CN113388003B - 一种天冬氨酸蛋白水解酶识别还原型分子探针及应用 - Google Patents

一种天冬氨酸蛋白水解酶识别还原型分子探针及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种天冬氨酸蛋白水解酶识别还原型分子探针及应用，属于化学技术领域。本发明提供了一种分子探针，此分子探针具有以下优势：第一，能够在还原环境以及caspase‑3存在条件下产生二聚体并自组装形成纳米颗粒；第二，能够被凋亡的癌细胞特异性摄取；第三，能够对小鼠体内凋亡的肿瘤成像，并且，凋亡的肿瘤可以在成像后的10min内可以清晰地观察到，并以高的肿瘤背景对比方式持续到1h，因此，此分子探针在实现检测凋亡水平异常或监测各种疾病状态下的治疗诱导的凋亡水平的非侵入性成像策略中具有极高的应用前景。

Description

一种天冬氨酸蛋白水解酶识别还原型分子探针及应用
技术领域
本发明涉及一种天冬氨酸蛋白水解酶识别还原型分子探针及应用，属于化学技术领域。
背景技术
癌症是严重威胁人类健康的重要疾病，在人口老龄化、紧张的生活节奏、不良生活习惯以及大气污染等因素的共同作用下，癌症的发病率越来越高，发病年龄越来越年轻化。如何实现癌症的早期精准诊断与个性化治疗已经成为目前亟待解决的问题。
大多数抗肿瘤治疗是通过诱导细胞凋亡来发挥它们的抗肿瘤效应。细胞凋亡是细胞生命的基本特征之一。对活体内细胞凋亡进行分子显像对于疾病治疗效果评估、治疗进程的监测、以及某些疾病的早期诊断或研究新疗法具有非常重要意义。细胞在实现凋亡的途径中最后都导致天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)的活化，进而激活内切核酸酶，使DNA链断裂，最终导致细胞结构的全面解体。因此，激活的天冬氨酸蛋白水解酶可作为检测细胞凋亡的一个重要靶点。通过监测激活的Caspase-3水平变化，可以间接反应患者对治疗的反应，从而实现早期诊断和疗效评价。
正电子发射断层扫描(PET)被认为是一种先进的无创成像技术，具有高灵敏度和深层组织穿透性，可用于活体受试者的分子靶标验证和临床疾病诊断。因此，开发一种能够检测凋亡水平异常或监测各种疾病状态下的治疗诱导的凋亡水平的非侵入性成像策略将具有重大意义。靶向细胞凋亡的理想PET成像探针可以同时无创地跟踪多个病变并且可以用于监测治疗或疾病进展，因此，开发靶向细胞凋亡的理想PET成像探针对于实现检测凋亡水平异常或监测各种疾病状态下的治疗诱导的凋亡水平的非侵入性成像策略必不可少。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种分子探针，所述分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000021
其中，R1为标记基团。
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针为天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针；所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000022
所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000031
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针为天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针；所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000032
所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000033
在本发明的一种实施方式中，所述分子探针为天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针；所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000034
所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000041
本发明提供了一种制备上述分子探针的方法，所述方法为：将化合物A5溶解于超干THF(四氢呋喃)中，得到溶解液；在溶解液中加入2-(乙基二硫烷基)吡啶和TIPS(三异丙基硅烷)后进行反应，得到反应液；将反应液浓缩、离心、干燥、纯化，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6；对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6进行放射性标记，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针；
所述化合物A5具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000042
在本发明的一种实施方式中，所述化合物A5的制备方法为：将化合物A4溶解于CH2Cl2中，得到溶解液；在溶解液中加入TFA(三氟乙酸)和TIPS(三异丙基硅烷)后进行反应，得到反应液；将反应液进行浓缩、离心，得到化合物A5；
所述化合物A4具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000043
在本发明的一种实施方式中，所述化合物A4的制备方法为：将化合物A1、化合物A3及HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)溶解于超干DMF(四氢呋喃)中，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)后进行反应，得到反应液；将反应液进行浓缩，得到化合物A4；
所述化合物A1具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000051
所述化合物A3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000052
在本发明的一种实施方式中，所述化合物A3的制备方法为：将化合物A2溶解于CH2Cl2中，得到溶解液；在溶解液中和TFA(三氟乙酸)混合后进行反应，得到反应液；将反应液离心、干燥，得到化合物A3；
所述化合物A2具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000053
在本发明的一种实施方式中，所述化合物A2的制备方法为：将N-Boc-D-炔丙基甘氨酸溶解于超干THF(四氢呋喃)中，得到混合液；在混合液中添加氯甲酸异丁酯和氮甲基吗啉后，在氮气的保护下进行反应，得到反应液A；将CBT(2-氰基-6-氨基苯并噻唑)溶于无水THF中，得到溶解液；将溶解液和反应液A混合后中进行反应，得到反应液B；对反应液B进行浓缩、萃取、纯化，得到化合物A2。
本发明还提供了一种制备上述分子探针的方法，其特征在于，所述方法为：将化合物B5和NOTA-NHS溶解于DMF(四氢呋喃)中，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)后进行反应，得到反应液；对反应液进行纯化，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2；对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2进行放射性标记，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针；
所述化合物B5具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000061
在本发明的一种实施方式中，所述化合物B5的制备方法为：将化合物B4溶解于CH2Cl2中，得到溶解液；在溶解液中加入TFA(三氟乙酸)和TIPS(三异丙基硅烷)后进行反应，得到反应液；将反应液浓缩、离心，得到化合物B5；
所述化合物B4具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000062
在本发明的一种实施方式中，所述化合物B4的制备方法为：将化合物B3溶解于CH2Cl2中，得到溶解液；在溶解液中加入TFA(三氟乙酸)和TIPS(三异丙基硅烷)后进行反应，得到反应液；将反应液浓缩、离心，得到化合物B4；
所述化合物B3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000063
