CN111004837A - 一种用于原位凋亡信号通路成像的一体式dna纳米元件 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于细胞凋亡信号通路有效成像的DNA纳米器件的设计原理、最优条件及其成像应用。虽然许多细胞凋亡信号通路已由经典的分子生物学技术所揭示,但细胞凋亡相关研究仍然迫切需要研发具有可操作性和高效率的技术和方法。为此,我们设计了一种DNA纳米器件,它是通过在金纳米颗粒表面组装一层Y型DNA结构所构建而成。只有包含了上游的锰超氧化物歧化酶信使RNA和下游的细胞色素c的凋亡信号通路作为输入时,DNA纳米器件才能执行“与”逻辑门操作,使Y型DNA从金纳米颗粒表面去组装,输出荧光信号。与靶向单个信号分子的分析方法相比,本发明中的DNA纳米器件同时表征上下游两个相关的信号分子,可以实现对细胞凋亡的信号通路直接的原位分析。

Description

一种用于原位凋亡信号通路成像的一体式DNA纳米元件
技术领域
本发明属于生物分析化学领域,尤其涉及一种一体式纳米元件,用于对凋亡信号通路进行有效成像的构建及应用,该纳米元件是通过在金纳米粒子 (AuNP)上组装精心设计的Y形DNA(Y-DNA)层而构建的。只有当涉及锰超氧化物歧化酶(MnSOD)mRNA和下游cyt c的凋亡信号通路作为输入时,纳米器件才能执行“和”逻辑门操作,从纳米颗粒中分解Y-DNA,然后输出荧光信号。
发明背景
细胞凋亡是细胞死亡的三种典型形式之一,是一种保守的、不可逆的程序性细胞死亡,在生物体内受到严格的调控。细胞凋亡调控的放松与多种人类疾病密切相关,如细胞凋亡相关的神经退行性疾病和移植排斥、细胞凋亡相关的自身免疫性疾病、癌症和某些病毒感染。因此,阐明细胞凋亡的激活机制和监测细胞凋亡的进展对于细胞生物学和人类疾病的预防都是必不可少的。
细胞凋亡的激活参与了由线粒体途径、死亡受体途径和内质网应激途径组成的相互交织的网络中。每个激活途径都由各种凋亡分子介导的信号途径组成,如线粒体途径中的细胞色素c(Cyt c)依赖的信号途径作为死亡受体通路中配体介导的信号通路。通过一些经典的分子生物学技术已经很好地揭示了这些通路。然而,在细胞凋亡相关疾病的诊断和治疗中,开发具有相当的可操作性和成本效益的技术是非常必要的。此外,在信号网络中发现了具有协同作用或拮抗作用的不同信号通路之间的相互作用,迫切需要从复杂的相互作用信号通路中准确识别出一种特定的信号通路,这对机制研究和药物发现也具有重要意义。然而,传统的方法通常是分别针对两个或两个以上的相关分子来定义信号通路。模拟物、活化剂或抑制剂也需要关联目标分子,使该程序适合机制研究,但费力且不利于实际应用,包括准确识别感兴趣的信号通路。
解决上述问题的一种可能方法是逻辑分析信号通路中的几个相关靶分子,并最终输出能够反映该通路的单个信号。因此,由于原位分析能够避免复杂的分离和提取步骤,并能在单细胞水平上提供信号通路的动态信息,因此是首选的分析方法。最近,许多方法和探针已经被开发出来用于原位分析,但通常仅限于针对单个分子,这不能用于信号通路的分析。鉴于此,我们提出了一种策略,通过逻辑分析揭示信号通路而不是单个信号分子。分析一个上游的mRNA 和一个下游的信号蛋白,它们之间的联系描述了一个最简单的正调节信号通路。在我们的策略中,一个设计良好的一体式DNA纳米元件被制造出来。只有当上游mRNA和下游蛋白共存时,纳米元件才执行“和”逻辑门操作,并最终输出荧光信号。由于该分析系统集成度高、易访问、可用于活细胞,作为药物发现的细胞分析模型、凋亡过程的动态监测等具有广阔的应用前景。
发明内容
在本发明中,为了构建一体式DNA纳米器件,所有的DNA成分,包括 mRNA和Cyt c-特异性适体的互补序列,都被捕获在精心设计的Y形DNA(Y- DNA)结构中,然后组装在锚定DNA修饰的金纳米粒子(A-DNA-AuNPs)上。通过标记叶酸,Y-DNA连接的AuNP(Y-AuNP)纳米器件可以被细胞高效地内化到细胞质中,而不会穿透细胞核和线粒体。细胞凋亡激活后,内化纳米器件可以进行“和”逻辑门操作,将线粒体释放到细胞质中的mRNA和Cyt c作为两个输入,然后输出荧光信号。从线粒体到细胞质的Cyt c易位,使Cyt c和逃逸的适配体由Y-DNA的DNA双链组成,由mRNA驱动,紧密相互作用,与适配体竞争结合。Cyt c-适体复合物的形成诱导了青色素5(cy5)和黑洞猝灭剂2(BHQ-2)的分离,产生了明显的荧光增强。因此,该纳米器件允许以高特异性分析一个mRNA和Cyt c相关的信号通路。但是其他的信号通路,可能与靶信号通路相互作用,导致凋亡网络中的Cyt c释放,不能激活纳米元件 (图1)。
