CN112341445B - 靶向cyp1b1酶的用于放射性18f标记的探针前体 - Google Patents

靶向cyp1b1酶的用于放射性18f标记的探针前体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向CYP1B1酶的用于放射性18F标记的探针前体；所述探针前体包括能与CYP1B1酶结合的亲和配体、可用于18F快速标记的螯合基团和用于连接配体和螯合基团的连接链；所述连接链包含多个乙二醇片段；所述亲和配体为α‑萘黄酮衍生物，可用于18F快速标记的螯合基团为1,4,7‑三氮杂环壬烷‑1,4‑二乙酸分子。本发明是一种可与肿瘤特异性表达的CYP1B1酶结合，并能用于18F标记的分子探针前体，进行放射性标记后可在PET显像中显示肿瘤中CYP1B1酶的水平使肿瘤可视化。本发明将有效促进分子影像学技术在肿瘤诊断的应用。

Description

靶向CYP1B1酶的用于放射性18F标记的探针前体
技术领域
本发明涉及PET显像和肿瘤诊断领域，涉及一种靶向CYP1B1酶的用于放射性核素18F标记的探针前体；具体来说是一种由乙二醇链将可用于18F标记的螯合基团与能与细胞色素P450 1B1酶特异性结合的配体连接在一起组成的诊断试剂复合物，在进行放射性18F标记后可在PET显像中通过显示细胞色素P450 1B1酶的水平使肿瘤可视化，用于肿瘤诊断。
背景技术
相比于传统的医学成像，分子影像学在肿瘤的早期诊断中呈现出更良好的应用前景。其通过分子探针对肿瘤组织的特异性靶点的高亲和力富集作用，从而在肿瘤发生早期甚至在症状出现之前即对肿瘤进行显像，起到早期诊断的效果。随着肿瘤生物学的发展，许多癌症的特异性生物标记物都被发现和确证。分子影像的发展有赖于细胞水平和分子水平特异性影像探针的发现。目前这一新的领域已经成为研究热点，其有助于肿瘤早期诊断个体化治疗方案的制定。
非侵袭性的分子影像探针通常由两部分组成，其一为靶向肿瘤分子标记物的特异性配体，其二为不同影像学模态所对应的信号分子，二者通过共价或非共价的化学键相连获得分子探针，从而实现探针在肿瘤部位的富集并对其进行实时显像。分子标记物一般为在肿瘤组织中特异性表达的生物分子，如酶、受体、核酸等，近年来许多标记物都被报道用于肿瘤的分子成像，包括叶酸受体、整合素受体、血管表皮生长因子受体等。常见的成像手段包括超声成像、X-射线计算机断层成像、光学成像、核磁共振成像、核医学成像等，每一种成像模态都有各自的优势并广泛应用于临床前及临床研究中。
正电子发射断层(PET)显像属于核医学成像，通过放射性标记特定物质，监测该物质在代谢中的聚集，来反映生命代谢活动的情况，达到诊断的目的。相较于磁共振分子显像、光学分子显像和单光子发射计算机断层(SPECT)显像，PET显像具备了以下显著优点：(1)动态获取动力学资料，显像迅速。(2)灵敏度高，可测定p-摩尔甚至 f-摩尔数量级的配体浓度。(3)选用的显像剂，多为正电子核素(如11C和18F)标记分子，不产生药理毒副作用。PET显像技术在靶向肿瘤表面特异性受体方面有着广泛的应用前景。PET显像技术的先决条件和核心技术是分子探针，因此设计和开发具有肿瘤组织高度特异性的分子成像探针，对肿瘤诊断至关重要。目前临床上所用的PET显像探针有氟脱氧葡萄糖(18F-FDG)、18F-胸腺嘧啶(18F-FLT)、16α-18F-17β-雌二醇(18F-FES) 等，仍然有非特异性针对肿瘤成像的问题存在。而一些以整合素、血管内皮生长因子、 HER受体蛋白等为标靶的新型探针，也因为靶标在正常的组织器官中有分布，造成在体内较高的本底信号，降低了对于肿瘤显像的特异性。因此以早期病变的肿瘤细胞中特异性产生的生物标志物为分子靶标，用于肿瘤的早期诊断得分子探针将有效促进分子影像学技术在肿瘤诊断及个体化治疗中的应用。
细胞色素P450(CYPs)是可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，它可以催化大量内源性底物(如类固醇激素)和外源性底物(包括药物和环境化合物) 的代谢，是肝脏内代谢的关键酶(Mankoff,D.A.；Link,J.M.；Linden,H.M.；Sundararajan L.；Krohn K.A.Tumor Receptor Imaging.J.Nucl.Med.,2008,49,149S-163S.)。大量研究已表明，其成员之一CYP1B1与癌症的发生有密不可分的联系。CYP1B1能够催化17-β雌激素羟基化、代谢激活多种前致癌物，如多环芳烃、杂环胺、芳香胺和硝基多环烃等，还能催化产生毒性更高的代谢中间物(Go,R.；Hwang,K.；Choi,K.Cytochrome P450 1 family andcancers.The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,2015,147,24-30)。