CN113388004B - 一种肿瘤蛋白酶激活自组装分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种肿瘤蛋白酶激活自组装分子探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤蛋白酶激活自组装分子探针及其制备方法和应用，属于化学技术领域。本发明提供了一种环化骨架SF‑11，此环化骨架SF‑11通过使用苯环以及甘氨酸来延长自组装结构链，使得自组装结构能够发生分子内点击反应，同时具有一定的疏水性以及π‑π堆积能力；在环化骨架SF‑11的基础上修饰标记基团和靶向基团得到的分子探针缩合环化的速率远远快于分子间缩合，这更有利于其在进入肿瘤细胞后进行缩合环化，因此，环化骨架SF‑11及在环化骨架SF‑11的基础上修饰标记基团和靶向基团得到的分子探针在靶标物显像中，例如，肿瘤显像中具有极高的应用前景。

Description

一种肿瘤蛋白酶激活自组装分子探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种肿瘤蛋白酶激活自组装分子探针及其制备方法和应用，属于化学技术领域。
背景技术
肿瘤是指生物体内由多种因素导致的其细胞异常生长而引发的疾病，按其对生物体的特性及危害又分为恶性肿瘤和良性肿瘤。恶性肿瘤，又称为癌症，有转移性和浸润性。癌症严重威胁人类健康，在人口老龄化、紧张的生活节奏、不良生活习惯以及大气污染等因素的共同作用下，癌症的发病率越来越高，发病年龄越来越年轻化。如何实现癌症的早期精准诊断已经成为目前亟待解决的问题。
2-氰基苯并噻唑(CBT)和D-半胱氨酸(D-Cys)缩合的分子间点击反应是一种生物正交反应，广泛应用于生物医药领域新药的开发。早在2017年，Lin等人就利用CBT-Cys点击反应设计合成了谷胱甘肽响应的PET显像探针，通过二硫键保护半胱氨酸中的巯基，实现了探针在高谷胱甘肽表达的肿瘤细胞内被还原触发CBT-Cys点击反应形成二聚体，该二聚体具有较强的π-π堆积能力，在细胞内堆积，从而实现探针在靶组织内由小分子到纳米颗粒的转变，增强探针在靶组织中的信号累计，从而有效达到靶部位并实现肿瘤显像的目的。
但是，该PET显像探针为分子间点击反应，在较低的浓度下(PET显像探针用量低)，反应不易发生，这不利于探针的使用。因此，亟需找到反应易发生的基于CBT-Cys点击反应的PET显像探针以克服现有基于CBT-Cys点击反应的PET显像探针存在的缺陷。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种分子探针，所述分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000021
其中，R1为标记基团，R2为靶向基团。
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针为Legumain靶向的分子探针；所述Legumain靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000022
或者，所述Legumain靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000031
或者，所述Legumain靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000032
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针为GGT靶向的分子探针；所述GGT靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000033
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针为Caspase靶向的分子探针；所述Caspase靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000041
或者，所述Caspase靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000042
本发明还提供了一种环化骨架，所述环化骨架具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000043
本发明还提供了一种制备上述Legumain靶向的分子探针的方法，所述方法为：在上述环化骨架的基础上修饰标记基团和靶向基团。
在本发明的一种实施方式中，当分子探针为Legumain靶向的分子探针时，所述方法为：将上述环化骨架和ANN、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA后进行反应，得到化合物SF-AAN；在化合物SF-AAN中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-AAN-T；在化合物SF-AAN-T中加入DMF、去离子水、AMBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜后进行反应，得到Legumain靶向的分子探针的标记前体；对Legumain靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Legumain靶向的分子探针；
或者，所述方法为：将上述环化骨架和ANN-HEHEHE、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA后进行反应，得到化合物SF-AAN；在化合物SF-AAN中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-AAN-T；在化合物SF-AAN-T中加入DMF、去离子水、AMBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜后进行反应，得到Legumain靶向的分子探针的标记前体；对Legumain靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Legumain靶向的分子探针；
或者，所述方法为：将上述环化骨架和ANN-TAT、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA后进行反应，得到化合物SF-AAN；在化合物SF-AAN中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-AAN-T；在化合物SF-AAN-T中加入DMF、去离子水、AMBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜后进行反应，得到Legumain靶向的分子探针的标记前体；对Legumain靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Legumain靶向的分子探针。
在本发明的一种实施方式中，当分子探针为GGT靶向的分子探针时，所述方法为：将上述环化骨架和Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA后进行反应，得到化合物G-1；在化合物G-1中加入DCM、Tips、TFA后进行反应，得到化合物G-2；在化合物G-2中加入DMF、去离子水、AMBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜后进行反应，得到GGT靶向的分子探针的标记前体；对GGT靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到GGT靶向的分子探针。
在本发明的一种实施方式中，当分子探针为Caspase-3靶向的分子探针时，所述方法为：将权利要求5所述环化骨架和DEVD、HBTU和THF混合得到混合液；在混合液中加入DIPEA将混合液的PH调至8-9后进行反应得到化合物SF-DEVD；在化合物SF-DEVD中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-DEVD-T；在化合物SF-DEVD-T中加入DMF、去离子水、AmBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟膦酸铜后进行反应，得到Caspase-3靶向的分子探针的标记前体；对Caspase-3靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Caspase-3靶向的分子探针；
或者，所述方法为：将权利要求5所述环化骨架和DEVD-HEHEHE、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA将PH调至8-9后进行反应，得到化合物SF-DEVD-HE3；在化合物SF-DEVD-HE3中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-DEVD-HE3-T；在化合物SF-DEVD-HE3-T中加入DMF、去离子水、AmBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟膦酸铜后进行反应，得到Caspase-3靶向的分子探针的标记前体；对Caspase-3靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Caspase-3靶向的分子探针。
本发明还提供了一种制备上述环化骨架的方法，所述方法为：将化合物SF-10溶于甲醇中，得到混合液；在混合液中加入Tips(三异丙基硅烷)和SEt(2-(ethyldisulfanyl)pyridine)进行反应，得到上述环化骨架；
所述化合物SF-10具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000061
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-10的制备方法为：将二氯甲烷、三异丙基硅烷、三氟乙酸加入化合物SF-9中进行反应，得到化合物SF-10；
所述化合物SF-9具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000071
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-9的制备方法为：在化合物SF-8中加入超干四氢呋喃、超干DMF、N-Boc-S-Trityl-L-半胱氨酸、HBTU和DIPEA进行反应，得到化合物SF-9；
所述化合物SF-8具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000072
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-8的制备方法为：将二氯甲烷、三氟乙酸加入化合物SF-7中进行反应，得到化合物SF-8；
所述化合物SF-7具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000073
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-7的制备方法为：在化合物SF-6中加入Boc-甘氨酸、HBTU、超干四氢呋喃和DIPEA进行反应，得到化合物SF-7；
所述化合物SF-6具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000081
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-6的制备方法为：将二氯甲烷、三氟乙酸加入化合物SF-5中进行反应，得到化合物SF-6；
所述化合物SF-5具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000082
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-5的制备方法为：在化合物SF-4中加入超干四氢呋喃、4-[((叔丁氧基羰基氨基)甲基]苯甲酸、HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)和DIPEA进行反应，得到化合物SF-5；
所述化合物SF-4具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000083
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-4的制备方法为：将二氯甲烷、三氟乙酸加入化合物SF-3中进行反应，得到化合物SF-4；
