr.)为3177.24。
前体DOTA-R-PDL1P按上述类似方法由PDL1P-Lys-BOC分别与R-OH(R＝-H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基)和1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N’，N”N”’-三乙酸基-N-乙酰基(DOTA-)丁二酰亚胺酯(NHS-)(DOTA-NHS)反应制备。产品经HPLC和MS测定。
实施例2[18F]AlF-NOTA-R-PDL1P的放射合成
在装有NOTA-R-PDL1P(R＝H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基)(50μg/μL，50μL)的反应瓶中，依次加入2mM AlCl3溶液6μL、冰醋酸4μL和乙腈300μL，混匀。由回旋加速器通过18O(p，n)18F核反应生产的18F-，在N2载带下，捕集在Sep-Pak QMA阴离子小柱中，18O-水被收集在回收瓶中。用生理盐水0.3～0.4mL将QMA小柱中18F-洗脱入小瓶中，取其中50-100μL加入上述反应瓶中。搅拌混匀后，100℃加热反应10～15min左右。冷却，加水6～8mL到反应瓶中，混匀，转移至HLB小柱或SEP-PAK C18小柱中。反应瓶中溶液全部转移完后，用10mL×3注射用水冲洗小柱，吹干小柱。最后，用乙醇1.5mL洗脱产品经无菌滤膜后收集在接收瓶中，用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[18F]AlF-NOTA-R-PDL1P注射液。[18F]AlF-NOTA-R-PDL1P未校正放射化学产率为10～30％，总放射合成时间为35min。
实施例3[68Ga]NOTA-R-PDL1P和[64Cu]NOTA-R-PDL1P的放射合成
在含前体NOTA-R-PDL1P(R＝H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基)(50μg/μL)50μL的反应管中加入1.25M乙酸钠溶液200μL。从68Ge/68Ga发生器中用0.05M盐酸4mL洗脱68GaCl3至上述反应管中，混匀，调溶液pH至4.0，100℃加热反应10～15min左右。冷却，加入生理盐水4mL到反应瓶中，混匀，转移至HLB小柱或SEP-PAK C18小柱中。待反应瓶中溶液全部转移完后，用10mL×2注射用水冲洗小柱，吹干小柱。然后，用乙醇1.5mL洗脱产品并经无菌滤膜后收集到接收瓶中，用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[68Ga]NOTA-R-PDL1P注射液。[68Ga]NOTA-R-PDL1P未校正放射化学产率为20～50％，总放射合成时间为30min。
在反应管中依次加入NOTA-R-PDL1P(R＝H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基)(50μg/μL)100μL和64CuCl2溶液0.100-1.000mL，用乙酸钠溶液调至pH4.0-5.6，室温反应10～15min。最后用生理盐水稀释并经无菌滤膜过滤后收集到接收瓶中，得到符合要求的[64Cu]NOTA-R-PDL1P注射液。[64Cu]NOTA-R-PDL1P未校正放射化学产率为50～70％。
实施例4[68Ga]DOTA-R-PDL1P和[64Cu]DOTA-R-PDL1P的放射合成
在反应管中依次加入DOTA-R-PDL1P(R＝H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基)(50μg/μL)50μL和1.25M乙酸钠溶液200μL。从68Ge/68Ga发生器中用0.05M盐酸4mL洗脱68GaCl3至上述反应管中，混匀，调溶液pH至4.0，100℃加热反应10min。冷却，加入生理盐水4mL到反应瓶中，混匀，转移至HLB小柱中。待反应瓶中溶液全部转移完后，用10mL×2注射用水冲洗小柱，吹干小柱。然后，用乙醇1.5洗脱产品并经无菌滤膜后收集到接收瓶中，用生理盐水将其稀释成含5％乙醇的产品溶液，得到符合要求的[68Ga]DOTA-R-PDL1P注射液。[68Ga]DOTA-R-PDL1P未校正放射化学产率为30～60％，总放射合成时间约30min。
