CN103342737A - 一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制备方法，特征是通过简单的固相多肽合成获得适当长度的连接物，再通过常规的液相羧氨缩合反应及荧光分子标记反应获得显像剂；该显像剂生理条件下亲水性良好，制备容易，同时由于荧光增强纳米显像剂分子含有半胱天冬酶3特异性识别的寡肽序列，可以被细胞凋亡过程产生的半胱天冬酶3剪切，能够指示细胞是否进入凋亡状态。与现有荧光增强凋亡诊断试剂盒相比，本发明的制备方法简单，本发明的酶敏感的荧光增强纳米显像剂生物相容性良好，可以通过对荧光信号的检测在体外环境和细胞裂解液中完成凋亡相关的特定酶活性检测，并能够在活体细胞层面对细胞凋亡状态进行实时监测。
Description
技术领域
本发明属于纳米显像剂技术领域，具体涉及针对细胞凋亡的荧光增强成像的纳米显像剂及其制备方法。
背景技术
利用生物体系内荧光增强的现象来检测细胞凋亡状态的荧光纳米显像剂曾见于美国化学学会的杂志《美国化学学会会志》（J.Am.Chem.Soc.,2012,134,17972-17981）的报道，其应用了具有聚集诱导发射特性的荧光基团，将生物过程与聚集过程整合，但该显像剂在活体细胞凋亡状态的检测中需要的激发光波长在紫外区，这种波长的激发光本身对于细胞等生物体系是有害的。利用金纳米粒子具有良好荧光淬灭效应的特性设计合成的纳米显像剂在细胞凋亡检测中的应用研究见于美国化学学会的杂志《生物共轭化学》（Bioconjugate Chem.，2010,21,1939–1942）的报道，其中所使用的金纳米粒子可以商业购买，但对其进行修饰的过程及程度难于控制，修饰后金纳米粒子的稳定性受到影响，会呈现一定程度的下降，使得其在生物体系中的应用受到限制。
采用异硫氰酸荧光素异构体I作为荧光基团，（4-（4-（二甲基氨基）苯基）偶氮）苯甲酸作为淬灭基团，以可被半胱天冬酶3降解的寡肽片段（天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸）作为连接物的纳米荧光探针，用于检测细胞凋亡特定酶活性及活细胞凋亡状态方面的研究工作至今尚未见文献报道。
发明内容
本发明的目的是提出一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制备方法，以获得能够用于检测细胞凋亡特定酶活性及活细胞凋亡状态的荧光增强纳米显像剂，克服现有相关显像剂所需激发光波长过短及制备复杂、稳定性差的缺点，从而实现在活体细胞层面用于检测细胞凋亡特定酶活性及活细胞凋亡状态。
本发明的对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂的制备方法，其特征在于：
先合成一段寡肽序列，按：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸上的芴甲氧羰基，加入活化的第二个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第三个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第四个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去天冬氨酸上的芴甲氧羰基，加入活化的第五个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-缬氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去缬氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第六个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，最后加入活化的第七个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，最后用按三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：99的混合液40-50毫升从该树脂上切下合成的寡肽片段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，沉淀中乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基；
将上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基取0.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入0.12毫摩尔叔丁氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第一种中间产物L1；
将上述制备的第一种中间产物L1溶解在按三氟乙酸与二氯甲烷体积比为95：5的10毫升混合液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第二种中间产物L2；
将0.12毫摩尔（4-（4-（二甲基氨基）苯基）偶氮）苯甲酸溶于3毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入第二种中间产物L20.1毫摩尔，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米及可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为第三种中间产物CL3；
