CN108801989B - 一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器及其制备方法 - Google Patents

一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测细胞色素c的核酸适配体‑分子印迹荧光传感器的制备方法，其包括以下步骤：首先，由模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体、甲基丙烯酸和交联剂形成预聚合复合物；然后，由预聚合复合物、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点和引发剂形成核酸适配体‑量子点复合物；最后，将核酸适配体‑量子点复合物中模版分子细胞色素c洗脱，得到核酸适配体‑分子印迹荧光传感器。本发明还提供一种有上述制备方法制备出的一种用于检测细胞色素c的核酸适配体‑分子印迹荧光传感器。本发明的核酸适配体‑分子印迹荧光传感器对细胞色素c具有双重特异性识别，对细胞色素c有很好的选择性。

Description

一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器 及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学分析化学领域，具体涉及一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器及其制备方法。
背景技术
细胞色素c(Cytochrome c，Cyt c)是一种以铁卟啉为辅基的可溶性色素蛋白，普遍存在于生物体中，是构成细胞呼吸链的主要成员之一。作为细胞凋亡的信息物质，细胞色素c在研究细胞凋亡过程的病理学、药理学以及线粒体变化的过程中具有非常重要的作用。目前,常用细胞色素c的检测方法为双抗夹心法。然而，抗体的物理和化学性质不稳定，在体外容易导致失活。抗体的筛选和生产过程繁琐，导致其生产成本高昂，对抗体在蛋白质检测中应用的发展受到限制。
核酸适配体是一种对靶物质有特异性识别能力的单链的核苷酸，有望成为抗体的替代物，在生物分析领域有巨大的应用潜力和多样性的应用范围。适配体在体外通过指数富集的配基系统进化技术筛选获得核酸序列，对目标物有高度的亲合力和特异性，因而非常适合用作识别探针。另外，核酸适配体有许多优点，如无毒、化学稳定性好、价格便宜、容易被修饰、序列设计灵活多变、无免疫原性及可以高亲和性和特异性得结合几乎任何目标分子如小分子、蛋白甚至微生物和细胞。
分子印迹聚合物作为一种识别元件，近年来获得了持续的关注，并广泛应用于纯化分离、化学/生物传感和药物递送等领域。由于其在空间和大小方面为模板分子量身定做了互补的结合位点，分子印迹聚合物能够高特异性和选择性的识别模板分子。相比于传统的识别元件，分子印迹聚合物制备成本低、物理稳定性好、可以多次循环使用。但是，不同于小分子的印迹，印迹模板体积太大，结构复杂且容易发生变化，印迹的难度也大大增大。因此，对诸如细胞色素c这种蛋白质大分子进行印迹仍然存在许多难题。
考虑到适配体和分子印迹各自独特的优点，以及荧光纳米材料半导体量子点具有荧光颜色可调、发射峰窄而对称、激发波长范围大等特点。因此，开发一种以半导体量子点作为支撑，巯基修饰的核酸适配体和甲基丙烯酸为功能单体，结合巯基-双键点击反应以及自由基聚合，制备出的一种对细胞色素c具有双重特异性识别的核酸适配体-分子印迹荧光传感器，用来快速、灵敏和专一性的检测样品中的细胞色素c。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术所存在的不足，提供一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法，其步骤简单、反应条件温和、反应速度快；所制备出的核酸适配体-分子印迹荧光传感器能快速、灵敏和专一性的检测样品中的细胞色素c。
为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：
一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法包括以下步骤：
1)制备预作用复合物
将模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体溶解于磷酸缓冲液中，再加入甲基丙烯酸和交联剂，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)制备核酸适配体—量子点复合物
向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，加入双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点和引发剂，再加入磷酸缓冲液，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)洗脱模版分子细胞色素c
将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用洗脱液除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器。
优选的，所述巯基修饰的细胞色素c核酸适配体的序列为5’-HS-(CH2)6-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-(CH2)6-SH-3’。
优选的，所述模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体和甲基丙烯酸的摩尔比为1:1:(80-120)。
特别优选的，所述模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体和甲基丙烯酸的摩尔比为1:1:100。
优选的，所述双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点由以下步骤制备所得：
S1：取巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点与体积分数为50％的乙醇混合，搅拌15分钟，再加入正硅酸乙酯和氨水，搅拌反应2小时，继续加入KH570，反应4小时；
S2：步骤S1的反应液在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，分别用乙醇和水洗涤数次，得到双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点。
特别优选的，所述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、乙醇、正硅酸乙酯、氨水和KH570的摩尔体积比为1mol:(310-315)L：(1.2-1.3)L：(2.5-2.6)L：(0.12-0.13)L