根据上述机理,本发明所涉及的这种适体纳米探针的构建和应用,其具体实施过程如下:
1、DNA双链体对Cyt c的反应。
将等摩尔浓度的Cyt c适体及其互补DNA(0.1μM)混合在一起并在 95℃下变性5分钟,然后使其自然冷却至室温(超过2小时)。随后,将20μM Cyt c加入溶液中并在37℃下孵育1.5小时,并用荧光分光光度计 (F-7000,Hitachi)测量荧光。
2、由mRNA驱动的Y-DNA对Cyt c的体外反应。
首先,使用一锅法合成Y-DNA,即将等摩尔的Ya,Yb和Yc在PBS缓冲液中混合,在95℃下变性10分钟,然后每5分钟将混合物依次降至5℃。在最低温度降至25℃之前,最后将混合物在室温下再孵育1小时。将合成的Y-DNA与0.1μM mRNA和20μM Cyt c在37℃下孵育1.5小时,并使用荧光分光光度计记录荧光变化。
3、AuNPs的合成。
根据报道的方法,通过种子介导的生长方法合成20nm的AuNP,并进行微小的修改。简而言之,在剧烈搅拌下将80mL 2.2mM柠檬酸钠溶液在三颈圆底烧瓶中加热至沸腾15分钟。然后注入533μL HAuCl4(25mM)并使其反应直至溶液的颜色在10分钟内从黄色变为柔和的粉红色。合成Au 种子后,将溶液冷却至90℃。随后,依次加入533μL的60mM柠檬酸钠和533μL的25mM HAuCl4溶液,延迟2分钟。通过重复7个生长步骤 (顺序注射533μL的60mM柠檬酸钠和533μL的25mM HAuCl4)获得 20nm的AuNP。将合成的AuNP自然冷却至室温,最后在使用前储存在4℃。
4、Y-DNA-AuNPs的构建。
用1mM TCEP活化100μL 10μM锚DNA(A-DNA)。1小时后,将A- DNA溶液与浓度比为250∶1的4nM AuNP在室温下孵育16小时。第二天,加入120μL MPEG-SH并继续孵育1小时。然后向混合物中加入2M NaCl,以逐步的方法达到0.2M的最终盐浓度。24小时后,通过以13000rpm离心10分钟除去未修饰的A-DNA,并用Tris-HCl(10mM Tirs,10mM NaCl,pH7.5)洗涤两次。通过将A-DNA-AuNP与制备的Y-DNA在45℃下孵育2小时来构建 Y-DNA-AuNP。冷却至室温后,通过以13000rpm离心10分钟除去未结合的 Y-DNA,并用Tris-HCl(10mM Tris,10mMNaCl,pH7.5)洗涤两次。最后,将制备的Y20-AuNP再分散在PBS中并在4℃下储存备用。
具体表征验证
1、Y-DNA和Y20-AuNPs的组装和构建
我们已经研究了Cyt c是否可以靶向适体-包含的双链DNA杂交复合物 (图2)。结果清楚地表明,Cyt c可以竞争性地结合适体序列并干扰DNA杂交复合物,导致双链体中猝灭荧光的激活(图3)。进一步的研究表明,当它经历具有20个碱基对的ds20时,仍观察到Cytc与适体的强结合亲和力(图 3C)。接下来,通过一锅合成组装三种Y-DNA结构,包括Y12,Y15和Y20,即,三种合理设计的寡核苷酸(Ya,Yb和Yc)以相等的摩尔数混合在一起(图4)。通过凝胶电泳评估组装过程,其中可以分析Y-DNA及其组分的迁移率(图5)。结果表明,Ya,Yb和Yc混合在一起后,凝胶上可以清楚地看到一条分子量较高的条带,其迁移率小于其组分,表明Y-DNA成功组装。
相比之下,Y20作为mRNA和Cyt c响应的探针可以获得更高的信噪比 (SNR)(图6),因此Y20作为最佳候选物在AuNP上组装以构建Y-DNA- AuNPs纳米器件(图7A)。透射电子显微镜(TEM)图像表明Y20-AuNP的平均直径为~20nm并且它们呈现良好的分散性(图7B)。AuNPs的吸收峰的红移和DNA的特征吸收峰的增加表明纳米装置的逐层组装是成功的(图7C)。此外,还进行了动态光散射(DLS)以分析Y20-AuNP组装过程中的流体动力学直径变化(图7D-F)。观察到与裸AuNP相比,A-DNA-AuNP的流体动力学直径从31.2nm增加至59.9nm,并且在加载Y20后进一步增加至69.9nm。所有表征结果表明Y20-AuNPs已成功构建。