在本发明的一种实施方式中，所述化合物B3的制备方法为：将化合物A1、化合物B2及HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)溶解于超干DMF(四氢呋喃)中，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)后进行反应，得到反应液；将反应液浓缩，得到化合物B3；
所述化合物A1具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000071
所述化合物B2具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000072
在本发明的一种实施方式中，所述化合物B2的制备方法为：将化合物B1和哌啶水溶液混合后进行反应，得到反应液；将反应液进行萃取、纯化，得到化合物B2；
所述化合物B1具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000073
在本发明的一种实施方式中，所述化合物B1的制备方法为：将赖氨酸溶解于超干THF(四氢呋喃)中，得到混合液；在混合液中添加氯甲酸异丁酯和氮甲基吗啉后进行反应，得到反应液A；将CBT(2-氰基-6-氨基苯并噻唑)溶于无水THF中，得到溶解液；将溶解液和反应液A混合后进行反应，得到反应液B；对反应液B进行浓缩、萃取、纯化，得到化合物B1。
本发明还提供了上述分子探针在靶标物显像中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为天冬氨酸蛋白水解酶。
本发明还提供了一种靶向靶标物的显像剂，所述显像剂含有上述分子探针。
在本发明的一种实施方式中，所述靶标物为天冬氨酸蛋白水解酶。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种分子探针，此分子探针具有以下优势：
第一，能够在还原环境以及caspase-3存在条件下产生二聚体并自组装形成纳米颗粒，具体的来说，此探针分子的二硫键通过肿瘤环境中的GSH剪切，分子中裸露的氰基和氨基硫醇发生点击缩合反应，发生分子内环化，分子内环化反应，不受配体浓度影响，形成的环化产物可减少细胞内分子泵出，增强探针效果；此探针分子通过苯环以及甘氨酸来延长自组装结构链，发生分子内环化反应，成环体系之间通过π-π堆积形成纳米颗粒，细胞内纳米颗粒的形成，增强了探针分子的滞留时间，从而增强探针的显像效果；此探针分子可结合多种标记核素和标记方法，深入探究不同核素(18F,68Ga)对探针药物性质和显像效果的影响，提高标记比活度和增强探针的稳定性，以达到在合适的时间内高质量可视化肿瘤凋亡水平；
第二，能够被凋亡的癌细胞特异性摄取；
第三，能够对小鼠体内凋亡的肿瘤成像，并且，凋亡的肿瘤可以在成像后的10min内可以清晰地观察到，并以高的肿瘤背景对比方式持续到1h，
因此，此分子探针在实现检测凋亡水平异常或监测各种疾病状态下的治疗诱导的凋亡水平的非侵入性成像策略中具有极高的应用前景。
附图说明
图1：化合物A1的合成路线。
图2：化合物A1的ESI-MS分析结果。
图3：化合物A1的HPLC谱图。
图4：化合物A3的合成路线。
图5：化合物A2的ESI-MS分析结果。
图6：化合物A2的HPLC谱图。
图7：化合物A3的ESI-MS分析结果。
图8：化合物A3的HPLC谱图。
图9：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6的合成路线。
图10：化合物A4的ESI-MS分析结果。
图11：化合物A4的HPLC谱图。
图12：化合物A5的ESI-MS分析结果。
图13：化合物A5的HPLC谱图。
图14：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6的ESI-MS分析结果。
图15：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6的HPLC谱图。
图16：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的合成路线。
图17：化合物2的HPLC谱图。
图18：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的HPLC谱图。
图19：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图20：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在小鼠血清中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图21：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在小鼠体内血液循环30min后的HPLC谱图。
图22：化合物A6经TCEP还原和Caspase-3酶剪切前后的HPLC谱图。
图23：化合物A6经canspase-3酶剪切前后的酶动力学参数分析。
图24：化合物A6经TCEP还原和Caspase-3酶剪切后反应液的DLS实验分析结果。
图25：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在凋亡的A549细胞中的细胞摄取值。
图26：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在凋亡的H460细胞中的细胞摄取值。
图27：凋亡与正常A549异种移植瘤小鼠在通过尾静脉注射天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1后的PET显像图。
图28：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在阿霉素诱导肿瘤凋亡模型中肿瘤与肌肉的定量分析结果。
图29：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在阿霉素诱导肿瘤凋亡模型中肿瘤与肌肉摄取值之比。
图30：化合物B2的合成路线。
图31：化合物B1的ESI-MS分析结果。
图32：化合物B1的HPLC谱图。
图33：化合物B2的ESI-MS分析结果。
图34：化合物B2的HPLC谱图。
图35：化合物B3的合成路线。
图36：化合物B4的合成路线。
图37：化合物B5的合成路线。
图38：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2的合成路线。
图39：化合物B3的ESI-MS分析结果。
图40：化合物B3的HPLC谱图。
图41：化合物B4的ESI-MS分析结果。
图42：化合物B4的HPLC谱图。
图43：化合物B5的ESI-MS分析结果。
图44：化合物B5的HPLC谱图。
图45：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2的HPLC谱图。
图46：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的合成路线。
图47：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的HPLC谱图。
图48：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图49：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2在小鼠血清中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图50：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2在凋亡的H460细胞中的细胞摄取值。
图51：凋亡与正常A375异种移植瘤小鼠在通过尾静脉注射天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2后的PET显像图。
图52：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2在阿霉素诱导肿瘤凋亡模型中肿瘤与肌肉的定量分析结果。
图53：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2在阿霉素诱导肿瘤凋亡模型中肿瘤与肌肉摄取值之比。
图54：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3的HPLC谱图。