将第三种中间产物CL3取0.1毫摩尔溶解于按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为5：95的3毫升混合液中，室温搅拌反应二十分钟，经过高效液相色谱分离提纯，收集仅在可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为第四种中间产物CL4；
将第四种中间产物CL4取0.1毫摩尔溶解于3毫升pH=9的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，另取0.12毫摩尔异硫氰酸荧光素异构体I溶解于300微升二甲亚砜中并滴加至第四种中间产物CL4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在可见波段442纳米及510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为最终化合物CLY；
其中固相肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基作为α-氨基保护基，天冬氨酸及谷氨酸的侧链羧基均由4-叔丁酯基保护；其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸等摩尔量的1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；在每新加入一个氨基酸和切去9-芴甲氧羰基保护基时，都采用凯撒测试（Kaiser Test）试剂检测氨基存在与否：若阳性，显蓝色，即表明已脱除9-芴甲氧羰基保护基；若阴性，显黄色，则表明氨基酸的氨基已发生缩合反应。
采用上述制备方法合成的可用于检测细胞凋亡特定酶活性及活细胞凋亡状态的荧光增强纳米显像剂，即最终化合物CLY，其特征在于结构为：
该最终化合物CLY可以被半胱天冬酶3特异性识别并剪切，剪切后连接物部分断开使得淬灭基团与荧光基团远离，淬灭效果消失，荧光基团发出的荧光可被检测。
与已有的荧光增强纳米显像剂相比，本发明的对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂的显著优点是合成简单，生物相容性好，同时对细胞凋亡过程中产生的特定酶敏感性高，可用于在体外条件下检测特定酶的活性以及在活细胞体系对细胞的凋亡状态进行研究；本发明的对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂分子通过简单的固相多肽合成、常规的液相羧氨缩合反应及荧光分子标记反应合成得到，在生理条件下亲水性良好，由于荧光增强纳米显像剂分子中含有半胱天冬酶3特异性识别的寡肽序列，对细胞凋亡过程产生的半胱天冬酶3敏感，可以被该酶高效剪切，使淬灭基团对于荧光的淬灭效果消失，得到常规荧光显微镜下易检测的荧光信号。因此，利用本发明的对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制备方法可以实现通过简单的方法合成荧光增强纳米显像剂，同时完成了荧光增强纳米显像剂在体外条件下用于检测特定酶的活性以及在活细胞体系对细胞的凋亡状态进行研究。本发明克服了已有的荧光纳米显像剂生物相容性差、荧光效率较低、容易出现误判的缺点，并进一步实现了在活体细胞层面对细胞凋亡状态进行实时监测。
附图说明
图1为实施例1中合成的最终化合物CLY的核磁共振氢谱图。
图2为实施例1中最终化合物CLY在半胱天冬酶3作用前后荧光淬灭及荧光增强的示意图，箭头指示了半胱天冬酶3作用的位点，即连接物断开的位置。
图3为实施例2中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析的结果。
图4为实施例2中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的残留色谱峰的紫外可见吸收光谱图。
图5为实施例2中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的新色谱峰即CL的紫外可见吸收光谱图。
图6为实施例2中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的新色谱峰即LY的紫外可见吸收光谱图。
图7为实施例2中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的新色谱峰即CL的基质辅助激光解析-飞行时间质谱图。
图8为实施例2中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的新色谱峰即LY的基质辅助激光解析-飞行时间质谱图。
图9为实施例2中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行荧光光谱实时检测得到的荧光发射光谱随时间变化的曲线。
图10为实施例2中最终化合物CLY在紫外诱导凋亡的HepG2细胞裂解液中完成酶的识别及剪切前后进行荧光光谱实时检测得到的荧光发射光谱随时间变化的曲线。
图11为实施例3中最终化合物CLY在25微摩尔浓度下与正常HepG2细胞及紫外诱导凋亡HepG2细胞共同孵育30分钟后HepG2细胞内的半胱天冬酶3、相应的半胱天冬酶3前体、半胱天冬酶3的剪切底物聚ADP-核糖聚合酶及剪切后的聚ADP-核糖聚合酶的蛋白质印迹比较图，其中阴性对照组为不加入最终化合物CLY的空白对照组，阳性对照组为紫外诱导凋亡组和不加入最终化合物CLY而加入10微摩尔浓度的喜树碱组。