2、实验可行性验证
为了清楚地证明我们设计的可行性,已经研究了在不同输入条件下刺激诱导的Y20从AuNPs表面的分解。如图8A所示,在不存在mRNA和Cyt c的情况下, Y20保持完整的Y形结构,因此荧光被灭活。mRNA或Cyt c的添加仅能诱导很少的荧光变化,表明标记的染料和猝灭剂保持彼此非常接近。然而,mRNA 和Cyt c的共刺激可导致Y-DNA的分解,与不存在mRNA和Cyt c的情况相比伴随着荧光强度增加5.85倍(图8B)。作为对照,利用与Cyt c亲和力差的 Cyt c适体(Ya1)的缩短序列构建新的纳米装置(表示为n1Y20-AuNP)。如所预期的,即使n1Y20-AuNP经受mRNA和Cyt c的共刺激,也不能检测到强荧光增强,这证明n1Y20-AuNP保持完整(图9)。此外,已经构建了n2Y20- AuNPs纳米装置,其中Yc序列不能与mRNA杂交,以检查对mRNA和Cyt c 的响应。结果表明,即使存在mRNA和Cyt c,n2Y20-AuNPs纳米装置也不能被激活(图9)。进一步的研究表明,输出荧光信号随着反应时间的增加而逐渐增加,并在45分钟后达到平衡(图10)。此外,发现荧光信号随着Cyt c浓度的增加而增加并且具有正线性相关性(图8C,D)。线性响应范围为0.05μ M至15μM,检测限为16nM,覆盖凋亡细胞中细胞溶质Cyt c的文献值(1- 10μM)。因此,构建的纳米器件可能提供用于获得Cyt c介导的信号传导途径的动态信息的平台。
3、稳定性分析
已经研究了Y20-AuNP在不同介质中的稳定性,包括PBS,DMEM和血浆提取物。结果表明,随着时间的推移,在这些溶液中没有观察到明显的荧光变化(图11A)。同时,在将mRNA添加到这些溶液中之后,除了由mRNA引起的背景信号变化之外,没有观察到强烈的荧光增强(图11B)。总之,这些结果表明,制造的纳米器件在复杂环境中是稳定的,甚至在血浆提取物中也是如此。值得注意的是,虽然细胞质中存在细胞色素c(一种未成熟形式的细胞色素c),但纳米装置不受血浆提取物的干扰,这实际上证明了从成熟血红素细胞中区分细胞色素c的高特异性。
4、细胞活动分析
在细胞内使用之前,已经研究了Y20-AuNP对活细胞的毒性。将不同浓度的Y20-AuNP与具有阳性叶酸受体(FR)的HeLa细胞一起温育8小时后,通过使用商业细胞计数试剂盒-8(CCK-8)评估毒性。结果,测量的细胞活力超过95%(图12A),证明了纳米装置的高生物相容性。使用商业细胞内半胱天冬酶-3探针与Y20-AuNP温育后HeLa细胞的荧光成像表明未观察到胱天蛋白酶-3活化(图12B)。因此,制造的纳米装置本身不会诱导细胞中的凋亡信号传导,但它具有揭示活细胞中凋亡信号传导途径的潜力。
5、该装置的概念验证
在询问纳米装置的体外反应后,已经探索了其在活细胞中可能分析凋亡信号传导途径的能力。作为概念验证,涉及上游MnSOD mRNA和下游Cyt c的信号传导途径用于促进活细胞中纳米装置的分解。已知MnSOD的异常表达可以激活Cyt c释放介导的信号传导途径。如所预期的,在无血清DMEM中将 MnSOD mRNA表达的HeLa细胞与Y20-AuNP孵育1.5小时后仅可见的弱红色荧光信号(图13A)。微小的荧光信号归因于位于线粒体膜间隙中的Cyt c的Y20-AuNP的空间隔离。然而,在用星形孢菌素(STS)(细胞凋亡诱导试剂) 处理HeLa细胞后,Cyt c将通过线粒体膜转移到细胞质。Cyt c的易位使其和由mRNA诱导的纳米装置中逃逸的Ya-Yb双链体发生紧密相互作用,导致明显的荧光增加。因此,在HeLa细胞中观察到更亮的红色荧光图像(图13B)。此外,更高浓度的STS可以导致更亮的红色荧光增强(图13C)。荧光变化证实纳米装置的分解是mRNA和Cyt c依赖性的。此外,如果Hepa细胞用胃酶抑素A预处理,胃蛋白酶抑制剂A抑制Cyt c从暴露于STS的线粒体释放,在 STS处理的细胞中只能获得非常弱的红色荧光信号(图13D)。结果进一步验证了该方法的开启荧光特征。作为对照,用缩短的适体(Ya1)制备的n1Y20- AuNP也与凋亡的HeLa细胞一起孵育。然而,在STS处理的细胞中没有观察到明显的荧光信号(图13E),这与体外记录的荧光变化一致(图9)。流式细胞术测定也证实了这些结果(图13F)。这些结果表明Cyt c从线粒体释放到细胞质中对于荧光激活是必需的,这意味着纳米装置可能用于分析细胞凋亡中 Cyt c的释放。
