CN107586317B - 一种可激活的肿瘤凋亡pet显像剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于放射性药物标记领域，具体涉及一种可激活的肿瘤凋亡正电子发射断层显像(Positron Emission Computed Tomography，简称PET)剂及其制备方法和用途，具有式(1)所示的结构，其标记过程仅需要30min，标记时间短，标记产物的放射化学产率能够达到54％，比活度为1.2Ci/μmol，放化纯大于98％，标记效率高，稳定性高，且制备步骤简单。标记产物体外稳定性高，对于凋亡细胞具有高度的靶向性，可以作为正电子发射断层显像(PET)剂，对肿瘤凋亡进行检测；也可用于因细胞凋亡异常导致的相关疾病的早期诊断、检测进展、治疗后的早期疗效评估或新治疗方案的开发和个性化的诊疗方案等。

Description

一种可激活的肿瘤凋亡PET显像剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于放射性药物标记领域，具体涉及一种可激活的肿瘤凋亡正电子发射断层显像(Positron Emission Computed Tomography，简称PET)剂及其制备方法和用途。

背景技术

细胞凋亡(Apoptosis)，是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。细胞凋亡和细胞坏死不同，细胞凋亡不是被动的过程，而是主动的过程，其涉及一系列基因的激活、表达、调控等的作用，并不是在病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好的适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡的形态学变化主要表现为细胞核内染色质凝聚，细胞质中胞质浓缩，细胞膜上出现生物大分子如磷酯酰丝氨酸，形成超微细胞体(或称为凋亡小体)；生化特征的变化主要表现为染色质中DNA被切断，胞浆中钙离子(Ca^{2 +})浓度的变化和pH值的改变。细胞凋亡对多细胞生物个体的发育、正常细胞更新、组织保持正常结构与功能有着积极而重要的意义。而细胞凋亡的异常可导致疾病的发生，迄今已证实细胞凋亡与肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病、神经系统疾病、动脉粥样硬化及艾滋病等的发生、发展密切相关。因此，细胞凋亡的检测对于疾病的早期诊断非常重要。

前人已对细胞凋亡检测进行了大量的研究，早期是基于传统的体外研究方法，但是其对活体的器官和组织均具有一定的创伤性，并且只能对某一特定时间点进行体外检查，不能连续、实时地检测细胞凋亡在体内变化的全过程。近年来引入了分子影像学技术检测细胞凋亡，由于细胞凋亡程序通过内源或外源性途径启动之后，凋亡细胞自身会产生、暴露或结合多种可识别的、特异性的靶标，利用核素标记的配体与凋亡细胞中的特异性靶标可结合的特性即可进行细胞凋亡分子显像，进而可以无创、精确、定位、实时地对细胞凋亡过程进行体内检测。而凋亡显像剂的开发与应用是放射性核素显像的重要研究内容，其对疾病的早期诊断、检测进展、治疗后的早期评估疗效、新治疗方案的开发和个性化的诊疗方案均有重大的意义。

目前主要有3类用于检测细胞凋亡的显像剂：靶向磷酯酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)的显像剂、靶向膜改变印迹的显像剂和靶向半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase-3)的显像剂。前两类细胞凋亡显像剂多存在标记步骤复杂、放射化学产率低、肿瘤处摄取率低和特异性差等缺陷。由于Caspase-3可以特异性识别氨基酸序列DEVD(DEVD是指能够选择性地被半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-7特异性切割的天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(Asp-Glu-Val-Asp)肽序列)，且Caspase-3酶自身不被消耗，因此基于氨基酸序列DEVD设计的细胞凋亡显像剂成为近年来的研究热点。如在2013年，Helen Su等人(Evaluation of[¹⁸F]-CP18as a PET Imaging Tracer for Apoptosis[J].MolecularImaging and Biology，2013，15(6):739-747.)通过亲核取代反应标记[¹⁸F]氟离子，再通过点击化学反应得到凋亡探针[¹⁸F]-CP18(如图1)，总的合成时间为92min，比活度为175GBq/μmol，并通过细胞摄取实验和小动物PET实验证明了探针的特异性；ChunFang Xia等人(InVitro and In Vivo Evaluation of the Caspase-3 Substrate-Based Radiotracer[¹⁸F]-CP18 for PET Imaging of Apoptosis in Tumors[J].Molecular Imaging andBiology，2013，15(6):748-757.)在前人工作的基础上进行小动物PET实验，对比不同肿瘤对[¹⁸F]-CP18摄取的影响，说明Caspase-3与凋亡水平呈正相关。然而上述凋亡探针[¹⁸F]-CP18的标记时间长达92min，标记时间过长，标记效率低，在细胞中保留时间短，靶本比低、显像灵敏度差，难以满足当前对肿瘤疗效早期评价高精准的临床要求。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提供一种标记效率高、稳定性高的DEVD的¹⁸F标记物及其制备方法和用途。

为此,本发明提供一种DEVD的¹⁸F标记物，具有式(1)所示的结构：

本发明提供了一种制备所述的DEVD的¹⁸F标记物的方法，包括如下步骤：

(1)将式(A)所示的化合物和式(B)所示的多肽DEVD混合，加入干燥的四氢呋喃溶解，然后加入O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N-二异丙基乙胺，在氮气保护下于室温反应1-3h后，旋干溶剂，纯化，得到式(C)所示的化合物；

(2)将式(C)所示的化合物加入极性溶剂中溶解，然后加入三氟乙酸与三异丙基硅烷，室温下反应0.5-1.5h，反应停止后，将得到的反应液进行减压蒸馏，沉淀，离心，干燥，得到式(D)所示的化合物；

(3)取式(D)所示的化合物和三氟硼酸盐溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液中，然后取抗坏血酸钠和CuSO₄·5H₂O分别加水溶解后快速加入上述溶液中，在氮气保护下于40-50℃反应15-45min，纯化，得到式(1-Cold)所示的化合物；

(4)向式(1-Cold)所示的化合物中加入50-500mCi的¹⁸F^-溶液，在pH为2.5的缓冲液中，于80-100℃下反应10-40min，将所得反应液进行纯化、洗涤，即得式(1)所示的化合物；合成路线图如下：

