CN107389628A - 一种细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用。本发明以荧光标记的细胞色素c核酸适配体和caspase‑3底物多肽序列为识别元件,以金纳米颗粒为荧光能量受体，在其表面共价修饰响应分子，通过能量转移过程同时淬灭两种荧光染料的荧光。在无目标时，染料荧光被淬灭。目标分子存在时，细胞色素c与其适配体结合，caspase‑3水解其底物多肽，使荧光染料远离金纳米颗粒表面，产生荧光信号，实现细胞色素c和caspase‑3的检测和成像。本发明探针合成简便、灵敏度高、选择性好，可同时检测两种细胞凋亡相关生物标志物，本发明可有效应用于细胞凋亡成像检测及细胞凋亡药物评价。

Description

一种细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用，属于生物分析技术和纳米医学领域。

(二)背景技术

细胞凋亡是一种程序化细胞死亡，在多细胞生物体的发育、体内平衡及免疫等方面中具有重要作用。通常，细胞凋亡的调节失衡会引起多种病理过程发生，如自体免疫失调、退行性病变、癌症等。所以，实时检测和监视生物体凋亡过程在研究凋亡信号、评估某些疾病过程、开发凋亡相关药物具有重要意义。

细胞凋亡的生物学变化特征主要有磷脂酰丝氨酸(PS)的膜联蛋白外露、线粒体释放细胞色素c(Cyt c)、DNA片段化、半胱天冬酶(caspase)激酶家族的活化等。目前，对于检测细胞凋亡的方法有电化学法、高效液相色谱法、比色法、荧光法等。其中，荧光法具有高灵敏度、非破坏性、操作简单等优点。近来，有多种有机探针被开发用于细胞凋亡检测，尽管取得良好效果，但是大部分有机探针合成及纯化步骤较多，成本较高，限制了其应用。也有一些荧光纳米材料如量子点、金纳米簇、石墨烯等被开发用于细胞凋亡检测。但是这些方法都是针对单一目标进行检测，如对细胞色素c或者caspase-3蛋白酶的检测。同时针对两种重要细胞凋亡相关分子的检测，可提高检测准确性和加深对细胞凋亡过程的理解。所以，开发一体同时检测多个细胞凋亡标志分子检测成像探针具有较高科学价值和实用价值。

(三)发明内容

本发明目的在于改善现有技术的不足，提供一种细胞凋亡双色检测和成像探针，以及所述的探针在检测细胞色素c和半胱天冬酶-3中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种提供一种细胞凋亡双色检测和成像探针，其检测目标为细胞色素c和半胱天冬酶-3，其特征在于所述探针由金纳米颗粒表面共价修饰细胞色素c和半胱天冬酶-3响应分子获得；所述细胞色素c响应分子为荧光染料标记的细胞色素c核酸适配体，所述半胱天冬酶-3响应分子为荧光染料标记的响应caspase-3多肽序列，所述细胞色素c核酸适配体序列为5’-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGG GTACGTTGTTGC-3’，所述caspase-3多肽序列为CALNNDEVD，所述荧光染料为FITC、Cy3、Cy5或罗丹明衍生物。

所述金纳米颗粒为球形金纳米颗粒、星形金纳米颗粒、棒状金纳米颗粒或壳状金纳米颗粒，其尺寸为5～500纳米。

所述共价修饰方法为金-巯键结合的盐老化法。

适配体链接DNA(作用是将适配体与金纳米颗粒连接)序列为：5′-SH-TTTTTTTTTGCAACAACGTA-3′。细胞色素c的适配体与链接DNA通过DNA杂交反应，杂交摩尔质量比1:1～2:1，杂交时间1小时～24小时，杂交溶液为磷酸盐缓冲液(PBS)(10mM PB溶液，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH 7.4)。

所述纳米探针合成方法如下：1毫升金纳米颗粒溶液与DNA杂交溶液共孵育，金纳米颗粒与DNA浓度摩尔比率为1-10nM：500nM-5μM。12小时之后，加入十二烷基磺酸钠(SDS)溶液至终浓度为0.01％～1％，加入磷酸缓冲液(pH 7.4)至终浓度5mM～50mM。每隔半小时加入NaCl溶液至终浓度为100mM～500mM。老化12小时后，加入荧光染料标记的响应caspase-3多肽(利用末端的半胱氨酸(即C)与金纳米颗粒连接)溶液至终浓度500nM～1mM。反应12小时后，4℃条件下14000转每分钟离心20分钟PBS缓冲洗涤3次。所得细胞凋亡成像探针重分散于PBS缓冲液中，四度避光保存。