最优选的，所述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、乙醇、正硅酸乙酯、氨水和KH570的摩尔体积比为1mol:325L：1.25L：2.5L：0.125L。
特别优选的，所述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点由以下步骤制备所得：
(1)将硫酸锌溶液、氯化锰溶液和3-巯基丙酸溶液混合，加入去离子水搅拌均匀，用氢氧化钠溶液调节pH值至10；
(2)再加入硫化钠水溶液，通入氮气，搅拌反应30分钟；
(3)将步骤(2)的反应液暴露在空气中，在温度为50℃的条件下，老化4小时；
(4)加入反应液等体积的乙醇，沉淀，在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用乙醇洗涤数次，得到巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点。
最优选的，所述硫酸锌溶液、氯化锰溶液和3-巯基丙酸溶液的摩尔比为1:0.04:4；所述硫酸锌溶液与去离子水的摩尔体积比为1mol：46L；所述硫酸锌溶液与硫化钠水溶液的摩尔比为1:1。
最优选的，所述硫酸锌溶液的摩尔浓度为0.1mol/L，氯化锰溶液的摩尔浓度为0.01mol/L，3-巯基丙酸溶液的摩尔浓度为0.1mol/L，硫化钠水溶液的摩尔浓度为0.1mol/L。
优选的，所述模版分子细胞色素c和双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点摩尔比为1：(675-750)。
优选的，所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；所述模版分子细胞色素c和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为1:(4400-4600)。
优选的，所述引发剂为四甲基乙二胺和过硫酸铵；所述模版分子细胞色素c和四甲基乙二胺的摩尔体积比为1mmol：(30-40)L。
优先的，所述模版分子细胞色素c和过硫酸铵的摩尔比为1：(900-980)。
优选的，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为10mmol/L，pH值为7-8。
特别优选的，所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为10mmol/L，pH值为7.5。
优选的，所述洗脱液为质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液。
本发明还提供一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器，其由上述的制备方法制备获得的。
本发明的有益效果：
1、本发明提供的制备方法，反应条件温和、反应速度快、产率高，是一种简便、高效的制备对细胞色素c具有双重特异性识别的核酸适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法。
2、本发明利用了适配体的高特异性与分子印迹的高选择性、特异性结合，以双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点为信号元件，制备了一种具有双重识别功能的核酸适配体-分子印迹荧光传感器。同时，制备过程中采用巯基修饰的细胞色素c核酸适配体作为生物分子单体，甲基丙烯酸作为化学分子单体，两种功能单体，其协同作用进一步增强了印迹聚合物的双识别效果。
3、本发明的核酸适配体-分子印迹荧光传感器进行了对细胞色素c的荧光滴定实验得到线性检测范围为0.20-2.00μmol/L，线性相关系数为0.9922，检测限为0.054μmol/L，专一性识别因子为3.28。
4、本发明的核酸适配体-分子印迹荧光传感器进行了选择性及竞争吸附试验，证明了本发明的核酸适配体-分子印迹荧光传感器对细胞色素c具有很好的选择性。
5、本发明的核酸适配体-分子印迹荧光传感器进行了重现性试验，证明了本发明的制备方法具有良好的重现性。
6、本发明的核酸适配体-分子印迹荧光传感器应用于实际样品包括人尿液和人血液中细胞色素c的加标检测，回收率在94.5％-102.3％，且相对标准偏差均小于4.6％，结果表明本发明的核酸适配体-分子印迹荧光传感器对细胞色素c具有实际检测价值和意义。
附图说明
图1是本发明所述制备方法的工艺流程图；
图2是制备核酸适配体-分子印迹荧光传感器中模板分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体、甲基丙烯酸的优化摩尔比例试验结果图；
图3是巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点、核酸适配体-分子印迹荧光传感器的FT-IR表征图；
图4是巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的荧光激发/发射光谱图；
图5是核酸适配体-分子非印迹荧光传感器、核酸适配体-分子印迹荧光传感器和(未洗脱模版分子的)核酸适配体—量子点复合物的荧光发射光谱图；
图6是核酸适配体-分子印迹荧光传感器的XRD表征图；
图7是巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点和核酸适配体-分子印迹荧光传感器的透射电镜表征(TEM)图，其中图7A是巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的透射电镜结果，图7B是核酸适配体-分子印迹荧光传感器的透射电镜结果；
图8是核酸适配体-分子印迹荧光传感器和核酸适配体-分子非印迹荧光传感器吸附动力学试验结果图；
图9是温度对核酸适配体-分子印迹荧光传感器和核酸适配体-分子非印迹荧光传感器测定细胞色素c的影响试验结果图；
图10是pH值对核酸适配体-分子印迹荧光传感器和核酸适配体-分子非印迹荧光传感器测定细胞色素c的影响试验结果图；
图11是核酸适配体-分子印迹荧光传感器对不同浓度的细胞色素c的荧光响应试验结果图；
图12是核酸适配体-分子非印迹荧光传感器对不同浓度的细胞色素c的荧光响应试验结果图；
图13是核酸适配体-分子印迹荧光传感器和核酸适配体-分子非印迹荧光传感器的Stern-Volmer方程线性图；
图14是核酸适配体-分子印迹荧光传感器和核酸适配体-分子非印迹荧光传感器对细胞色素c及其结构类似物的选择性试验结果图；
图15是核酸适配体-分子印迹荧光传感器对溶菌酶-细胞色素c的竞争吸附实验结果图；
图16是核酸适配体-分子印迹荧光传感器对牛血清白蛋白-细胞色素c的竞争吸附实验结果图；
图17是核酸适配体-分子印迹荧光传感器的重现性实验结果图。
具体实施方式
如图1所示，本发明提供一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)制备预作用复合物