所述的方法，所述步骤(1)中，式(A)所示的化合物、式(B)所示的多肽DEVD、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N-二异丙基乙胺加入的摩尔比为1：(1-1.2)：(1-1.2)：(2.2-2.7)。

所述的方法，所述步骤(2)中，取式(C)所示的化合物300重量份，对应加入2-4体积份的三氟乙酸和0.05-0.15体积份的三异丙基硅烷；所述重量份与体积份的关系为mg/mL。

所述的方法，所述步骤(3)中，式(D)所示的化合物、三氟硼酸盐、抗坏血酸钠和CuSO₄·5H₂O加入的摩尔比为1:(1.4-1.6)：(1.9-2.1)：(1.9-2.1)。

所述的方法，所述步骤(2)中，所述极性溶剂选自CH₂Cl₂、CHCl₃、THF或CH₃CN。

本发明提供了所述的DEVD的¹⁸F标记物在细胞凋亡检测中的用途。

本发明提供了所述的DEVD的¹⁸F标记物在制备PET显像剂中的用途。

本发明提供了一种可激活的肿瘤凋亡PET显像剂，包括所述的DEVD的¹⁸F标记物。

优选的，所述的PET显像剂中，还包括式(1-Cold)所示的化合物。

优选的，所述的PET显像剂中，所述的DEVD的¹⁸F标记物为0.3-2mCi/mL，所述的冷化合物式(1-Cold)所示的化合物为2-6μmol/mL。

本发明提供了一种诊断试剂盒，包括所述的DEVD的¹⁸F标记物或所述的可激活的肿瘤凋亡PET显像剂。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明提供的一种DEVD的¹⁸F标记物，具有式(1)所示的结构。在制备所述标记物过程中，标记时间仅需要30min，标记时间短，标记效率高，制备方法简单，且该标记物稳定性高，在稳定性实验中，证明了该标记物在PBS和血清中稳定性高，说明该标记物在细胞中能够长时间保留，靶本比高、显像灵敏度强，显像效果优，在细胞摄取实验中，该标记物在凋亡细胞中的摄取是正常细胞的2倍，在小动物PET成像中，该标记物在正常组中的肿瘤摄取较低，而在凋亡组肿瘤摄取值较大，肌肉摄取较低且可被快速清除，以上证明了本发明制备的DEVD的¹⁸F标记物对于凋亡的肿瘤细胞具有特异的靶向性。由上述可见，本发明制备的DEVD的¹⁸F标记物可以作为肿瘤凋亡显像剂，具有标记效率高、稳定性高和对于凋亡的肿瘤细胞具有特异的靶向性等优势，确保精确、实时地对细胞凋亡过程进行体内检测，进而可以用于因细胞凋亡异常导致的相关疾病的早期诊断、检测进展、治疗后的早期评估疗效或新治疗方案的开发和个性化的诊疗方案等。

2.本发明提供的一种DEVD的¹⁸F标记物制备方法，其标记过程仅需要30min，标记时间短，制备步骤简单，显著提高了标记效率；所获得的DEVD的¹⁸F标记物比活度为1.2Ci/μmol，放化纯大于98％，标记产物的放射化学产率能够达到54％，放射化学产率高，更加有利于放射性标记化合物的商业应用于临床推广。

3.本发明提供的一种可激活的肿瘤凋亡PET显像剂，包括所述的DEVD的¹⁸F标记物，进一步的，所述显像剂为还包括式(1-Cold)所示的化合物。在所述显像剂中，所述的DEVD的¹⁸F标记物为0.3-2mCi/mL，所述的冷化合物式(1-Cold)所示的化合物为2-6μmol/mL，该显像剂对于凋亡的肿瘤细胞具有更高的特异靶向性，在小动物PET成像中，相比于仅经过所述的DEVD的¹⁸F标记物处理的凋亡组，该混合物处理的凋亡组中肿瘤摄取值更高，在肌肉中摄取更低，可被快速清除，靶本比高、显像灵敏度高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明背景技术中所述的凋亡探针[¹⁸F]-CP18的分子结构式；

图2是本发明实施例1中的DEVD的¹⁸F标记物的分子结构式；

图3是本发明实施例1中式(C)所示的化合物的高效液相图谱；

图4是本发明实施例1中式(C)所示的化合物的质谱分析图谱；

图5是本发明实施例1中式(C)所示的化合物的¹H-NMR图谱；

图6是本发明实施例1中式(C)所示的化合物的¹³C-NMR图谱；

图7是本发明实施例1中式(D)所示的化合物的质谱分析图谱；

图8是本发明实施例1中式(1-Cold)所示的化合物的高效液相图谱；

图9是本发明实施例1中式(1-Cold)所示的化合物的质谱分析图谱；

图10是本发明实施例1中式(1-Cold)所示的化合物的¹H-NMR图谱；

图11是本发明实施例1中式(1-Cold)所示的化合物的¹³C-NMR图谱；

图12是本发明实施例1中式(1-Cold)所示的化合物的¹⁹F-NMR图谱；

图13是本发明实施例1中式(1)所示的化合物的放射性高效液相图谱；

图14是本发明实施例1中式(1)所示的化合物纯化后放射性高效液相图谱；

图15是本发明实验例1中不同浓度标记前体式(1-Cold)所示的化合物下Hela细胞的细胞生存率柱状图；

图16是本发明实验例1中标记前体式(1-Cold)所示的化合物在哒嗪-盐酸缓冲液中不同温度下的高效液相图谱；

图17是本发明实验例2中标记前体式(1-Cold)所示的化合物的液质联用质谱图谱；

图18是本发明实验例2中标记前体式(1-Cold)所示的化合物的分子间点击化学反应路线图；

图19是本发明实验例3中标记产物式(1)所示的化合物在PBS中孵育4h后radio-HPLC分析图谱；

图20是本发明实验例3中标记产物式(1)所示的化合物在血清中孵育4h后radio-HPLC分析图谱；

图21是本发明实验例3中标记产物式(1)所示的化合物在PBS或血清中孵育不同时间的放射性化学纯度图；

图22是本发明实验例5中标记产物式(1)所示的化合物在凋亡Hela细胞与正常Hela细胞中的摄取值柱状图；

图23是本发明实验例6中标记产物式(1)所示的化合物在正常肿瘤小鼠(正常组)和用阿霉素诱导肿瘤凋亡小鼠(凋亡组)中的PET成像结果图；

图24是本发明实验例6中标记产物式(1)所示的化合物在肿瘤与肌肉中摄取值变化图；

图25是本发明实验例6中标记产物式(1)所示的化合物不同时间点在正常组和凋亡组中的肿瘤/肌肉比值柱状图。

具体实施方式

下述实施例中涉及到的试剂如下：

DMSO、N,N-二异丙基乙胺、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯、三氟乙酸、TIPS、N,N-二甲基甲酰胺、CuSO₄·5H₂O、四氢呋喃、二氯甲烷、甲醇、三氟乙酸。所有试剂均为分析纯，使用前未经纯化，购置于阿拉丁试剂公司。