图12为实施例3中最终化合物CLY在25微摩尔浓度下与正常HepG2细胞共同孵育30分钟后对HepG2细胞进行紫外诱导凋亡，以紫外诱导凋亡完成时间为零时刻进行实时监测拍照，得到的荧光显微镜明场与绿色荧光蛋白频道合并照片，其中抑制剂对照组为25微摩尔浓度最终化合物CLY与正常HepG2细胞共同孵育30分钟后再加入100微摩尔商业化半胱天冬酶3抑制剂Ac-DEVD-CHO共同孵育30分钟后对HepG2细胞进行紫外诱导凋亡，而阴性对照组为25微摩尔浓度最终化合物CLY与正常HepG2细胞共同孵育30分钟后直接进行实时监测拍照。图中所有标尺均为20微米。
具体实施方式
下面的实施例1中提供了最终化合物CLY的合成及荧光信号增强示意图，实施例2为体外酶活性检测实验，实施例3为紫外诱导凋亡有效性验证及最终化合物CLY生物相容性检测和凋亡细胞显像实验。最终化合物CLY是可以被半胱天冬酶3特异性识别并剪切的化合物。
实施例1：
先采用固相肽合成法将寡肽片段甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基合成出来。
本实施例中最终化合物CLY(Dabcyl-EDA-Gly-Gly-Gly-Asp-Val-Glu-Asp-FITC)的合成路线如下：
。
先采用固相肽合成法合成寡肽序列甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基，按：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，反应4-8分钟，切去甘氨酸的芴甲氧羰基保护基，Kaiser测试显蓝色，加入活化的1.6毫摩尔第二个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，Kaiser测试显黄色，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，反应4-8分钟，切去甘氨酸的芴甲氧羰基保护基，Kaiser测试显蓝色，加入活化的1.6毫摩尔第三个氨基酸甘氨酸反应2-3小时，Kaiser测试显黄色，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，反应4-8分钟，切去甘氨酸的芴甲氧羰基保护基，Kaiser测试显蓝色，加入活化的1.6毫摩尔第四个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，Kaiser测试显黄色，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，反应4-8分钟，切去天冬氨酸的芴甲氧羰基保护基，Kaiser测试显蓝色，加入活化的1.6毫摩尔第五个氨基酸缬氨酸反应2-3小时，Kaiser测试显黄色，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，反应4-8分钟，切去缬氨酸的芴甲氧羰基保护基，Kaiser测试显蓝色，加入活化的1.6毫摩尔第六个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，Kaiser测试显黄色，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，反应4-8分钟，切去谷氨酸的芴甲氧羰基保护基，Kaiser测试显蓝色，最后加入活化的1.6毫摩尔第七个氨基酸N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，Kaiser测试显黄色，最后用按三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：99的混合液40-50毫升从该树脂上切下合成的寡肽序列，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，沉淀中乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基；将上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸芴甲氧羰基取0.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入0.12毫摩尔叔丁氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的主要组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第一种中间产物L1；将上述制备的第一种中间产物L1溶解在按三氟乙酸与二氯甲烷体积比为95：5的10毫升混合液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第二种中间产物L2；将0.12毫摩尔（4-（4-（二甲基氨基）苯基）偶氮）苯甲酸溶于3毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入第二种中间产物L20.1毫摩尔，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米及可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为第三种中间产物CL3；将第三种中间产物CL3取0.1毫摩尔溶解于按