所述化合物SF-3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000091
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-3的制备方法为：将化合物SF-2和4-[(叔丁氧基羰基氨基)苯甲酸]溶于超干四氢呋喃中，得到溶解液；在溶解液中加入HBTU和DIPEA进行反应，得到化合物SF-3；
所述化合物SF-2具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000092
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-2的制备方法为：将二氯甲烷和三氟乙酸加入化合物SF-1中进行反应，得到化合物SF-2；
所述化合物SF-1具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000093
在本发明的一种实施方式中，所述化合物SF-1的制备方法为：将氯甲酸异丁酯、N-甲基吗啉加入到N-Boc-炔丙基甘氨酸(384mg，1.8mmol，1.8eq)中，得到混合液；将混合液和超干四氢呋喃混合后进行反应，得到反应液A；将2-氰基6-氨基苯并噻唑的THF溶液加入到反应液A中进行反应，得到化合物SF-1。
本发明还提供了上述环化骨架在制备分子探针中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针为Legumain靶向的分子探针、GGT靶向的分子探针或Caspase靶向的分子探针。
本发明还提供了上述分子探针或环化骨架在靶标物显像中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为Legumain、GGT或Caspase。
本发明还提供了一种靶向靶标物的显像剂，所述显像剂含有上述分子探针或上述环化骨架。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为Legumain、GGT或Caspase。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种环化骨架SF-11，此环化骨架SF-11通过使用苯环以及甘氨酸来延长自组装结构链，使得自组装结构能够发生分子内点击反应，同时具有一定的疏水性以及π-π堆积能力；在环化骨架SF-11的基础上修饰标记基团和靶向基团得到的分子探针缩合环化的速率远远快于分子间缩合，这更有利于其在进入肿瘤细胞后进行缩合环化，因此，环化骨架SF-11及在环化骨架SF-11的基础上修饰标记基团和靶向基团得到的分子探针在靶标物显像中，例如，肿瘤显像中具有极高的应用前景。
附图说明
图1：化合物SF-11的合成路线。
图2：化合物SF-1的HPLC谱图。
图3：化合物SF-2的HPLC谱图。
图4：化合物SF-3的HPLC谱图。
图5：化合物SF-4的HPLC谱图。
图6：化合物SF-5的HPLC谱图。
图7：化合物SF-6的HPLC谱图。
图8：化合物SF-7的HPLC谱图。
图9：化合物SF-7的ESI-MS分析结果。
图10：化合物SF-8的HPLC谱图。
图11：化合物SF-8的ESI-MS分析结果。
图12：化合物SF-9的HPLC谱图。
图13：化合物SF-9的ESI-MS分析结果。
图14：化合物SF-10的HPLC谱图。
图15：化合物SF-10的ESI-MS分析结果。
图16：环化骨架SF-11的HPLC谱图。
图17：环化骨架SF-11的ESI-MS分析结果。
图18：环化骨架SF-11经过还原缩合形成环化产物SF-C1和SF-C2的示意图。
图19：环化骨架SF-11在pH＝7.4的还原条件下37℃孵育不同时间后的HPLC分析结果。
图20：环化骨架SF-11在pH＝7.4的还原条件下37℃孵育1min后的HPLC谱图。
图21：环化产物SF-C1的ESI-MS分析结果。
图22：环化产物SF-C2的ESI-MS分析结果。
图23：环化骨架SF-11在存在游离半胱氨酸的pH＝7.4的还原条件下的反应示意图。
图24：环化骨架SF-11在存在不同浓度游离半胱氨酸的环境中孵育30min后的HPLC分析结果。
图25：环化产物SF-Cys的ESI-MS分析结果。
图26：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3的合成路线。
图27：化合物SF-AAN的HPLC谱图。
图28：化合物SF-AAN的ESI-MS分析结果。
图29：化合物SF-AAN-T的HPLC谱图。
图30：化合物SF-AAN-T的ESI-MS分析结果。
图29：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3的HPLC谱图。
图30：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3的ESI-MS分析结果。
图31：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3体外酶响应还原自组装的HPLC分析结果。
图32：还原产物SF-AAN-AMBF3-reduced的HPLC谱图。
图33：剪切还原产物SF-10-AMBF3的HPLC谱图。
图34：环化产物SF-C1的HPLC谱图。
图35：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的合成路线。
图36：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的ESI-MS分析结果。
图37：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图38：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3在小鼠体内血液循环30min后的HPLC谱图。
图39：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3和Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3在细胞裂解液和细胞中Legumain酶响应液相图。
图40：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3后的PET显像图。
图41：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3后肿瘤与肌肉摄取的定量分析结果。
图42：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3后肿瘤与肌肉的摄取值之比。
图43：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的合成路线。
图44：化合物SF-AAN-HEHEHE的HPLC谱图。
图45：化合物SF-AAN-HEHEHE的ESI-MS分析结果。
图46：化合物SF-AAN-HEHEHE-T的HPLC谱图。
图47：化合物SF-AAN-HEHEHE-T的ESI-MS分析结果。
图48：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的HPLC谱图。
图49：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的ESI-MS分析结果。
图50：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3体外酶响应还原自组装的HPLC分析结果。
图51：环原产物SF-AAN-HEHEHE-AMBF3-reduced的HPLC谱图。
图52：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的合成路线。
图53：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的HPLC谱图。
图54：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的ESI-MS分析结果。
图55：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图56：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3后的PET显像图。
图57：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3后肿瘤与肌肉摄取的定量分析结果。
图58：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3后肿瘤与肌肉的摄取值之比。
图59：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3的合成路线。
图60：化合物SF-AAN-TAT的TLC谱图。
图61：化合物SF-AAN-TAT的ESI-MS分析结果。
图62：化合物SF-AAN-TAT-T的HPLC谱图。
图63：化合物SF-AAN-TAT-T的ESI-MS分析结果。
图64：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3的HPLC谱图。
图65：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3的ESI-MS分析结果。
图66：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3体外酶响应还原自组装的HPLC分析结果。
图67：环原产物SF-AAN-TAT-AMBF3-reduced的HPLC谱图。
图68：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的合成路线。
图69：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的HPLC谱图。
图70：Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图71：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3后的PET显像图。
图72：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3后肿瘤与肌肉摄取的定量分析结果。
图73：MDA-MB-468荷瘤小鼠在通过尾静脉注射Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3后肿瘤与肌肉的摄取值之比。
图74：GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3的合成路线。
图75：化合物SF-AAN-TAT的HPLC谱图。
图76：化合物SF-AAN-TAT的ESI-MS分析结果。
图77：化合物SF-AAN-TAT-T的HPLC谱图。
图78：化合物SF-AAN-TAT-T的ESI-MS分析结果。
图79：GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3的HPLC谱图。
图80：GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3的ESI-MS分析结果。
图81：GGT靶向的分子探针[18F]G-3的合成路线。
图82：GGT靶向的分子探针[18F]G-3在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图83：GGT靶向的分子探针[18F]G-3在小鼠体内血液循环30min后的HPLC谱图。
图84：GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3分别与U87细胞和NCI-H1299细胞孵育12h后的细胞活力。
图85：GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3分别与U87细胞和NCI-H1299细胞孵育24h后的细胞活力。
图86：GGT靶向的分子探针[18F]G-3在U87细胞和使用GGsTop预处理的U87细胞中的细胞摄取值。
图87：U87荷瘤小鼠在通过尾静脉注射GGT靶向的分子探针[18F]G-3后的PET显像图。
图88：U87荷瘤小鼠在通过尾静脉注射GGT靶向的分子探针[18F]G-3后肿瘤与肌肉摄取的定量分析结果。