三氟硼酸盐购自阿拉丁试剂公司；抗坏血酸钠购自阿拉丁试剂公司；Hela细胞购自上海中科院细胞库；DMEM培养基购自碧云天；MTT购自碧云天；Caspase-3酶购自R&DSystems(美国明尼苏达州)；胰酶消化液购自碧云天；BALB/c裸鼠购自南京大学-南京生物医药研究院；阿霉素购自Sigma Aldrich；

式(A)所示的化合物为按照文献(Jianguo Lin,Wei Wang,Ke Li,Hongbo Huang,Gaochao Lv,Shineng Luo and Ling Qiu.Development of a kit-likeradiofluorinated biomolecule leading to a controlled self-assembly of 18Fnanoparticles for a smart PET imaging application.ChemicalCommunication.2017,53(48),6476-6479.)中方法合成。

式(B)所示的DEVD为按照文献(Quinn P.Peterson,David R.Goode,DianaC.West,Rachel C.Botham,Paul J.Hergenrother.Preparation of the caspase-3/7substrate Ac-DEVD-pNA by solution-phase peptide synthesis,Nature Protocols,2010,5(2),294-302.)中的方法合成。

下述实施例中涉及到的仪器如下：

核磁共振仪(Bruker DRX-500)、高效液相色谱仪(Waters 2445)、γ计数仪(Perkin-Elmer 1470)、元素分析仪(Perkin-Elmer 240C)、酶联免疫检测(美国Bio-Rad)、高速离心机(美国贝克曼库尔特J2-HS)。

实施例1

本实施例所述的DEVD的¹⁸F标记物，具有如下式(1)所示的结构：

所述的DEVD的¹⁸F标记物的合成路线为：

所述的DEVD的¹⁸F标记物的合成步骤包括：

(1)将式(A)所示的化合物150mg(0.325mmol)和式(B)所示的多肽DEVD 246mg(0.380mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，加入干燥的四氢呋喃(THF)3mL溶解，再加入O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)142mg(0.375mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)142μL(0.815mmol)，氮气保护下于室温反应2h后，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.6，判定反应结束后旋干溶剂，将所得粗产品通过硅胶柱层析分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×19mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→35min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；35min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→0:100；40min→45min，流动相A：流动相B的体积比由0:100→0:100；45min→50min，流动相A：流动相B的体积比由0:100→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃，检测波长为254nm。通过质谱验证，35.9min处的峰为产物峰，其高效液相色谱图如图3所示。收集35.9min处的流出液，干燥，得到式(C)所示的化合物，为白色固体(338mg，92％)。将所得式(C)所示的化合物进行元素分析，通过元素分析仪测定式(C)所示的化合物(C₅₂H₇₅N₉O₁₃S₃)中C，H，N等元素的含量，结果表明测定结果与理论值相一致，见下表1。

表1式(C)所示的化合物的元素分析

将所得式(C)所示的化合物进行电喷雾质谱分析，质谱结果如图4所示。实际测得，m/z＝1130.28的信号峰对应式(C)所示的化合物的分子离子峰[M+H]+，m/z＝1152.22的信号峰对应式(C)所示的化合物的分子离子峰[M+Na]+，均与目标式(C)所示的化合物(ExactMass:1129.46)的分子量相符。

将所得式(C)所示的化合物进行核磁共振氢谱分析：以d₆-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振氢谱对式(C)所示的化合物的结构进行表征，其¹H-NMR结果如图5所示。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO),δ(ppm):10.52(s,1H),8.78(s,1H),8.63(m,2H),8.38(m,1H),8.22(m,1H),7.95(m,1H),7.86(d,J＝8.00Hz,1H),7.79(d,J＝8.00Hz,1H),4.64(m,4H),4.32(m,1H),4.19(m,1H),3.12(m,1H),2.93(m,4H),2.87(s,1H),2.74(m,2H),2.65(m,2H),2.45(m,2H),2.20(m,2H),1.85(s,3H),1.38(s,18H),1.30(s,18H),0.82(m,6H)。其中，δ3.42ppm对应氘代试剂d₆-DMSO中水的信号峰；δ2.50ppm对应氘代试剂d₆-DMSO上氢的信号峰；δ10.52ppm对应2-氰基-6-氨基苯并噻唑(2-cyanobenzothiazole,CBT)旁羰基上氢的信号峰；δ8.78,7.86,7.79ppm对应苯环上3组氢的信号峰；δ2.87ppm对应炔基上氢的信号峰。

将所得式(C)所示的化合物进行核磁共振碳谱分析：以d₆-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振碳谱对式(C)所示的化合物的结构进行表征，其¹³C-NMR结果如图6所示。¹³C-NMR(101MHz,d₆-DMSO),δ(ppm):δ172.2,171.2,171.2,171.0,171.0,170.0,169.8,169.7,169.5,169.5,148.3,139.5,137.1,135.7,125.2,121.5,114.0,112.1,80.7,80.6,80.3,80.0,73.7,57.8,53.1,52.3,50.0,48.2,42.7,41.8,37.7,37.7,31.7,31.2,30.0,28.2,28.1,27.8,22.9,22.0,19.7,18.4。所有碳均找到对应的归属，其中，δ40.0ppm对应氘代试剂d₆-DMSO上碳的信号峰；δ172.2,171.2,171.2,171.0,171.0,170.0,169.8,169.7,169.5,169.5ppm对应羰基上碳的信号峰；δ148.3,139.5,137.1,135.7,125.2,121.5,112.1ppm对应苯并噻唑环上7组碳的信号峰；δ73.7ppm对应炔基上碳的信号峰。