作为另一个对照实验,将n2Y20-AuNP与HeLa细胞一起温育,然后进行 STS处理,然后观察荧光变化。毫不奇怪,与用Y20-AuNP孵育的细胞的强红色荧光增加相反,在HeLa细胞中仅可见非2常弱的荧光信号(图14)。这显然是因为n2Y20-AuNPs不能提供与mRNA杂交的互补序列,间接下调MnSOD mRNA的表达。纳米器件仅在存在Cyt c时才能执行逻辑门操作,这与体外实验结果一致(图9)。因此,Y20-AuNPs纳米装置只有在经受MnSOD mRNA 和Cyt c时才能执行“与”逻辑操作并输出荧光信号。因此,通过纳米装置可以实现通过MnSOD mRNA和Cyt c的连接表征来代替单个分子的信号传导途径的可用分析。
3、该纳米元件的独特性
一些信号传导途径之间的交叉可以针对Cyt c的释放,因此对来自复杂串扰信号传导途径的特定信号传导途径的准确分析对于凋亡机制研究是非常重要的。为了验证所设计的纳米器件对MnSOD mRNA和Cyt c依赖性凋亡信号通路的可能分析的独有性,另一种纳米器件(定义为n3Y20-AuNPs),其能够分析c-Myc和Cyt c依赖性凋亡信号传导。途径,也是在这项工作中设计和制造的。MnSOD和c-Myc可以在不同的凋亡信号传导途径中激活线粒体中的Cyt c释放(图15A和图16)。如图15所示,将MnSOD mRNA和c-Myc mRNA 的DNA类似物转染到细胞中以分别上调细胞中mRNA的水平。已经通过共聚焦激光扫描显微镜检查了具有不同表达水平的mRNA的HeLa细胞中两种纳米装置的性能。获得的图像表明,与未转染细胞或正常HeLa细胞产生的红色荧光相比,MnSOD mRNA上调的HeLa细胞可以产生更高的红色荧光。此外,在MnSOD mRNA上调后,HeLa细胞与n3Y20-AuNP一起温育,与STS处理的细胞产生的红色荧光相比,没有进一步的红色荧光增加。在c-Myc mRNA上调的 HeLa细胞与两种纳米装置一起温育后,也可以观察到这些变化。因此,这些结果证实仅涉及MnSOD mRNA和Cyt c的信号传导途径可以刺激Y20-AuNP的分解,导致荧光增加。即使mRNA被上调或Cyt c从线粒体释放,其他信号传导途径也不能激活纳米装置。另一方面,与靶向单个分子的常规方法相比,我们的策略适用于准确鉴定感兴趣的信号传导途径而无需费力和不利的操作,同时避免来自串扰信号传导途径的干扰(图15C)。
4、该装置的稳定性
设计的用于实时监测Cyt c易位动力学的纳米装置,其在询问凋亡信号传导途径中是重要的。在STS处理的HeLa细胞内,记录时间依赖性荧光信号。很明显,随着孵育时间的增加,荧光信号变得更强。此外,红色荧光信号在20 分钟后显着增加,并在45分钟后达到最大强度(图17)。因此,我们设计的 Y20-AuNP可用于揭示细胞凋亡信号通路中的原位Cyt c释放。
8、结论
总之,我们已经提出了一种一体化DNA纳米装置,其可以应用于凋亡细胞中凋亡信号传导途径的可用分析。通过在AuNP上组装精心设计的Y-DNA可以容易地制备纳米装置,其可以由信号传导途径中的特定分子驱动而被分解。纳米器件可以提供用于体内操作的“开启”工具,具有灵敏度,稳定性,选择性,生物相容性和增强的细胞内化效率。作为概念验证,已经表明,只有当呈现上游MnSOD mRNA和下游Cyt c作为输入的信号传导途径时,纳米器件才能执行“与”逻辑门操作,然后输出荧光信号。与分别分析单个mRNA或Cyt c的常规方法相比,精心设计的一体化DNA纳米装置可以分析正向调节的信号传导途径,这允许在复杂的信号传导网络中准确分析感兴趣的信号传导途径而无需费力和不利的行动。此外,通过监测由特定信号传导途径的调节诱导的线粒体的Cyt c释放,可以获得动态信息。纳米器件的可编程性质显示了其通过多个分子的连接表征可能用于分析其他信号传导途径的潜力。该分析系统高度集成,易于获取,可用于活细胞,因此具有很大的应用前景,可用作机体研究,药物发现,凋亡过程动态监测等的细胞分析模型。
