CN110437490B - 一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点及其制备方法和应用，其制备方法包括以下步骤：（1）量子点分散液制备；（2）依次将细胞色素c、丙烯酰胺和N‑异丙基丙烯酰胺、交联剂加入到步骤（1）制得的量子点分散液中，超声分散混合得到预聚合溶液；（3）将引发剂和加速剂加入到步骤（2）制得的预聚合溶液中，水浴反应，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点；（4）将温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，洗脱除去模板蛋白细胞色素c，即得温敏性分子印迹量子点。该种制备方法操作简单，成本低。采用该制备方法制备得到的温敏性分子印迹量子点具有温敏性和荧光性，能够快速灵敏的检测出细胞色素c的含量。

Description

一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点及其制备方法和应用。
背景技术
量子点（quantum dots，QD），是由II-VI（CdTe、CdSe、ZnS、ZnSe等），III-V （InP、GaN等）或IV-VI元素（PbSe等）组成的微球，也是一种零维的半导体纳米晶体或纳米微晶。量子点具有优异的光学和电学特性，包括尺寸可调、斯托克斯位移大（Stokes shift)、发射光谱窄而对称、荧光产率高、稳定性强及生物相容性高。目前量子点广泛用于生物分析领域，作为生物传感器在生物分析、荧光标记、生物成像等领域具有极大的应用前景。
分子印迹聚合物（Molecularly Imprinting polymer，MIP）是指通过交联单体与给定模板分子之间的相互作用，在聚合物基质的合成过程中形成与模板分子在大小、形状、功能基团上具有互补性能的印迹空穴，具有特异性识别和选择性吸附的高分子聚合物。
细胞色素C（Cytochrome c，Cyt c）分子量为 12 KD，是一种仅由104个氨基酸组成的含有血红素的小分子球状蛋白质。它是一种重要的标志物蛋白，是活细胞凋亡早期的重要生物标志物，在细胞水平上研究某些疾病或筛选抗癌药物具有重要的作用。
然而，现有技术中用于检测细胞色素c的分子印迹量子点并不具备温敏特性，制备过程复杂，不便于细胞色素c洗脱和再结合，重复利用率低，成本较高。如中国专利CN108801989A公开了一种用于检测细胞色素c的核酸适配体-分子印迹荧光传感器及其制备方法，其是以细胞色素c为模板分子、以巯基修饰的核酸适配体和甲基丙烯酸为功能单体，制备出一种对细胞色素c具有双重特异性识别的核酸适配体-分子印迹荧光传感器。此种方式获得的分子印迹荧光传感器虽然表现出较高的灵敏度和专一性，但是涉及到核酸适配体的筛选构建，制造过程复杂，成本较高。此外，该方法对模板细胞色素c洗脱效果不佳，降低了稳定性和再利用率，且甲基丙烯酸功能单体主要是用于有机小分子印迹，对于生物大分子并不适用，影响蛋白质分子结构，从而导致生物大分子的失活，进而影响对细胞色素c含量检测的准确性。因此，提供一种操作简便、温度敏感、灵敏度高、重复利用性强、能够快速准确检测出细胞色素c的温敏性分子印迹量子点及其制备方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种操作简便、成本低的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，制备得到的温敏性分子印迹量子点同时具有温敏特性和荧光性，可实现对细胞色素c快速高效检测，灵敏度高、重复利用性强。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
（1）将量子点溶于磷酸盐缓冲溶液中，超声分散得量子点分散液；
（2）依次将模板蛋白细胞色素c、功能单体、交联剂加入到步骤（1）制得的量子点分散液中，超声分散混合得到预聚合溶液，所述功能单体由丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺组成；
（3）将引发剂和加速剂加入到步骤（2）制得的预聚合溶液中，水浴反应，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点；
（4）将步骤（3）制得的温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，低温条件下洗脱除去模板蛋白细胞色素c，即得用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点。
上述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其中，所述步骤（1）中量子点为硫化锌量子点，所述硫化锌量子点的浓度为0.1-10%（w/v），磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.02mol/L、体积为50-1000mL，超声分散的功率为120W，时间为5-30min。