本发明还设计所述的探针在检测细胞色素c和半胱天冬酶-3中的应用。

具体的，所述检测方法为：将所述成像探针与细胞孵育后，加入凋亡诱导剂或促凋亡药物诱导细胞凋亡，利用共聚焦荧光仪实现细胞凋亡成像和药物评估。

检测细胞色素c时，将检测探针与不同浓度细胞色素c于PBS中37℃反应30分钟后检测荧光信号，获得标准曲线；样品溶液在相同条件下检测荧光信号，对照标准曲线获得样品中细胞色素c浓度值。

检测半胱天冬酶-3时，将检测探针与不同浓度半胱天冬酶-3于HEPES缓冲液(pH7.4，含100mM NaCl，1mM EDTA，10％sucrose，0.1％CHAPS)中，37℃反应30分钟后检测荧光信号，获得标准曲线；样品溶液在相同条件下检测荧光信号，对照标准曲线获得样品中半胱天冬酶-3浓度值。

进一步，本发明还包括所述的探针在凋亡药物筛选中的应用。

本发明以荧光标记细胞色素c核酸适配体和caspase-3底物多肽序列为识别元件，在无目标时，染料荧光被金纳米颗粒淬灭。在目标分子存在时，细胞色素c与其适配体结合，caspase-3水解其底物多肽，使荧光染料远离金纳米颗粒表面，产生荧光信号，用于细胞色素c和caspase-3的检测。检测原理如图1所示。

本发明的有益效果主要体现在：相对于现有技术，本发明探针合成简便、灵敏度高、选择性好，可同时检测两种细胞凋亡相关生物标志物，本发明可有效应用于细胞凋亡成像检测及细胞凋亡药物评价。

(四)附图说明

图1为本发明细胞凋亡成像纳米探针合成及检测的原理示意图。

图2为本发明制备的纳米探针表征图；(A)金纳米颗粒及纳米探针吸收图；(B)纳米探针的透射电镜图。

图3为纳米探针用于检测不同浓度的细胞色素c(Cyt c)(A、B)和caspase-3(C、D)荧光光谱图及线性相关图。

图4为纳米探针检测目标分子的选择性实验图和动力学响应图，所选择干扰物分别为：氯化钾溶液(KCl)、氯化镁(MgCl₂)、三磷酸腺苷(ATP)、谷胱甘肽(GSH)、葡萄糖(glucose)、抗坏血酸(AA)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、胰蛋白酶(Trypsin)，以上浓度为100μM。细胞色素c的浓度为300nM，caspase-3浓度为200ng/mL。(A)和(C)为纳米探针响应细胞色素c，(B)和(D)为纳米探针响应caspase-3。

图5为纳米探针用于细胞凋亡荧光成像，其中凋亡诱导剂十字孢碱(STS)浓度为0～4μM。

图6为纳米探针用于检测不同药物诱导细胞凋亡的荧光成像图。其中DMSO为二甲亚枫，NaAsb为柠檬酸钠，PTX为紫杉醇，STS为十字孢碱，药物浓度为2μM。药物作用时间为2小时。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

金纳米颗粒的合成：所用玻璃器皿泡王水4小时后，二次水彻底清洗烘干后使用。50毫升0.01％wt氯金酸水溶液加热至沸腾后，搅拌下快速加入1毫升1％wt柠檬酸三钠溶液，继续反应20分钟至颜色由无色变为酒红色。冷却至室温，避光保存于4℃冰箱待用。图2A所示为纳米金的吸收光谱图。

细胞色素c适配体与链接DNA杂交：细胞色素c的适配体序列为5’-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-Cy5-3’；适配体链接DNA序列：5′-SH-TTTTTTTTTGCAACAACGTA-3′。24μL 100μM细胞色素c的适配体与20μL 100μM链接DNA通过DNA杂交反应，与杂交溶液40μL磷酸盐缓冲液(PBS)(10mM PB溶液，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)混合，于80℃加热10分钟后，冷却至室温，反应12小时。

纳米探针的合成：1毫升6nM金纳米颗粒溶液与DNA杂交溶液共孵育，金纳米颗粒与DNA浓度摩尔比率为6nM：2μM。12小时之后，加入十二烷基磺酸钠(SDS)溶液至终浓度为0.1％(wt)，加入磷酸缓冲液(pH 7.4)至终浓度10mM。每隔半小时加入NaCl溶液至终浓度为200mM。老化12小时后，加入caspase-3多肽溶液(多肽序列为CALNNDEVD-FITC)至终浓度4μM。反应12小时后，4℃条件下14000转每分钟离心20分钟，PBS缓冲洗涤3次。所得细胞凋亡成像探针重分散于PBS缓冲液中，4℃避光保存。纳米探针的吸收光谱如图2A，透射电镜图如图2B。