图89：U87荷瘤小鼠在通过尾静脉注射GGT靶向的分子探针[18F]G-3后肿瘤与肌肉的摄取值之比。
图90：Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1的合成路线。
图91：Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1的HPLC谱图。
图92：Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1的ESI-MS分析结果。
图93：Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记前体F-2的合成路线。
图94：Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记前体F-2的HPLC谱图。
图95：Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-2的ESI-MS分析结果。
图96：Caspase-3靶向的分子探针18F-1的合成路线。
图97：Caspase-3靶向的分子探针18F-2的合成路线。
图98：纯化前后的Caspase-3靶向的分子探针18F-1的HPLC谱图。
图99：纯化前后的Caspase-3靶向的分子探针18F-2的HPLC谱图。
图100：Caspase-3靶向的分子探针18F-1在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图101：Caspase-3靶向的分子探针18F-2在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图102：Caspase-3靶向的分子探针18F-1在胎牛血清中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图103：Caspase-3靶向的分子探针18F-2在胎牛血清中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图104：Caspase-3靶向的分子探针18F-1对HeLa细胞的细胞毒性实验。
图105：Caspase-3靶向的分子探针18F-2对HeLa细胞的细胞毒性实验。
图106：Caspase-3靶向的分子探针18F-1分别在HeLa细胞、阿霉素处理的HeLa细胞和阿霉素和18F-1探针前体处理的HeLa细胞中的细胞摄取实验。
图107：Caspase-3靶向的分子探针18F-2分别在HeLa细胞、阿霉素处理的HeLa细胞和阿霉素和18F-2探针前体处理的HeLa细胞中的细胞摄取实验。
图108：Caspase-3靶向的分子探针18F-1在HeLa肿瘤模型鼠中的PET显像结果。
图109：Caspase-3靶向的分子探针18F-1在HeLa肿瘤模型中肿瘤和肌肉的ROI分析。
图110：Caspase-3靶向的分子探针18F-1在HeLa肿瘤模型中肿瘤和肌肉的摄取比值分析。
图111：Caspase-3靶向的分子探针18F-2在HeLa肿瘤模型中肿瘤摄取ROI分析。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种环化骨架
本实施例提供了一种环化骨架SF-11，所述环化骨架SF-11具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000171
实施例2：一种制备环化骨架的方法
本实施例提供了实施例1所述环化骨架SF-11的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将氯甲酸异丁酯(195μL，1.5mmol，1.5eq)、N-甲基吗啉(NMM)(330μL，3.0mmol，3eq)分别加入到N-Boc-炔丙基甘氨酸(384mg，1.8mmol，1.8eq)中，得到混合液；在氮气的保护下，于0℃的超干四氢呋喃(THF 9.0mL)中将混合物搅拌2h，得到反应液A；于0℃、避光的条件下，将2-氰基6-氨基苯并噻唑(175mg，1.0mmol，1eq)的THF(3mL)溶液加入到反应液A中反应30min后，继续于25℃、避光的条件下反应16h，得到反应液B；使用3mL盐酸(浓度1mM)淬灭反应液B中的反应后，将反应液B溶于乙酸乙酯(EtOAc)(50mL)中，并分别用水和饱和NaHCO3水溶液(50mL)分别洗涤三次；收集有机相用Na2SO4干燥并用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到粗产物；将粗产物用硅胶层析柱进行纯化后，用正己烷∶乙酸乙酯＝1:1(v/v)的洗脱液洗脱，得到的化合物SF-1(369mg，收率：99％)。C18H18N4O3SNa+([M+Na]+)的ESI-MS计算值393.10，实测值393.13(HPLC＝19.8min)。
步骤二：将二氯甲烷(4mL)和三氟乙酸(4mL)加入化合物SF-1(369mg，1mmol)中，于25℃下搅拌30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到化合物SF-2(269mg，产率99％)(HPLC＝9min)。
步骤三：将化合物SF-2(269mg，1mmol，1eq)和4-[(叔丁氧基羰基氨基)苯甲酸](276mg，1.1mmol，1.1eq)溶于超干四氢呋喃(THF)(8mL)中，得到溶解液；在溶解液中加入HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(436mg，1.15mmol，1.15eq)和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(824μL，5mmol，5eq)后，于25℃下搅拌3h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到粗产物；将粗产物用硅胶层析柱进行纯化后，用正己烷∶乙酸乙酯＝1.5:1(v/v)的洗脱液洗脱，得到化合物SF-3(492mg，产率：97.3％)(HPLC＝21.5min)。
步骤四：将二氯甲烷(4mL)、三氟乙酸(4mL)加入化合物SF-3(492mg,0.97mmol，1eq)中，得到混合液；将混合液于25℃下搅拌30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到化合物SF-4(404.8mg)(HPLC＝12.5min)。
步骤五：在化合物SF-4(186mg，0.46mmol，1eq)中加入超干四氢呋喃(THF)(8mL)、4-[((叔丁氧基羰基氨基)甲基]苯甲酸(127.4mg，0.51mmol，1.1eq)、HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(201mg，0.53mmol，1.15eq)和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(190μL，1.15mmol，2.5eq)，得到混合液；将混合液于25℃下搅拌3h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到粗产物；将粗产物用硅胶层析进行纯化后，用二氯甲烷：甲醇＝1:1(v/v)的洗脱液洗脱，得到化合物SF-5(192mg，产率：65.6％)(HPLC＝21min)。
步骤六：将二氯甲烷(3mL)、三氟乙酸(3mL)加入化合物SF-5(192mg，0.3mmol，1eq)中，得到混合液；将混合液于25℃下搅拌30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到化合物SF-6(404.8mg)(HPLC＝12.5min)。
步骤七：在化合物SF-6(107mg，0.2mmol，1eq)中加入Boc-甘氨酸(38.5mg，0.22mmol，1.1eq)、HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(87.17mg，0.23mmol，1.15eq)、超干四氢呋喃(8mL)和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(83μL，0.5mmol，2.5eq)得到混合液；将混合液于25℃下搅拌3h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到粗产物；将粗产物用硅胶层析进行纯化后，用二氯甲烷：甲醇＝15:1(v/v)的洗脱液洗脱，得到化合物SF-7(101mg，产率：74％)(HPLC＝22min)。
步骤八：将二氯甲烷(3mL)、三氟乙酸(3mL)加入化合物SF-7(101mg，0.146mmol，1eq)中，得到混合液；将混合液于25℃下搅拌30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到化合物SF-8(86mg，产率：99％)(HPLC＝17min)。
步骤九：在化合物SF-8(107mg，0.2mmol，1eq)中加入超干四氢呋喃(THF)(8mL)、超干DMF(N,N-二甲基甲酰胺)(1ml)、N-Boc-S-Trityl-L-半胱氨酸(74mg，0.16mmol，1.1eq)、HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(64mg，0.17mmol，1.15eq)和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(60μL，0.4mmol，2.5eq)，得到混合液；将混合液于25℃下搅拌3h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到粗产物；将粗产物用半制备高效液相色谱纯化(半制备高效液相色谱纯化条件见表1)、干燥，得到化合物SF-9(115mg，产率：65％)(HPLC＝32min)。
步骤十：将二氯甲烷(2mL)、三异丙基硅烷(2mL)、三氟乙酸(2mL)加入化合物SF-9(92mg，0.089mmol，1eq)中，得到混合液；将混合液于25℃下搅拌30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到化合物SF-10(61mg，收率：98％)(HPLC＝16.5min)。
步骤十一：将化合物SF-10(61mg，0.087mmol，1eq)溶于无水甲醇(6mL)中，得到混合液；在混合液中添加Tips(三异丙基硅烷)(120μL)和SEt(2-(ethyldisulfanyl)pyridine)(5μL)后，在氮气的保护下，于25℃下搅拌1h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到环化骨架SF-11(64.5mg，产率：98％)(HPLC＝18min)(环化骨架SF-11的合成路线见图1)。
采用Waters1525对化合物SF-1进行HPLC检测，检测结果见图2。
采用Waters1525对化合物SF-2进行HPLC检测，检测结果见图3。
采用Waters1525对化合物SF-3进行HPLC检测，检测结果见图4。
采用Waters1525对化合物SF-4进行HPLC检测，检测结果见图5。
采用Waters1525对化合物SF-5进行HPLC检测，检测结果见图6。
采用Waters1525对化合物SF-6进行HPLC检测，检测结果见图7。
采用Waters1525对化合物SF-7进行HPLC检测，检测结果见图8。
采用电喷雾电离源对化合物SF-7进行ESI-MS分析，分析结果见图9。
采用Waters1525对化合物SF-8进行HPLC检测，检测结果见图10。
采用电喷雾电离源对化合物SF-8进行ESI-MS分析，分析结果见图11。
采用Waters1525对化合物SF-9进行HPLC检测，检测结果见图12。
采用电喷雾电离源对化合物SF-9进行ESI-MS分析，分析结果见图13。
采用Waters1525对化合物SF-10进行HPLC检测，检测结果见图14。
采用电喷雾电离源对化合物SF-10进行ESI-MS分析，分析结果见图15。
采用Waters1525对环化骨架SF-11进行HPLC检测，检测结果见图16。
采用电喷雾电离源对环化骨架SF-11进行ESI-MS分析，分析结果见图17。
表1半制备高效液相色谱纯化条件
Figure BDA0003113696110000211
实验例1：环化骨架的分子间点击缩合实验
本实验例提供了实施例1所述环化骨架SF-11的分子间点击缩合实验，具体过程如下：