研究发现，CYP1B1在肿瘤细胞中高表达，正常组织中表达水平远低于相应的肿瘤组织(Murray,G.I.；Taylor,M.C.；McFadyen,M.C.；McKay,J.A.；Greenlee,W.F.；Burke,M.D.；Melvin,W.T.Tumor-specific Expression of Cytochrome P450 CYP1B1.CancerRes., 1997,57,3026-3031.)。此外，当芳烃受体(AhR)与其对应的配体即前致癌物结合，还可以诱导CYP1B1的表达。CYP1B1酶同时具备了在肿瘤组织特异性表达和在早期癌变细胞中诱导表达两大特征，因此具备作为生物标志物用于肿瘤诊断的潜力。
α-萘黄酮衍生物是一类CYP1酶的抑制剂，但对CYP1酶的亚型不具有选择性(Shimada,T.；Yamazaki,H.；Foroozesh,M.；Hopkins,N.E.；Alworth,W.L.；Guengerich,F.P.Selectivity of polycyclic inhibitors for human cytochrome P450s 1A1,1A2,and 1B1. Chem.Res.Toxicol.,1998,11,1048-1056.)。前期研究中，我们以高选择性和强抑制性的萘环上6、7及10位甲氧基取代及B环卤素取代的α-萘黄酮衍生物(CN201210475989.2， CN 201410228733.0)为配体，设计合成了靶向CYP1B1的近红外荧光(NIR)探针，该探针可通过与CYP1B1酶特异性结合，在肿瘤组织中富集(J.Med.Chem.,2018,61, 10901-10909)，证实了以CYP1B1酶作为分子靶标进行肿瘤成像研究的可行性。然而，近红外探针仅能用于荧光介导的手术切除以及小动物体表或近体表的成像。为了促进靶向CYP1B1酶的分子探针的临床转化，迫切需要一种能与CYP1B1特异性结合并可用于 PET显像的探针，探索靶向CYP1B1的分子探针在肿瘤早期发现和诊断中的作用和临床转化价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：针对前期专利中靶向CYP1B1酶的近红外探针仅适用于临床前研究以及荧光介导手术，不适用临床诊断的不足，提供一种靶向CYP1B1酶的用于放射性核素18F标记的探针前体；以及其制备方法和应用。完成18F标记后，通过对胞内CYP1B1酶进行PET成像，在体显示其表达部位与水平，为肿瘤的早期诊断提供新方法，解决目前肿瘤治疗中诊断困难和诊断特异性不高的问题。
本发明的原理是：CYP1B1酶具有肿瘤标志物的特征，多种肿瘤组织中具有特异性高表达，同时在早期癌变细胞中能被前致癌物诱导表达，在肿瘤早期诊断中有应用潜力及价值。在前期研究中，我们以对CYP1B1具有最强抑制活性的化合物3’-氟-6,7,10-三甲基氧-α-萘黄酮为配体，在α-萘黄酮3位通过连接链引入近红外荧光基团，获得了可用肿瘤分子成像的探针。前期研究中我们选择了2-3个乙二醇片段(n＝1,2)作为连接链，设计合成了近红外荧光探针，证实了该探针的高选择性。此次，我们进一步选择了2-4 个乙二醇片段(n＝1,2,3)作为连接链，并分别在此基础上连接1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4- 二乙酸(NODA)分子制备本发明所述的分子探针前体。并且，NODA可与(Al18F)2 +螯合，具有优异的结合动力学，且在体内高度稳定，可用于放射性18F标记形成PET探针。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明提供了一种靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体，包括能与CYP1B1酶结合的亲和配体、可用于18F快速标记的螯合基团和用于连接所述亲和配体和信号螯合基团的连接链；所述连接链包含多个乙二醇片段；所述亲和配体为α-萘黄酮衍生物，用于18F快速标记的螯合基团为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸 (NODA)分子。
优选地，所述探针前体的结构式如式I所示：
Figure BDA0002160778640000031
其中，n＝1、2或3。
第二方面，本发明还提供了一种靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体在制备肿瘤诊断试剂中的用途。
第三方面，本发明还提供一种靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体的制备方法，所述方法包括以二甲亚砜为溶剂，在三乙胺存在的条件下，3'-氟-6,7,10- 三甲氧基-α-萘黄酮醇衍生物V