在反应管中依次加入DOTA-R-PDL1P(R＝H，4-甲基苯丁酰基，或4-碘代苯丁酰基)(50μg/μL)100μL和64CuCl2溶液0.100-1.0mL，用乙酸钠溶液调至pH4.0-5.6，室温反应10～15min。最后用生理盐水稀释并经无菌滤膜过滤后收集到接收瓶中，得到符合要求的[64Cu]DOTA-R-PDL1P注射液。[64Cu]DOTA-R-PDL1P未校正放射化学产率为30～70％。
实施例5产品放化纯度和稳定性的测定
用放射性高效液相色谱(HPLC)和薄层色谱法(TLC)测定多肽PET药物注射液的放射化学纯度。HPLC分析条件：分析柱为Zorbax eclipse xdb-c18柱。流动相为0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液：0.1％TFA的水溶液，行梯度洗脱：0min时，含0.1％TFA的乙腈溶液/0.1％TFA的水溶液：2/98；逐渐升到8min时，0.I％TFA的乙腈溶液/0.1％TFA的水溶液：10/90；再升到20min时，0.1％TFA的乙腈溶液/0.I％TFA的水溶液：80/20。流速为1mL/min，紫外检测波长210nm和254nm。用确定结构的非放射性标准品[19F]AlF-NOTA-R-PDL1P、[Ga3+]NOTA-R-PDL1P、[Cu2+]NOTA-R-PDL1P、[Ga3+]DOTA-R-PDL1P和[Cu2+]DOTA-R-PDL1P，分别与相应的放射性多肽探针[18F]AlF-NOTA-R-PDL1P、[68Ga]NOTA-R-PDL1P、[64Cu]NOTA-R-PDL1P、[68Ga]DOTA-R-PDL1P和[64Cu]DOTA-R-PDL1P注射液共同注射到HPLC中，或共同点样行TLC，以确定其保留时间(Rt)或比移值Rf是否一致，并证实制备多肽探针的真实性。用HPLC法测定其放射化学纯度均大于95％。代表性[18F]AlF-NOTA-PDL1P注射液放射性HPLC分析结果示于图1(上图放射峰Rt＝14.12min，下图标准品紫外峰Rt＝14.88)，放射化学纯度大于95％。
TLC法检测靶向PD-L1多肽探针[X]NOTA-R-PDL1P注射液的放射化学纯度。取一条硅胶板，放到屏蔽铅玻璃后面，用毛细管吸取少许放射性样品及其标准品(浓度0.5mg/mL)，一同轻轻点在硅胶板上距离一头1.5cm处，用电吹风吹干。在层析缸内进行层析，展开剂为甲醇：1.0M乙酸铵＝50：50(V/V)，层析后用热空气吹干，采用放射性TLC扫描仪行薄层扫描。扫描后，用碘染色TLC板，检测放射性样品和标准品的比移值(Rf)。代表性[18F]AlF-NOTA-PDL1P注射液Rf＝＝0.45。
HPLC法检测血清中[X]NOTA-R-PDL1P稳定性。代表性例子就是用HPLC检测血清中[18F]AlF-NOTA-PDL1P稳定性。[18F]AlF-NOTA-PDL1P在血清中不同时间的放化纯度示于图2。由图2可知道，在60min、90min和120min时，均只出现单一主峰，没有检测到其它副峰，提示[18F]AlF-NOTA-PDL1P在血清中2h内没有脱氟和分解现象发生(图2)。用同样方法检测其它[X]NOTA-R-PDL1P体外稳定性，在120min内均只发现单一主峰。这些结果表明，其它[X]NOTA-R-PDL1P在血清中较稳定。
[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P注射液的HPLC分析图谱及NOTA-IPB-PDL1P的HPLC紫外图示于图3，[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P放射化学纯度大于95％。[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在PBS缓冲液2h时放化纯度大于90％(图4)，表明其体外稳定性良好。
实验例5体外细胞摄取实验