实施例2：

荧光检测和caspase-3：检测细胞色素c时，1nM的纳米探针与不同浓度的细胞色素c于PBS中37℃反应30分钟后检测荧光信号。激发波长为635nm，检测波长665nm。检测caspase-3时，1nM的纳米探针与不同浓度的caspase-3孵育于25mM HEPES缓冲液(pH 7.4，含100mM NaCl,1mM EDTA，10％sucrose，0.1％CHAPS)，37℃反应30分钟后检测荧光信号。激发波长480nm，检测波长520nm。结果如图3所示，对细胞色素c检测线性范围为0～500nM，检测限10nM；对caspase-3检测线性范围0～300ng/mL，检测限5ng/mL。

纳米探针检测选择性实验：1nM的纳米探针与不同干扰物于37℃反应30分钟后检测相应荧光信号。分别检测两种不同荧光染料，激发波长为635nm，检测波长665nm；激发波长480nm，检测波长520nm。其中，细胞色素c的浓度为300nM，caspase-3浓度为200ng/mL。结果如图4A和B所示，证明该探针具有良好的检测选择性。

纳米探针响应目标的动力学曲线：细胞色素c的浓度为300nM，caspase-3浓度为200ng/mL。分别与1nM的纳米探针反应，测定不同时间点的荧光值。结果如图4C和4D所示，在20分钟左右，两种荧光恢复至最高，证明该探针具有良好的响应动力学。

实施例3：

纳米探针用于细胞凋亡成像：HeLa细胞培养在含10％胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培养基中于37℃高湿度含5％二氧化碳培养箱中。HeLa细胞培养于共聚焦成像培养皿，长至覆盖培养皿60～70％时，PBS洗2次，加入含1nM纳米探针的Opti-MEM培养液，孵育2小时后，PBS洗2次后，加入含有不同浓度STS的培养液孵育2小时。PBS洗2次后，荧光共聚焦成像。结果如图5所示，证明该纳米探针可以双色成像细胞凋亡。

纳米探针用于细胞凋亡药物评价：HeLa细胞培养在含10％胎牛血清、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培养基中于37℃高湿度含5％二氧化碳培养箱中。HeLa细胞培养于共聚焦成像培养皿，长至覆盖培养皿60～70％时，PBS洗2次，加入含1nM纳米探针的Opti-MEM培养液，孵育2小时后，PBS洗2次后，加入含有2μM不同药物的培养液孵育2小时，PBS洗2次后，荧光共聚焦成像。结果如图6所示，三种细胞凋亡诱导剂都能诱导细胞凋亡产生荧光，其中STS细胞凋亡诱导能力最强，产生的荧光信号最大，证明该纳米探针可用于细胞凋亡药物的评价。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建医科大学孟超肝胆医院

<120> 一种细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

ccgtgtctgg ggccgaccgg cgcattgggt acgttgttgc 40

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

Cys Ala Leu Asn Asn Asp Glu Val Asp

1 5

Claims (8)

1.一种细胞凋亡双色检测和成像探针，其检测目标为细胞色素c和半胱天冬酶-3，其特征在于所述探针由金纳米颗粒表面共价修饰细胞色素c和半胱天冬酶-3响应分子获得；所述细胞色素c响应分子为荧光染料标记的细胞色素c核酸适配体，所述半胱天冬酶-3响应分子为荧光染料标记的响应caspase-3多肽序列，所述细胞色素c核酸适配体序列为5’-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-3’，所述caspase-3多肽序列为CALNNDEVD，所述荧光染料为FITC、Cy3、Cy5或罗丹明衍生物。

2.如权利要求1所述的探针，其特征在于所述金纳米颗粒为球形金纳米颗粒、星形金纳米颗粒、棒状金纳米颗粒或壳状金纳米颗粒，其尺寸为5～500纳米。

3.如权利要求1所述的探针，其特征在于所述共价修饰方法为金-巯键结合的盐老化法。

4.权利要求1所述的探针在检测细胞色素c和半胱天冬酶-3中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述检测方法为：将所述成像探针与细胞孵育后，加入凋亡诱导剂或促凋亡药物诱导细胞凋亡，利用共聚焦荧光仪实现细胞凋亡成像和药物评估。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于：检测细胞色素c时，将检测探针与不同浓度细胞色素c于PBS中37℃反应30分钟后检测荧光信号，获得标准曲线；样品溶液在相同条件下检测荧光信号，对照标准曲线获得样品中细胞色素c浓度值。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：检测半胱天冬酶-3时，将检测探针与不同浓度半胱天冬酶-3于HEPES缓冲液中，37℃反应30分钟后检测荧光信号，获得标准曲线；样品溶液在相同条件下检测荧光信号，对照标准曲线获得样品中半胱天冬酶-3浓度值。

8.权利要求1所述的探针在凋亡药物筛选中的应用。