Figure BDA0002160778640000041
与NCS-MP-NODA反应，生成所述探针前体。
所述乙基醚衍生物V为3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物V-3，其制备包括如下步骤：
S1、在N,N-二甲基甲酰胺和5-50当量碳酸钾存在的条件下，1-5当量叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-碘代乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺III-3与6,7,10-三甲氧基-3'-氟-α-萘黄酮醇在10-25℃反应5-20小时生成氨基被叔丁氧酰基保护的3'-氟-6,7,10-三甲氧基 -α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物IV-3；
S2、在氮气保护下，在体积比为20:1-10:1的乙酸乙酯和浓盐酸存在的条件下，氨基被叔丁氧酰基保护的3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物IV-3脱保护，生成3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物V-3。
步骤S1中，所述叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-碘代乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺III-3 是通过以二氯甲烷为溶剂，在1-3当量三苯基膦和1-3当量咪唑存在的条件下，叔丁氧酰基叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺II和1-3当量碘单质在0-25℃反应而得。
所述叔丁氧酰基叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺II-3 是通过以二氯甲烷为溶剂，2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇和1-2当量二羰基二叔丁酯在0-25℃反应5-20小时而得。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明所选用的靶点CYP1B1酶为肿瘤的特异性标记物。CYP1B1酶是一个在早期癌变细胞中出现且特异性高表达的标记物，具备了作为生物靶标的潜力。本发明所述的分子探针前体在标记放射性18F后可作为PET显像的探针，具有临床转化的潜力，解决了近红外探针只能用于荧光介导的手术切除以及小动物体表或近体表的成像问题。本发明提供的可用于放射性18F标记的探针前体可选择性靶向CYP1B1酶。该前体可利用配体的高选择性与CYP1B1酶特异性结合，在肿瘤组织中富集，在PET 显像中使肿瘤部位可视化。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明制得的结构式I正电子发射断层(PET)探针前体的制备路线图；
图2为本发明制得的结构式(a)I-1，(b)I-2，(c)I-3与CYP1B1酶的对接图；
图3为本发明制得的结构式I-1在细胞水平与CYP1B1酶的竞争结合实验结果(**：P<0.05，***：P<0.001)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及一种具有结构式I的由6,7,10-三甲氧基-3'-氟-α-萘黄酮醇衍生的可用于放射性18F标记的探针前体I-3的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤一：将2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇(2mmol)溶于6mL二氯甲烷，在冰浴下逐滴加入溶于4mL二氯甲烷的二羰基二叔丁酯(2.3mmol)。滴加完毕后，撤去冰浴，反应液于室温下搅拌过夜。反应结束后，用10mL二氯甲烷稀释反应液，有机相先后用等体积水，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相后，减压浓缩可获得无色油状物叔丁氧酰基叔丁氧酰基 2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺II-3(n＝3)。收率：77％。1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ3.61(m,4H),3.50-3.60(m,8H),3.45(m,2H),3.21(s,2H),1.44(s, 9H).