将模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体溶解于磷酸缓冲液中，再加入甲基丙烯酸和交联剂，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)制备核酸适配体—量子点复合物
向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，加入双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点和引发剂，再加入磷酸缓冲液，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)洗脱模版分子细胞色素c
将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用洗脱液除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器。
本发明还提供由上述制备方法制备获得的用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器。
各种试验仪器与试剂均为市售商品，均为可通过商业途径购买获得。
以下实施例中的巯基修饰的细胞色素c核酸适配体的序列为5’-HS-(CH2)6-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-(CH2)6-SH-3’，购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
下面通过具体较佳实施例结合制备工艺试验例、结构表征试验例、检测条件试验例和效果试验例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
实施例1：
(一)巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
(1)在50mL的三颈烧瓶中加入5mL 0.1mol/L硫酸锌溶液、2mL 0.01mol/L氯化锰溶液和20mL 0.1mol/L 3-巯基丙酸溶液，三种溶液充分混合，然后加入23mL去离子水搅拌均匀，往混合溶液中滴加2mol/L氢氧化钠溶液调节溶液的pH值到10；
(2)注入5mL 0.1mol/L硫化钠水溶液，通入氮气，持续搅拌30min；
(3)将反应溶液暴露在空气氛围中，50℃水浴加热，老化4小时；
(4)所得的量子点溶液用等体积的乙醇沉淀，12000rpm离心分离上清液，再用乙醇洗涤数次；将巯基丙酸修饰的锰摻杂硫化锌量子点分散在去离子水中，使其摩尔浓度为0.01mol/L。
(二)双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
S1：取8mL上述巯基丙酸修饰的锰摻杂硫化锌量子点溶液与50mL的体积分数为50％乙醇溶液混合，搅拌15分钟，再加入100μL正硅酸乙酯和200μL氨水，搅拌反应2小时，继续加入10μL KH570，继续反应4小时；
S2：步骤S1的反应液在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，分别用乙醇或水洗涤数次，所得的双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点分散在去离子水中，使其摩尔浓度为0.01mol/L。
(三)用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)的制备
1)取2.8nmol的模版分子细胞色素c和2.8nmol巯基修饰的细胞色素c核酸适配体溶解在100μL的磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)，然后加入280nmol的甲基丙烯酸(MAA)和2mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，随后加入100μl双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点，然后加入0.6mg过硫酸铵(APS)和0.3μl四甲基乙二胺(TEMED)，补充磷酸缓冲液使反应溶液总体积为1ml，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)。
实施例2：
(一)巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本实施例中上述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(二)双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本实施例中上述双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(三)用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)的制备
1)取2.8nmol的模版分子细胞色素c和2.8nmol巯基修饰的细胞色素c核酸适配体溶解在100μL的磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)，然后加入560nmol的甲基丙烯酸(MAA)和2mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，随后加入100μl双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点，然后加入0.6mg过硫酸铵(APS)和0.3μl四甲基乙二胺(TEMED)，补充磷酸缓冲液使反应溶液总体积为1ml，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)。
实施例3：
(一)巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本实施例中上述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(二)双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本实施例中上述双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(三)用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)的制备
1)取2.8nmol的模版分子细胞色素c和2.8nmol巯基修饰的细胞色素c核酸适配体溶解在100μL的磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)，然后加入224nmol的甲基丙烯酸(MAA)和2mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，随后加入100μl双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点，然后加入0.6mg过硫酸铵(APS)和0.3μl四甲基乙二胺(TEMED)，补充磷酸缓冲液使反应溶液总体积为1ml，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)。