综上所述，通过元素分析确定化合物中C、H、N等元素的含量为C:H:N＝52:75:9，电喷雾质谱结果与目标化合物分子量一致；氢谱、碳谱证实氢元素和碳元素的个数与位置均能与目标化合物相吻合，所有表征结果均表明所得化合物即为目标化合物式(C)所示的化合物。

(2)将式(C)所示的化合物300mg(0.265mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH₂Cl₂溶解，再加入3mL的TFA与0.1mL的三异丙基硅烷(TIPS)，室温下反应1h，反应停止后，减压蒸馏，加入无水乙醚沉淀，离心，得到的固体放入真空干燥箱中，25℃下干燥6h，得到式(D)所示的化合物，为白色固体(282mg，产率：94％)。将所得式(D)所示的化合物进行电喷雾质谱分析，式(D)所示的化合物的质谱结果如图7所示。实际测得，m/z＝962.15的信号峰对应式(D)所示的化合物的分子离子峰[M+H]⁺，m/z＝984.24的信号峰对应式(D)所示的化合物的分子离子峰[M+Na]⁺，均与目标式(D)所示的化合物(Exact Mass:961.28)的分子量相符。

(3)将式(D)所示的化合物115mg(0.120mmol)，三氟硼酸盐(AmBF₃)36mg(0.184mmol)，溶于3mL的DMF：H₂O体积比为2：1的溶液中；将抗坏血酸钠48mg(0.242mmol)和CuSO₄·5H₂O 60mg(0.242mmol)分别加少量水溶解后快速加入上述混合溶液中，在氮气保护下于45℃反应30min，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.4，判定反应结束，停止反应，通过半制备型HPLC分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×19mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃，检测波长为254nm。通过质谱验证，17.9min处的峰为产物峰，其高效液相色谱图如图8所示，收集17.9min处的流出液，干燥，得到式(1-cold)所示的化合物，为白色固体(100mg，产率：72％)；将所得式(1-cold)所示的化合物进行元素分析，通过元素分析仪测定式(1-cold)所示的化合物(C₄₅H₆₃BF₃N₁₃O₁₃S₃)中C，H，N等元素的含量，结果表明测定结果与理论值相一致，见下表2。

表2式(1-cold)所示的化合物的元素分析

将所得式(1-cold)所示的化合物进行液质联用质谱分析：式(1-cold)所示的化合物的质谱结果如图9所示。实际测得，m/z＝1156.32的信号峰对应式(1-cold)所示的化合物的分子离子峰[M-H]^-，m/z＝577.86的信号峰对应式(1-cold)所示的化合物的分子离子峰[M-2H]^2-/2，与式(1-cold)所示的化合物(Exact Mass:1157.39)的分子量基本一致。

将所得式(1-cold)所示的化合物进行核磁共振氢谱分析：以d₆-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振氢谱对式(1-cold)所示的化合物的结构进行表征，其¹H-NMR结果如图10所示。¹H-NMR(400MHz,d₆-DMSO),δ(ppm):10.39(s,1H),8.75(s,1H),8.43(d,J＝4.00Hz,1H),8.31(s,1H),8.18(m,3H),7.98(d,J＝8.00Hz,1H),7.92(s,1H),7.81(d,J＝8.00Hz,1H),7.70(d,J＝8.00Hz 1H),4.83～4.29(m,6H),4.14(t,J＝4.00Hz,2H),3.24(t,J＝4.00Hz,1H),3.10(m,J＝4.00Hz,4H),2.97(d,J＝8.00Hz,6H),2.70(m,J＝4.00Hz,4H),2.38(m,J＝4.00Hz,2H),2.22(m,J＝4.00Hz,2H),1.98(m,J＝4.00Hz,2H),1.84(s,3H),1.27(s,9H),0.81(t,J＝4.00Hz,6H)。其中，δ3.80ppm对应氘代试剂d₆-DMSO中水的信号峰，其中有2个氢的信号峰处于水峰的位置而被掩盖；δ2.50ppm对应氘代试剂d₆-DMSO上氢的信号峰；δ8.43～7.98ppm对应酰胺上氢的信号峰；δ4.83～4.29ppm对应叔丁基上氢的信号峰；δ7.92ppm对应三氮唑上氢的信号峰，表明点击化学反应成功。

将所得式(1-cold)所示的化合物进行核磁共振碳谱分析：以d₆-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振碳谱对式(1-cold)所示的化合物的结构进行表征，其¹³C-NMR结果如图11所示。13C-NMR(101MHz,d₆-DMSO):δ(ppm):δ174.5,172.2,172.2,171.6,171.6,171.5,171.4,170.3,170.1,170.0,148.3,143.4,139.5,137.1,135.7,125.2,124.4,121.5,114.0,112.2,64.0,58.1,54.3,53.5,53.4,53.2,52.6,50.1,48.2,46.2,44.1,42.1,36.4,36.2,31.0,30.5,30.0,28.2,27.5,23.0,19.7,18.4。其中，δ40.0ppm对应氘代试剂d₆-DMSO上碳的信号峰；δ174.5,172.2,172.2,171.6,171.6,171.5,171.4,170.3,170.1,170.0ppm对应羰基上碳的信号峰；δ148.3,143.4,139.5,137.1,135.7,121.5,112.2ppm对应苯并噻唑环上7组碳的信号峰；δ124.4,114.0ppm对应三氮唑上2组碳的信号峰，而炔基处的信号峰消失，表明点击化学反应成功。

将所得式(1-cold)所示的化合物进行核磁共振氟谱分析：以d₆-DMSO为氘代试剂，通过核磁共振氟谱对式(1-cold)所示的化合物的结构进行表征，其¹⁹F-NMR结果如图12所示。¹⁹F-NMR(386MHz,d₆-DMSO),δ(ppm):-135.8。其中，δ73.4ppm为半制备HPLC纯化过程中引入的三氟乙酸中氟的信号峰；δ-135.8ppm对应式(1-cold)所示的化合物上氟的信号峰。