步骤二：将II-3(1.5mmol)和碘单质(1.8mmol)加入10mL二氯甲烷中，并充分搅拌，随后在冰浴下滴加溶于10mL二氯甲烷中的三苯基膦(2mmol)和咪唑 (2mmol)的混合物。随着反应的进行，反应液中的碘逐渐溶解形成奶黄色悬浊液。滴加完毕后，撤去冰浴，室温搅拌过夜。反应结束后，在反应液中加入10mL乙酸乙酯和10mL10％硫代硫酸钠水溶液，用分液漏斗将有机相和水相分开，水相用10mL 乙酸乙酯萃取三次并将其与之前的有机相合并。合并后的有机相先后用饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠溶液洗涤，用无水硫酸钠干燥。干燥后的有机相减压浓缩，混合物经柱层析后获得无色油状物叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-碘代乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺III-3(n＝3)。收率：44％。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ5.03(br,1H),3.66(t,J＝6.8 Hz,2H),3.56-3.60(m,8H),3.47(t,J＝5.2Hz,2H),3.18-3.24(m,4H),1.34(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ155.77,78.78,71.76,70.39,70.04,40.21,28.32,2.88.
步骤三：在氮气保护下，将6,7,10-三甲氧基-3'-氟-α-萘黄酮醇(0.2mmol，合成方法参见已授权专利CN 201410228733.0)和III-3(0.4mmol)溶于10mL干燥的 N,N-二甲基甲酰胺中。在充分搅拌下，分批向反应液中加入碳酸钾固体(2mmol)。反应在室温下搅拌过夜，用饱和氯化铵溶液淬灭反应，分出有机相。水相用乙酸乙酯萃取后，合并有机相，并用无水硫酸钠干燥。有机相减压浓缩后获得的粗品，经过柱层析可得黄色油状的氨基被叔丁氧酰基保护的3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物IV-3(n＝3)。收率： 90％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.23-8.33(m,2H),7.40-7.49(m,2H),6.97-7.18(m,3 H),4.43-4.45(m,2H),4.00-4.11(m,6H),3.88(s,3H),3.80-3.82(m,2H),3.55-3.59(m,8 H),3.48(t,J＝4.8Hz,2H),3.25(m,2H),1.39(s,9H).13CNMR(100MHz,CDCl3):δ 173.87,162.60(d,J＝242.8Hz),155.93,154.61,151.41,151.14,148.08,140.92,133.68(d,J ＝8.4Hz),129.67(d,J＝8.2Hz),124.74(d,J＝2.9Hz),122.06,121.71,117.95,117.00(d,J ＝21.1Hz),115.63(d,J＝24.7Hz),113.33,108.86,98.44,71.12,70.48,70.41,70.15,58.04, 56.43,56.17,40.33,28.35.