上述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其中，所述步骤（2）中交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯胺，细胞色素c的浓度为0.02-0.4%（w/v），丙烯酰胺的浓度为0.1-5.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺的浓度为0.05-5.0%（w/v），N,N’-亚甲基双丙烯胺的浓度为0.2-1.0%（w/v）。
上述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其中，所述丙烯酰胺与N-异丙基丙烯酰胺的用量比为1:1。
上述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其中，所述步骤（3）中引发剂为硫酸铵或过硫酸钾，所述加速剂为四甲基乙二胺。
上述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其中于，所述引发剂与加速剂的用量比为（5.0-50）mg：（5.0-50）μL，水浴反应的条件为温度25-50℃，时间为10-20h。
上述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其中，所述步骤（4）中洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，洗脱温度为0-45℃，洗脱时间为0.5~2h。
上述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其中，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为10-90%、乙酸的体积分数为1-15%。
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点，所述温敏性分子印迹量子点为上述制备方法制备获得的。
上述的温敏性分子印迹量子点在检测细胞色素c中的应用。
本发明提供的一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，以量子点为基质，以细胞色素c为模板蛋白，以丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺为共聚功能单体，其中N-异丙基丙烯酰胺是一种温敏材料，在低于最低共溶温度时，温敏预聚合物处于支链舒展状态，当温度逐渐升高超过最低共溶温度时，温敏预聚合物收缩聚合成微球，温度越高，链收缩的越厉害，然后再结合丙烯酰胺，能够保证印迹效果的同时，使制备得到分子印迹量子点具有温度敏感特性，且该种制备方法操作简单，成本低。
采用该制备方法制备得到的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点可以通过温度改变快速吸附和洗脱细胞色素c，在温度较高时，制备的分子印迹量子点可以大量吸附细胞色素c，随着吸附细胞色素c分子数量的增加，分子印迹量子点会发生不同程度的荧光猝灭，根据分子印迹量子点吸附待测溶液中细胞色素c前后荧光强度的变化，可以实现对待测溶液中细胞色素c浓度的快速检出。然后，在温度较低时，可以利用洗脱液快速洗脱去除分子印迹量子点吸附的细胞色素c，并且能够恢复分子印迹量子点的荧光强度，实现分子印迹量子点的再生，洗脱后获得的分子印迹量子点可以再次用于吸附细胞色素c，用于对细胞色素c含量的检测，重复利用率较高。
附图说明
图1是丙烯酰胺（AAM）、N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）两种单体以及两者混合作为功能单体对制备的分子印迹量子点的荧光强度的影响；
图2 是实施例1中制备的温敏性分子印迹量子点Ⅰ对细胞色素c的吸附动力学曲线；
图3是实施例1中制备的温敏性分子印迹量子点Ⅰ在吸附细胞色素c前后荧光强度的变化；
图4是实施例1中制备的温敏性分子印迹量子点Ⅰ在不同温度下对细胞色素c的洗脱后荧光强度的变化；
图5是实施例1制备的温敏性分子印迹量子点Ⅰ在不同温度下对细胞色素c的吸附量；
图6是制备的温敏性分子印迹量子点Ⅰ置入0 nM、0.2 nM、0.6 nM、0.8 nM、1.0nM、1.2 nM、1.4 nM、1.6nM、1.8 nM、2.0 nM的细胞色素c标准溶液后得到的荧光强度变化量-细胞色素c浓度变化曲线；
图7 是实施例1制备的温敏性分子印迹量子点Ⅰ在多次吸附-洗脱循环后的荧光稳定性；
图8 是实施例1制备的温敏性分子印迹量子点Ⅰ对细胞色素c及其它相关蛋白质的选择性试验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中使用的试剂均购买获得，市售分析纯。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