综上所述，通过元素分析确定化合物中C、H、N等元素的含量为C:H:N＝45:63:13；电喷雾质谱结果与目标化合物分子量一致；氢谱、碳谱证实氢元素和碳元素的个数与位置均能与目标化合物相吻合，证明点击化学反应成功；氟谱表明化合物中含有三氟硼酸盐结构，所有表征结果均表明所得化合物即为目标化合物式(1-cold)所示的化合物。

(4)用300μL的哒嗪-盐酸-N,N-二甲基甲酰胺(pH＝2.5)缓冲液洗脱QMA柱，收集得到300mCi的¹⁸F^-溶液，然后转移到1mL的标记反应管中，将式(1-cold)所示的化合物溶于DMF中配制成浓度为25mmol/L的溶液，取所述溶液10-20μL加至所述标记反应管中，80℃下反应30min，反应结束后，取微量所得反应液稀释，通过放射性HPLC检测标记率，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。检测结果如图13所示，所述标记产物的保留时间与标记前体在紫外吸收下的保留时间(t_R＝17.9min)一致，证明标记反应成功。经衰变校正后，标记产物的放射化学产率为54％，比活度为1.2Ci/μmol。

向所得反应液中加入20mL去离子水稀释，通过C18柱(C18Sep-Pak小柱)吸附标记产物，用去离子水10mL洗涤C18柱三次，最后用0.5mL无水乙醇将标记产物淋洗到西林瓶中，以备使用。取少量上述所得溶液进行稀释，通过放射性HPLC检测放化纯，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。标记产物纯化后检测结果如图14所示，标记产物的保留时间为18.0min，放化纯大于98％。

实施例2

本实施例所述的分子探针DEVD的18F标记物的合成步骤包括：

(1)将式(A)所示的化合物150mg(0.325mmol)和式(B)所示的多肽DEVD 243.75mg(0.325mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，加入干燥的四氢呋喃(THF)3mL溶解，再加入O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)147.68mg(0.39mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)124.5μL(0.715mmol)，氮气保护下于室温反应1h后，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.6，判定反应结束后旋干溶剂，将所得粗产品通过硅胶柱层析分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×4.6mm,Phenomenex)；以水(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→35min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；35min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→0:100；40min→45min，流动相A：流动相B的体积比由0:100→0:100；45min→50min，流动相A：流动相B的体积比由0:100→80:20；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃；检测波长为254nm。通过质谱验证，35.9min处的峰为产物峰，收集35.9min处的流出液，干燥，得到式(C)所示的化合物，为白色固体(338mg，92％)。

(2)将式(C)所示的化合物300mg(0.265mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH₂Cl₂溶解，再加入2mL的三氟乙酸(TFA)与0.15mL的三异丙基硅烷(TIPS)，室温下反应1.5h，反应停止后，减压蒸馏，加入无水乙醚沉淀，离心，得到的固体放入真空干燥箱中，25℃下干燥6h，得到式(D)所示的化合物。

(3)将式(D)所示的化合物115mg(0.120mmol)，三氟硼酸盐(AmBF₃)32.86mg(0.168mmol)，溶于3mL的DMF：H₂O体积比为2：1的溶液中，将抗坏血酸钠50mg(0.252mmol)和CuSO₄·5H₂O 56.5mg(0.228mmol)分别加少量水溶解后快速加入上述混合溶液中，氮气保护下于40℃反应45min，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.4，判定反应结束，停止反应，通过半制备型HPLC分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×4.6mm,Phenomenex)；以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃；检测波长为254nm。收集17.9min处的流出液，干燥，得到式(1-Cold)所示的化合物，为白色固体。

(4)用300μL的哒嗪-盐酸(pH＝2.5)缓冲液洗脱QMA柱，收集得到50mCi的¹⁸F^-溶液，转移到1mL的标记反应管中，将式(1-Cold)所示的化合物溶于DMF中配制成式(1-Cold)所示的化合物浓度为25mmol/L的溶液，取所述溶液10-20μL加至所述标记反应管中，100℃下反应40min，反应结束后，取微量所得反应液稀释，通过放射性HPLC检测标记率，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃。所述标记产物的保留时间与标记前体在紫外吸收下的保留时间(t_R＝17.9min)一致，证明标记反应成功。经衰变校正后，标记产物的放射化学产率为53％，比活度为1.2Ci/μmol。

向所得反应液中加入20mL去离子水稀释，通过C18柱(C18spe小柱)吸附标记产物，用去离子水10mL洗涤C18柱三次，最后用0.5mL无水乙醇将标记产物淋洗到西林瓶中，以备使用。取少量上述所得溶液进行稀释，通过放射性HPLC检测放化纯，放射性HPLC检测条件为：所用色谱柱放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃，控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃。标记产物的保留时间为18.0min，放化纯大于98％。

实施例3

本实施例所述的DEVD的¹⁸F标记物的合成步骤包括：

(1)将式(A)所示的化合物150mg(0.325mmol)和式(B)所示的多肽DEVD 252.5mg(0.390mmol)加入到25mL圆底烧瓶中，加入干燥的四氢呋喃(THF)3mL溶解，再加入O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)123mg(0.325mmol)和N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)152.9μL(0.8775mmol)，氮气保护下于室温反应3h后，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝20:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.5，判定反应结束，然后旋干溶剂，将所得粗产品通过硅胶柱层析分离纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×4.6mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度0.1％TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→35min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；35min→40min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→0:100；40min→45min，流动相A：流动相B的体积比由0:100→0:100；45min→50min，流动相A：流动相B的体积比由0:100→80:20；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃；检测波长为254nm。通过质谱验证，35.9min处的峰为产物峰，收集35.9min处的流出液，干燥，得到式(C)所示的化合物，为白色固体(338mg，92％)。

(2)将式(C)所示的化合物300mg(0.265mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入3mL的CH₂Cl₂溶解，再加入4mL的TFA与0.05mL的TIPS(三异丙基硅烷)，室温下反应0.5h，反应停止后，减压蒸馏，加入无水乙醚沉淀，离心，得到的固体放入真空干燥箱中，25℃下干燥6h，得到式(D)所示的化合物。