步骤四：在氮气保护下，将IV-3(0.14mmol)溶于5mL乙酸乙酯，并加入0.5mL 乙酸乙酯：浓盐酸＝1:1的混合液。反应液在室温下搅拌5小时，脱保护产物以黄色粉末的形式从反应液中沉淀析出，过滤后可得3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物V-3(n＝3)。收率：72％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.21-8.30(m,2H),7.61-7.67(m,1H),7.38-7.48(m,1H), 7.22-7.26(m,3H),4.34-4.38(m,2H),4.00(s,3H),3.89(s,3H),3.80(s,3H),3.53-3.55(m, 4H),3.48-3.51(m,8H),2.91-2.95(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ173.79, 162.53(d,J＝242.6Hz),155.97,154.16,151.23,151.01,148.42,140.82,133.58(d,J＝8.7 Hz),129.64(d,J＝8.0Hz),124.67(d,J＝2.7Hz),121.89,121.57,117.76,116.97(d,J＝21.0 Hz),115.56(d,J＝24.4Hz),113.15,108.72,98.25,71.07,70.42,70.37,70.12,57.87,56.31, 56.04,40.05.ESI-HRMS:C30H34FNO9[M+H]+calcd.572.2296；found 572.2290.HPLC纯度:>95％(检测波长：254nm，参比波长：360nm)。
步骤五：将V-3(6.0μmol)溶于0.6mL干燥的二甲亚砜中，另将NCS-MP-NODA (6.0μmol)溶于0.6mL干燥二甲基亚砜，加至反应液中，再加入0.3mL三乙胺，室温下搅拌过夜。反应结束后，反应液直接用半制备HPLC分离纯化得到探针前体 I-1，使用YMC的C-18填料柱(250mm×10mm)，流动相为从95％水(含0.1％三氟乙酸)/5％乙腈到100％乙腈，40分钟内梯度洗脱，流速为2mL/min，Rf＝ 27.635min，得纯化后产物I-3，冻干后为橙黄色固体，Rf＝27.635min,收率：55.6％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ9.77(br,s,1H),8.36(d,J＝5.4Hz,1H),8.29(d,J＝8.4 Hz,1H),7.85(br,s,1H),7.68-7.71(m,1H),7.57(d,J＝7.2Hz,2H),7.43-7.45(m,3H), 7.31-7.34(m,3H),4.39-4.40(m,2H),4.29(s,2H),4.07(s,3H),3.95(s,3H),3.85(s,3H), 3.69-3.71(m,2H),3.62(m,2H),3.45-3.53(m,14H),3.31(m,2H),3.12-3.14(m,4H), 3.01-3.04(m,2H),2.79-2.80(m,2H),2.61-2.68(m,4H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6): δ181.02,173.24,173.13,162.50(d,J＝205.5Hz),154.55,152.54,151.28,151.07,147.81, 140.91,133.65(d,J＝7.2Hz),131.09(d,J＝6.0Hz),130.87,125.03,122.96,121.57,121.46, 117.87(d,J＝17.5Hz),117.61,115.43(d,J＝21.0Hz),113.93,110.61,98.08,71.27,70.20, 70.16,70.13,70.06,70.00,68.91,57.94,57.86,56.90,56.64,55.09,50.71,49.52,46.97, 43.96.ESI-HRMS:C48H57FN5O13S[M-H]-calcd.962.3663；found 962.3661.HPLC纯度:>95％(检测波长：254nm，参比波长：360nm)。
实施例2