常规培养中科院上海细胞库的肿瘤细胞株HCT116。取对数生长期的癌细胞，用0.25％的胰酶消化，PBS洗细胞两次；1000转/s离心5min，收集细胞，调整细胞密度约6×106/mL。于24孔板中每孔加入0.1mL细胞悬液，培养24h，待细胞贴壁后更换新鲜培养液并将其随机分为A、B、C、D、E五组，加入[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P后继续培养，于15min、30min、60min、90min、120min后分别用PBS洗3次，之后加入十二烷基硫酸钠使细胞脱落，收集每个孔的细胞，测定细胞的计数，细胞的计数即内摄入胞浆内的标记探针。
细胞摄取实验结果：[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在HCT116细胞中快速摄取，在30分钟时达到1.93±0.17％，并且在120分钟时还能维持在1.96±0.08％，表明[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在HCT116细胞中有相对较高的摄取(图5)。
实施例6[18F]AIF-NOTA-PDL1P体内生物分布实验
正常昆明小鼠体内[18F]AlF-NOTA-PDL1P生物分布实验。20只昆明小鼠随机分成5组，每组4只，每只经尾静脉注射0.1-0.2mL含20-40μCi[18F]AlF-NOTA-PDL1P的溶液，于注射后15、30、60、90和120min分组移除眼球取血后处死小鼠。解剖取各感兴趣脏器(血液、脑、心脏、肺、肝、肾、胰腺、脾脏、胃、小肠、肌肉与骨等组织)的组织样本，称重，测量其放射性计数，计算不同时间点每克组织放射性注射剂量的百分比(％ID/g)。
生物分布结果：[18F]AlF-NOTA-PDL1P在健康昆明小鼠体内生物分布实验结果如图6。结果表明肾脏中每克组织的注射剂量百分比从15min时的9.2±0.05％ID/g下降到120min时的5.4±0.03％ID/g。血液中的放射性从30min的4.7±0.02％ID/g下降到120min时的0.3±0.04％ID/g，表明显像剂在血液中的放射性清除较快。其它脏器心脏，脑，肺，肌肉，骨、肝、脾、胰腺，胃，肠放射性摄取较低。
实验例7体内模型动物PET显像研究
Micro-PET/CT显像研究利用Siemens Inveon Micro-PET/CT(分辨率大约为1.4mm，孔径12cm，轴向视野12.7cm)，采集工作站为Inveon Acquirision workplace(IRW)2.0，数据采集前建立新Workflow(包含CT acquirsion，Reconstruction，PETacquirision，PET histogram，PET Recon.)，受试裸鼠经腋下移植PC3前列腺癌细胞株、HCT116结肠癌细胞株、SUM149人乳腺癌细胞株、H22肝癌细胞株以及MDA-MB-231乳腺癌细胞株等，制成荷瘤裸鼠模型。经10％水合氯醛麻醉后行PET/CT扫描，采集显像剂[18F]AlF-NOTA-PDL1P注射200μCi后60分钟时的PET/CT图像(MDA-MB-231，SUM149，H22)。采集显像剂[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P注射200μCi后120分钟的动态PET/CT图像(PC3，HCT116)。
PET显像结果表明：[18F]AlF-NOTA-PDL1P(18F-PD-L1)在MDA-MB-231乳腺癌模型中具有较高摄取，免疫组化结果显示PD-L1表达阳性(图7)，在H22肝癌模型中也具有较高摄取(图8)，而在SUM149人乳腺癌模型中则几乎没有摄取(图9)。[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在HCT116结肠癌和PC3前列腺肿瘤模型中具有较高摄取，从30分钟开始到120分钟，肿瘤一直维持着比较高的摄取，而且免疫组化结果也显示PD-L1表达阳性(图10和图11)。