图55：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3在PBS缓冲液中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图56：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3在小鼠血清中孵育不同时间后的HPLC谱图。
图57：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3在凋亡的H1299细胞中的细胞摄取值。
图58：凋亡与正常A549异种移植瘤小鼠在通过尾静脉注射天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3后的PET显像图。
图59：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3在阿霉素诱导肿瘤凋亡模型中肿瘤与肌肉的定量分析结果。
图60：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3在正常肿瘤模型中肿瘤与肌肉的定量分析结果。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1：一种天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1
本实施例提供了一种天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1，所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000121
实施例2：一种制备天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的方法
本实施例提供了实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的制备方法，所述方法利用固相多肽合成法，具体步骤如下：
步骤一：用二氯甲烷冲洗砂芯漏斗两次，抽干，在抽干的砂芯漏斗中加入2-氯三苯甲基氯树脂(负载量为1.106mmol/g，763mg)后，继续加入10mL的二氯甲烷以浸泡溶胀2-氯三苯甲基氯树脂，浸泡溶胀10min后，抽干，得到经预处理的砂芯漏斗；
步骤二：向步骤一获得的砂芯漏斗中加入FMOC-(4-氨甲基)苯甲酸(373.4mg，1mmol)，用10mL超干DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(329.92L，2mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在25℃下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mL DMF/CH3OH/DIPEA的混合溶液(DMF/CH3OH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作一次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)洗涤两次，振荡后抽滤；向砂芯漏斗中加入10mL含20vt％哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼5次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
步骤三：向步骤二获得的砂芯漏斗中加入FMOC-(4-氨甲基)苯甲酸(373.4mg，1mmol)和HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(379mg，1mmol)，用10mL超干DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(329.92μL，2mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在25℃下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mLDMF/CH3OH/DIPEA的混合溶液(DMF/CH3OH/DIPEA＝17：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作一次，以除去未反应的氨基酸；再用10mL DMF(HPLC型)洗涤两次，振荡2min后抽滤；向砂芯漏斗中加入10mL含20vt％哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mL DMF(HPLC型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；
步骤四：在步骤三的基础上，将FMOC-(4-氨甲基)苯甲酸依次替换为N-(9-芴甲氧羰基)甘氨酸、N-(9-芴甲氧羰基)-S-三苯甲基-L-半胱氨酸、Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯、Fmoc-L-缬氨酸、Fmoc-O-叔丁基-L-谷氨酸、Fmoc-L-天冬氨酸beta-叔丁酯，重复步骤三的操作，即可得到所需多肽链；
步骤五：向步骤四获得的砂芯漏斗中加入超干DMF(8mL)、乙酸酐(1mL，10mmol)和DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(1mL，6.1mmol)，得到混合液；将混合液在25℃下振荡5h在室温下振荡5h，振荡完成后，抽干溶剂；先用7mL DMF(HPLC型)清洗滤饼两次，随后使用7mL二氯甲烷清洗滤饼两次；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，取少量样品进行Kaiser测试，颜色为淡黄色，说明裸露的氨基已与乙酸酐缩合；
步骤六：向步骤五获得的砂芯漏斗中加入10mL含1vt％TFA(三氟乙酸)的CH2Cl2溶液，得到混合液；将混合液在25℃下振荡10min，振荡完成后，滤出带有化合物A1的滤液，重复该操作，直至2-氯三苯甲基氯树脂出现酒红色且不褪色时停止；将收集到的滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液；取沉淀干燥，得到粗产物；使用半制备型HPLC对粗产物进行纯化，得到白色粉末状的化合物A1(268.2mg，产率87.6％)(化合物A1的合成路线见图1)；
步骤七：将N-Boc-D-炔丙基甘氨酸(0.9mmol，192mg)溶解于7mL超干THF(四氢呋喃)中，得到混合液；在混合液中添加氯甲酸异丁酯(0.75mmol，97μL)和氮甲基吗啉(1.5mmol，165μL)后，在氮气的保护下，于冰浴下反应2h，得到反应液A；将CBT(2-氰基-6-氨基苯并噻唑)(0.5mmol，87.605mg)溶于3mL无水THF中，得到溶解液；将溶解液使用注射器加入反应液A中后，先于避光、冰浴的条件下反应30min，然后于25℃下反应16h，得到反应液B；将盐酸(2mL，1mol/L)使用注射器加入反应液B中淬灭反应后，使用旋转蒸发仪除去反应液B中的有机溶剂，得到粗产物A；通过乙酸乙酯-水体系萃取粗产物A中化合物A2后，使用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，中和多余的盐酸，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后使用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得到到粗产物B；将粗产物B用1mL二氯甲烷溶解后使用硅胶柱对粗产物B进行层析(正己烷：乙酸乙酯＝1：1，v/v)纯化，得到黄色油状的化合物A2(184mg，产率99％，纯度>99％)；
步骤八：将化合物A2(184mg)溶解于2mL CH2Cl2中，得到溶解液；在溶解液中滴加2mL TFA(三氟乙酸)后，于25℃下搅拌30min，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液；取沉淀干燥，得到化合物A3(200mg，产率>99％，纯度97％)(化合物A3的合成路线见图4)；
步骤九：将化合物A1(0.1401mmol，190mg)、化合物A3(0.1544mmol，41.6mg)及HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(0.1611mmol，62mg)溶解于超干DMF(四氢呋喃)中，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(73μL，0.4203mmol)调节溶解液的pH至8后，在氮气的保护下，于25℃下搅拌4h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色油状化合物A4(248mg，产率>99％，纯度92％)；