本实施例涉及一种具有结构式I的由6,7,10-三甲氧基-3'-氟-α-萘黄酮醇衍生的可用于放射性18F标记的探针前体I-1的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤一：同实施例1步骤五，以V-1(合成方法见已发表论文J.Med.Chem.,2018,61,10901-10909)代替V-3，Rf＝27.525min，得橙黄色固体I-1(n＝1)。收率，52.4％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ9.80(s,1H),8.27-8.35(m,2H),7.67-7.70(m,1H),7.58 (d,J＝6.0Hz,2H),7.41-7.44(m,3H),7.30-7.32(m,3H),4.41(s,2H),4.28(s,2H),4.06 (s,3H),3.94(s,3H),3.84(s,3H),3.75(s,2H),3.64(s,2H),3.55-3.57(m,2H),3.42-3.47 (m,4H),3.30(m,2H),3.11(m,4H),3.00-3.03(m,2H),2.79(m,2H),2.61-2.68(m,4 H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ181.09,173.26,173.12,162.52(d,J＝207.0Hz), 154.57,152.61,151.26,151.05,147.83,140.92,133.60(d,J＝7.5Hz),131.09(d,J＝6.0Hz), 130.87,125.00,123.00,121.57,121.44,117.92(d,J＝17.8Hz),117.58,117.47,115.80, 115.40(d,J＝21.3Hz),113.94,110.59,98.03,71.30,69.85,68.85,57.94,57.83,56.87,56.61,55.09,50.70,49.52,46.98,43.89.ESI-HRMS:C44H51FN5O11S[M+H]+calcd.876.3284；found876.3290.HPLC纯度:>95％(检测波长：254nm，参比波长：360nm)。
实施例3
本实施例涉及一种具有结构式I的由6,7,10-三甲氧基-3'-氟-α-萘黄酮醇衍生的可用于放射性18F标记的探针前体I-2的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
步骤一：
同实施例1步骤五，以V-2(合成方法见已发表论文J.Med.Chem.,2018,61, 10901-10909)代替V-3，Rf＝27.865min，得橙黄色固体I-2(n＝2),收率：72％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ9.77(s,1H),8.28-8.37(m,2H),7.67-7.71(m,1H),7.57(d, J＝6.6Hz,2H),7.43-7.49(m,3H),7.31-7.33(m,3H),4.40(m,2H),4.29(s,2H),4.07(s, 3H),3.95(s,3H),3.85(s,3H),3.72(m,2H),3.62(m,2H),3.53-3.54(m,6H),3.42-3.48 (m,4H),3.30(m,2H),3.12(m,4H),3.01-3.03(m,2H),2.79(m,2H),2.61-2.68(m,4H). 13C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ181.03,173.25,173.14,162.52(d,J＝207.0Hz),154.57, 152.57,151.28,151.08,147.82,140.90,133.62(d,J＝7.5Hz),131.09(d,J＝6.8Hz),130.87, 125.03,122.96,121.58,121.47,117.89(d,J＝17.9Hz),117.62,115.44(d,J＝21.0Hz), 113.98,110.63,98.08,71.29,70.08,70.06,70.00,68.97,57.86,56.92,56.64,55.09,50.71, 49.53,46.97,43.96.ESI-HRMS:C46H55FN5O12S[M+H]+calcd.920.3546；found 920.3552. HPLC纯度:>95％(检测波长：254nm，参比波长：360nm)。
实施例4
实施例1、2及3中得到探针前体I-1、I-2和I-3对CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1 酶的抑制活性测定。
本实验用7-乙氧基-3H-吩噁嗪3-酮脱乙氧基(EROD)实验测定其对CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1酶的抑制活性和选择性(Yamaori et al,Biochem.Pharmacol.2010, 79:1691-1698.)反应体系(200μL)包含CYP1A1(100fmol)，CYP1A2(100fmol) 或CYP1B1(100fmol)，150nM的7-乙氧基-3H-吩噁嗪-3-酮，不同浓度的待测化合物，NADPH再生系统(0.54mMNADPH，3.3mM氯化镁溶液)。每个实验组或者对照组设3个复孔作为平行实验，同时设置零抑制和全抑制对照组。