对比例1
(一)巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本对比例中上述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(二)双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本对比例中上述双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(三)分子印迹荧光传感器(MIP/QDs)的制备
1)取2.8nmol的模版分子细胞色素c溶解在100μL的磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)，然后加入280nmol的甲基丙烯酸(MAA)和2mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，随后加入100μl双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点，然后加入0.6mg过硫酸铵(APS)和0.3μl四甲基乙二胺(TEMED)，补充磷酸缓冲液使反应溶液总体积为1ml，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到分子印迹荧光传感器(MIP/QDs)。
对照例1
(一)巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本对照例中上述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(二)双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本对照例中上述双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(三)核酸适配体-分子非印迹荧光传感器(aptamer-NIP/QDs)的制备
1)取2.8nmol巯基修饰的细胞色素c核酸适配体溶解在100μL的磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)，然后加入280nmol的甲基丙烯酸(MAA)和2mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，随后加入100μl双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点，然后加入0.6mg过硫酸铵(APS)和0.3μl四甲基乙二胺(TEMED)，补充磷酸缓冲液使反应溶液总体积为1ml，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)进行洗脱，得到核酸适配体-分子非印迹荧光传感器(aptamer-NIP/QDs)。
对照例2
(一)巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本对照例中上述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(二)双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备
本对照例中上述双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的制备方法同实施例1。
(三)分子非印迹荧光传感器(NIP/QDs)的制备
1)取100μL的磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)，然后加入280nmol的甲基丙烯酸(MAA)和2mg的N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，随后加入100μl双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点，然后加入0.6mg过硫酸铵(APS)和0.3μl四甲基乙二胺(TEMED)，补充磷酸缓冲液使反应溶液总体积为1ml，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到分子非印迹荧光传感器(NIP/QDs)。
制备工艺试验例1：
模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体和甲基丙烯酸比例的优化。
试验方法：按表1(模板分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体、甲基丙烯酸)的摩尔比例共有5种，交联剂MBA、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点、引发剂过硫酸铵和四甲基乙二胺的用量与实施例1/对照例1相同)，来制备核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)和核酸适配体-分子非印迹荧光传感器(aptamer-NIP/QDs)。所制备得到的核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)、核酸适配体-分子非印迹荧光传感器(aptamer-NIP/QDs)以及对比例1、对照例2所制备的分子印迹荧光传感器(MIP/QDs)和分子非印迹荧光传感器(NIP/QDs)分别分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)中，配置成浓度为100mg/L的溶液，再与摩尔浓度为1.6μmol/L的细胞色素c充分混合，利用荧光光谱仪测试与细胞色素c作用前后的aptamer-MIP/QDs和对应的aptamer-NIP/QDs的荧光强度。通过印迹因子(imprinted factor，IF)来评估印迹聚合物的特异性识别能力。印迹因子的计算公式如下：
IF＝ΔF(aptamer-MIP/QDs)/ΔF(aptamer-NIP/QDs)
其中，ΔF(aptamer-MIP/QDs)表示aptamer-MIP/QDs溶液重新吸附模板前后荧光强度的差值((F0-F)/F)，ΔF(aptamer-NIP/QDs)表示aptamer-NIP/QDs溶液重新吸附模板前后荧光强度的差值((F0-F)/F)。
表1模板分子、核酸适配体和功能单体比例的优化
Figure GDA0002636676910000101
Figure GDA0002636676910000111