将环化骨架SF-11溶解在DMF中，配置成浓度为25mM的SF-11溶液；将2μL SF-11溶液加入158μL DMF/H2O的混合溶液(DMF:H2O＝1:1,v/v)中，得到混合液；在混合液中加入10μL HCl溶液(浓度为1mM)使混合液的pH值为3后，在混合液中加入20μLTCEP(浓度为50mM)，得到反应体系；在反应体系中加入10μL饱和NaHCO3溶液使反应体系的pH值为7.4后，将反应体系于37℃下孵育，得到反应液；分别在孵育1、3、5、10min后取出25μL反应液，并在反应液中加入10μL HCl溶液(浓度为1mM)淬灭反应，得到待测液；使用高效液相色谱检测待测液，并且，通过分析HPLC数据得到环化骨架SF-11的分子间点击缩合速率。环化骨架SF-11经过还原缩合形成环化产物SF-C1和SF-C2的反应路线见图18。检测结果见图19～22。
由图19～22可知，当环化骨架SF-11在pH＝7.4的还原环境中孵育1min后发现环化骨架SF-11已经完全被转化为两个新的产物，他们的半保留时间分别为16.0min和18.9min。随后将反应液进行LC-MS分析，通过LC图可以发现反应液中的确存在两种产物，其保留时间分别为16.33min和17.11min；质谱分析发现这两个新产物分别为分子内缩合环化产物SF-C1和分子间缩合环化产物SF-C2。这表明环化骨架SF-11结构中的二硫键同样极易被还原，同时也说明环化骨架SF-11在pH＝7.4的还原环境中极易发生点击缩合反应生产环化产物。出乎意料的是，仍然有27％～33％的环化骨架SF-11转化为分子间缩合产物。这可能是因为CBT与半胱氨酸之间的连接链的长度不够与柔性不佳阻碍了分子内缩合，使得部分环化骨架SF-11在被还原后发生了分子间缩合。尽管如此，环化骨架SF-11缩合环化的速率依然远远快于分子间缩合，这更有利于基于环化骨架SF-11开发的肿瘤蛋白酶靶向分子探针在进入肿瘤细胞后进行缩合环化。
实验例2：环化骨架与L-Cys的竞争反应实验
本实验例提供了实施例1所述环化骨架SF-11与L-Cys的竞争反应实验，具体过程如下：
将环化骨架SF-11溶解在DMF中，配置成浓度为25mM的SF-11溶液；将浓度为25mM的SF-11溶液用DMF稀释成浓度为0.5mM的SF-11溶液；取四支1.5mL的反应管，先在四支反应管中加入35μL H2O和10μL HCl(浓度为1mM)调节pH至3，然后在四支反应管中加入10μL TCEP(浓度为50mM)以及20μL浓度为0.5mM的SF-11溶液，再在四支反应管中分别加入1μL Cys水溶液(浓度为10mM)、10μL Cys水溶液(浓度为10mM)，10μL Cys水溶液(浓度为100mM)或10μLCys水溶液(浓度为1000mM)，使四支反应管中，游离Cys与环化骨架SF-11之间的浓度比分别为1:1、10:1、100:1和1000:1，最后在四支反应管中加入15μL饱和NaHCO3溶液调节pH至7.4激活点击反应；将四支反应管在37℃下孵育10min后，在四支反应管中滴加10μL HCl溶液(浓度为1mM)淬灭反应，得到四份待测液；使用高效液相色谱检测待测液，并且，通过分析HPLC数据得到待测液中环化骨架SF-11与L-Cys之间竞争产物的生成情况。环化骨架SF-11在存在游离半胱氨酸的pH＝7.4的还原条件下的反应路线见图23。检测结果见图24～25。
如图24～25所示，当反应环境中存在与环化骨架SF-11相同浓度的游离半胱氨酸时，发现仅有少量保留时间为14.2min的产物产生，收集产物进行质谱分析，发现其为环化骨架SF-11与半胱氨酸的缩合产物SF-Cys。
实施例3：一种Legumain靶向的分子探针的标记前体
本实施例提供了一种Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-AMBF3，所述Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-AMBF3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000231
实施例4：一种制备Legumain靶向的分子探针的标记前体的方法
本实施例提供了实施例3所述Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-AMBF3的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将实施例2制得的环化骨架SF-11(0.0192mmol，1eq)加入反应瓶，然后加入ANN(丙氨酸-丙氨酸-天门冬氨酸，0.02112mmol，11.798mg，1.1eq)、HBTU(0.02208mmol，8.368mg，1.15eq)和THF(7mL)得到混合液；在混合液中加入DIPEA(100μL)调pH至8后，在氮气的保护下，于25℃下反应3h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物SF-AAN(HPLC＝27min)；
步骤二：在化合物SF-AAN中加入DCM(4mL)、Tips(130μL)、TFA(4mL)，得到混合液；将混合液于25℃下反应30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物SF-AAN-T(HPLC＝18.5min)；
步骤三：在化合物SF-AAN-T中加入DMF(2mL)、去离子水(1mL)、AMBF3(2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐)(0.0768mmol，100mg/mL，244μL，4eq)、三(2-苯并咪唑甲基)胺(0.00192mmol，4mg/mL，316μL，0.1eq)和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜(0.02496mmol,15.397mg，1.3eq)，得到混合液；将混合液在氮气的保护下，于45℃下反应45min，得到反应液；将反应液用半制备液相色谱纯化(半制备高效液相色谱纯化条件见表2)后，真空冷冻干燥，得到Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3(11mg，产率：45.68％)(HPLC＝16.7min)(Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3的合成路线见图26)；
采用Waters1525对化合物SF-AAN进行HPLC检测，检测结果见图27。
采用电喷雾电离源对化合物SF-AAN进行ESI-MS分析，分析结果见图28。
采用Waters1525对化合物SF-AAN-T进行HPLC检测，检测结果见图29。
采用电喷雾电离源对化合物SF-AAN-T进行ESI-MS分析，分析结果见图30。
采用waters高效液相对Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3进行HPLC检测，检测结果见图31。
采用电喷雾质谱法对Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3进行ESI-MS分析，分析结果见图32。
表2半制备高效液相色谱纯化条件
Time/min Flow(mL/min) <![CDATA[H<sub>2</sub>O(0.1％TFA)％]]> MeCN(0.1％TFA)％
Initial 3 75 25
3 3 75 25
25 3 60 40
30 3 10 90
35 3 75 25
Initial 3 75 25
实验例3：Legumain靶向的分子探针的标记前体的Legumain酶响应机制实验
本实验例提供了实施例3所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3的Legumain酶响应机制实验，具体过程如下：
将实施例3所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3(50μM)溶解于DMF中制备原液，与TCEP(1mM)在37℃下孵育30min。加入Legumain工作缓冲液(Legumain1μg/mL、柠檬酸20mM、磷酸氢二钠60mM、EDTA 1mM、DTT 1mM，pH＝5.5)，37℃下孵育60分钟。取20μL上清进行高效液相色谱分析和质朴验证。检测结果见图33～36。
由图33～36可知，当二硫键还原后，探针底物能快速被Legumain酶识别剪切，然后快速分子内成环，通过Π-Π堆积形成纳米颗粒，防止探针从细胞内泵出，增强其滞留效应。
实施例5：一种Legumain靶向的分子探针(放射性)
本实施例提供了一种Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3，所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000251
实施例6：一种制备Legumain靶向的分子探针的方法
本实施例提供了实施例5所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的制备方法，所述方法利用氟-18同位素交换法，具体如下：
标记反应如下：
将医用加速器按需生产的核素18F传靶于QMA柱上，并用300μL哒嗪-盐酸缓冲液(pH＝2.5)将18F洗脱至已经加了25μL，25mM的探针前体的反应管中，在80℃温度下孵育30min，完成18F与19F的同位素交换(IEX)。
标记过程如下：
1、配置标记前体：将3.2mg实施例3所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3溶于100μL DMF中配成25mmol/L的澄清溶液。
2、QMA柱活化：先用注射器吸取10mL 0.5M的碳酸氢钠溶液注入柱内清洗，再吸取10mL超纯水清洗，最后将注射器吸入空气吹干QMA柱。
3、将QMA柱挂上加速器，待氟计量达到200mCi时，用300μL哒嗪-盐酸缓冲液将18F从QMA柱上洗脱到含有30μL标记前体的反应管中，然后测其剂量。然后，将反应管在油浴锅内80℃加热反应30分钟，油浴后测其剂量。取反应液用乙腈稀释至1μCi/μL，用放射型HPLC(5μCi以内)观测标记情况，确认标记成功后，测纯化前剂量。
4、C-18柱活化：先取10mL乙醇注入C-18柱，然后用10mL超纯水清洗(无需吹干)。
5、反应液转入50mL离心管，加入20毫升水稀释，用注射器吸取混合液经C-18柱纯化，去除游离氟离子，然后再用10mL水洗涤三次(水洗每次都测一下剂量)，用500μL乙醇将标记产物淋洗到10mL西林瓶中，取纯化后的产物稀释，经放射型HPLC检测其放射化学纯度，得到实施例5所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3(HPLC＝16.7min，纯度>97％)(Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的合成路线见图37)。
采用waters高效液相对Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3进行HPLC检测，检测结果见图38。
实验例4：Legumain靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例5所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的体外稳定性实验，具体过程如下：
将Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3(800MBq)加入到pH＝7.4的90μLPBS缓冲液中，于37℃中分别孵化1、2和4h。到达时间点之后，取20μL混合物进行放射性HPLC分析。分析结果见图39。
由图39可知，将Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3与PBS缓冲液在37℃下孵育4h后探针的放射化学纯度并没有发生显著改变。
实验例5：Legumain靶向的分子探针的体内稳定性实验
本实验例提供了实施例5所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的体内稳定性实验，具体过程如下：
将2.4GBq的Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3注射到正常白鼠(购自常州卡文斯公司的正常白鼠)体内。30min后取5μL尾静脉血，加入等体积的乙腈析出血液中的蛋白质。使用高速离心机沉降血液中的细胞与蛋白，然后取20μL上清液进行radio-HPLC分析。分析结果见图40。
由图40可知，将Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3在小鼠体内随血液循环30min后探针依然保持良好的稳定性。