反应缓冲液为含1％BSA溶液的50mM Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液。孔中加入50微升待测溶液、 75微升酶与7-乙氧基-3H-吩噁嗪-3-酮的混合溶液。反应体系于37℃预热5min后，加入NADPH再生系统启动反应，含CYP1A1酶的反应体系于37℃孵育15min，含 CYP1A2酶体系温孵55min，含CYP1B1酶体系温孵35min。待反应结束后加入100 微升预冷甲醇终止反应，10min内采用多功能酶标仪检测荧光值，激发波长和发射波长分别为545nm和590nm。然后运用统计软件Prism计算IC50数值，最终的IC50测定结果采用三次重复实验的平均值，以α-萘黄酮(ANF)为阳性对照。实验结果如表1所示：
表1、I-1、I-2和I-3对CYP1A1，CYP1A2，CYP1B1酶的抑制活性和选择性
Figure BDA0002160778640000091
由表1的结果可知，与ANF组相比，化合物I对CYP1B1酶的抑制活性有一定程度的降低，但仍保持在纳摩尔量级，符合作为探针的亲和力要求。与ANF相比较，在化合物I对三种酶的抑制活性中下降幅度最大的是对CYP1A2酶的抑制活性，为 2000-10000倍，而对CYP1B1和CYP1A2的抑制活性的下降倍数在数十倍左右。上述抑制活性的变化使得化合物I对于CYP1B1与CYP1A2的选择性较ANF有了大幅的上升，而对CYP1A1的选择性与ANF基本一致。由于CYP1A1也主要在肿瘤中有所表达，只是在肿瘤中表达的广泛性不如CYP1B1，因此化合物I对于CYP1B1与CYP1A1 的选择性并不影响其作为探针前体在肿瘤诊断中的应用潜力。而CYP1A2酶大量存在于肝脏中且无肿瘤特异性，探针前体具有显著的CYP1B1和CYP1A2间选择性正是我们所期待看到的结果，预示着我们获得的探针前体在进行放射性18F标记后具有肿瘤特异性成像的能力。综上所述，在α-萘黄酮衍生物的3位引入羟基并用连接链与螯合基团NODA连接后获得的化合物I对CYP1B1保持了纳摩尔级别的抑制活性，较 ANF具备了更高的选择性，连接链的长短对选择性有一定影响，在合成的化合物I中， I-2有更显著的对于CYP1B1与CYP1A2的选择性。
实施例5
实施例1、2及3中得到的探针前体I-1、I-2和I-3与CYP1B1酶对接实验的结果。
对接实验中使了人CYP1B1酶与ANF复合物的单晶结构(PDB号：3PM0)。 ANF作为I-1、I-2和I-3的模板用于手动对接，乙二醇连接链和NODA片段均在 ANF的模板上进行构建。构建好的抑制剂和蛋白复合物用Macromodel 11.1进行优化。距离配体
Figure BDA0002160778640000092
以外的氨基酸残基用OPLS3力场限制后进行优化。I-1、I-2和I-3 与CYP1B1酶的对接结果如图2所示，小分子与蛋白之间有多种相互作用。在三个化合物的对接结果中均能观察到聚乙二醇连接链与Phe134，Phe123和Ser119间的疏水作用，NODA通过聚乙二醇链从B-C loop区域旁穿过，成功延伸到酶的表面。我们在前期研究中已发现由于CYP1酶血红素中的铁原子与氧的结合对于酶的催化作用起着至关重要的作用，配体中3’位的氟原子指向铁原子会干扰酶血红素中的铁原子与氧的结合，影响酶的功能，因此F-Fe之间的距离会显著影响其对CYP1B1 酶的抑制活性。I-1、I-2和I-3的对接结果中F-Fe距离分别为
Figure BDA0002160778640000101
Figure BDA0002160778640000102
和
Figure BDA0002160778640000103
Figure BDA0002160778640000104
与它们的酶抑制活性趋势是一致的，F-Fe距离最近的I-1具有最好的CYP1B1 酶抑制活性。对接实验的结果从侧面说明了连接链及NODA引入后，化合物I扔能保持与CYP1B1酶结合的能力。
实施例6
本实施例在细胞水平测定了探针可用于18F标记的探针前体I-1与CYP1B1酶在近红外探针的存在下的竞争结合能力。
为了评价可用于18F标记的探针前体通过与CYP1B1酶结合在肿瘤细胞中富集的能力，我们在细胞水平进行了I-1与靶向CYP1B1酶的近红外荧光探针在肿瘤细胞中的竞争结合实验。将CYP1B1酶高表达的结肠癌细胞HCT-15以合适的密度种于六孔板中，在37℃，5％CO2中贴壁过夜之后吸除培养基，每孔分别加入500nM我们在前期工作中获得的能与CYP1B1特异性结合的近红外荧光探针(J.Med.Chem.,2018,61, 10901-10909)，以及不同浓度的I-1(2μM，5μM，10μM，20μM)。另外设置空白对照组(不加荧光探针)和阳性对照组(只加荧光探针)。在37℃，5％CO2中孵育1h后吸除含有分子探针的培养基并用PBS缓冲液洗两遍。细胞用胰酶消化并悬浮于1mL培养基中，转移至离心管中进行离心(1000r/min，5min)，离心完毕后弃去上清液，用0℃的PBS缓冲液重悬再进行离心，重复两遍最终悬浮于0℃PBS溶液中并转移至流式管，将样品至于冰浴上待测。