(3)将式(D)所示的化合物115mg(0.120mmol)，三氟硼酸盐(AmBF₃)37.6mg(0.192mmol)，溶于3mL的DMF：H₂O体积比为2：1的溶液中，将抗坏血酸钠45.2mg(0.228mmol)和CuSO₄·5H₂O 62.48mg(0.254mmol)分别加少量水溶解后快速加入上述混合溶液中，氮气保护下于45℃反应15min，将上述反应液进行TLC检测，以二氯甲烷：甲醇＝10:1(v/v)展开，254nm紫外检测，Rf＝0.4，判定反应结束，停止反应，通过半制备型HPLC分离纯化，照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm，250×4.6mm，Phenomenex)；以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃；检测波长为254nm。收集17.9min处的流出液，干燥，得到式(1-Cold)所示的化合物，为白色固体。

(4)用300μL的哒嗪-盐酸-N,N-二甲基甲酰胺(pH＝2.5)缓冲液洗脱QMA柱，收集得到500mCi的¹⁸F^-溶液，转移到1mL的标记反应管中，将式(1-Cold)所示的化合物溶于DMF中配制成式(1-Cold)所示的化合物浓度为25mmol/L的溶液，取所述溶液10-20μL加至所述标记反应管中，80℃下反应10min，反应结束后，取微量所得反应液稀释，通过放射性HPLC检测标记率，放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃。所述标记产物的保留时间与标记前体在紫外吸收下的保留时间(t_R＝17.9min)一致，证明标记反应成功。经衰变校正后，标记产物的放射化学产率为51％，比活度为1.2Ci/μmol。

向所得反应液中加入20mL去离子水稀释，通过C18柱(C18spe小柱)吸附标记产物，用去离子水10mL洗涤C18柱三次，最后用0.5mL无水乙醇将标记产物淋洗到西林瓶中，以备使用。取少量上述所得溶液进行稀释，通过放射性HPLC检测放化纯，放射性HPLC检测条件为：放射性HPLC检测条件为：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃；控制流动相的流速为1mL/min；控制柱温25℃。标记产物的保留时间为18.0min，放化纯大于98％。

实施例4

本实施例提供了一种可激活的肿瘤凋亡PET显像剂，所述显像剂包括实施例1制备的式(1)所示的化合物和式(1-cold)所示的化合物，所述的DEVD的¹⁸F标记物为1mCi/mL，所述的冷化合物式(1-Cold)所示的化合物为4μmol/mL，即得。

实施例5

本实施例提供了一种可激活的肿瘤凋亡PET显像剂，所述显像剂包括实施例1制备的式(1)所示的化合物和式(1-cold)所示的化合物，所述的DEVD的¹⁸F标记物为0.3mCi/mL，所述的冷化合物式(1-Cold)所示的化合物为2μmol/mL，即得。

实施例6

本实施例提供了一种可激活的肿瘤凋亡PET显像剂，所述显像剂包括实施例1制备的式(1)所示的化合物和式(1-cold)所示的化合物，所述的DEVD的¹⁸F标记物为2mCi/mL，所述的冷化合物式(1-Cold)所示的化合物为6μmol/mL，即得。

实验例

实验例1标记前体式(1-Cold)所示的化合物的毒性和稳定性

1.细胞毒性实验

通过MTT实验测定标记前体式(1-Cold)所示的化合物在Hela细胞中的细胞毒性，包括如下步骤：

(1)以每孔5×10³个细胞/100μL的密度将Hela细胞接种于96孔板中，培养基为DMEM，在37℃下含5％的CO₂的恒温培养箱中培养过夜；

(2)将实施例1制备的标记前体式(1-Cold)所示的化合物用二甲基亚砜(DMSO)溶解，配制成浓度为0.1mol/L的母液，用DMEM培养基稀释成含式(1-Cold)所示的化合物的浓度分别为100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L和6.25μmol/L的溶液，备用；另取DMEM培养基加入等体积的去离子水稀释，其中含式(1-Cold)所示的化合物的浓度为0μmol/L；

(3)将步骤(1)中的96孔板中原有培养基更换为上述步骤(2)中配制的药浓度分别为0μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的DMEM培养基，每孔200μL，每个药物浓度设置6个复孔。随后将96孔板放入37℃下含5％的CO₂恒温培养箱中分别孵育3h、6h、12h和24h。孵育结束后，向每孔中加入20μL的MTT(5mg/mL)继续培养4h。培养结束后，吸去培养基，向每孔中加入150μL的DMSO，并在摇床上震荡10min，直至结晶完全溶解。用酶标记测定490nm下每孔的吸光度值，实验结果为至少三次独立实验的平均值。

不同药物浓度与孵育时间下，式(1-Cold)所示的化合物对Hela细胞生存率柱状图如图15所示。随着药物作用时间延长与化合物浓度的增大，细胞生存率变化并不明显，且在24h内，细胞生存率均大于90％，所以可以判定标记前体式(1-Cold)所示的化合物对Hela细胞是安全低毒的，具有良好的生物兼容性。由于标记产物式(1)所示的化合物与标记前体式(1-Cold)所示的化合物结构相同，则预示着标记产物式(1)所示的化合物可以安全地用于进一步的细胞摄取实验。

2.式(1-Cold)所示的化合物在哒嗪-盐酸缓冲液中的稳定性实验

由于放射性化学产物的合成是将¹⁸F离子与标记前体式(1-Cold)所示的化合物是在哒嗪-盐酸缓冲液中加热制备而成的，标记前体在哒嗪盐酸缓冲液中能否稳定存在是标记能否进行的前提。因此，本实验检测式(1-Cold)所示的化合物在哒嗪-盐酸缓冲液中的稳定性的步骤，具体如下：

取实施例1制备的式(1-Cold)所示的化合物10μg溶于10μL甲醇中，然后加入100μL哒嗪-盐酸缓冲液，在不同温度下分别孵育30min。然后将式(1-Cold)所示的化合物与哒嗪-盐酸缓冲液的混合溶液用分析型HPLC在320nm吸收波长下检测纯度。HPLC条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱(5μm,250×4.6mm,Phenomenex)；以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃；检测波长为320nm。