实验例6：Legumain靶向的分子探针及其标记前体在细胞裂解液和细胞中的Legumain酶响应实验
本实验例提供了实施例5所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3及其标记前体SF-AAN-AMBF3在细胞裂解液和细胞中的Legumain酶响应，具体过程如下：
将100μL细胞裂解液与1mM TCEP和0.2μL SF-AAN-AMBF3(25mM)于37℃共孵育10h，离心后取20μL上清液进行高效液相色谱分析。将Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3(2.4GBq)加入含有300万HCT116细胞和300μL无血清1640培养基(购自BI公司)的离心管中，37℃孵育1h。12000g离心5分钟，取上清。然后加入100μL DMSO裂解细胞，12000g离心5分钟，收集上清，然后用放射性HPLC分析。检测结果见图41。
由图41可知，用细胞裂解液和细胞层面，在放射性和非放射性探针双方面验证了，该探针二硫键被还原，酶响应剪切底物，可环化自组装。
实验例7：Legumain靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了实施例5所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
将活力良好，肿瘤大小合适的MDA-MB-468荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉。小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在150μL生理盐水中的150μCi的Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3通过尾静脉注射。探针注射完毕后立即执行60min的动态PET扫描。感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取通过ASIProVM软件进行定量分析。肿瘤与肌肉定量结果用每毫升肌肉肿瘤肿瘤摄取量占总给药量的比值(％ID/mL)表示。实验结果见图42～44。
由图42～44可知，探针能较快得到达靶标部位，并且有较好的的滞留效果以及较高的靶本比，并且体内清除速率较快。
实施例7：一种Legumain靶向的分子探针的标记前体
本实施例提供了一种Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3，所述Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000291
实施例8：一种制备Legumain靶向的分子探针的标记前体的方法
本实施例提供了实施例7所述Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将实施例2制得的环化骨架SF-11(0.0192mmol，1eq)加入反应瓶，然后加入ANN-HEHEHE(丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-(组氨酸-谷氨酸)3，0.02112mmol，11.798mg，1.1eq)、HBTU(0.02208mmol，8.368mg，1.15eq)和THF(7mL)得到混合液；在混合液中加入DIPEA(100μL)调pH至8后，在氮气的保护下，于25℃下反应3h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物SF-AAN-HEHEHE(HPLC＝32min)；
步骤二：在化合物SF-AAN-HEHEHE中加入DCM(4mL)、Tips(130μL)、TFA(4mL)，得到混合液；将混合液于25℃下反应30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物SF-AAN-HEHEHE-T(HPLC＝15min)；
步骤三：在化合物SF-AAN-HEHEHE-T中加入DMF(2mL)、去离子水(1mL)、AMBF3(2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐)(0.0768mmol，100mg/mL，244μL，4eq)、三(2-苯并咪唑甲基)胺(0.00192mmol，4mg/mL，316μL，0.1eq)和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜(0.02496mmol,15.397mg，1.3eq)，得到混合液；将混合液在氮气的保护下，于45℃下反应45min，得到反应液；将反应液用半制备液相色谱纯化后(同实施例2)，真空冷冻干燥，得到Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3(26mg，产率：64％)(HPLC＝13.7min)(Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的合成路线见图45)；
采用Waters1525对化合物SF-AAN-HEHEHE进行HPLC检测，检测结果见图46。
采用电喷雾电离源对化合物SF-AAN-HEHEHE进行ESI-MS分析，分析结果见图47。
采用Waters1525对化合物SF-AAN-HEHEHE-T进行HPLC检测，检测结果见图48。
采用电喷雾电离源对化合物SF-AAN-HEHEHE-T进行ESI-MS分析，分析结果见图49。
采用waters高效液相对Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3进行HPLC检测，检测结果见图50。
采用电喷雾质谱法对Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3进行ESI-MS分析，分析结果见图51。
实验例8：Legumain靶向的分子探针的标记前体的Legumain酶响应机制实验
本实验例提供了实施例7所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的Legumain酶响应机制实验，具体过程同实验例3。检测结果见图52～53。
由图52～53可知，该探针同Legumain靶向的分子探针SF-AAN-AMBF3一样，能快速发生还原二硫键，酶响应环化自组装，并且对酶具有更好的亲和力。
实施例9：一种Legumain靶向的分子探针(放射性)
本实施例提供了一种Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3，所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000311
实施例10：一种制备Legumain靶向的分子探针的方法
本实施例提供了实施例9所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的制备方法，所述方法利用氟-18同位素交换法，具体如下：
参照实施例6，将实施例6的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3替换为实施例7所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3，得到实施例9所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3(Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的合成路线见图54)。
实验例9：Legumain靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例9所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的体外稳定性实验，具体过程如下：
将20μL Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3(0.74MBq/μL)溶于180μL PBS缓冲液，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、1、2或4h；孵育结束后，取孵育液直接使用radio-HPLC分析。分析结果见图55。
由图55可知，将Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3与PBS缓冲液在37℃下孵育4h后探针的放射化学纯度并没有发生显著改变。
实验例10：Legumain靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了实施例9所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
将活力良好，肿瘤大小合适的MDA-MB-468荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉。小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在150μL生理盐水中的150μCi的Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3通过尾静脉注射。探针注射完毕后立即执行60min的动态PET扫描。感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取通过ASIProVM软件进行定量分析。肿瘤与肌肉定量结果用每毫升肌肉肿瘤肿瘤摄取量占总给药量的比值(％ID/mL)表示。实验结果见图56～58。
由图56～58可知，Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3在肿瘤部位有较好的滞留效果，比Legumain靶向的分子探针SF-AAN-AMBF3摄取更高，靶本比也更高，效果更好。
实施例11：一种Legumain靶向的分子探针的标记前体
本实施例提供了一种Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3，所述Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000331
实施例12：一种制备Legumain靶向的分子探针的标记前体的方法
本实施例提供了实施例11所述Legumain靶向的分子探针的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将实施例2制得的环化骨架SF-11(0.0192mmol，1eq)加入反应瓶，然后加入ANN-TAT(丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸(穿透肽)，0.02112mmol，11.798mg，1.1eq)、HBTU(0.02208mmol，8.368mg，1.15eq)和THF(7mL)得到混合液；在混合液中加入DIPEA(100μL)调pH至8后，在氮气的保护下，于25℃下反应3h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物SF-AAN-TAT；
步骤二：在化合物SF-AAN-TAT中加入DCM(4mL)、Tips(130μL)、TFA(4mL)，得到混合液；将混合液于25℃下反应30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物SF-AAN-TAT-T(HPLC＝13.5min)；
步骤三：在化合物SF-AAN-TAT-T中加入DMF(2mL)、去离子水(1mL)、AMBF3(2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐)(0.0768mmol，100mg/mL，244μL，4eq)、三(2-苯并咪唑甲基)胺(0.00192mmol，4mg/mL，316μL，0.1eq)和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜(0.02496mmol,15.397mg，1.3eq)，得到混合液；将混合液在氮气的保护下，于45℃下反应45min，得到反应液；将反应液用半制备液相色谱纯化后(纯化条件同实施例2)，真空冷冻干燥，得到Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3(16.5mg，产率：13％)(HPLC＝12min)(Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3的合成路线见图59)；