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为5：95的3毫升混合液中，室温搅拌反应二十分钟，经过高效液相色谱分离提纯，收集仅在可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为第四种中间产物CL4；将第四种中间产物CL4取0.1毫摩尔溶解于3毫升pH=9的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，另取0.12毫摩尔异硫氰酸荧光素异构体I溶解于300微升二甲亚砜中并滴加至第四种中间产物CL4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在可见波段442纳米及510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为最终化合物CLY。
采用德国布鲁克公司（Bruker）布鲁克核磁软件解析本实施例中合成的最终化合物得到如图1所示的核磁共振谱图：
图1是本实施例中合成的最终化合物CLY的核磁共振氢谱图。由图1可见，最终化合物CLY的核磁共振氢谱(d6-二甲亚砜，300MHz):10.29-10.46(s,1H),9.94-10.27(s,1H),8.56-8.66(t,1H),8.38-8.44(s,1H),8.29-8.38(t,2H),8.16-8.23(d,1H),8.04-8.12(m,2H),7.96-8.02(t,2H),7.92-7.96(s,1H),7.79-7.86(t,4H),7.70-7.78(d,1H),7.12-7.23(t,1H),6.81-6.88(d,2H),6.65-6.72(s,2H),6.58-6.63(d,2H),6.52-6.58(m,2H),5.16-5.26(m,1H),4.50-4.59(m,1H),4.34-4.43(m,1H),4.10-4.17(t,1H),3.74-3.77(s,4H),3.69-3.73(d,6H),3.31-3.39(t,2H),3.22-3.31(t,2H),2.98-3.16(s,6H),2.75-2.84(m,3H),2.69-2.74(d,1H),2.53-2.61(m,1H),2.20-2.37(m,2H),1.88-2.03(m,2H),1.72-1.85(m,1H),1.25-1.31(m,1H),0.73-0.94(t,6H)。
最终化合物CLY是可以被半胱天冬酶3特异性识别并剪切从而得到增强的荧光信号的化合物；最终化合物CLY可用于在体外进行相应酶活性的检测实验及活细胞体系细胞凋亡状态实时监测。
图2为本实施例中最终化合物CLY被半胱天冬酶3特异性识别并剪切从而得到增强的荧光信号的示意图。
其中箭头所指是对本发明方法制备的最终化合物CLY被半胱天冬酶3作用的位点，即连接物在半胱天冬酶3作用后断开的位点。由图中化合物结构式在半胱天冬酶3作用前后的变化可以看出，采用本发明方法制备的最终化合物CLY在半胱天冬酶3作用后断开为两部分：淬灭基团部分CL和荧光基团部分LY。同时，由于最终化合物CLY的两个功能基团相距约3纳米，在合适的淬灭距离即1-10纳米范围内，距离控制淬灭效应的影响使得其在半胱天冬酶3作用前表现为荧光淬灭状态，而半胱天冬酶3作用后，淬灭基团部分CL和荧光基团部分LY相互远离，超出合适的淬灭距离范围，因此淬灭效应消失，获得随时间增强的荧光信号。
实施例2：体外酶活性检测实验
本实施例体外实验中采用浓度均为0.26微摩尔每升的最终化合物CLY，在含有浓度为50毫摩尔每升的4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.1%的3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、50毫摩尔每升的氯化钠、10毫摩尔每升的乙二胺四乙酸和5个单位体积为50微升的半胱天冬酶3的总体积为100微升的溶液里，37摄氏度下孵育80分钟完成酶的识别及剪切，同时进行荧光发射光谱扫描得到荧光发射光谱随时间变化的曲线。凋亡细胞裂解液中酶活性的检测则采用如下方式：首先在含体积浓度为5%CO2的空气环境的37摄氏度培养箱中使用含体积浓度10%的牛血清蛋白的DMEM培养基培养人肝癌细胞株HepG2，当细胞数到达百万后直接在培养皿中给予10000微焦每平方厘米的紫外诱导辐射，继续培养1小时后用2毫升放射免疫沉淀分析裂解液对细胞进行裂解，然后冷冻离心，取上清液199微升，加入浓度为0.26微摩尔每升的最终化合物CLY，在总体积为200微升的溶液里，37摄氏度下孵育900分钟完成酶的识别及剪切，同时进行荧光发射光谱扫描得到荧光发射光谱随时间变化的曲线。
图3给出了本实施例中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切后进行高效液相色谱跟踪检测的表征结果；图4为本实施例中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的残留色谱峰的紫外可见吸收光谱图；图5为本实施例中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的新色谱峰即CL的紫外可见吸收光谱图；图6为本实施例中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的新色谱峰即LY的紫外可见吸收光谱图；图7为本实施例中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的新色谱峰即CL的基质辅助激光解析-飞行时间质谱图；图8为本实施例中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱分析时得到的新色谱峰即LY的基质辅助激光解析-飞行时间质谱图；图9为本实施例中最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行荧光光谱实时检测得到的荧光发射光谱随时间变化的曲线；图10为本实施例中最终化合物CLY在紫外诱导凋亡的HepG2细胞裂解液中完成酶的识别及剪切前后进行荧光光谱实时检测得到的荧光发射光谱随时间变化的曲线。