附图说明
图1:制备一体化DNA纳米装置的示意图及其在活细胞中可用于mRNA和 Cyt c释放依赖性凋亡信号传导途径的成像的应用。(B)“AND”逻辑门的真值表。
图2:不同适体组成的双链DNA杂化复合物响应Cyt c的例证。
图3:不同DNA双链体对Cyt c的荧光反应。每个DNA双链体为0.1μM, Cyt c为20μM。
图4:不同Y-DNA制备过程的示意图。
图5:20%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳证明了Y-DNA结构的构建过程。
图6:(A-C)在mRNA,Cyt c和mRNA/Cyt c存在下,三种构建的Y-DNA 探针(Y12,Y15和Y20)的荧光响应。(D)实验组(分别在mRNA,Cyt c 和mRNA/Cyt c存在下)和对照组的荧光强度。
图7:纳米元件结构的表征过程。(A)Y20AuNP的制造程序示意图。(B) 裸AuNPs和制备的Y20-AuNPs透射电镜图像的形态特征。(C)Y20-AuNPs 构建过程中紫外-可见吸收峰的变化。(D-F)非功能化AuNPs、A-DNA-AuNPs 和Y20-AuNPs的水动力直径。
图8:(A)Y20-AuNPs纳米元件在体外对mRNA、Cyt c和mRNA/Cyt c的荧光响应。(B)实验组(分别存在于mRNA、Cyt c和mRNA/Cyt c)和对照组的荧光强度比。(C)664nm处的荧光峰强度对不同浓度的Cyt c的响应。(D) 664nm处荧光峰强度与Cyt c浓度的相关曲线。(E,F)Y20-AuNPs对不同干扰物的荧光峰强度响应。Cyt c浓度为20μm,其他物种浓度为100μm,所有 RNA的浓度均为20纳米。
图9:在mRNA和Cyt c的存在下,Y-DNA-AuNPs纳米装置(Y20-AuNPs, n1Y20-AuNPs和n2Y20-AuNPs)的荧光响应。Cyt c为20μM,mRNA为 20nM。所有Y-DNA-AuNPs分别在mRNA存在下与Cyt c在37℃下孵育1.5 小时。
图10:在存在20nM mRNA的情况下使用Y20-AuNPs纳米装置在664nm至20 μM Cyt c的时间依赖性荧光峰响应。
图11:(A)Y20-AuNPs在DMEM,PBS和细胞提取物中随时间的稳定性。 (B)在20nMmRNA存在下,Y20-AuNP在DMEM,PBS和细胞提取物中随时间的荧光变化。
图12:(A)CCK-8测定Y20-AuNPs纳米探针的细胞毒性。在孵育8小时后,监测HeLa细胞的细胞存活率值(%)的不同Y20-AuNPs纳米探针浓度 (0,1,2,3,4nM)。(B)在37℃下,在无血清DMEM中用Y20-AuNPs纳米探针和半胱天冬酶-3探针孵育的HeLa细胞的荧光成像1.5小时。
图13:HeLa细胞(FR+)的荧光成像与100μL的2nM Y20-AuNP在无血清 DMEM中在37℃,5%CO2下孵育1.5小时。(A)不治疗,(B)0.5μ MSTS2小时,(C)4μMSTS2小时,(D)用100μM胃蛋白酶抑制剂A预处理24小时,并与Y20-AuNP孵育1.5小时,然后4小时μMSTS持续2小时,(E)与n1Y20-AuNP孵育1.5小时,然后4μMSTS孵育2小时。(F)用不同处理的HeLa细胞的流式细胞术测定。
图14:HeLa细胞(FR+)的荧光成像分别与无血清DMEM中的0.2nM n2Y20- AuNPs和Y20-AuNPs在37℃和5%CO2下孵育1.5小时。在用纳米探针孵育后,用4μMSTS处理HeLa细胞2小时。
图15:(A)MnSOD mRNA和c-Myc mRNA介导的Cyt c释放依赖性凋亡信号传导途径的假设模型。(B)分别与100μL的2nM Y20-AuNP和n3Y20- AuNP温育后,具有不同表达水平的mRNA的HeLa细胞(FR+)的荧光成像。 STS为2μM。(C)我们的方法的示意图,其靶向凋亡网络中的信号传导途径和靶向个体分子的策略。