（1）硫化锌量子点的制备：首先，将氯化锌、氯化锰依次加入到50 mL纯水中，超声反应（10~60分钟）；其次，缓慢加入硫化钠，使溶液中氯化锌、氯化锰、硫化钠的摩尔范围比为20：1：25- 25：5：20，在氮气保护下，避光加热（30-80℃）反应12小时；最后，10000rpm/min下离心收集得到橘红色荧光发射的量子点；
（2）将步骤（1）中制备的硫化锌量子点溶于磷酸盐缓冲溶液中，超声分散得量子点分散液；其中，所述硫化锌量子点的浓度为0.1-10%（w/v），磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.02mol/L、体积为50-1000mL，超声分散的功率为120W、时间为5-30min；
（3）依次将模板蛋白细胞色素c、功能单体、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺加入到步骤（2）制得的量子点分散液中，超声分散混合得到预聚合溶液，所述功能单体的总浓度为1-10%（w/v），所述功能单体由丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺组成；其中，细胞色素c的浓度为0.02-0.4%（w/v），丙烯酰胺的浓度为0.1-5.0%%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺的浓度为0.05-5.0%（w/v），交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺的浓度为0.2-1.0%（w/v），丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺的用量比为（1-5）：1；
（4）将引发剂过硫酸铵或过硫酸钾和加速剂四甲基乙二胺加入到步骤（3）制得的预聚合溶液中，水浴反应，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点；其中，引发剂与加速剂的用量比为（5.0-50）mg：（5.0-50）μL，水浴反应的条件为温度25-50℃，时间为10-20h；
（5）将步骤（4）制得的温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，洗脱除去模板蛋白细胞色素c，即得用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点；其中，洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为10-90%、乙酸的体积分数为1-15%，洗脱温度为0-45℃，洗脱时间为0.5-2h。通过引入丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺两种功能单体，能够通过乙腈和乙酸的混合水溶液在低温条件下对模板蛋白细胞色素c进行洗脱，洗脱过程简单，易于实现。
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
实施例1 -温敏性分子印迹量子点Ⅰ的制备
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
（1）硫化锌量子点的制备：首先，将氯化锌、氯化锰依次加入到50 mL纯水中，超声反应30分钟；其次，缓慢加入硫化钠，使溶液中氯化锌、氯化锰、硫化钠的摩尔范围比为12:1:15，在氮气保护下，65℃下避光加热反应12小时；最后，10000rpm/min下离心收集得到橘红色荧光发射的量子点；
（2）量子点分散液的制备：将步骤（1）中制备的硫化锌量子点溶于100mL磷酸盐缓冲溶液中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH=6.5，摩尔浓度为0.02mol/L，使所述硫化锌量子点的浓度为0.5%（w/v），在120W功率下超声分散10分钟得量子点分散液；
（3）预聚合溶液的制备：依次将模板蛋白细胞色素c、功能单体丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺加入到步骤（2）制得的量子点分散液中，超声分散10分钟，混合得到预聚合溶液，其中，细胞色素c的浓度为0.1%（w/v），丙烯酰胺（AAM）的浓度为3.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为3.0%（w/v），也即是AAM：NIPAAM用量比为1:1，交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺的浓度为0.35%（w/v）；
（4）温敏性细胞色素c分子印迹量子点的制备：将引发剂过硫酸铵10mg和加速剂四甲基乙二胺10μL加入到步骤（3）制得的预聚合溶液中，30℃下水浴反应12h，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点聚合物；