其中图3是对本发明方法制备的最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱跟踪检测的表征结果，曲线b为最终化合物CLY不与半胱天冬酶3一起孵育，得到的色谱分析结果，其色谱峰b1即表示最终化合物CLY，曲线a为最终化合物CLY与半胱天冬酶3一起孵育，得到的色谱分析结果，其中小色谱峰a1与曲线b的色谱峰b1有相同的保留时间，即表示最终化合物CLY经过酶识别剪切后仍有残余，而新出现的大色谱峰a2和a3则具有更短的保留时间，同时经过基质辅助激光解离飞行时间质谱检测，为最终化合物CLY被酶识别剪切后的片段淬灭基团部分CL和荧光基团部分LY，表明最终化合物CLY在体外环境中可以被半胱天冬酶3识别并剪切；图4是对本发明方法制备的最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱跟踪检测得到的小色谱峰a1的紫外可见吸收光谱，曲线c在可见波段442纳米及510纳米处同时具有荧光基团部分LY和淬灭基团部分CL的特征吸收，进一步说明此峰为最终化合物CLY经过酶识别剪切后的残余峰；图5是对本发明方法制备的最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱跟踪检测得到的色谱峰a2的紫外可见吸收光谱，曲线d在可见波段510纳米处具有淬灭基团部分CL的特征吸收，说明此峰为最终化合物CLY经过酶识别剪切后的淬灭基团部分CL；图6是对本发明方法制备的最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱跟踪检测得到的色谱峰a3的紫外可见吸收光谱，曲线e在可见波段442纳米处具有荧光基团部分LY的特征吸收，说明此峰为最终化合物CLY经过酶识别剪切后的荧光基团部分LY；图7是对本发明方法制备的最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱跟踪检测得到的色谱峰a2的基质辅助激光解析-飞行时间质谱图，峰f所示分子量对应淬灭基团部分CL的分子量，即峰f为淬灭基团部分CL的分子离子峰，说明此峰为最终化合物CLY经过酶识别剪切后的淬灭基团部分CL；图8是对本发明方法制备的最终化合物CLY在体外环境完成酶的识别及剪切前后进行高效液相色谱跟踪检测得到的色谱峰a3的基质辅助激光解析-飞行时间质谱图，峰g所示分子量对应淬灭基团部分LY的分子量，即峰f为淬灭基团部分LY的分子离子峰，说明此峰为最终化合物CLY经过酶识别剪切后的淬灭基团部分LY；图9为最终化合物CLY在体外环境完成半胱天冬酶3的识别及剪切前后进行荧光光谱实时检测得到的荧光发射光谱随时间变化的曲线，以酶加入反应体系时刻为零时刻，曲线h1-h6分别对应第0分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、80分钟时反应溶液的荧光发射光谱，荧光发射峰的高度随时间不断增加说明了在体外环境下最终化合物CLY对半胱天冬酶3敏感，且确实能够在该酶的作用下降解并获得不断增强的荧光信号；图10为最终化合物CLY在具有10000微焦每平方厘米能量的紫外诱导凋亡的HepG2细胞裂解液中完成半胱天冬酶3的识别及剪切前后进行荧光光谱实时检测得到的荧光发射光谱随时间变化的曲线，以酶加入反应体系时刻为零时刻，曲线i1-i11分别对应第0分钟、5分钟、10分钟、20分钟、40分钟、80分钟、160分钟、320分钟、640分钟、880分钟、900分钟时反应溶液的荧光发射光谱，荧光发射峰的高度随时间不断增加说明了在紫外诱导凋亡的HepG2细胞裂解液中最终化合物CLY对半胱天冬酶3敏感，且确实能够在该酶的作用下降解并获得不断增强的荧光信号。
实施例3：紫外诱导凋亡细胞的蛋白质印记实验和凋亡细胞显像实验
首先进行人肝癌细胞HepG2的培养：在含体积浓度为5%CO2的空气环境的37摄氏度培养箱中使用含体积浓度10%的牛血清蛋白的DMEM培养基培养人肝癌细胞株HepG2；用0.01摩尔每升的无菌PBS缓冲液洗涤处于对数生长期的细胞三次，然后用质量体积浓度0.25%的胰蛋白酶将其消化下来；分盘细胞用DMEM润洗，然后进行计数，并将细胞浓度稀释至每毫升3×104个细胞。
然后，测试紫外诱导和最终化合物CLY作用后人肝癌细胞HepG2内的凋亡相关蛋白酶的含量变化情况，验证紫外诱导和最终化合物CLY对细胞的影响：人肝癌细胞HepG2分为五组，除阴性对照组不加最终化合物CLY和不做紫外诱导以外，其中两组分别加入最终浓度25微摩尔每升的最终化合物CLY培养30分钟、最终浓度25微摩尔每升的最终化合物CLY培养30分钟后加以10000微焦每平方厘米的紫外诱导辐射，剩下两组分别加10000微焦每平方厘米的紫外诱导辐射、加入最终浓度10微摩尔每升的喜树碱培养6小时；结束后，用无菌PBS缓冲溶液润洗培养好的人肝癌细胞HepG2一次，再用5倍体积的含有混合蛋白酶抑制剂的冷冻裂解缓冲液充分混悬，煮沸5分钟后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转入聚偏二氟乙烯膜；将膜放在4℃的含5%脱脂牛奶的TBST中过夜培养后用TBST润洗20分钟，然后在室温下与初级抗体孵育1小时；所得印记图再用复合了碱性磷酸酶的二级抗体标记，最后使用Promega公司的针对碱性磷酸酶的Western Blue稳定底物使目标蛋白可视化。