步骤十：将化合物A4溶解于3mL CH2Cl2中，得到溶解液；在溶解液中依次加入3mLTFA(三氟乙酸)和180μL TIPS(三异丙基硅烷)后，于25℃下搅拌2h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到化合物A5(152mg，产率83％，纯度93％)；
步骤十一：将化合物A5(0.1277mmol，152mg)溶解于4mL超干THF(四氢呋喃)中，得到溶解液；在溶解液中加入2-(乙基二硫烷基)吡啶(0.1531mmol，22.2μL)和TIPS(100μL)后，在氮气的保护下，于25℃下反应2h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液；取沉淀干燥，得到粗产物；使用半制备型HPLC对粗产物进行纯化，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6(75mg，产率46％)(天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6的合成路线见图9)；
步骤十二：在PET示踪回旋加速器中辐照富集的[18O]H2O，通过18O(p,n)18F核反应产生带有放射活性的18F氟化物(9.03GBq)，并用季甲基铵阴离子交换柱(QMA，Waters lightSep-Pak)将其捕获，该柱提前用NaHCO3溶液(10mL，0.5mol/L)和H2O(10mL)活化；然后用Kryptofix K222(15mg溶于1mL超干乙腈)和K2CO3(3mg溶于0.5mL水)的混合液将18F离子洗脱至反应管中；共沸干燥后，将化合物1(3mg溶于1mL超干乙腈和500μL超干DMSO的混合溶剂)加入[18F]F-/K222/K2CO3复合物中，反应在110℃下进行25min，然后冷却至25℃；随后将得到的粗产物(5.4GBq)用半制备型HPLC进行纯化(0～3min 10％B，v/v；3～30min 10～30％B，v/v；30～40min 30～90％B，v/v；5.0mL/min；B相为乙腈流动相)，得到粗产物馏分(3.5GBq)；将粗产物馏分转移至手动模块中进行固相萃取，提前用无水乙醇(10mL)和水(10mL)活化C18柱，然后用45mL水稀释后萃取；随后用乙醇将捕获在C18柱上的化合物2(1.85GBq)洗脱至西林瓶，转移至自动模块反应管，在氮气流下100℃干燥后冷却至25℃用于Click反应(化合物2的保留时间为25min，18F离子保留时间为3.3min)(化合物2的合成路线见图16)；
步骤十三：向步骤十二获得的反应管中加入含有天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6(3.1mg，2.5μmol)、CuSO4·5H2O(38.5μL，1.2μmol)、LAASS(抗坏血酸钠)(61.1μL，2.5μmol)和THPTA(三(3-羟丙基三唑甲基)胺)(67μL，1.2μmol)的DMF/H2O＝5：1的混合溶液(DMF：H2O＝5：1，v/v)，得到混合液；将混合液在25℃、氮气流下反应50min，得到反应液；反应结束后，用分析型HPLC检测反应液(0～3min 20％B，v/v；3～35min 20～90％B，v/v；1.0mL/min；B相为乙腈流动相)；确定产物生成后，使用半制备型HPLC对反应液进行纯化(0～3min 20％B，v/v；3～35min 20～90％B；35～40min 90～20％B，v/v；3.0mL/min；B相为乙腈流动相)，得到产物馏分；将产物馏分用20mL水稀释后通过C18柱进行固相萃取，最后用500μL无水乙醇将天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1洗脱至西林瓶，用生理盐水稀释用于后续生物实验(天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的保留时间为21.5min)(天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的合成路线见图16)。
其中，半制备型HPLC的纯化条件见表1；
半制备型HPLC纯化的过程为：选择表1的流动相梯队，将溶解在DMF中的样品通过C18反向色谱柱纯化。
采用电喷雾电离源对化合物A1进行ESI-MS分析，分析结果见图2。
采用Waters1525对化合物A1进行HPLC检测，检测结果见图3。
采用电喷雾电离源对化合物A2进行ESI-MS分析，分析结果见图5。
采用Waters1525对化合物A2进行HPLC检测，检测结果见图6。
采用电喷雾电离源对化合物A3进行ESI-MS分析，分析结果见图7。
采用Waters1525对化合物A3进行HPLC检测，检测结果见图8。
采用电喷雾电离源对化合物A4进行ESI-MS分析，分析结果见图10。
采用Waters1525对化合物A4进行HPLC检测，检测结果见图11。
采用电喷雾电离源对化合物A5进行ESI-MS分析，分析结果见图12。
采用Waters1525对化合物A5进行HPLC检测，检测结果见图13。
采用电喷雾电离源对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6进行ESI-MS分析，分析结果见图14。
采用Waters1525对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6进行HPLC检测，检测结果见图15。
采用Waters1525对化合物2进行HPLC检测，检测结果见图17。
采用Waters1525对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1进行HPLC检测，检测结果见图18。
表1步骤六中半制备型HPLC的纯化条件
Time/min Flow(mL/min) <![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> <![CDATA[CH<sub>3</sub>CN]]>
0 3.00 60.0 40.0
3 3.00 60.0 40.0
28 3.00 35.0 65.0
35 3.00 10.0 90.0
40 3.00 60.0 40.0
0 3.00 60.0 40.0
表2步骤中半制备型HPLC的纯化条件
Time/min Flow(mL/min) <![CDATA[H<sub>2</sub>O]]> <![CDATA[CH<sub>3</sub>CN]]>
0 3.00 80.0 20.0
3 3.00 80.0 20.0
15 3.00 57.0 43.0
25 3.00 54.0 46.0
35 3.00 10.0 90.0
40 3.00 80.0 20.0
实验例1：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的体外稳定性实验，具体过程如下：
实验一：将实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1(600μCi)与PBS缓冲液以1：9的体积比混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、1、2或4h；孵育结束后，取孵育液进行HPLC分析。分析结果见图19。
实验二：将实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1(600μCi)与小鼠血清(取自购自南京森贝伽生物科技有限公司)以1：9的体积比混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、0.5、1或2h；孵育结束后，取20μL孵育液，加入等体积乙腈，在12000g条件下高速离心3min使血清与蛋白分离，吸取上清液进行HPLC分析。分析结果见图20。
由图19可知，将实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1分别在PBS缓冲液中孵育不同时间后，HPLC光谱中未出现其他峰，表明该探针在PBS缓冲液中具有很好的稳定性。
由图20可知，实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在血清中也表现出令人满意的稳定性，孵育2h后，实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在血清中的纯度超过86％。
上述实验结果表明实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1具有良好的体外稳定性。