（5）温敏性分子印迹量子点的制备：将步骤（4）制得的温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，所述洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为60%、乙酸的体积分数为10%，在15℃下摇床孵育洗脱0.5h，洗脱3次，除去模板蛋白细胞色素c，即得用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点Ⅰ，制得的温敏性分子印迹量子点在纯水中保存备用。
实施例2-温敏性分子印迹量子点Ⅱ的制备
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
具体制备步骤同实施例1，不同之处在于丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺的浓度不同，其中丙烯酰胺（AAM）的浓度为2.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为4.0%（w/v），也即是AAM：NIPAAM用量比为1:2。
实施例3-温敏性分子印迹量子点Ⅲ的制备
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
具体制备步骤同实施例1，不同之处在于丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺的浓度不同，其中丙烯酰胺（AAM）的浓度为1.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为5.0%（w/v），也即是AAM：NIPAAM用量比为1:5。
实施例4-温敏性分子印迹量子点Ⅳ的制备
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
具体制备步骤同实施例1，不同之处在于丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺的浓度不同，其中丙烯酰胺（AAM）的浓度为4.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为2.0%（w/v），也即是AAM：NIPAAM用量比为2:1。
实施例5-温敏性分子印迹量子点Ⅴ的制备
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
具体制备步骤同实施例1，不同之处在于丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺的浓度不同，其中丙烯酰胺（AAM）的浓度为5.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为1.0%（w/v），也即是AAM：NIPAAM用量比为5:1。
实施例6
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
（1）硫化锌量子点的制备：首先，将氯化锌、氯化锰依次加入到50 mL纯水中，超声反应10分钟；其次，缓慢加入硫化钠，使溶液中氯化锌、氯化锰、硫化钠的摩尔范围比为20:1:25，在氮气保护下，30℃下避光加热反应12小时；最后，10000rpm/min下离心收集得到橘红色荧光发射的量子点；
（2）量子点溶液的制备：将步骤（1）中制备的硫化锌量子点溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH=5.5，摩尔浓度为0.02mol/L，使所述硫化锌量子点的浓度为0.1%（w/v），在120W功率下超声分散20分钟得量子点分散液；
（3）预聚合溶液的制备：依次将模板蛋白细胞色素c、功能单体丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺加入到步骤（2）制得的量子点分散液中，超声分散10分钟，混合得到预聚合溶液，其中，细胞色素c的浓度为0.02%（w/v），丙烯酰胺（AAM）的浓度为1.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为0.5%（w/v），也即是AAM：NIPAAM用量比为2:1，交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺的浓度为0.2%（w/v）；
（4）温敏性细胞色素c分子印迹量子点的制备：将引发剂过硫酸钾5mg和加速剂四甲基乙二胺5μL加入到步骤（3）制得的预聚合溶液中，25℃下水浴反应10h，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点；
（5）温敏性分子印迹量子点的制备：将步骤（4）制得的温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，所述洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为10%、乙酸的体积分数为1%，在0℃下摇床孵育洗脱0.5h，洗脱3次，除去模板蛋白细胞色素c，即得用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点。