最后，测试最终化合物CLY对活体细胞中凋亡细胞的实时监测能力。取培养好的细胞，浓度稀释至每毫升3×104个细胞，在玻璃底观察用培养皿中使用含体积浓度10%的牛血清蛋白的DMEM培养基培养24小时后，换用不含牛血清蛋白的DMEM培养基培养4小时，使细胞处于饥饿状态，加入最终浓度25微摩尔每升的最终化合物CLY培养30分钟，再用0.01摩尔每升的无菌PBS缓冲液洗涤三次，除去未被细胞吸收的最终化合物CLY，立刻加以10000微焦每平方厘米的紫外诱导辐射，完成后换用含体积浓度10%的牛血清蛋白的DMEM培养基培养，并在荧光显微镜下采用明场和绿色荧光蛋白频道观察拍照；对于抑制剂对照组，加入最终浓度25微摩尔每升的最终化合物CLY培养30分钟后再加入最终浓度100微摩尔每升的商业化半胱天冬酶3抑制剂Ac-DEVD-CHO培养30分钟，再用0.01摩尔每升的无菌PBS缓冲液洗涤三次，除去未被细胞吸收的最终化合物CLY和商业化半胱天冬酶3抑制剂Ac-DEVD-CHO，立刻加以10000微焦每平方厘米的紫外诱导辐射，完成后换用含体积浓度10%的牛血清蛋白的DMEM培养基培养，并在荧光显微镜下采用明场和绿色荧光蛋白频道观察拍照；对于阴性对照组，加入最终浓度25微摩尔每升的最终化合物CLY培养30分钟后，再用0.01摩尔每升的无菌PBS缓冲液洗涤三次，完成后换用含体积浓度10%的牛血清蛋白的DMEM培养基培养，直接在荧光显微镜下采用明场和绿色荧光蛋白频道观察拍照。
图11为实施例3中最终化合物CLY在25微摩尔浓度下与正常HepG2细胞及紫外诱导凋亡HepG2细胞共同孵育30分钟后HepG2细胞内的半胱天冬酶3、相应的半胱天冬酶3前体、半胱天冬酶3的剪切底物聚ADP-核糖聚合酶及剪切后的聚ADP-核糖聚合酶的蛋白质印迹比较图，其中阴性对照组为不加入最终化合物CLY的空白对照组，阳性对照组为紫外诱导凋亡组和不加入最终化合物CLY而加入10微摩尔浓度的喜树碱组。图12为实施例3中最终化合物CLY在25微摩尔浓度下与正常HepG2细胞共同孵育30分钟后对HepG2细胞进行紫外诱导凋亡，以紫外诱导凋亡完成时间为零时刻进行实时监测拍照，得到的荧光显微镜明场与绿色荧光蛋白频道合并照片，其中抑制剂对照组为25微摩尔浓度最终化合物CLY与正常HepG2细胞共同孵育30分钟后再加入100微摩尔商业化半胱天冬酶3抑制剂Ac-DEVD-CHO共同孵育30分钟后对HepG2细胞进行紫外诱导凋亡，而阴性对照组为25微摩尔浓度最终化合物CLY与正常HepG2细胞共同孵育30分钟后直接进行实时监测拍照。图12中所有标尺均为20微米。
如图11中所示，阴性对照组列可见半胱天冬酶的底物多聚(ADP-核糖)聚合酶条带j1，半胱天冬酶3前体条带j2及作为内参比的磷酸甘油醛脱氢酶条带j3；最终化合物CLY处理组列可见半胱天冬酶的底物多聚(ADP-核糖)聚合酶条带k1，半胱天冬酶3前体条带k2及作为内参比的磷酸甘油醛脱氢酶条带k3；紫外诱导处理组列可见半胱天冬酶的底物多聚(ADP-核糖)聚合酶条带l1、剪切后的多聚(ADP-核糖)聚合酶条带l2、半胱天冬酶3前体条带l3、剪切后的半胱天冬酶3条带l4、剪切后的半胱天冬酶3条带l5及作为内参比的磷酸甘油醛脱氢酶条带l6；最终化合物CLY与紫外诱导共处理组列可见半胱天冬酶的底物多聚(ADP-核糖)聚合酶条带m1、剪切后的多聚(ADP-核糖)聚合酶条带m2、半胱天冬酶3前体条带m3、剪切后的半胱天冬酶3条带m4、剪切后的半胱天冬酶3条带m5及作为内参比的磷酸甘油醛脱氢酶条带m6；喜树碱处理组列可见半胱天冬酶的底物多聚(ADP-核糖)聚合酶条带n1、剪切后的多聚(ADP-核糖)聚合酶条带n2、半胱天冬酶3前体条带n3、剪切后的半胱天冬酶3条带n4、剪切后的半胱天冬酶3条带n5及作为内参比的磷酸甘油醛脱氢酶条带n6。在这五组中，每一组的内参比磷酸甘油醛脱氢酶条带都相当，说明四组细胞所提取蛋白量相当，数据间可以相互比较；阴性对照组只有半胱天冬酶3前体条带、半胱天冬酶的底物多聚(ADP-核糖)聚合酶条带及作为内参比的磷酸甘油醛脱氢酶条带，作为细胞正常生长的对照基准；喜树碱处理组可见半胱天冬酶3前体条带、剪切后的半胱天冬酶3条带、剪切后的半胱天冬酶3条带、半胱天冬酶的底物多聚(ADP-核糖)聚合酶条带、剪切后的多聚(ADP-核糖)聚合酶条带及作为内参比的磷酸甘油醛脱氢酶条带，作为细胞发生凋亡的对照模型；紫外诱导处理组列可见半胱天冬酶的底物多聚(ADP-核糖)聚合酶条带、剪切后的多聚(ADP-核糖)聚合酶条带、半胱天冬酶3前体条带、剪切后的半胱天冬酶3条带、剪切后的半胱天冬酶3条带及作为内参比的磷酸甘油醛脱氢酶条带，与喜树碱处理组一致，说明紫外诱导辐射能够成功建立细胞凋亡模型；最终化合物CLY处理组列没有剪切后的半胱天冬酶3条带及剪切后的多聚(ADP-核糖)聚合酶条带，而其半胱天冬酶3前体条带k2与阴性对照组的半胱天冬酶3前体条带j2相当，说明最终化合物CLY处理组细胞的半胱天冬酶3前体并未活化，未产生可测的剪切的半胱天冬酶3及剪切的多聚(ADP-核糖)聚合酶，细胞正常生长，最终化合物CLY具有良好的生物相容性；最终化合物CLY与紫外诱导共处理组列有明显的剪切后的半胱天冬酶3条带及剪切后的多聚(ADP-核糖)聚合酶条带且可与紫外诱导处理组相应条带相比较，而其半胱天冬酶3前体条带m3与喜树碱组的半胱天冬酶3前体条带l3相当，说明最终化合物CLY对本处理组发生凋亡细胞的相关酶无影响，不会由于加入化合物影响细胞凋亡状态。以上数据表明，10000微焦每平方厘米的紫外诱导辐射能够有效诱导HepG2细胞发生凋亡，最终化合物CLY具有良好的细胞生物相容性，且不干预细胞凋亡状态。