实验例2：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的体内稳定性实验
本实验例提供了实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的体内稳定性实验，具体过程如下：
将11.1MBq的实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1注射到正常白鼠(购自常州卡文斯公司的正常白鼠)体内。30min后取5μL尾静脉血，加入等体积的乙腈析出血液中的蛋白质。使用高速离心机沉降血液中的细胞与蛋白，然后取20μL上清液进行HPLC分析。分析结果见图21。
由图21可知，将天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在小鼠体内随血液循环30min后探针依然保持良好的稳定性。
上述实验结果表明实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1具有良好的体内稳定性。
实验例3：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的酶切及酶动力学实验
本实验例提供了实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6的酶切及酶动力学实验，具体过程如下：
将天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6(50μM)与TCEP(三(2-羧乙基)膦)混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育20min，使二硫键充分被还原；孵育结束后，取孵育液通过HPLC和LC-MS表征；表征结束后，在上述孵育液中加入caspase-3(购自R&DSystems(USA)公司)，于37℃下孵育1h；孵育结束后，再次取孵育液通过HPLC和LC-MS对剪切产物表征，并通过动态光散射(DLS)实验分析生成纳米粒子的粒径。表征及分析结果见图22～24。
由图22可知，天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6与TCEP孵育后完全转换为新产物(保留时间为17.2min)，通过LC-MS测试，发现新产物是A6-reduce。
由图23可知，对于天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6与caspase-3和TCEP孵育的混合物，通过HPLC检测发现，新产物保留时间为15.1min，通过LC-MS确认为A6-cycled。
由图24可知，通过动态光散射可以清晰地检测到平均直径为183nm的纳米颗粒物，该实验验证了天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6能够在还原环境以及caspase-3存在条件下产生二聚体并自组装形成纳米颗粒，表明天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1具有特异性靶向凋亡肿瘤的潜力。
实验例4：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的细胞摄取实验
本实验例提供了实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的细胞摄取实验，具体过程如下：
将A549细胞、H460细胞分别以5×105细胞/孔的密度接种到含有1.5mL的1640培养基(购自BI公司)的6孔板中后，分别于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中培养至细胞开始贴壁生长。培养结束后，将生长有A549细胞、H460细胞的6孔板分别平均分为三组，培养基中不添加阿霉素的记为untreated组，培养基中添加阿霉素的记为treated组，培养基中添加阿霉素并在后续摄取实验中额外加入冷化合物的记为treated+inhibitor组。对于untreated组，直接更换新鲜的1640培养基即可；treated以及treated+inhibitor组则需要在1640培养基中额外添加DOX(2μM，购自安耐吉公司)。将分组后的A549细胞、H460细胞分别于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中培养24h后，在6孔板中添加100μL新鲜的含有1μCi实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的1640培养基，对于treated+inhibitor组，在培养基内额外添加50μM的Z-VAD-fmk(购自碧云天公司)。添加完毕后，将A549细胞、H460细胞分别于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中继续培养0.5、1、2或4h。培养结束后，使用移液枪移除6孔板中的DMEM培养基并用4℃的PBS缓冲液清洗6孔板中A549细胞、H460细胞，随后使用伽马计数器对A549细胞、H460细胞内放射性活度进行计数，计算摄取百分比。计数结束后，使用RIPA裂解液裂解细胞并对裂解液蛋白量进行计算。实验结果见图25～26。
由图25～26可知，实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在A549凋亡细胞中的摄取在0.5h时达到较大值(4.0±0.4％ID mg-1)，然后随时间的推移基本保持稳定，除了少量增加(1小时4.1±0.4％ID mg-1，2小时4.12±0.4％ID mg-1，4小时4.34±0.4％ID mg-1)，这可能归因于对化疗肿瘤细胞中caspase-3高表达的反应，从而产生二聚体并增强细胞中的保留效果。此外，未经处理的细胞对实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的摄取始终处于较低的值(0.5h时为0.45±0.04％ID mg-1，1h时为0.66±0.04％ID mg-1，2h时为1.1±1.14％ID mg-1，4h时为1.32±1.15％ID mg-1)，与treated组相比有显着差异，这也证实了实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1对caspase-3的特异性和选择性。在H460细胞中发生了另一种情况，其最大摄取值在0.5h(1.59±0.08％ID mg-1)处检测到并在随后的时期逐渐降低(在1h为1.45±0.05％ID mg-1，在2h为0.92±0.01％ID mg-1)，即使在4h，细胞中残留的放射性示踪剂仍为0.54±0.04％ID mg-1，即使如此，凋亡细胞对探针的摄取也总是高于untreated组和treated+inhibitor组。
综上，化学诱导的凋亡细胞可以有效地增强实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的细胞摄取，并且实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1对A549细胞更敏感。
实验例5：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
待A549荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)的肿瘤直径达到0.8～1.0cm时，将小鼠随机分为两组(n＝3)，对照组小鼠不做处理，实验组小鼠瘤内注射溶解有0.2mg的DOX(购自安耐吉公司)的DMSO(100μL)诱导肿瘤部位凋亡。注射三天后，用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉小鼠。将小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在100μL生理盐水中100～150μCi的天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1通过尾静脉注射。对照组A5499荷瘤小鼠，以同样的方式和剂量给药。探针注射完毕后，立即执行60min的动态PET扫描，PET显像结果见图27。对阿霉素治疗组的肿瘤或肌肉感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取用衰减曲线校正数据并分析，分析结果见图28。肿瘤与肌肉定量结果用每毫升肌肉肿瘤摄取量占总给药量的比值(％ID/mL)表示，定量结果见图29。