实施例7
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
（1）硫化锌量子点的制备：首先，将氯化锌、氯化锰依次加入到50 mL纯水中，超声反应25分钟；其次，缓慢加入硫化钠，使溶液中氯化锌、氯化锰、硫化钠的摩尔范围比为15:1:10，在氮气保护下，40℃下避光加热反应12小时；最后，10000rpm/min下离心收集得到橘红色荧光发射的量子点；
（2）量子点分散液的制备：将步骤（1）中制备的硫化锌量子点溶于500mL磷酸盐缓冲溶液中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH=6，摩尔浓度为0.02mol/L，使所述硫化锌量子点的浓度为5%（w/v），超声分散10分钟得量子点分散液；
（3）预聚合溶液的制备：依次将模板蛋白细胞色素c、功能单体丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺加入到步骤（2）制得的量子点分散液中，超声分散10分钟，混合得到预聚合溶液，其中，细胞色素c的浓度为0.2%（w/v），丙烯酰胺（AAM）的浓度为2.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为1.5%（w/v），交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺的浓度为0.5%（w/v）；
（4）温敏性细胞色素c分子印迹量子点的制备：将引发剂过硫酸铵25mg和加速剂四甲基乙二胺25μL加入到步骤（3）制得的预聚合溶液中，45℃下水浴反应15h，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点；
（5）温敏性分子印迹量子点的制备：将步骤（4）制得的温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，所述洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为25%、乙酸的体积分数为7.5%，在22.5℃下摇床孵育洗脱1h，洗脱3次，除去模板蛋白细胞色素c，即得用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点。
实施例8
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
（1）硫化锌量子点的制备：首先，将氯化锌、氯化锰依次加入到50 mL纯水中，超声反应40分钟；其次，缓慢加入硫化钠，使溶液中氯化锌、氯化锰、硫化钠的摩尔范围比为15:3:12，在氮气保护下，55℃下避光加热反应12小时；最后，10000rpm/min下离心收集得到橘红色荧光发射的量子点；
（2）量子点分散液的制备：将步骤（1）中制备的硫化锌量子点溶于750mL磷酸盐缓冲溶液中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH=6.7，摩尔浓度为0.02mol/L，使所述硫化锌量子点的浓度为7.5%（w/v），超声分散25分钟得量子点分散液；
（3）预聚合溶液的制备：依次将模板蛋白细胞色素c、功能单体丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺加入到步骤（2）制得的量子点分散液中，超声分散10分钟，混合得到预聚合溶液，其中，细胞色素c的浓度为0.3%（w/v），丙烯酰胺（AAM）的浓度为3.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为5.0%（w/v），交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺的浓度为0.8%（w/v）；
（4）温敏性细胞色素c分子印迹量子点的制备：将引发剂过硫酸铵35mg和加速剂四甲基乙二胺25μL加入到步骤（3）制得的预聚合溶液中，45℃下水浴反应16h，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点；
（5）温敏性分子印迹量子点的制备：将步骤（4）制得的温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，所述洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为70%、乙酸的体积分数为12%，在27.5℃下摇床孵育，洗脱1.5h，洗脱3次，除去聚合物中的模板蛋白细胞色素c，即得用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点。
实施例9
一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