[18F]AlF-NOTA-PDL1P和[18F]AlF-NOTA-IPB-PDL1P在乳腺癌、肝癌、结肠癌、前列腺癌等多种实体瘤中均有较高摄取，可用于PD-L1高表达PET显像，但后者在肿瘤中滞留时间更长。为进一步改善其药代动力学特性，尽管其结构可能需要优化，但对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明对其结构加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针，由药效基团多肽PDL1P、联结基团、结合血浆白蛋白基R、结合金属螯合基团以及正电子放射性金属核素Xn+构成，靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针为[X]NOTA-R-PDL1P或[X]DOTA-R-PDL1P，其中[X]NOTA-R-PDL1P结构式如式1，药效基团多肽PDL1P为GSGSGSTYLCGAISLAPKAQIKESL；联结基团为赖氨酸基；结合血浆白蛋白基R＝-H,4-甲基苯丁酰基或4-碘代苯丁酰基；结合金属螯合基团为1,4,7-三氮杂环九烷基-N’,N”-二乙酸基-N-乙酰基，即-NOTA或1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N’,N”N”’-三乙酸基-N-乙酰基，即-DOTA；Xn+＝68Ga3+,[Al18F]2+,64Cu2+；
2.权利要求1所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针的制备方法，其特征在于用以下方法制备：以NOTA-R-PDL1P或DOTA-R-PDL1P为前体原料，分别与Xn+发生螯合反应并经小柱分离纯化，制成靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针[X]NOTA-R-PDL1P或[X]DOTA-R-PDL1P。
3.根据权利要求2所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针的制备方法，其特征在于所述的[X]NOTA-R-PDL1P或[X]DOTA-R-PDL1P前体原料NOTA-R-PDL1P或DOTA-R-PDL1P用以下方法制备：PDL1P修饰-Lys后形成PDL1P-Lys，分别与-NOTA或-DOTA和结合血浆白蛋白基R在微碱性溶液中室温下反应1-2小时，生成[X]NOTA-R-PDL1P或[X]DOTA-R-PDL1P，用制备型HPLC分离纯化收集产品峰，即可获得纯化前体产品。
4.权利要求1所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针的制备方法，其特征在于所述的[68Ga]NOTA-R-PDL1P或[68Ga]DOTA-R-PDL1P用以下方法制备：所述的前体原料NOTA-R-PDL1P或DOTA-R-PDL1P与弱酸性68GaCl3溶液在90-110℃加热下反应，用HLB小柱或SEP-PAK C18小柱分离纯化，即得到[68Ga]NOTA-R-PDL1P或[68Ga]DOTA-R-PDL1P注射液。
5.权利要求1所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针[X]NOTA-R-PDL1P的制备方法，其特征在于所述的[18F]AlF-NOTA-R-PDL1P用以下方法制备：所述的前体原料NOTA-R-PDL1P在乙腈的酸性溶液中与[Al18F]2+反应，经HLB小柱或SEP-PAK C18小柱分离纯化，即得到[18F]AlF-NOTA-R-PDL1P注射液。
6.权利要求1所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针的制备方法，其特征在于所述的[64Cu]NOTA-R-PDL1P或[64Cu]DOTA-R-PDL1P用以下方法合成：所述的前体原料NOTA-R-PDL1P或DOTA-R-PDL1P与64CuCl2在乙酸钠缓冲溶液，pH 4.0-5.6中室温下温育15min，经HLB小柱或SEP-PAK C18小柱分离纯化，得到符合要求的[64Cu]NOTA-R-PDL1P或[64Cu]DOTA-R-PDL1P注射液。
7.权利要求1所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针在制备靶向肿瘤免疫检查点PD-L1的PET显像剂中的应用。
8.权利要求1所述的靶向程序性死亡受体1配体PD-L1的多肽探针在制备PD-L1较高表达的乳腺癌、肝癌、结肠癌PET显像剂中的应用。
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