具体的试验结果见图2。从图2中可以看出，当模板分子细胞色素c、核酸适配体和甲基丙烯酸(MAA)三者的摩尔比例为1:1:0时，由于印迹效应，aptamer-MIP/QDs的响应值比对应的aptamer-NIP/QDs大，印迹因子为2.32。随着MAA的用量不断增大，aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs的响应值也随之增大，三者摩尔比例从1:1:0变化到1:1:100，IF值不断增大，在摩尔比例为1:1:100时，达到最大为3.17，这是由于MAA用量的增大使聚合物层的负电位点增多，对带正电的细胞色素c更强的结合能力。这一结果可以说明非特异性功能单体MAA与特异性的功能单体(核酸适配体)存在协同效应，可以看出MAA的使用可以提高复合物对细胞色素c特异性结合能力。随着MAA的用量增加，当MAA与模板分子的比例大于100:1，更多的MAA使用提高了aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs对细胞色素c结合能力。另一方面，IF值却不断下降，这是由于过多的MAA造成了非特异性吸附，导致印迹效果下降。因此，优选的模板分子细胞色素c、核酸适配体和甲基丙烯酸(MAA)三者的摩尔比为1:1:(80-120)，最优选的模板分子细胞色素c、核酸适配体和甲基丙烯酸(MAA)三者的摩尔比为1:1:100。
另外，实验还以对比例1所制备的MIP/QDs(模板分子细胞色素c、核酸适配体和甲基丙烯酸三者的摩尔比例为1:0:100)和对照例2所制备的NIP/QDs(模板分子细胞色素c、核酸适配体和甲基丙烯酸三者的摩尔比例为0:0:100)作对比。从图2中可以看出，以核酸适配体作为特异性的功能单体可以显著提高aptamer-MIP/QDs对细胞色素c的特异性识别能力。
结构表征试验例1：FT-IR表征
分别检测巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点、核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)的FT-IR表征。
试验方法：分别称取烘干的100mg溴化钾和1mg实施例1中的巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点、核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)，在干燥的玛瑙研钵中将其混合均匀并研磨成细粉，压片。扣除溴化钾背景后，分别检测三种材料在4000cm-1-400cm-1范围内的透光率。放入傅里叶红外变换光谱仪中进行扫描，得到红外光谱图(图3)。
由图3可以看出，(a)、(b)和(c)分别是巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点、核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)的红外光谱图。在(a)中，有两个比较明显的特征峰1564cm-1和1400cm-1，这是由于量子点表面的巯基丙酸的羧基对称和非对称伸缩振动引起的。在(b)中，饱和C-H的伸缩振动峰位置在2927cm-1和2856cm-1；在1716cm-1处的峰源于KH570酯基的C＝O的伸缩振动；C＝C的伸缩振动峰位置在1636cm-1；在1080cm-1和795cm-1处的红外峰分别是由Si-O-Si和Si-O的振动引起的。从上述(b)的这些红外峰可以说明在量子点表面进行硅烷化并修饰双键是成功的。在(c)中，1663cm-1和1526cm-1处有强的吸收峰，分别是来自酰胺的C＝O和N-H基团振动；C-H的伸缩振动峰在2930cm-1处。从(c)的红外吸收情况可以说明聚合物层的合成是成功的。
实施例2、3的FT-IR表征结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
结构表征试验例2：荧光激发/发射光谱
检测巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点、核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)和核酸适配体-分子非印迹荧光传感器(aptamer-NIP/QDs)的荧光激发/发射光谱(图4、图5)。
试验方法：
1、吸取2mL的巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点溶液到荧光比色皿中，固定荧光光谱仪接收595nm处的荧光，扫描量子点在225nm-500nm范围内的激发光谱(图4(a))；固定荧光光谱仪发射315nm的激发光，扫描量子点在420nm-700nm范围内的发射光谱(图4(b))。
2、吸取2mL的双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点溶液，到荧光比色皿中，固定荧光光谱仪发射315nm的激发光，扫描双键量子点在420nm-700nm范围内的发射光谱(图4(c))。
3、吸取2mL的对照例1所制备的核酸适配体-分子非印迹荧光传感器(aptamer-NIP/QDs)，到荧光比色皿中，固定荧光光谱仪发射315nm的激发光，扫描aptamer-NIP/QDs在420nm-700nm范围内的发射光谱(图5(a))。
4、吸取2mL的实施例1所制备的洗脱模版分子细胞色素c核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)，到荧光比色皿中，固定荧光光谱仪发射315nm的激发光，扫描aptamer-MIP/QDs在420nm-700nm范围内的发射光谱(图5(b))。
5、吸取2mL的实施例1所制备的未洗脱模版分子细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)，到荧光比色皿中，固定荧光光谱仪发射315nm的激发光，扫描aptamer-MIP/QDs在420nm-700nm范围内的发射光谱(图5(c))。
荧光测试条件：激发光和发射光夹缝宽度均为10nm；光电倍增管电压为400V；需使用420nm长通滤光片。
从图4(a)中可以看出，巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的最大激发波长为315nm。在其发射光谱图4(b)可以看出有两个发射峰，第一个发射峰的波长是450nm，这是由于硫化锌晶体缺陷产生的短寿命发生光；由于摻杂了锰离子，量子点在595nm处有一个寿命更长、强度更大、stokes位移更大的发射峰，这是由于硫化锌基体的电子空穴对能量转移产生的。从图4(c)中可以看出，经过溶胶-凝胶法进行包硅后，制得的双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点的荧光强度有所降低，但是其发射峰波长与巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点一致，没有改变。
图5中的三个荧光发射光谱的发射峰在595nm。说明经过包裹聚合物之后，复合材料的中的量子点仍然稳定存在。对比图5(b)和图5(c),模版分子细胞色素c洗脱后，aptamer-MIP/QDs的荧光恢复到与aptamer-NIP/QDs(图5a)相当，说明模板分子已经基本洗脱完全。