由图27～29可知，与预期一致，凋亡的肿瘤可以在成像后的10min内清晰地观察到，并以高的肿瘤背景对比方式持续到1h，而非凋亡的肿瘤则没有，这表明在还原性肿瘤中对caspase-3的反应在微环境中，触发实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1使其环化并自组装以生成纳米粒子，从而放大并保留了F-18信号。值得注意的是，随着时间的流逝，肝脏和膀胱的摄取量逐渐增加，这意味着该探针可能会通过肝脏和肾脏从活体中代谢出来。
实施例3：一种天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2
本实施例提供了一种天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2，所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000231
实施例4：一种制备天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的方法
本实施例提供了实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的制备方法，具体步骤如下：
步骤一：将赖氨酸(1.5mmol，703mg)溶解于7mL超干THF(四氢呋喃)中，得到混合液；在混合液中添加氯甲酸异丁酯(1.5mmol，195μL)和氮甲基吗啉(3mmol，330μL)后，在氮气的保护下，于冰浴下反应2h，得到反应液A；将CBT(2-氰基-6-氨基苯并噻唑)(1mmol，175mg)溶于3mL无水THF中，得到溶解液；将溶解液使用注射器加入反应液A中后，先于避光、冰浴的条件下反应30min，然后于25℃下反应16h，得到反应液B；将盐酸(2mL，1mol/L)使用注射器加入反应液B中淬灭反应后，使用旋转蒸发仪除去反应液B中的有机溶剂，得到粗产物A；通过乙酸乙酯-水体系萃取粗产物A中化合物B1后，使用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤三次，中和多余的盐酸，收集有机相，用无水硫酸钠干燥后使用旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得到到粗产物B；将粗产物B用1mL二氯甲烷溶解后使用硅胶柱对粗产物B进行层析(正己烷：乙酸乙酯＝1：1，v/v)纯化，得到黄色油状的化合物B1(457mg，产率73％，纯度>99％)；
步骤二：将化合物B1(50mg)加入1mL 5vt％的哌啶水溶液中，得到混合液；将混合液于冰浴下反应15min，得到反应液；将盐酸(1mL，1mol/L)使用注射器加入反应液中淬灭反应后，先通过二氯甲烷-水体系萃取反应液中化合物B2，然后通过使用硅胶柱对反应液进行层析(CH2Cl2:CH3OH＝10:1，v/v)纯化，得到化合物B2(50mg，产率78％，纯度99％)(化合物B2的合成路线见图30)；
步骤三：将实施例2制得的化合物A1(0.01401mmol，20mg)、化合物B2(0.01544mmol，6.55mg)及HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(0.01611mmol，6.43mg)溶解于超干DMF(四氢呋喃)中，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(73μL，0.04203mmol)调节溶解液的pH至8后，在氮气的保护下，于25℃下搅拌4h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，得到黄色油状化合物B3(30mg，产率>99％，纯度99％)(化合物B3的合成路线见图35)；
步骤四：将化合物B3溶解于3mL CH2Cl2中，得到溶解液；在溶解液中依次加入3mLTFA(三氟乙酸)和180μL TIPS(三异丙基硅烷)后，于25℃下搅拌2h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到化合物B4(20mg，产率80％，纯度93％)(化合物B4的合成路线见图36)；
步骤五：将化合物B4溶解于3mL CH2Cl2中，得到溶解液；在溶解液中依次加入3mLTFA(三氟乙酸)和180μL TIPS(三异丙基硅烷)后，于25℃下搅拌2h，得到反应液；将反应液用旋转蒸发仪除去有机溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液，得到化合物B5(20mg，产率80％，纯度93％)(化合物B5的合成路线见图37)；
步骤六：将化合物B5(5mg，1eq)和NOTA-NHS(1.86mg，1.2eq)溶解于DMF(四氢呋喃)中，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)(3.4μL，0.01938mmol)调节溶解液的pH至8后，在氮气的保护下，于25℃下搅拌5h，得到反应液；使用半制备型HPLC(0～3min 20％B，；3～5min20～30％B；5～30min 30～45％B；30～35min 45～90％B；35～40min90～20％B v/v；5.0mL/min；B相为乙腈流动相)对反应液进行纯化，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2(1.42mg，产率30.2％)(天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2的合成路线见图38)；
步骤七：使用0.05M HCl从68Ge/68Ga发生器(ITG)中洗脱68Ga，并与1.25MNaOAc缓冲液混合以将pH值调节至4.0；然后将混合物直接转移到含有20μg的天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2的1mL塑料管中，混匀后，将混合物在油浴锅中于37℃孵育15min；通过放射-HPLC对产物进行分析(天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的合成路线见图46)
采用电喷雾电离源对化合物B1进行ESI-MS分析，分析结果见图31。
采用Waters1525对化合物B1进行HPLC检测，检测结果见图32。
采用电喷雾电离源对化合物B2进行ESI-MS分析，分析结果见图33。
采用Waters1525对化合物B2进行HPLC检测，检测结果见图34。
采用电喷雾电离源对化合物B3进行ESI-MS分析，分析结果见图39。
采用Waters1525对化合物B3进行HPLC检测，检测结果见图40。
采用电喷雾电离源对化合物B4进行ESI-MS分析，分析结果见图41。
采用Waters1525对化合物B4进行HPLC检测，检测结果见图42。
采用电喷雾电离源对化合物B5进行ESI-MS分析，分析结果见图43。
采用Waters1525对化合物B5进行HPLC检测，检测结果见图44。
采用Waters1525对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2进行HPLC检测，检测结果见图45。
采用Waters1525对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2行HPLC检测，检测结果见图47。
实验例6：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的体外稳定性实验，具体过程如下：
实验一：将实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2(600μCi)与小鼠血清(取自购自南京森贝伽生物科技有限公司)以1：9的体积比混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、0.5、1或2h；孵育结束后，取20μL孵育液，加入等体积乙腈，在12000g条件下高速离心3min使血清与蛋白分离，吸取上清液进行HPLC分析。分析结果见图48。
实验二：将实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2(600μCi)与PBS缓冲液以1：9的体积比混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、1、2或4h；孵育结束后，取孵育液进行HPLC分析。分析结果见图49。
由图48可知，实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2在血清中表现出令人满意的稳定性，孵育2h后，实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在血清中的纯度超过86％。