采用TLC对化合物SF-AAN-TAT进行TLC检测(检测条件：二氯甲烷/甲醇＝10：1，v/v)，检测结果见图60。
采用电喷雾电离源对化合物SF-AAN-TAT进行ESI-MS分析，分析结果见图61。
采用Waters1525对化合物SF-AAN-TAT-T进行HPLC检测，检测结果见图62。
采用电喷雾电离源对化合物SF-AAN-TAT-T进行ESI-MS分析，分析结果见图63。
采用waters高效液相对Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3进行HPLC检测，检测结果见图64。
采用电喷雾质谱法对Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3进行ESI-MS分析，分析结果见图65。
实验例11：Legumain靶向的分子探针的标记前体的Legumain酶响应机制实验
本实验例提供了实施例11所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3的Legumain酶响应机制实验，具体过程同实验例3。检测结果见图66～67。
由图66～67可知，该探针仍然能够快速成环，且比SF-AAN-HEHEHE剪切速率更快，具有更好的酶亲和力。
实施例13：一种Legumain靶向的分子探针(放射性)
本实施例提供了一种Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3，所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000351
实施例14：一种制备Legumain靶向的分子探针的方法
本实施例提供了实施例9所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的制备方法，所述方法利用氟-18同位素交换法，具体如下：
参照实施例6，将实施例6的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3替换为实施例11所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的标记前体SF-AAN-TAT-AMBF3，得到实施例13所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3(Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的合成路线见图68)。
采用waters高效液相对Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3进行HPLC检测，检测结果见图69。
实验例12：Legumain靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例13所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的体外稳定性实验，具体过程如下：
将20μL Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3(0.74MBq/μL)溶于180μL PBS缓冲液，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、1、2或4h；孵育结束后，取孵育液直接使用radio-HPLC分析。分析结果见图70。
由图70可知，将Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3与PBS缓冲液在37℃下孵育4h后探针的放射化学纯度并没有发生显著改变。
实验例13：Legumain靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了实施例13所述Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
将活力良好，肿瘤大小合适的MDA-MB-468荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉。小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在150μL生理盐水中的150μCi的Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-TAT-AMBF3通过尾静脉注射。探针注射完毕后立即执行60min的动态PET扫描。感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取通过ASIProVM软件进行定量分析。肿瘤与肌肉定量结果用每毫升肌肉肿瘤肿瘤摄取量占总给药量的比值(％ID/mL)表示。实验结果见图71～73。
由图71～73可知，该探针仍然能有较好的滞留效果，但是相对于SF-ANN-HEHEHE，肿瘤摄取效果不是特别好，靶本比也不是特别高，骨摄取相对较高。
实施例15：一种GGT靶向的分子探针的标记前体
本实施例提供了一种GGT靶向的分子探针的标记前体G-3，所述GGT靶向的分子探针的标记前体G-3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000361
实施例16：一种制备GGT靶向的分子探针的标记前体的方法
本实施例提供了实施例15所述GGT靶向的分子探针的标记前体G-3的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤一：将实施例2制得的环化骨架SF-11(0.0192mmol，1eq)加入反应瓶，然后加入Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯(0.0318mmol，1.1eq)、HBTU(0.0332mg，1.15eq)和THF(4mL)得到混合液；在混合液中加入DIPEA(50μL)调pH至8后，在氮气的保护下，于25℃下反应3h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物G-1(HPLC＝27.3min)；
步骤二：在化合物G-1中加入DCM(4mL)、Tips(130μL)、TFA(4mL)，得到混合液；将混合液于25℃下反应30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到化合物G-2(HPLC＝18.4min)；
步骤三：在化合物G-2中加入DMF(4mL)、去离子水(1mL)、AMBF3(2-叠氮乙基-N，N-二甲基氨基甲基-三氟硼酸盐)(100mg/mL，244μL，4eq)、三(2-苯并咪唑甲基)胺(4mg/mL，316μL，0.1eq)和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜(15.397mg，1.3eq)，得到混合液；将混合液在氮气的保护下，于45℃下反应45min，得到反应液；将反应液用半制备液相色谱纯化后(纯化条件同实施例2)，真空冷冻干燥，得到GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3(15.4mg)(HPLC＝16min)(GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3的合成路线见图74)；
采用Waters1525对化合物G-1进行HPLC检测，检测结果见图75。
采用电喷雾电离源对化合物G-1进行ESI-MS分析，分析结果见图76。
采用Waters1525对化合物G-2进行HPLC检测，检测结果见图77。
采用电喷雾电离源对化合物G-2进行ESI-MS分析，分析结果见图78。
采用waters高效液相对GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3进行HPLC检测，检测结果见图79。
采用电喷雾质谱法对GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3进行ESI-MS分析，分析结果见图80。
实施例17：一种GGT靶向的分子探针(放射性)
本实施例提供了一种GGT靶向的分子探针[18F]G-3，所述GGT靶向的分子探针[18F]G-3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000381
实施例18：一种制备GGT靶向的分子探针的方法
本实施例提供了实施例17所述GGT靶向的分子探针[18F]G-3的制备方法，所述方法利用氟-18同位素交换法，具体如下：
参照实施例6，将实施例6的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3替换为实施例11所述GGT靶向的分子探针[18F]G-3的标记前体G-3，得到实施例17所述GGT靶向的分子探针[18F]G-3(GGT靶向的分子探针[18F]G-3的合成路线见图81)。
实验例14：GGT靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例17所述GGT靶向的分子探针[18F]G-3的体外稳定性实验，具体过程如下：
将20μL GGT靶向的分子探针[18F]G-3(0.74MBq/μL)溶于180μLPBS缓冲液，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、1、2或4h；孵育结束后，取孵育液直接使用radio-HPLC分析。分析结果见图82。
由图82可知，将GGT靶向的分子探针[18F]G-3与PBS缓冲液在37℃下孵育4h后探针的放射化学纯度并没有发生显著改变。
实验例15：GGT靶向的分子探针的体内稳定性实验
本实验例提供了17所述GGT靶向的分子探针[18F]G-3的体内稳定性实验，具体过程如下：
将11.1MBq的GGT靶向的分子探针[18F]G-3注射到正常白鼠(购自常州卡文斯公司的正常白鼠)体内。30min后取5μL尾静脉血，加入等体积的乙腈析出血液中的蛋白质。使用高速离心机沉降血液中的细胞与蛋白，然后取20μL上清液进行radio-HPLC分析。分析结果见图83。
由图83可知，将GGT靶向的分子探针[18F]G-3在小鼠体内随血液循环30min后探针依然保持良好的稳定性。
实验例16：GGT靶向的分子探针的标记前体的细胞毒性评估实验
本实验例提供了实施例15所述GGT靶向的分子探针的标记前体G-3的细胞毒性评估实验，GGT靶向的分子探针的标记前体G-3对U87和NCI-H1299细胞系的细胞毒性通过3-(4，5--二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT法)来测定，具体过程如下：
先将8×103个U87细胞或NCI-H1299细胞(U87细胞和NCI-H1299细胞购自中科院上海细胞库)接种到分别添加有100μL DMEM高糖培养基(购自BI公司)和1640培养基(购自BI公司)的96孔板中(1个空白对照组和5个实验组，每个实验组设置为3加药孔)。于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养12h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入200μL含不同浓度的(0、12.5、25、50、100μmol)GGT靶向的分子探针的标记前体G-3(溶剂为购自BI公司的完全培养基)加到各实验孔中，继续在相同的条件下培养12和24h。孵育结束后，每个孔添加20μL MTT(5mg/mL)，再于37℃下孵育4h。除去孔内上清液后，加入150μL的DMSO溶解甲瓒，用酶标仪记录490nm波长下的吸光度值，并根据公式：细胞存活率％＝(加药组的平均吸光度值/空白组的平均吸光度值)×100％，对细胞毒性进行评估。评估结果见图84～85。
由图84～85可知，GGT靶向的分子探针的标记前体G-3具有良好的生物相容性，可安全用于细胞实验与动物显像实验。
实验例17：GGT靶向的分子探针的细胞摄取实验
本实验例提供了实施例17所述GGT靶向的分子探针[18F]G-3的细胞摄取实验，具体过程如下：