结构表征试验例3：XRD表征
试验方法：将实施例1所制备的核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)研磨成均匀粉末，用压片的方法装载到玻璃样品台中，采用铜靶产生的X射线照射样品，收集样品的衍射信号。表征结果见图6。
从图6可以看出有三个明显的衍射峰，它们是双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点闪锌矿晶体结构特征峰。
实施例2、3的XRD表征结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
结构表征试验例4：透射电镜表征(TEM)
分别检测巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)的透射电镜表征(TEM)
试验方法：取少量实施例1制备的巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点和aptamer-MIP/QDs分散在去离子水中，超声分散半小时。吸取少量液体样品，滴加到超薄碳膜铜网上，干燥后，分别对量子点和aptamer-MIP/QDs分别放大2.5万倍和20万倍拍照。图7(A)是巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的透射电子显微镜表征结果和图7(B)是aptamer-MIP/QDs的透射电子显微镜表征结果。
从图7(A)中可以看出，巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点的尺寸分布均匀，粒径约为2nm。从图7(B)图可以看出，经过包硅，aptamer-MIP/QDs颗粒的粒径增大，经过聚合物的包覆，颗粒表面有一层衬度不一样的结构，说明聚合物的包覆是成功的。
实施例2、3的透射电镜表征(TEM)结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
检测条件试验例1：aptamer-MIP/QDs对细胞色素c的吸附动力学
试验方法：取实施例1制备的aptamer-MIP/QDs和对照例1制备的aptamer-NIP/QDs分别分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)配置成质量浓度为100mg/L的溶液，再分别与1.6μmol/L的细胞色素c混合，在25℃的条件下水浴，测试不同时间下(0、2、5、10、15、20、25、30、40、50、60min)，aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs在595nm处的荧光强度。探索两种复合物的吸附动力学，试验结果见图8，其中(a)是aptamer-MIP/QDs的吸附动力学试验结果，(b)是aptamer-NIP/QDs的吸附动力学试验结果。
荧光测试条件：采用315nm作为激发波长，激发光和发射光狭缝宽度均为10nm，光电倍增管电压为400V；进行荧光测试时需要使用420nm长通滤光片。
从图8中可以看出，在吸附刚刚开始时，荧光强度下降比较明显，随后下降速度逐步减慢。在吸附50min后，荧光强度趋于稳定，说明在此时，吸附和脱附到达了平衡。与aptamer-MIP/QDs相比，aptamer-NIP/QDs荧光强度下降的速率和程度更慢和更小。在吸附40min后，aptamer-NIP/QDs的荧光强度趋于稳定。这一结果说明，aptamer-MIP/QDs具有对细胞色素c特异性识别的印迹空穴，对它有更强的结合能力。因此，细胞色素c需要更长的时间进入这些空穴。为保证aptamer-MIP/QDs对不同浓度的细胞色素c有充足的时间到达平衡，作用时间优选为90分钟。
实施例2、3的试验结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
检测条件试验例2：温度对aptamer-MIP/QDs测定细胞色素c的影响
试验方法：取实施例1制备的aptamer-MIP/QDs和对照例1制备的aptamer-NIP/QDs分别分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)配置成质量浓度为100mg/L的溶液，再分别与1.6μmol/L的细胞色素c混合，然后依次放入温度为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的水浴锅中静置90min，测试aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs在595nm处的荧光强度。试验结果见图9。
荧光测试条件：与检测条件试验例1的荧光测试条件相同。
从图9可以看出，aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs在吸附细胞色素c后的荧光强度随温度的变化情况。随着温度从20℃升高至60℃，荧光强度不断下降。在20℃到30℃的范围内，猝灭后的荧光强度较为稳定。考虑到蛋白质在温度较高的条件下容易发生变性，而且荧光强度大可以保证检测的灵敏度。25℃为常温，温度条件更易实现。因此，优选的检测温度为25℃。
实施例2、3的试验结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
检测条件试验例3：pH对aptamer-MIP/QDs测定细胞色素c的影响
pH值对量子点稳定性和荧光强度，以及aptamer-MIP/QDs与细胞色素c的结合能力有很大的影响。为提高aptamer-MIP/QDs的结合性能，探索不同的pH条件对apta-MIP-CdSeQDs测定细胞色素c的影响是非常重要的。
将实施例1制备的aptamer-MIP/QDs和对照例1制备的aptamer-NIP/QDs分别分散到不同pH的缓冲溶液中，与相同浓度的细胞色素c(1.6μmol/L)在25℃下相互作用90min。测试aptamer-MIP/QDs或aptamer-NIP/QDs在加入细胞色素c前后的595nm处的荧光强度，并计算荧光猝灭效率。荧光猝灭效率为1-F/F0。试验结果见图10。
pH缓冲液：pH＝5-6乙酸-乙酸钠(10mmol/L)；pH＝7-8磷酸二氢钠-磷酸氢二钠(10mmol/L)；pH＝9-10碳酸氢钠-碳酸钠(10mmol/L)。
荧光测试条件：与检测条件试验例1的荧光测试条件相同。
pH值可以影响量子点表面的环境，从而导致了aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs的荧光强度的变化。如图10所示，随着pH值的升高，复合的荧光强度不断增大，荧光猝灭比例先增大后减小。加入相同量的细胞色素c的条件下，在pH为7-8的范围，aptamer-MIP/QDs的荧光猝灭比例较大；在pH＝7.5的时候，aptamer-MIP/QDs的荧光猝灭比例最大。这是aptamer-MIP/QDs含有对细胞色素c的特异性识别位点，pH的变化很大程度上改变了aptamer-MIP/QDs与细胞色素c之间的正负电荷的互补状态。除此之外，基于SELEX技术筛选得到的核酸适配体在温和的中性条件下对靶物质有很强的结合能力，酸性或碱性太强都会减弱它的结合能力。因此，优选的检测的基底溶液为磷酸缓冲液(pH＝7-8)，最优选的检测的基底溶液为磷酸缓冲液(pH＝7.5)。