（1）硫化锌量子点的制备：首先，将氯化锌、氯化锰依次加入到50 mL纯水中，超声反应60分钟；其次，缓慢加入硫化钠，使溶液中氯化锌、氯化锰、硫化钠的摩尔范围比为20:5:20，在氮气保护下，80℃下避光加热反应12小时；最后，10000rpm/min下离心收集得到橘红色荧光发射的量子点；
（2）量子点分散液的制备：将步骤（1）中制备的硫化锌量子点溶于1000mL磷酸盐缓冲溶液中，所述磷酸盐缓冲溶液的pH=6.9，摩尔浓度为0.02mol/L，使所述硫化锌量子点的浓度为9.0%（w/v），超声分散30分钟得量子点分散液；
（3）预聚合溶液的制备：依次将模板蛋白细胞色素c、功能单体丙烯酰胺和N-异丙基丙烯酰胺、交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺加入到步骤（2）制得的量子点分散液中，超声分散30分钟，混合得到预聚合溶液，其中，细胞色素c的浓度为0.4%（w/v），丙烯酰胺（AAM）的浓度为5.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为5.0%（w/v），交联剂N,N’-亚甲基双丙烯胺的浓度为1.0%（w/v）；
（4）温敏性细胞色素c分子印迹量子点的制备：将引发剂过硫酸铵50mg和加速剂四甲基乙二胺45μL加入到步骤（3）制得的预聚合溶液中，50℃下水浴反应10h，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点；
（5）温敏性分子印迹量子点的制备：将步骤（4）制得的温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，所述洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为70%、乙酸的体积分数为15%，在45℃下摇床孵育，洗脱2h，洗脱3次，除去聚合物中的模板蛋白细胞色素c，即得用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点。
对比例1-分子印迹量子点1的制备
一种分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
具体制备步骤同实施例1，不同之处在于功能单体的种类不同，本对比例中功能单体单纯使用浓度为6%（w/v）的丙烯酰胺（AAM）。
对比例2-分子印迹量子点2的制备
一种分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
具体制备步骤同实施例1，不同之处在于功能单体的种类不同，本对比例中功能单体单纯使用浓度为6%（w/v）的N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）。
对比例3-分子印迹量子点3的制备
一种分子印迹量子点的制备方法，其包括以下步骤：
具体制备步骤同实施例1，与实施例1不同之处在于功能单体的用量，本对比例中丙烯酰胺（AAM）的浓度为6.0%（w/v），N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAM）的浓度为9.0%（w/v），所述功能单体的总浓度为15%（w/v）。 当单体总浓度超过15%时，制备的预聚合溶液会发生明显的团聚和自凝结现象，难以再次分散进行下一步制备。
制备工艺试验例1-功能单体种类和用量的优化
分别取对比例1制备得到的分子印迹量子点1水溶液（AAM）、对比例2制备得到的分子印迹量子点2水溶液（NIPAAM）、实施例1制备得到的分子印迹量子点Ⅰ水溶液（1:1）、实施例2制备得到的分子印迹量子点Ⅱ水溶液（1:2）、实施例3制备得到的分子印迹量子点Ⅲ水溶液（1:5）、实施例4制备得到的分子印迹量子点Ⅳ水溶液（2:1）、实施例5制备得到的分子印迹量子点Ⅴ水溶液（5:1）测定其在586nm处的荧光强度，具体测试结果如图1所示。
从图1中可以看出，单独使用NIPAAM作为功能单体时，分子印迹量子点2的荧光强度较弱，而使用AAM作为功能单体时，分子印迹量子点1的荧光强度较强，但是AAM功能单体并不具备温敏特性，故为了保证制备的分子印迹量子点能同时具备温敏特性和较好的荧光性能，选用了AAM和NIPAAM作为共聚功能单体，从图1中可以看出，AAM和NIPAAM作为共聚功能单体时制备的分子印迹量子点的荧光强度整体是高于单独使用NIPAAM作为功能单体时制备的分子印迹量子点的荧光强度，尤其是在AAM和NIPAAM浓度（w/v）比为1:1时，制备得到的温敏性分子印迹量子点在15℃时可以有效的洗脱去除量子点上结合的模板蛋白细胞色素c，且荧光强度得到明显恢复高于其它单体比例时制得的分子印迹量子点。
检测条件试验例1-温敏性分子印迹量子点对细胞色素c的吸附动力学
将实施例1制备得到的50 mg温敏性分子印迹量子点Ⅰ溶于100mL浓度为2.0 nM的细胞色素c标准溶液中，在50℃下孵育，待分别在0min、1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min时取2mL量子点分散液到荧光比色皿中，设置激发波长为310 nm，扫描测定温敏性分子印迹量子点Ⅰ水溶液在586nm波长处的荧光强度，具体测试结果如图2所示。