如图12中所示，图o1是紫外诱导组细胞在0分钟，即紫外诱导开始前所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，图o2是紫外诱导组细胞在60分钟，即紫外诱导后60分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，图o3是紫外诱导组细胞在80分钟，即紫外诱导后80分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，且与图o2摄于相同放大倍数下相同视场，图o4是紫外诱导组细胞在100分钟，即紫外诱导后100分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，且与图o2摄于相同放大倍数下相同视场；图p1是酶抑制剂与紫外诱导共处理组细胞在0分钟，即紫外诱导开始前所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，图p2是酶抑制剂与紫外诱导共处理组细胞在60分钟，即紫外诱导后60分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，图p3是酶抑制剂与紫外诱导共处理组细胞在80分钟，即紫外诱导后80分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，且与图p2摄于相同放大倍数下相同视场，图p4是酶抑制剂与紫外诱导共处理组细胞在100分钟，即紫外诱导后100分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，且与图p2摄于相同放大倍数下相同视场；图q1是阴性对照组细胞在0分钟，即与最终化合物CLY孵育并用PBS溶液洗涤完成时刻开始所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，图q2是阴性对照组细胞在60分钟，即与最终化合物CLY孵育并用PBS溶液洗涤完成后60分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，图q3是阴性对照组细胞在80分钟，即与最终化合物CLY孵育并用PBS溶液洗涤完成后80分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，且与图q2摄于相同放大倍数下相同视场，图q4是阴性对照组细胞在100分钟，即与最终化合物CLY孵育并用PBS溶液洗涤完成后100分钟所拍摄的明场与绿色荧光蛋白频道叠加照片，且与图q2摄于相同放大倍数下相同视场。以上各图中白色箭头指示的均为将要发生凋亡或者已经发生凋亡的细胞，比例尺均为20微米。紫外诱导组图o2及o3中白色箭头指出了将要发生凋亡的细胞，此时能够观察到明显的荧光信号，但细胞外部形态并未发生明显变化，接下来的图o4中白色箭头则指出了已经发生凋亡的细胞，正是前两图中观察到明显荧光信号的细胞，此时细胞已经发生明显形态变化；酶抑制剂与紫外诱导共处理组图p2及p3中白色箭头指出了将要发生凋亡的细胞，此时不能观察到荧光信号，且细胞外部形态并未发生明显变化，接下来的图p4中白色箭头则指出了已经发生凋亡的细胞，此时细胞已经发生明显形态变化；阴性对照组图中细胞由于未受到紫外诱导，因此无可观察的凋亡细胞和相应的荧光信号。以上数据表明，最终化合物CLY能够在细胞未发生明显凋亡形态变化时通过荧光信号的增强指出细胞凋亡的发生，且这一能力取决于细胞凋亡相关的重要酶——半胱天冬酶3的活性，若半胱天冬酶3活性被相应酶抑制剂抑制，则不能引发荧光信号增强。
通过上述实施例及其检测实验的结果可知：本发明对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂及其制备方法，通过简单的固相多肽合成获得适当长度的连接物，再通过常规的液相羧氨缩合反应及荧光分子标记反应获得显像剂，生理条件下亲水性良好，制备容易，同时由于荧光增强纳米显像剂分子含有半胱天冬酶3特异性识别的寡肽序列，可以被细胞凋亡过程产生的半胱天冬酶3剪切，能够指示细胞是否进入凋亡状态。本发明可以克服现有荧光增强凋亡诊断试剂盒生物相容性差，荧光效率低，容易出现误判的缺点。采用本发明方法可以通过简单的化学反应合成酶敏感的荧光增强纳米显像剂，并在体外环境和活体细胞层面完成凋亡相关的特定酶活性检测及细胞凋亡状态的实时监测。
Claims (2)
1.一种对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂的制备方法，其特征在于：