实施例2、3的试验结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
效果试验例1：aptamer-MIP/QDs对细胞色素c的荧光传感
为了评估aptamer-MIP/QD对细胞色素c的荧光传感，分别测定aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs对不同浓度的细胞色素c的荧光响应。
试验方法：将实施例1制备的aptamer-MIP/QDs和对照例1制备的aptamer-NIP/QDs分别分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)配置成质量浓度为100mg/L的溶液，再分别与不同浓度的细胞色素c溶液混合，在温度为25℃条件下，震荡90分钟，测试其在595nm处的荧光强度。试验结果见图11-13。
细胞色素c溶液摩尔浓度分别为：0.0μmol/L、0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.8μmol/L、1.0μmol/L、1.2μmol/L、1.4μmol/L、1.6μmol/L、1.8μmol/L、2.0μmol/L、2.2μmol/L、2.5μmol/L、3.0μmol/L。
荧光测试条件：与检测条件试验例1的荧光测试条件相同。
从图11-12可以看出，aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs对细胞色素c均表现出猝灭的情况。随着细胞色素c浓度的逐渐增大，二者在595nm的橙色荧光不断减弱。相比aptamer-NIP/QDs，细胞色素c对aptamer-MIP/QDs的荧光猝灭程度更大。由此可说明aptamer-MIP/QDs具有对细胞色素c特异性识别的结合位点，它们对目标物展现出更强的亲合力。
这一荧光猝灭的体系，在一定的浓度范围内符合Stern-Volmer方程，即(F0-F)/F＝Ksvcq，cq是猝灭剂的浓度，Ksv是Stern-Volmer方程的常数。从图13可以看出，在猝灭剂浓度相同的情况下，aptamer-MIP/QDs的(F0-F)/F值大于是aptamer-NIP/QDs的三倍。计算得出，aptamer-MIP/QDs的猝灭方程为线性方程：(F0-F)/F＝1.4526c-0.3504(R2＝0.9922)。优选的，在细胞色素c浓度在0.20-2.00μmol/L的范围内，aptamer-MIP/QDs的(F0-F)/F值有良好的线性关系，线性相关系数为0.9922。
试验还通过测试10次空白溶液的荧光强度计算得到标准偏差σ，通过3倍标准偏差除以线性方程的斜率，获得细胞色素c的检出限为0.054μmol/L。
另外，aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs猝灭方程的Ksv比值可以用来评价aptamer-MIP/QDs对细胞色素c特异性识别能力。aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs对应线性方程的斜率分别为1.453和0.443。因此，Ksv比值为3.28。这表明经过了分子印迹的过程，核酸适配体-分子印迹荧光传感器(aptamer-MIP/QDs)对细胞色素c的检测灵敏度得到提高。
实施例2、3对细胞色素c的荧光传感结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
效果试验例2：aptamer-MIP/QDs的选择性
选用了溶菌酶(Lyz)、牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白(Trf)、α-糜蛋白酶(Chy)和卵清蛋白(Ova)作为模板分子细胞色素c(Cyt c)的类似物，用来考察aptamer-MIP/QDs的选择性。
试验方法：将模板分子细胞色素c(Cyt c)以及溶菌酶(Lyz)、牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白(Trf)、α-糜蛋白酶(Chy)和卵清蛋白(Ova)配置成摩尔浓度为1.6μmol/L的蛋白质溶液。取实施例1制备的aptamer-MIP/QDs分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)配置成质量浓度为100mg/L的溶液，与蛋白质溶液混合，在温度为25℃条件下，充分相互作用90分钟，测试其在595nm处的荧光强度。试验结果见图14。
荧光测试条件：与检测条件试验例1的荧光测试条件相同。
从图14可以看出，aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs对相同浓度的类似物的响应值很弱。这是因为类似物有不同的三维尺寸和结构，与印迹空穴并不匹配，aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs对类似物的吸附主要是非特异性吸附。相比与类似物的作用，aptamer-MIP/QDs和aptamer-NIP/QDs都对细胞色素c有强的响应。是因为aptamer-NIP/QDs的聚合物层也共价修饰了核酸适配体，因此它们对细胞色素c也有一定结合能力。但与aptamer-NIP/QDs比较，aptamer-MIP/QDs对细胞色素c有更高的选择性，是因为印迹聚合物层含有与Cyt c在大小、形状和化学基团互补的印迹空穴。另一方面，核酸适配体可以看成是一种特异性的功能单体，与传统的分子印迹聚合物相比这种具有双重识别能力的聚合物的选择性更强。
实施例2、3的选择性结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
效果试验例3：aptamer-MIP/QDs的竞争吸附实验
竞争吸附实验在溶菌酶-细胞色素c混合溶液和牛血清白蛋白-细胞色素c溶液中进行。
1、细胞色素c(Cyt c)与溶菌酶(Lyz)按一定比例混合(CLyz/CCyt c分别为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1；其中，细胞色素c的浓度均为0.4μmol/L)制得混合蛋白溶液。取实施例1制备的aptamer-MIP/QDs分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)配置成质量浓度为100mg/L的溶液，与混合蛋白溶液混合，在温度为25℃条件下，充分相互作用90分钟，测试其在595nm处的荧光强度。试验结果见图15。