检测结果如图16所示，由图中可以看出，哒嗪-盐酸缓冲液的保留时间是3.5min，而式(1-Cold)所示的化合物的保留时间为18min。在不同温度下与哒嗪盐酸缓冲液共同孵育30min后，HPLC检测显示没有新的杂质出现，式(1-Cold)所示的化合物纯度>99％。结果表明标记前体式(1-Cold)所示的化合物在50-100℃的范围内有良好的稳定性，标记条件可在一个较为宽广的温度范围内进行。

实验例2标记前体式(1-Cold)所示的化合物的分子识别、剪切与聚合反应

通过Caspase-3酶对标记前体式(1-Cold)所示的化合物的响应进行体外分子自组装实验。取一定量的实施例1制备的标记前体式(1-Cold)所示的化合物溶解在Caspase-3酶的缓冲液(200μL，pH＝7.4)中，得到浓度为200μmol/L的式(1-Cold)所示的化合物混合液。在37℃下反应20min后，加入Caspase-3酶使得混合液中Caspase-3酶的浓度为50nmol/L，继续在37℃下反应4h。反应结束后，将所得反应液于室温在4000g下离心5min，收集沉淀，再将沉淀物加水洗涤3次后冻干，并通过质谱、动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)等手段进行表征。液质联用质谱(LC-MS/MS)结果如图17所示，m/z＝1105.43的信号峰对应标记前体式(1-Cold)所示的化合物二聚体的分子离子峰[M+H]⁺，m/z＝1127.21的信号峰对应二聚体的分子离子峰[M+Na]⁺，与标记前体式(1-Cold)所示的化合物缩合成环后二聚体的理论分子量1104.80相一致。这是由于标记前体式(1-Cold)所示的化合物与Caspase-3和谷胱甘肽作用发生了化学反应，形成了二聚体。首先标记前体式(1-Cold)所示的化合物中的DEVD序列被Caspase-3特异性识别切断，使得氨基裸露，而二硫键被谷胱甘肽还原为巯基。在水环境中，β位的氨基巯基可以与腈基发生点击化学反应，但是由于标记前体式(1-Cold)所示的化合物切断产物的空间位阻效应，使得其在分子内不能发生点击化学反应，所以一分子标记前体式(1-Cold)所示的化合物切断还原产物中的氨基巯基与另一分子标记前体式(1-Cold)所示的化合物切断还原产物中的腈基发生点击化学反应，进行分子间成环，得到环状的二聚体产物，反应路线如图18所示。在PET显像中，放射性纳米粒子的形成有利于探针在肿瘤处的信号聚集、形成持久稳定的放射性信号，从而灵敏度增强、靶本比增大可有效提高显像效果，为肿瘤凋亡早期检测提供一种有效的方法。

实验例3标记产物式(1)所示的化合物的稳定性实验

取4份800μL的PBS(pH＝7.4)缓冲液和200μL的实施例1制备的标记产物式(1)所示的化合物溶液分别混合，在37℃下加热0.5h、1h、2h、3h、4h。取上述少量溶液稀释，通过放射性高效液相检测标记产物的稳定性，高效液相条件：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。再取4份800μL老鼠血清(购自碧云天)和200μL的实施例1制备的标记产物式(1)所示的化合物溶液分别混合，在37℃下加热0.5h、1h、2h、3h、4h，然后取100μL上述溶液，加入100μL乙腈，用高速离心机在10000g下离心5min，取上层清液，通过放射性高效液相检测标记产物的稳定性，高效液相条件：以水(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相A，以CH₃CN(含有体积浓度为0.1％的TFA)为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min→3min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→80:20；3min→25min，流动相A：流动相B的体积比由80:20→10:90；25min→30min，流动相A：流动相B的体积比由10:90→80:20，控制流动相的流速为1mL/min，控制柱温25℃。结果如图19-21所示，图19为标记产物式(1)所示的化合物在PBS中孵育4h后radio-HPLC分析图谱，图20为标记产物式(1)所示的化合物在血清中孵育4h后radio-HPLC分析图谱，图21为标记产物式(1)所示的化合物在PBS或血清中孵育不同时间的放射性化学纯度图。由上述附图中可知，随着孵育时间的增加，标记产物式(1)所示的化合物在PBS与血清中放射性化学纯度略有下降，在4h的时候，PBS与血清中的放化纯仍大于95％。这表明该标记产物式(1)所示的化合物在体外具有良好的稳定性，有利于进一步的体内实验研究。

实验例4标记产物式(1)所示的化合物的脂水分配系数测定

取PBS缓冲液与等体积的正辛醇混合后充分振荡，使两相相互饱和，在室温下静置一天以上，用分液漏斗将两相分离。取1mL正辛醇、0.95mLPBS缓冲液、0.05mL实施例1制备的标记产物式(1)所示的化合物溶液混合，用涡旋混合器振荡5min，充分混匀，按照4000g离心5min。在有机相和水相中分别平行取3个样(100μL)于放敏管中，用γ计数仪测定其放射性活度，每个样品测定3次。计算脂水分配系数的log P值。根据公式logP＝log(CPM水相/CPM有机相)计算得到Log P＝-1.169±0.028。说明该式(1)所示的化合物具有较好的亲水性，便于用生理盐水稀释后进行体内注射。预示着其在脂肪等其他软组织的摄取可能较低，组织靶向性可能较好，有利于动物体内PET显像。

实验例5标记产物式(1)所示的化合物的细胞摄取实验

将Hela细胞消化、计数，以4×10⁵/孔的细胞密度接种到6孔板中，培养基为DMEM。将6孔板放入37℃、5％CO₂培养箱中过夜培养，使细胞贴壁。24h后将这些孔分为两组，第1组将原有培养基吸去换为新鲜培养基继续孵育24h。第2组中换为含2μmol/L阿霉素的培养基继续孵育24h。而后将实施例1制备的标记产物式(1)所示的化合物以1μCi/孔的剂量加入到6孔板中，分别培养0.5h、1h、2h和4h。培养结束后，吸去培养基，将细胞用冷的PBS冲洗3次。在每孔中加入1mL的胰酶消化液，收集细胞裂解液，用γ计数仪测量放射性量。对每孔中的细胞进行蛋白浓度标准化后，计算标记产物式(1)所示的化合物在凋亡Hela细胞与正常Hela细胞中的摄取比值。结果如图22所示，在0.5h和4h时，式(1)所示的化合物在凋亡Hela细胞(图22中Dox)与正常Hela细胞(图22中Control)的摄取比值分别为1.20和2.08。随着孵育时间的增加，式(1)所示的化合物在凋亡Hela细胞与正常Hela细胞中的摄取比值逐渐变大，在4h时，式(1)所示的化合物在凋亡细胞中摄取是正常细胞的2倍。