先合成一段寡肽序列，按：将1毫摩尔2-氯三苯甲基氯树脂在2-3毫升N，N-二甲基甲酰胺里溶胀4-8分钟后，加入2毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸，再加入2毫摩尔N，N-二异丙基乙胺，反应2-3小时后，用100微升甲醇反应5-10分钟，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸上的芴甲氧羰基，加入活化的第二个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第三个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-甘氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去甘氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第四个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去天冬氨酸上的芴甲氧羰基，加入活化的第五个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-缬氨酸反应2-3小时，加入按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为20：80的混合液4-5毫升，切去缬氨酸的芴甲氧羰基，加入活化的第六个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-谷氨酸-4-叔丁酯反应2-3小时，最后加入活化的第七个氨基酸1.6毫摩尔N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸-4-叔丁酯反应3-4小时，最后用按三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为1：99的混合液40-50毫升从该树脂上切下合成的寡肽片段，用乙醚使其沉淀析出，冷冻离心并倾倒除去上层乙醚，沉淀中乙醚挥发干后所得白色固体粉末即为寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基；
将上述合成的寡肽序列——甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-芴甲氧羰基取0.1毫摩尔溶于2毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入0.12毫摩尔叔丁氧羰基-乙二胺，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第一种中间产物L1；
将上述制备的第一种中间产物L1溶解在按三氟乙酸与二氯甲烷体积比为95：5的10毫升混合液中搅拌反应3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到白色固体粉末，即为第二种中间产物L2；
将0.12毫摩尔（4-（4-（二甲基氨基）苯基）偶氮）苯甲酸溶于3毫升N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.12毫摩尔N，N-二异丙基乙胺、0.12毫摩尔苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及0.12毫摩尔1-羟基苯并三唑活化半小时后，加入第二种中间产物L20.1毫摩尔，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在紫外波段300纳米及可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为第三种中间产物CL3；
将第三种中间产物CL3取0.1毫摩尔溶解于按哌啶与N，N-二甲基甲酰胺的体积比为5：95的3毫升混合液中，室温搅拌反应二十分钟，经过高效液相色谱分离提纯，收集仅在可见波段510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为第四种中间产物CL4；
将第四种中间产物CL4取0.1毫摩尔溶解于3毫升pH=9的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，另取0.12毫摩尔异硫氰酸荧光素异构体I溶解于300微升二甲亚砜中并滴加至第四种中间产物CL4的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲溶液中，室温搅拌反应2-3小时，经过高效液相色谱分离提纯，收集在可见波段442纳米及510纳米处有特征吸收的组分并浓缩得到红色固体粉末，即为最终化合物CLY；
其中固相肽合成所用的氨基酸都是以9-芴甲氧羰基
作为α-氨基保护基，天冬氨酸及谷氨酸的侧链羧基均由4-叔丁酯基
保护；其中活化氨基酸的试剂是与氨基酸等摩尔量的1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐；在每新加入一个氨基酸和切去9-芴甲氧羰基保护基时，都采用凯撒测试（Kaiser Test）试剂检测氨基存在与否：若阳性，显蓝色，即表明已脱除9-芴甲氧羰基保护基；若阴性，显黄色，则表明氨基酸的氨基已发生缩合反应。
2.权利要求1方法制备的对半胱天冬酶3敏感的荧光增强纳米显像剂，即最终化合物CLY，其特征在于结构为：
，
该最终化合物CLY可以被半胱天冬酶3特异性识别并剪切，剪切后连接物部分断开使得淬灭基团与荧光基团远离，淬灭效果消失，荧光基团发出的荧光可被检测。
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2013
- 2013-07-10 CN CN2013102876913A patent/CN103342737A/zh active Pending
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