2、细胞色素c(Cyt c)与牛血清白蛋白(BSA)按一定比例混合(CBSA/CCyt c分别为0:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1；其中，细胞色素c的浓度均为0.4μmol/L)制得混合蛋白溶液。取实施例1制备的aptamer-MIP/QDs分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)配置成质量浓度为100mg/L的溶液，与混合蛋白溶液混合，在温度为25℃条件下，充分相互作用90分钟，测试其在595nm处的荧光强度。试验结果见图16。
荧光测试条件：与检测条件试验例1的荧光测试条件相同。
从图15-16可以看出，随着溶菌酶或牛血清白蛋白的量的不断增大，荧光猝灭的情况都没有受到太大的影响，说明aptamer-MIP/QDs对细胞色素c具有很高的选择性识别能力。
实施例2、3的竞争吸附实验结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
效果试验例4：重现性考察
在不同时间，重复采用实施例1的制备方法，制备出5个不同批次的aptamer-MIP/QDs分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)配置成质量浓度为100mg/L的溶液，与摩尔浓度为1.6μmol/L的细胞色素c溶液混合，在温度为25℃条件下，充分相互作用90分钟，测试其在595nm处的荧光强度。
荧光测试条件：与检测条件试验例1的荧光测试条件相同。
5个不同批次的aptamer-MIP/QDs的荧光猝灭响应情况，如图17所示。可以看出，不同批次的响应情况差异不大，说明本发明的制备方法以及所制备出的aptamer-MIP/QDs重现性良好。
实施例2、3的重现性实验结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
效果试验例5：实际生物样品检测
为了考察本发明的aptamer-MIP/QDs能否在实际生物样品中使用，使用加标回收的方法，向人尿液和人血清空白样中加入细胞色素c(Cyt c)。
取实施例1制备的aptamer-MIP/QDs分散在磷酸缓冲液(pH＝7.5，10mmol/L)配置成质量浓度为100mg/L的溶液，与样品溶液混合，在温度为25℃条件下，充分相互作用90分钟，测试其在595nm处的荧光强度。样品及试验结果见表2。
荧光测试条件：与检测条件试验例1的荧光测试条件相同。
表2细胞色素c在样品中的加标回收率(n＝3)
Figure GDA0002636676910000181
Figure GDA0002636676910000191
从表2可以看出，加标回收率在94.5％-102.3％的范围内相对标准偏差在2.4-4.5％。说明本发明的aptamer-MIP/QDs可以高效、灵敏地检测出生物样品中的细胞色素c的含量。
实施例2、3的实际生物样品检测实验结果和实施例1基本相同，在此不再赘述。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备预作用复合物
将模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体溶解于磷酸缓冲液中，再加入甲基丙烯酸和交联剂，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；
2)制备核酸适配体—量子点复合物
向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，加入双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点和引发剂，再加入磷酸缓冲液，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；
3)洗脱模版分子细胞色素c
将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用洗脱液除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：巯基修饰的细胞色素c核酸适配体的序列为5’-HS-(CH2)6-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-(CH2)6-SH-3’。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体和甲基丙烯酸的摩尔比为1:1:(80-120)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点由以下步骤制备所得：
S1：取巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点与体积分数为50％的乙醇混合，搅拌15分钟，再加入正硅酸乙酯和氨水，搅拌反应2小时，继续加入KH570，反应4小时；
S2：步骤S1的反应液在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，分别用乙醇和水洗涤数次，得到双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、水、乙醇、正硅酸乙酯、氨水和KH570的摩尔体积比为1mol:(310-315)L：(1.2-1.3)L：(2.5-2.6)L：(0.12-0.13)L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述模版分子细胞色素c和双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点摩尔比为1：(675-750)。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；所述模版分子细胞色素c和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的摩尔比为1:(4400-4600)。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述引发剂为四甲基乙二胺和过硫酸铵；所述模版分子细胞色素c和四甲基乙二胺的摩尔体积比为1mmol：(30-40)L；所述模版分子细胞色素c和过硫酸铵的摩尔比为1：(900-980)。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述磷酸缓冲液的摩尔浓度为10mmol/L，pH值为7-8；和/或，所述洗脱液为质量分数为5％的十二烷基磺酸钠溶液。
10.一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器，其特征在于：所述核酸适配体-分子印迹荧光传感器为根据权利要求1—9中任意一项所述的制备方法制备获得的。
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