由图49可知，将实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2分别在PBS缓冲液中孵育不同时间后，HPLC光谱中未出现其他峰，表明该探针在PBS缓冲液中也具有很好的稳定性。
上述实验结果表明实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2具有良好的体外稳定性。
实验例7：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的细胞摄取实验
本实验例提供了实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的细胞摄取实验，具体过程如下：
将H1299细胞以5×105细胞/孔的密度接种到含有1.5mL的1640培养基(购自BI公司)的6孔板中后，于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中培养至细胞开始贴壁生长。培养结束后，将生长有H1299细胞的6孔板平均分为三组，培养基中不添加阿霉素的记为untreated组，培养基中添加阿霉素的记为treated组，培养基中添加阿霉素并在后续摄取实验中额外加入冷化合物的记为treated+inhibitor组。对于untreated组，直接更换新鲜的1640培养基即可；treated以及treated+inhibitor组则需要在1640培养基中额外添加DOX(2μM，购自安耐吉公司)。将分组后的H1299细胞于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中培养24h后，在6孔板中添加100μL新鲜的含有1μCi实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的1640培养基，对于treated+inhibitor组，在培养基内额外添加50μM的Z-VAD-fmk(购自碧云天公司)。添加完毕后，将H1299细胞于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中继续培养0.5、1、2或4h。培养结束后，使用移液枪移除6孔板中的DMEM培养基并用4℃的PBS缓冲液清洗6孔板中H1299细胞，随后使用伽马计数器对H1299细胞内放射性活度进行计数，计算摄取百分比。计数结束后，使用RIPA裂解液裂解细胞并对裂解液蛋白量进行计算。实验结果见图50。
由图50可知，实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2在未凋亡的肿瘤细胞中摄取较低，随着时间的推移，摄取增长也较为缓慢，从1h的0.4％ID/mg增长到4h的0.5％ID/mg，而在凋亡细胞中，实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的摄取有了显著的增长，从1h的0.7％ID/mg增长到4h的1.6％ID/mg。
综上，实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2具有良好的靶向凋亡肿瘤细胞的能力。
实验例8：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
待A375荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)的肿瘤直径达到0.8～1.0cm时，将小鼠随机分为两组(n＝3)，对照组小鼠不做处理，实验组小鼠瘤内注射溶解有0.2mg的DOX(购自安耐吉公司)的DMSO(100μL)诱导肿瘤部位凋亡。注射三天后，用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉小鼠。将小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在100μL生理盐水中100～150μCi的天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2通过尾静脉注射。对照组A375荷瘤小鼠，以同样的方式和剂量给药。探针注射完毕后，立即执行60min的动态PET扫描，PET显像结果见图51。对阿霉素治疗组的肿瘤或肌肉感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取用衰减曲线校正数据并分析，分析结果见图52。肿瘤与肌肉定量结果用每毫升肌肉肿瘤摄取量占总给药量的比值(％ID/mL)表示，定量结果见图53。
由图51～53可知，在对照组中，肿瘤与肌肉摄取情况相似(30min时，肿瘤摄取为1.92±0.47％ID/mL，肌肉摄取为1.82±0.43％ID/mL)；而在实验组中，实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2能够有效区分肿瘤以及肌肉(30min时，肿瘤摄取为6.89±1.28％ID/mL，肌肉摄取为1.87±0.90％ID/mL)，然而，随着时间的推移，肿瘤内18F信号逐渐减弱(60min时，肿瘤摄取为3.59±0.80％ID/mL，肌肉摄取为1.48±0.29％ID/mL)；同时，也可以发现，实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[68Ga]-DW-2能够短时间分散于生物体内，随后主要以肾代谢的途径排出体外，在小鼠体内各器官中摄取较低(除肝脏、肾、膀胱外，无高摄取器官)，这一代谢性质能够有效降低正常器官对探针特异性显像的影响，并有用于器官凋亡显像的潜力。
实施例5：一种天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3
本实施例提供了一种天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3，所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3具有如下所示结构：
Figure BDA0003113695700000281
实施例6：一种制备天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3的方法
本实施例提供了实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3的制备方法，具体步骤如下：
向氯化铝(6μL，2mM)、冰醋酸(5μL，2mM)和乙腈(384μL，2mM)的混合溶液中添加40μg实施例4制得的天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2，得到混合液；将混合液在100μL靶水(通过30MeV质子轰击银回旋加速器靶中富含98％的[18O]水产生的靶水)中，于100℃下加热10min，得到反应液；将反应液冷却至25℃后，用15mL去离子水稀释，得到稀释液；将稀释液经C18柱纯化后，先用20mL水洗杂，再用0.3mL含10mM HCl的乙醇洗脱，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3。
采用Waters1525对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3行HPLC检测，检测结果见图54。
实验例9：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的体外稳定性实验
本实验例提供了实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3的体外稳定性实验，具体过程如下：
实验一：将实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3(600μCi)与PBS缓冲液以1：9的体积比混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、1、2或4h；孵育结束后，取孵育液进行HPLC分析。分析结果见图55。
实验二：将实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3(600μCi)与小鼠血清(取自购自南京森贝伽生物科技有限公司)以1：9的体积比混合，得到混合液；将混合液在37℃下孵育0、0.5、1或2h；孵育结束后，取20μL孵育液，加入等体积乙腈，在12000g条件下高速离心3min使血清与蛋白分离，吸取上清液进行HPLC分析。分析结果见图56。
由图55可知，将实施例3所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1分别在PBS缓冲液中孵育不同时间后，HPLC光谱中未出现其他峰，表明该探针在PBS缓冲液中具有很好的稳定性。