图16:在不同的凋亡信号通路中,MnSOD-mRNA和c-Myc-mRNA诱导细胞色素c释放的假设模型。
图17:HeLa细胞(FR+)中Cyt c释放的实时荧光成像与100μL2nM Y20- AuNPs孵育1.5小时,然后处理4μMSTS。用共聚焦荧光显微镜记录Y20- AuNPs的时间依赖性荧光响应。
Figure ISA0000190957240000011

Claims (2)

1.一种一体式DNA纳米元件用于原位凋亡信号通路成像的监测,我们设计了一种一体式纳米元件,它允许对凋亡信号通路进行有效成像,而不是在原位分离分子。为了构建一体式DNA纳米元件,所有的DNA序列,包括mRNA和Cyt c-特异性适体的互补序列,都被捕获在精心设计的Y形DNA(y-dna)结构中,然后组装在锚定DNA修饰的金纳米颗粒(a-DNA-AuNPs)上。通过标记叶酸,Y-DNA连接的AuNP(Y-AuNP)纳米元件可以被细胞高效地内化到细胞质中,而不会穿透细胞核和线粒体。细胞凋亡激活后,内化纳米元件可以进行“和”逻辑门操作,将线粒体释放到细胞质中的mRNA和Cyt c作为两个输入,然后输出荧光信号。从线粒体到细胞质的Cyt c迁移,使Cyt c和逃逸的适配体由Y-DNA的DNA双链组成,由mRNA驱动,紧密相互作用,与适配体竞争结合。Cyt c-适体复合物的形成诱导了菁5(Cy5)和黑洞猝灭剂2(BHQ-2)的分离,产生了明显的荧光增强。因此,该纳米元件允许高特异性分析一个与mRNA和Cyt c相关的信号通路。但是其他的信号通路,可能与靶信号通路相互作用,导致凋亡网络中的cyt c释放,不能激活纳米元件。
2.该设计中相关的核酸序列如下表
Figure FSA0000190957210000021
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070048759A1 (en) * 2005-06-10 2007-03-01 Dan Luo Detection of target molecules with labeled nucleic acid detection molecules
CN107389628A (zh) * 2017-06-09 2017-11-24 福建医科大学孟超肝胆医院 一种细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070048759A1 (en) * 2005-06-10 2007-03-01 Dan Luo Detection of target molecules with labeled nucleic acid detection molecules
CN107389628A (zh) * 2017-06-09 2017-11-24 福建医科大学孟超肝胆医院 一种细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIPING QIU等: "A Targeted, Self-Delivered, and Photocontrolled Molecular Beacon for mRNA Detection in Living Cells", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHENMICAL SOCIETY》 *
MEIHUA LIN等: "Photo-Activated Nanoflares for mRNA Detection in Single Living Cells", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
XIAOLONG ZHANG等: "A fluorescent turn on nanoprobe for simultaneous visualization of dual-targets involved in cell apoptosis and drug screening in living cells", 《NANOSCALE》 *

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