从图2中可以看出，随着孵育时间的增加，吸附细胞色素c后的温敏性分子印迹量子点在586nm处的荧光强度逐渐下降，在第8分钟时荧光强度降到最低，此后分子印迹量子点的荧光强度不在发生变化。根据温敏性分子印迹量子点在不同时间吸附细胞色素c荧光强度的变化，可以确定温敏性分子印迹量子点对细胞色素c的最佳吸附反应时间为8分钟。
检测条件试验例2-温敏性分子印迹量子点吸附细胞色素c前后荧光强度的变化
吸取实施例1制得的温敏性分子印迹量子点Ⅰ水溶液2mL（0.5 g/L）到荧光比色皿中，设置激发波长为310nm，扫描温敏性分子印迹量子点Ⅰ水溶液在500-700nm波长内的发射光谱，具体测试结果如图3中实线所示。
将实施例1制备得到的50 mg温敏性分子印迹量子点Ⅰ溶于100mL、浓度为2.0nM的细胞色素c标准溶液中，在50℃下孵育8分钟，待吸附饱和后，取2mL吸附细胞色素c后的溶液到荧光比色皿中，设置激发波长为310 nm，扫描温敏性分子印迹量子点Ⅰ水溶液在500-700nm波长内的发射光谱，具体测试结果如图3中虚线所示。
从图3中可以看出，未吸附细胞色素c前的温敏性分子印迹量子点在586nm处有明显的荧光发射峰，而吸附细胞色素c后，其发射峰显著降低，荧光强度仅为结合前的37.4%，说明，随着吸附细胞色素c分子数量的增加，分子印迹量子点会发生不同程度的荧光猝灭。根据温敏性分子印迹量子点吸附细胞色素c前后荧光强度的变化，可以实现对待测样品中细胞色素c浓度的快速检测。
检测条件试验例3-温度对温敏性分子印迹量子点吸附细胞色素c的影响
将实施例1制备得到的50 mg温敏性分子印迹量子点Ⅰ溶于100 mL、浓度为2.0nM的细胞色素c标准溶液中，平行试验8组，分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下孵育8分钟，待吸附饱和后，分别离心取上清液2mL，在520nm处测定其紫外吸收值，根据细胞色素c-紫外吸收值标准工作曲线计算出上清液中细胞色素c含量，测得温敏性量子点在不同温度下对细胞色素c的吸附量，具体测试结果如图4所示。
从图4中可以看出在0-70℃之间，温敏性分子印迹量子点Ⅰ对细胞色素c的吸附量随着温度的升高是先升高后降低，在50℃时，吸附量达到最大。
检测条件试验例4-洗脱温度对敏性分子印迹量子点荧光强度的影响
将实施例1制备得到的500 mg温敏性分子印迹量子点Ⅰ溶于1000mL、浓度为2.0nM的细胞色素c标准溶液中，在50℃下孵育8分钟，待吸附饱和后，离心，得聚合物，将得到的聚合物置于洗脱液中，所述洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为60%、乙酸的体积分数为10%，平行试验10组，分别在0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下摇床孵育洗脱0.5h，洗脱3次，除去聚合物中的模板蛋白细胞色素c，并对相应温度下制得的温敏性分子印迹量子点测定其在586nm处的荧光强度，具体测试结果如图5所示。
从图5中可以看出，在洗脱温度为15℃时，对细胞色素c的洗脱效果最好，洗脱后再次获得的温敏性分子印迹量子点的荧光强度最强，可以再次用于对细胞色素c的吸附，实现了温敏性分子量子点的再重复利用。
实施例10-检测方法
一种利用温敏性分子印迹量子点检测细胞色素c的方法，使用实施例1制备的温敏性分子印迹量子点Ⅰ，并按照以下步骤完成：
（1）标准曲线的绘制：将温敏性分子印迹量子点Ⅰ分散在浓度分别为0nM、0.2nM、0.6nM、0.8nM、1.0nM、1.2nM、1.4nM、1.6nM、1.8nM、2.0nM的细胞色素c标准溶液中，在50℃下孵育，待吸附饱和后，在激发波长为310nm，发射波长为586nm处测定其荧光强度，根据细胞色素c的浓度和586nm处的荧光强度，绘制“荧光强度-细胞色素c浓度”标准工作曲线，如图6所示，算出工作方程；
（2）待测样品中细胞色素c含量的测定：将步骤（1）所用的温敏性分子印迹量子点加到待测样品中，在50℃下孵育，待吸附饱和后，在激发波长为310nm，发射波长为586nm处测定其荧光强度，将所得的荧光强度数值带入工作方程得到待测样品中细胞色素c含量。
从图6中可以看出，所述检测细胞色素c的方法对细胞色素c的线性检测范围为0.2-2.0nM，检测方程为y=191.02x-31.30，线性相关系数为0.9918，检测限为0.1526nM。
将步骤（1）所用的20mg温敏性分子印迹量子点分别加到100mL中含有细胞色素c的牛血清蛋白溶液和牛血红蛋白溶液样品中，在50℃下孵育，待吸附饱和后，在激发波长为310nm，发射波长为586nm处测定其荧光强度，根据工作方程计算的溶液中细胞色素c的含量结果如表1所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从表1可知，温敏性分子印迹量子点Ⅰ可以有效测定含有细胞色素c的样品，回收率在96.2%-103.6%之间，RSD为1.89%-2.51%，实现了样品中细胞色素c的准确测定。