用流式细胞仪测定Cy5.5的吸收波长段的细胞荧光强度，用 student T-test方法分别比较在不同浓度的I-1存在下细胞荧光强度与不存在I-1(阳性对照组)的情况下细胞的荧光强度。实验结果如附图3所示，当使用5μM，10μM，20μM 的I-1时，细胞荧光强度与阳性对照组均有显著差异，且差异随I-1浓度的增大而增大。我们在前期已经通过体内外成像实验证实了我们所使用的近红外探针与CYP1B1酶特异性结合的能力，而随着I-1浓度的增大，细胞的荧光强度逐渐减弱，说明I-1具有与近红外荧光探针竞争CYP1B1酶结合的能力，从侧面说明了本发明中获得的探针前体I 在细胞水平上具有与肿瘤中特异性高表达的CYP1B1酶特异性结合的能力，在18F标记后即可用于肿瘤的PET成像。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (6)

1.一种靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体，其特征在于，包括能与CYP1B1酶结合的亲和配体、可用于18F快速标记的螯合基团，以及用于连接所述亲和配体和螯合基团的连接链；所述连接链包含多个乙二醇片段；所述亲和配体为α-萘黄酮衍生物，用于18F快速标记的螯合基团为1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二乙酸分子；所述探针前体的结构式如式I所示：
Figure FDA0003343422050000011
其中，n＝1、2或3。
2.一种根据权利要求1所述的靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体在制备肿瘤诊断试剂中的用途。
3.一种根据权利要求1所述的靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以二甲亚砜为溶剂，在三乙胺存在的条件下，3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇衍生物V
Figure FDA0003343422050000012
与NCS-MP-NODA反应，生成所述探针前体。
4.根据权利要求3所述的靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体的制备方法，其特征在于，所述乙基醚衍生物V为3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物V-3，其制备包括如下步骤：
S1、在N,N-二甲基甲酰胺和5-50当量碳酸钾存在的条件下，1-5当量叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-碘代乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺III-3与6,7,10-三甲氧基-3'-氟-α-萘黄酮醇在10-25℃反应5-20小时生成氨基被叔丁氧酰基保护的3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物IV-3；
S2、在氮气保护下，在体积比为20:1-10:1的乙酸乙酯和浓盐酸存在的条件下，氨基被叔丁氧酰基保护的3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物IV-3脱保护，生成3'-氟-6,7,10-三甲氧基-α-萘黄酮醇羟基-2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基醚衍生物V-3。
5.根据权利要求4所述的靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-碘代乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺III-3是通过以二氯甲烷为溶剂，在1-3当量三苯基膦和1-3当量咪唑存在的条件下，叔丁氧酰基叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺II-3和1-3当量碘单质在0-25℃反应而得。
6.根据权利要求5所述的靶向CYP1B1酶的可用于放射性18F标记的探针前体的制备方法，其特征在于，所述叔丁氧酰基叔丁氧酰基2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基胺II-3是通过以二氯甲烷为溶剂，2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙醇和1-2当量二羰基二叔丁酯在0-25℃反应5-20小时而得。
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