将1×106个U87细胞分散在200μL的DMEM高糖培养基(购自BI公司)中后加入到放免管中。将GGT靶向的分子探针[18F]G-3使用DMEM高糖培养基稀释至370KBq/mL的浓度，然后每管添加100μL。为了验证GGT靶向的分子探针[18F]G-3对GGT的靶向性，另外再设置一组阻断实验。同样每个管中加入1×106个U87细胞，随后每管加入0.33μL 100μM的GGT抑制剂(GGsTop)于37℃下孵育30min，然后再将溶解在100μL培养基中放射性量共37KBq的GGT靶向的分子探针[18F]G-3加到已处理好的U87细胞中。摇匀后置于37℃下孵育15min、30min、60min、120min和240min。每当设定的孵育时间结束，立即加入PBS洗涤细胞洗去管中游离的GGT靶向的分子探针[18F]G-3，用γ计数仪测量细胞摄取的探针量，结果以U87细胞内现有的探针量占孵育前总输入剂量的百分比表示。实验结果见图86。
由图86可知，GGT靶向的分子探针[18F]G-3在GGT高表达的U87肿瘤细胞中具有较高的摄取，而在GGT抑制剂抑制后的U87细胞摄取显著下降，表明该探针具有良好的GGT靶向性，可特异性的识别肿瘤中GGT。
实验例18：GGT靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了实施例17所述GGT靶向的分子探针[18F]G-3的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
将活力良好，肿瘤大小合适的U87荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉。小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在150μL生理盐水中的150μCi的GGT靶向的分子探针[18F]G-3通过尾静脉注射。探针注射完毕后立即执行60min的动态PET扫描。感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取通过ASIProVM软件进行定量分析。肿瘤与肌肉定量结果用每毫升肌肉肿瘤肿瘤摄取量占总给药量的比值(％ID/mL)表示。实验结果见图87～89。
由图87～89可知，GGT靶向的分子探针[18F]G-3在肿瘤部位有较高的摄取，滞留时间较长，且靶本比较高，表明该探针可在活体内特异性的识别GGT，并对其进行量化。
实施例19：一种Caspase-3靶向的分子探针(放射性)及其标记前体(非放射性)
本实施例提供了一种Caspase-3靶向的分子探针18F-1及其标记前体F-1，所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000411
所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000412
Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1的制备方法参照实施例4，在实施例4的基础上，将AAN替换为DEVD。
Caspase-3靶向的分子探针18F-1的制备方法参照实施例6，在实施例6的基础上，将Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-AMBF3的标记前体SF-AAN-AMBF3替换为Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1。
Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1的合成路线见图90。
采用Waters1525对Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1进行HPLC检测，检测结果见图91。
采用电喷雾电离源对Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记前体F-1进行ESI-MS分析，分析结果见图92。
Caspase-3靶向的分子探针18F-1的合成路线见图96。
采用Waters1525对纯化前后的Caspase-3靶向的分子探针18F-1进行HPLC检测，检测结果见图98。
Caspase-3靶向的分子探针18F-1的标记产率为86％，随后经过C-18柱纯化，纯度大于95％。
实施例20：一种Caspase-3靶向的分子探针(放射性)及其标记前体(非放射性)
本实施例提供了一种Caspase-3靶向的分子探针18F-2及其标记前体F-2，所述Caspase-3靶向的分子探针18F-2具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000421
所述Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记前体F-2具有如下所示结构：
Figure BDA0003113696110000422
Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记前体F-2的制备方法参照实施例8，在实施例8的基础上，将AAN-HEHEHE替换为DEVD-HEHEHE。
Caspase-3靶向的分子探针18F-2的制备方法参照实施例10，在实施例10的基础上，将Legumain靶向的分子探针[18F]SF-AAN-HEHEHE-AMBF3的标记前体SF-AAN-HEHEHE-AMBF3替换为Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记前体F-2。
Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记前体F-2的合成路线见图93。
采用Waters1525对Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记前体F-1进行HPLC检测，检测结果见图94。
采用电喷雾电离源对Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记前体F-1进行ESI-MS分析，分析结果见图95。
Caspase-3靶向的分子探针18F-2的合成路线见图97。
采用Waters1525对纯化前后的Caspase-3靶向的分子探针18F-2进行HPLC检测，检测结果见图99。
Caspase-3靶向的分子探针18F-2的标记产率为88％，随后经过C-18柱纯化，纯度大于95％。
实验例19：Caspase-3靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例19～20所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2的体外稳定性实验，具体过程如下：
实验一：将实施例19～20所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2(500μCi)分别与PBS缓冲液(500μL，pH＝7.4)混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、1、2或4h；孵育结束后，取孵育液进行HPLC分析。分析结果见图100～101。
实验二：将实施例1所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2(500μCi)分别与胎牛血清(取自购自BI公司，500μL)混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、0.5、1或2h；孵育结束后，取20μL孵育液，加入等体积乙腈，在12000g条件下高速离心3min使血清与蛋白分离，吸取上清液进行HPLC分析。分析结果见图102～103。
由图100～103可知，经过4h的孵育后，通过放射性HPLC检测发现，探针18F-1在PBS和血清中具有良好的稳定性；探针18F-2在PBS的孵育液中仅有少量的杂质出现，这表明探针18F-2具有良好的PBS稳定性，探针18F-2在与血清进行共孵育4h有较多杂质产生，探针保留率为68％，而在1～2h，探针无明显分解，测定结果表明，探针18F-2也具有一定的血清稳定性，能够用于短时间内生物活体实验。
实验例20：Caspase-3靶向的分子探针的脂水分配系数实验
本实验例提供了实施例19～20所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2的脂水分配系数实验，具体过程如下：
将20μL Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2(15μCi)分别溶于去离子水(1mL)以及正辛醇(1mL)的混合溶液中，得到混合液；将混合液分别震荡混匀后再离心分离。分别取出500μL的有机相和水相置于两只放免管中，然后使用γ计数仪分别测量两相中的放射性以检测探针的分布情况。然后通过公式：logP(logP＝logC正辛醇/C水)计算出Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2的脂水分配系数(logP)来反应它的亲水性与亲脂性。C水和C正辛醇分别近似代表Caspase-3靶向的分子探针[18F]GD-16在水相和有机相中的浓度。回收水相，添加一定量的纯水使总体积回到1mL，再加入1mL正辛醇。震荡混匀，离心分离。取等体积的水相和有机相置于两只放免管中，并使用γ计数仪分别测量两相中的放射性，再通过公式计算出logP。重复上述过程，直到连续测出三组log P值接近，取三组数据平均值为脂水分配系数值，结果表示为平均数±标准差。
测得Caspase-3靶向的分子探针18F-1的log P＝-0.72±0.05、Caspase-3靶向的分子探针18F-2的log P＝-1.28±0.05，表明Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2均是亲水的。
实验例21：Caspase-3靶向的分子探针的标记前体的细胞毒性评估实验
本实验例提供了实施例19～20所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2的细胞毒性评估实验，Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2对HeLa细胞的细胞毒性通过3-(4，5-二甲基-噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT法)来测定，具体过程如下：
先将8×103个HeLa细胞(HeLa细胞购自中科院上海细胞库)接种到分别添加有100μL含有10(v/v)％胎牛血清的DMEM培养基(购自BI公司)的96孔板中。于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养12h至细胞贴壁后，去除原培养基，加入200μL分别含不同浓度的(0、6.25、12.5、25、50、100μM)Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2(溶剂为购自BI公司的DMEM培养基)加到各实验孔中，继续在相同的条件下培养24h。培养结束后，每个孔添加20μLMTT(5mg/mL)，再于37℃下孵育4h。除去孔内上清液后，加入150μL的DMSO溶解甲瓒，用酶标仪记录495nm波长下的吸光度值，并根据公式：细胞存活率％＝(加药组的平均吸光度值/空白组的平均吸光度值)×100％，对细胞毒性进行评估。实验结果是五个平行实验的平均值，结果表示为平均值±标准差。评估结果见图104～105。
由图104～105可知，在较短的时间内，探针18F-1、18F-2几乎无毒(100μM孵育6h后，细胞存活率大于90％)，仅仅在长时间作用下表现出微弱毒性(在100μM孵育24h后，HeLa细胞仍然保持80％以上的细胞存活率)。实验结果表明，探针18F-1、18F-2仅在高浓度下，较长时间作用后，具有较低的细胞毒性，探针18F-1、18F-2可用于生物体内实验。
实验例22：Caspase-3靶向的分子探针的细胞摄取实验
本实验例提供了实施例19～20所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2的细胞摄取实验，具体过程如下：