实施例11-分子印迹温敏性量子点的重复性
将实施例1制备得到的500 mg温敏性分子印迹量子点Ⅰ溶于1000mL、浓度为2.0nM的细胞色素c标准溶液中，在50℃下孵育8分钟，待吸附饱和后，10000 rpm/min下离心收集聚合物，将得到的聚合物置于洗脱液中，所述洗脱液为乙腈和乙酸的混合水溶液，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为60%、乙酸的体积分数为10%， 15℃下摇床孵育洗脱0.5h，每次洗脱3次，除去聚合物中的模板蛋白细胞色素c。将上述试验过程重复循环七次，并测定每次吸附/洗脱后温敏性分子印迹量子点在586nm处的荧光强度，具体测试结果如图7所示。
从图7可知，在吸附-洗脱反复进行五次后，制备的分子印迹温敏量子点在586nm下的荧光强度没有发生明显变化。每次在50℃下吸附模板细胞色素c后，荧光都发生明显猝灭，而在15℃下洗脱后荧光强度得到显著恢复。在洗脱超过五次后，制备的分子印迹温敏量子点与之前相比，荧光强度略有下降。因此，为了保证制备的分子印迹温敏性量子点的性能，吸附-洗脱的重复利用次数为五次。
实施例12-分子印迹温敏性量子点的选择特异性
将实施例1制备得到的500 mg温敏性分子印迹量子点Ⅰ分别溶于1000mL、浓度为2.0nM的细胞色素c（Cyt c）、血红蛋白（Hb）、血清蛋白（HSA）、溶菌酶（Lyz）以及辣根过氧化物酶（HRP）的标准溶液中，在50℃下孵育8分钟，待吸附饱和后，测定每组温敏性分子印迹量子点在586nm处的荧光强度，具体测试结果如图8所示。
由图8可知，制备的温敏性分子印迹量子点在吸附结合细胞色素c后荧光强度下降量明显，表现出明显的荧光猝灭现象；而相对于模板细胞色素c蛋白质，制备的温敏型分子印迹量子点在结合其他四种对比蛋白质分子后荧光强度变化不大，荧光猝灭程度明显低于细胞色素c对分子印迹量子点的影响。这说明本发明制备的温敏性量子点具有明显的选择特异性，对细胞色素c的分析具有高选择性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。

Claims (7)

1.一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将量子点溶于磷酸盐缓冲溶液中，超声分散得量子点分散液；
（2）依次将模板蛋白细胞色素c、功能单体、交联剂加入到步骤（1）制得的量子点分散液中，超声分散混合得到预聚合溶液，所述功能单体由丙烯酰胺和 N -异丙基丙烯酰胺组成；
（3）将引发剂和加速剂加入到步骤（2）制得的预聚合溶液中，水浴反应，离心，得温敏性细胞色素c分子印迹量子点；
（4）将步骤（3）制得的温敏性细胞色素c分子印迹量子点置于洗脱液中，低温条件下洗脱除去模板蛋白细胞色素c，即得用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点；
所述步骤（1）中量子点为硫化锌量子点，所述硫化锌量子点的浓度为0.1-10%（w/v），磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.02mol/L，体积为50-1000mL，超声分散的功率为120W、时间为5-30min；
所述步骤（2）中交联剂为 N,N’ -亚甲基双丙烯胺，细胞色素c的浓度为0.02-0.4%（w/v），丙烯酰胺的浓度为0.1-5.0%（w/v）， N -异丙基丙烯酰胺的浓度为0.05-5.0%（w/v）， N,N’ -亚甲基双丙烯胺的浓度为0.2-1.0%（w/v）；
所述丙烯酰胺与 N -异丙基丙烯酰胺的用量比为1:1。
2.根据权利要求1所述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中引发剂为过硫酸铵或过硫酸钾，所述加速剂为四甲基乙二胺。
3.根据权利要求2所述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其特征在于，所述引发剂与加速剂的用量比为（5.0-50）mg： （5.0-50）μL，水浴反应的条件为温度25-50℃，时间为10-20h。
4.根据权利要求1所述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中洗脱液为乙腈和乙酸的水溶液，洗脱温度为0-45℃，洗脱时间为0.5-2h。
5.根据权利要求4所述的用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点的制备方法，其特征在于，所述混合水溶液中乙腈的体积分数为10-90%、乙酸的体积分数为1-15%。
6.一种用于检测细胞色素c的温敏性分子印迹量子点，其特征在于，所述温敏性分子印迹量子点为根据权利要求1-5任意一项所述制备方法制备获得的。
7.根据权利要求6所述的温敏性分子印迹量子点在非诊断性检测细胞色素c中的应用。
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