由图56可知，实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在血清中也表现出令人满意的稳定性，孵育2h后，实施例1所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-1在血清中的纯度超过89％。
上述实验结果表明实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3具有良好的体外稳定性。
实验例10：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的细胞摄取实验
本实验例提供了实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3的细胞摄取实验，具体过程如下：
将H1299细胞以5×105细胞/孔的密度接种到含有1.5mL的1640培养基(购自BI公司)的6孔板中后，于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中培养至细胞开始贴壁生长。培养结束后，将生长有H1299细胞的6孔板平均分为三组，培养基中不添加阿霉素的记为untreated组，培养基中添加阿霉素的记为treated组，培养基中添加阿霉素并在后续摄取实验中额外加入冷化合物的记为treated+inhibitor组。对于untreated组，直接更换新鲜的1640培养基即可；treated以及treated+inhibitor组则需要在1640培养基中额外添加DOX(2μM，购自安耐吉公司)。将分组后的H1299细胞于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中培养24h后，在6孔板中添加100μL新鲜的含有1μCi实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3的DMEM培养基，对于treated+inhibitor组，在培养基内额外添加50μM的Z-VAD-fmk(购自碧云天公司)。添加完毕后，将H1299细胞于37℃、5％(v/v)二氧化碳的培养箱中继续培养0.5、1、2或4h。培养结束后，使用移液枪移除6孔板中的DMEM培养基并用4℃的PBS缓冲液清洗6孔板中H1299细胞，随后使用伽马计数器对H1299细胞内放射性活度进行计数，计算摄取百分比。计数结束后，使用RIPA裂解液裂解细胞并对裂解液蛋白量进行计算。实验结果见图57。
由图57可知，实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3在未凋亡的肿瘤细胞中摄取较低，并且随时间变化不大，在60min时摄取为0.64±0.05％ID/mg，240min时摄取为0.72±0.22％ID/mg，而在凋亡细胞中，实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3细胞摄取保持上升趋势，摄取也保持在较高水平，在60min时摄取为1.05±0.08％ID/mg，240min时摄取为1.50±0.16％ID/mg，这有可能与实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3进入细胞内，被细胞内部caspase-3以及GSH共同作用后，形成纳米粒子有关，纳米粒子不易于细胞排出，从而具有很高的摄取值，此外，还能发现，实验组的细胞摄取约为untreated组摄取的两倍，表明实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3具有较高的信噪比。
综上，实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3具有良好的靶向凋亡肿瘤细胞的能力。
实验例11：天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的小鼠PET成像实验
本实验例提供了实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3的小鼠PET成像实验，具体过程如下：
待A549荷瘤小鼠(购自常州卡文斯实验动物公司)的肿瘤直径达到0.8～1.0cm时，将小鼠随机分为两组(n＝3)，对照组小鼠不做处理，实验组小鼠瘤内注射溶解有0.2mg的DOX(购自安耐吉公司)的DMSO(100μL)诱导肿瘤部位凋亡。注射三天后，用含有2vt％异氟烷的氧气以1.5L/min的流速麻醉小鼠。将小鼠的四肢与尾巴固定后，将溶解在100μL生理盐水中100～150μCi的实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3通过尾静脉注射。对照组A549荷瘤小鼠，以同样的方式和剂量给药。探针注射完毕后，立即执行60min的动态PET扫描，PET显像结果见图58。对阿霉素治疗组的肿瘤或肌肉感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取用衰减曲线校正数据并分析，分析结果见图59。对非阿霉素治疗组的肿瘤或肌肉感兴趣区域(ROI)的组织药物摄取用衰减曲线校正数据并分析，分析结果见图60。
由图58～60可知，在对照组中，肿瘤与肌肉摄取情况相似(30min时，肿瘤摄取为1.82±0.23％ID/mL，肌肉摄取为1.73±0.13％ID/mL)；而在实验组中，实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3能够有效区分肿瘤以及肌肉(30min时，肿瘤摄取为肿瘤摄取为4.8±1.28％ID/mL，肌肉摄取为1.23±0.90％ID/mL)；同时，也可以发现，实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3能够短时间分散于生物体内，随后主要以肾代谢的途径排出体外，在小鼠体内各器官中摄取较低(除肝脏、肾、膀胱外，无高摄取器官)，阿霉素(DOX)治疗前后肿瘤部位显著的摄取差异进一步验证了实施例5所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针[18F]-DW-3具有特异性监测凋亡水平的能力。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (5)

1.一种分子探针，其特征在于，所述分子探针为天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针；所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004110335880000011
或者，所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004110335880000012
或者，所述天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针具有如下所示结构：
Figure FDA0004110335880000013
2.一种制备权利要求1所述分子探针的方法，其特征在于，所述方法为：将化合物A5溶解于超干THF中，得到溶解液；在溶解液中加入2-(乙基二硫烷基)吡啶和TIPS后进行反应，得到反应液；将反应液浓缩、离心、干燥、纯化，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6；对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体A6进行放射性标记，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针；
所述化合物A5具有如下所示结构：
Figure FDA0004110335880000021
3.一种制备权利要求1所述分子探针的方法，其特征在于，所述方法为：将化合物B5和NOTA-NHS溶解于DMF中，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA后进行反应，得到反应液；对反应液进行纯化，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2；对天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针的标记前体DW-2进行放射性标记，得到天冬氨酸蛋白水解酶靶向的分子探针；
所述化合物B5具有如下所示结构：
Figure FDA0004110335880000022
4.权利要求1所述分子探针在制备靶标物显像剂中的应用。
5.一种靶向靶标物的显像剂，其特征在于，所述显像剂含有权利要求1所述分子探针。
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