将HeLa细胞以5×105细胞/孔的密度接种到含有1.5mL的DMEM培养基(购自I公司)的6孔板中后，于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养至细胞开始贴壁生长。培养结束后，将生长有HeLa细胞细胞的6孔板平均分为三组，培养基中不添加阿霉素的记为untreated组，培养基中添加阿霉素的记为treated组，培养基中添加阿霉素并在后续摄取实验中额外加入冷化合物的记为treated+inhibitor组。对于untreated组，直接更换新鲜的DMEM培养基即可；treated以及treated+inhibitor组则需要在DMEM培养基中额外添加DOX(2μM，购自阿拉丁公司)。将分组后的HeLa细胞于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中培养24h后，在6孔板中添加100μL新鲜的分别含有1μCi实施例19～20所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2的DMEM培养基，对于treated+inhibitor组，在培养基内额外添加50μM的Z-VAD-fmk(购自碧云天公司)。添加完毕后，将HeLa细胞于37℃、5％(v/v)CO2培养箱中继续培养0.5、1、2或4h。培养结束后，使用移液枪移除6孔板中的DMEM培养基并用4℃的PBS缓冲液清洗6孔板中HeLa细胞，随后使用伽马计数器对HeLa细胞内放射性活度进行计数，计算摄取百分比。计数结束后，使用RIPA裂解液裂解细胞并对裂解液蛋白量进行计算。最后细胞摄取结果表示为每毫克蛋白摄取百分数(％ID/mg)，每组实验平行做三次。实验结果见图106～107。
由图106～107可知，Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2在未凋亡的肿瘤细胞中摄取较低，随着时间的推移，摄取增长也较为缓慢，而在凋亡组的细胞中，Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2的摄取有了显著的增长，加入少量冷化合物DOX后，增长更加明显，这一现象表明Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2具有良好的靶向凋亡肿瘤细胞的能力，也表明Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2在较低浓度下就能有效区分凋亡和非凋亡细胞。
实验例23：Caspase-3靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了实施例19～20所述Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
将活力良好，肿瘤大小合适的HeLa荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉。小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在150μL生理盐水中的150μCi的Caspase-3靶向靶向的分子探针18F-1、18F-2分别通过尾静脉注射。探针注射完毕后，启动PET扫描，并通过Inveon Dedicated micro-PET扫描仪(Siemens)以列表模式获得PET成像数据，扫描时间设置为60min，得到untreated组PET显像数据。小鼠PET扫描结束后，将DOX(0.2mg，溶于25μL DMSO中)注入肿瘤部位以诱导肿瘤细胞凋亡，三天后，将小鼠分为四组，每组两只。其中两组直接分别尾静脉注射溶解在150μL生理盐水中的150μCi的Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2并收集数据，得到treated组PET显像数据。另两组则分别尾静脉注射溶解在150μL生理盐水中的150μCi的Caspase-3靶向的分子探针18F-1+400nmol探针前体、溶解在150μL生理盐水中的150μCi的GGT靶向的分子探针18F-2+400nmol探针1，得到treated+Cold组PET显像数据。用衰减曲线校正数据并分析感兴趣区域(ROI)，最终结果表示为每毫升注射剂量的百分比(％ID/mL)。实验结果见图108～111。
由图108～111可知，在treated组中，肿瘤与肌肉摄取情况相似(30min时，肿瘤摄取为1.92±0.47％ID/mL，肌肉摄取为1.82±0.43％ID/mL)；而在treated组中，Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2能够有效区分肿瘤以及肌肉(30min时，肿瘤摄取为6.89±1.28％ID/mL，肌肉摄取为1.87±0.90％ID/mL)，然而，随着时间的推移，肿瘤内18F信号逐渐减弱(60min时，肿瘤摄取为3.59±0.80％ID/mL，肌肉摄取为1.48±0.29％ID/mL)；当额外加入冷化合物DOX进行显像时(treated+cold组)，肿瘤内18F信号达到最大值后保持不变(30min时，肿瘤摄取为10.29±1.10％ID/mL，肌肉摄取为2.38±0.40％ID/mL；60min时，肿瘤摄取为9.70±0.92％ID/mL，肌肉摄取为1.40±0.25％ID/mL)。这一结果表明Caspase-3靶向的分子探针18F-1、18F-2具有对凋亡肿瘤进行特异性成像的性质，同时加入少量冷化合物(12.5nmol)后能够延长18F信号在凋亡肿瘤内滞留时间。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (13)

1.一种分子探针，其特征在于，所述分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000011
其中，R1为标记基团，R2为靶向基团。
2.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针为Legumain靶向的分子探针；所述Legumain靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000012
或者，所述Legumain靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000021
或者，所述Legumain靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000022
3.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针为GGT靶向的分子探针；所述GGT靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000023
4.如权利要求1所述的分子探针，其特征在于，所述分子探针为Caspase靶向的分子探针；所述Caspase靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000031
或者，所述Caspase靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000032
5.一种环化骨架，其特征在于，所述环化骨架具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000033
6.一种制备权利要求1～4任一项所述分子探针的方法，其特征在于，所述方法为：在权利要求5所述环化骨架的基础上修饰标记基团和靶向基团。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当分子探针为Legumain靶向的分子探针时，所述方法为：将权利要求5所述环化骨架和ANN、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA后进行反应，得到化合物SF-AAN；在化合物SF-AAN中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-AAN-T；在化合物SF-AAN-T中加入DMF、去离子水、AMBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜后进行反应，得到Legumain靶向的分子探针的标记前体；对Legumain靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Legumain靶向的分子探针；
或者，所述方法为：将权利要求5所述环化骨架和ANN-HEHEHE、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA后进行反应，得到化合物SF-AAN；在化合物SF-AAN中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-AAN-T；在化合物SF-AAN-T中加入DMF、去离子水、AMBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜后进行反应，得到Legumain靶向的分子探针的标记前体；对Legumain靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Legumain靶向的分子探针；
或者，所述方法为：将权利要求5所述环化骨架和ANN-TAT、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA后进行反应，得到化合物SF-AAN；在化合物SF-AAN中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-AAN-T；在化合物SF-AAN-T中加入DMF、去离子水、AMBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜后进行反应，得到Legumain靶向的分子探针的标记前体；对Legumain靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Legumain靶向的分子探针。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当分子探针为GGT靶向的分子探针时，所述方法为：将权利要求5所述环化骨架和Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA后进行反应，得到化合物G-1；在化合物G-1中加入DCM、Tips、TFA后进行反应，得到化合物G-2；在化合物G-2中加入DMF、去离子水、AMBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸铜后进行反应，得到GGT靶向的分子探针的标记前体；对GGT靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到GGT靶向的分子探针。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，当分子探针为Caspase-3靶向的分子探针时，所述方法为：将权利要求5所述环化骨架和DEVD、HBTU和THF混合得到混合液；在混合液中加入DIPEA将混合液的PH调至8-9后进行反应得到化合物SF-DEVD；在化合物SF-DEVD中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-DEVD-T；在化合物SF-DEVD-T中加入DMF、去离子水、AmBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟膦酸铜后进行反应，得到Caspase-3靶向的分子探针的标记前体；对Caspase-3靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Caspase-3靶向的分子探针；
或者，所述方法为：将权利要求5所述环化骨架和DEVD-HEHEHE、HBTU和THF混合，得到混合液；在混合液中加入DIPEA将PH调至8-9后进行反应，得到化合物SF-DEVD-HE3；在化合物SF-DEVD-HE3中加入DCM、Tips和TFA后进行反应，得到化合物SF-DEVD-HE3-T；在化合物SF-DEVD-HE3-T中加入DMF、去离子水、AmBF3、三(2-苯并咪唑甲基)胺和四(乙腈)铜(I)六氟膦酸铜后进行反应，得到Caspase-3靶向的分子探针的标记前体；对Caspase-3靶向的分子探针的标记前体进行放射性标记，得到Caspase-3靶向的分子探针。
10.一种制备权利要求5所述环化骨架的方法，其特征在于，所述方法为：将化合物SF-10溶于无水甲醇中，得到混合液；在混合液中加入Tips和SEt进行反应，得到权利要求5所述的环化骨架；
所述化合物SF-10具有如下所示结构：
Figure FDA0004085991710000051
11.权利要求5所述环化骨架在制备分子探针中的应用。
12.权利要求1～4任一项所述分子探针或权利要求5所述环化骨架在制备靶标物显像剂中的应用。
13.一种靶向靶标物的显像剂，其特征在于，所述显像剂含有权利要求1～4任一项所述分子探针或权利要求5所述环化骨架。
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