实验例6标记产物式(1)所示的化合物的小动物PET成像

Hela模型鼠构建：将处于对数生长期的Hela细胞配成细胞悬液10⁷个/mL，备用；取18-20g、6-8周龄的雄性BALB/c裸鼠，用酒精棉将背部靠近右后肢处消毒，皮下注射上述细胞悬液50μL，约7天后肿瘤长出。实验方法：待肿瘤直径为8-10mm时，取所述肿瘤直径为8-10mm的Hela模型鼠3只，将其放入预麻装置中，用异氟烷麻醉，而后将其转移至PET扫描床上，将小鼠的四肢用医用胶布固定住，用异氟烷体积为2.0％的异氟烷-氧气的混合气体维持小鼠麻醉状态。通过尾静脉对其中两只小鼠注射0.1mL施例1制备的放射性药物式(1)所示的化合物，另一只通过尾静脉注射0.1mL的式(1)所示的化合物和冷化合物式(1-Cold)所示的化合物(即实施例4制备的显像剂)，然后进床，对荷瘤小鼠进行动态扫描，动态图像连续采集60min。显像结束后，分别对这3只Hela模型鼠肿瘤部位直接注射0.2mg阿霉素，诱导肿瘤细胞凋亡。4天后，对3只小鼠二次动态成像。成像数据经配套软件衰减校正，OSEM三维定量分析。通过对图像的感兴趣区(ROI)进行勾画，将摄取表述为％ID/g(每克组织放射性计数百分数)，并计算肿瘤肌肉比。

实验结果如下，式(1)所示的化合物在阿霉素处理前的正常肿瘤小鼠(正常组)中和用阿霉素诱导肿瘤凋亡的小鼠(凋亡组)中的PET成像结果如图23所示，图中圈出的区域即为肿瘤区域，从图中可以看出，正常组的肿瘤区域呈暗黑色，表明此处摄取较低，在仅经过式(1)所示的化合物处理的凋亡组的肿瘤处部分呈白色，表明此处有一定的摄取，在经过式(1)所示的化合物和式(1-Cold)所示的化合物混合后的显像剂处理的凋亡组，凋亡组的白色有所增加，表明摄取有一定的增强。通过对显像数据进行处理，随时间变化式(1)所示的化合物在肿瘤与肌肉中摄取值变化如图24所示，式(1)所示的化合物处理的凋亡组的肿瘤摄取值在8min左右达到最大，为4.2％ID/mL，并且在1h内，肿瘤摄取值均大于1.8％ID/mL，相应的肌肉中的摄取在初始阶段较高，并随时间迅速清除，式(1)所示的化合物和式(1-Cold)所示的化合物混合后的显像剂处理的凋亡组的肿瘤摄取值在10min左右达到最大，为6.3％ID/mL，并且在1h内，肿瘤摄取值均大于4％ID/mL，相应的肌肉中的摄取在初始阶段较高，并随时间迅速清除。图25为不同时间点式(1)所示的化合物在正常组和凋亡组中的肿瘤/肌肉比(T/M)，两组的肿瘤/肌肉比随时间增加，在60min达到最大，式(1)所示的化合物处理的凋亡组的肿瘤/肌肉比为11，式(1)所示的化合物和式(1-Cold)所示的化合物混合后的显像剂处理的凋亡组的肿瘤/肌肉比为15，而正常组的肿瘤/肌肉比仅为2.6，凋亡组的摄取值及肿瘤/肌肉比明显高于正常组。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种用于细胞凋亡检测的¹⁸F标记物，其特征在于，具有式(1)所示的结构：

2.一种制备权利要求1所述的DEVD的¹⁸F标记物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将式(A)所示的化合物和式(B)所示的多肽DEVD混合，加入干燥的四氢呋喃溶解，然后加入O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N-二异丙基乙胺，在氮气保护下于室温反应1-3h后，旋干溶剂，纯化，得到式(C)所示的化合物；

(2)将式(C)所示的化合物加入极性溶剂中溶解，然后加入三氟乙酸与三异丙基硅烷，室温下反应0.5-1.5h，反应停止后，将得到的反应液进行减压蒸馏，沉淀，离心，干燥，得到式(D)所示的化合物；

(3)取式(D)所示的化合物和AmBF₃溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液中，然后取抗坏血酸钠和CuSO₄·5H₂O分别加水溶解后快速加入上述溶液中，在氮气保护下于40-50℃反应15-45min，纯化，得到式(1-Cold)所示的化合物；

(4)向式(1-Cold)所示的化合物中加入50-500mCi的¹⁸F^-溶液，在pH为2.5的缓冲液中，于80-100℃下反应10-40min，将所得反应液进行纯化、洗涤，即得式(1)所示的化合物；

合成路线图如下：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，式(A)所示的化合物、式(B)所示的多肽DEVD、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N，N-二异丙基乙胺加入的摩尔比为1：(1-1.2)：(1-1.2)：(2.2-2.7)。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，取式(C)所示的化合物300重量份，对应加入2-4体积份的三氟乙酸和0.05-0.15体积份的三异丙基硅烷；所述重量份与体积份的关系为mg/mL。

5.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，式(D)所示的化合物、三氟硼酸盐、抗坏血酸钠和CuSO₄·5H₂O加入的摩尔比为1:(1.4-1.6)：(1.9-2.1)：(1.9-2.1)。

6.根据权利要求2-4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述极性溶剂选自CH₂Cl₂、CHCl₃、THF或CH₃CN。

7.权利要求1所述的用于细胞凋亡检测的¹⁸F标记物在制备细胞凋亡检测产品中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的用途为在制备细胞凋亡检测PET显像剂中的用途。

9.一种可激活的肿瘤凋亡PET显像剂，其特征在于，包括权利要求1所述的DEVD的¹⁸F标记物。

10.一种诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的DEVD的¹⁸F标记物或权利要求9所述的可激活的肿瘤凋亡PET显像剂。

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