CN113004887A - 金纳米圆盘皇冠状纳米探针、其制备方法及其在生物检测中的应用 - Google Patents

金纳米圆盘皇冠状纳米探针、其制备方法及其在生物检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种金纳米圆盘皇冠状纳米探针、其制备方法及其在生物检测中的应用。该纳米探针的制备方法包括：将金纳米圆盘溶液以纯化水稀释至预定浓度，用氢氧化钠溶液调节混合液酸碱度至碱性；向所得混合液中加入预定量的4‑(氨基磺酰基)苯硼酸以及预定量的修饰荧光素的多肽，混匀；将所得混合液放置在1℃‑4℃环境中进行连接反应至少24小时，即得金纳米圆盘皇冠状纳米探针成品。该纳米探针能以荧光、SERS双通道对caspase‑3和H2O2快速检测，准确性高，灵敏度高。

Description

金纳米圆盘皇冠状纳米探针、其制备方法及其在生物检测中 的应用
技术领域
本发明涉及一种金纳米圆盘皇冠状纳米探针、其制备方法及其在生物检测中的应用，主要基于荧光成像和SERS传感技术手段，属于新型纳米功能材料技术领域。
背景技术
据申请人了解，细胞凋亡是一种程序性细胞死亡，通过清除受感染或受损细胞、调节细胞数量来维持体内稳态的重要生理机制。这一过程在组织周转、适应性免疫、血管生成和正常伤口愈合等多种生物学功能中起着不可或缺的作用，并与自身免疫性疾病、癌症、神经退行性疾病和心血管疾病等多种疾病相关。目前评估细胞凋亡的方法通常需要细胞固定(原位末端标记法或免疫组化)，细胞裂解(免疫印迹，PCR)，或立即处理被检测细胞(流式细胞术)等。然而，程序性细胞死亡的过程涉及复杂的蛋白激活级联反应和复杂细胞事件的执行，这一过程需要数小时。因此实时评估细胞凋亡的方法往往是比较可取且迫切需要的。
Caspase-3属于半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族(活性位点包含半胱氨酸残基，能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键)，在凋亡细胞中通过内外两种途径被激活，并被认为是凋亡的关键介质和细胞标记物。众所周知，caspase-3可以特异性切割四肽Asp-Glu-Val-Asp(DEVD)的N端，用于开发caspase-3检测的特异性探针，包括比色法、荧光偏振法或荧光相关法、基于荧光亮度等均质检测技术，和Western blot法、原子力显微镜法、电化学法等非均质检测技术。其中，基于荧光共振能量转移(FRET-based)的均质检测技术具有灵敏度高、特异性强、响应速度快、技术简单等优点而占据了重要地位。传统的荧光方法有着高荧光本底、光漂白和光毒性等缺陷，限制在复杂的生物条件下的应用。因此，开发一种实时监测、高灵敏度、特异性识别caspase-3的新型探针对于了解其在生理、病理过程中的作用，对疾病的诊断和预后以及癌症治疗的疗效或凋亡启动药物的开发至关重要。
各种促凋亡信号(如环境不利因素、损伤、辐射、化疗药物、兴奋性氨基酸、死亡配体等)都引起细胞内源性或外源性活性氧(ROS)升高或氧化还原平衡改变,这可能作为信号触发凋亡信号转导途径。当凋亡启动后，ROS进一步升高可能加速凋亡过程。过氧化氢(H2O2)是生物体内主要的ROS之一，也是活性氧相互转化的枢纽。一方面，H2O2的过量积累会引起氧化应激，直接或间接地氧化细胞内核酸、蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体；另一方面，H2O2是许多氧化应急反应中的关键调节因子，也和细胞凋亡、细胞增殖等密切相关。因此，能选择性准确测定H2O2的方法对于深入研究H2O2的分子机制和阐明其生物学作用具有重要意义。在过去的几十年里，已经发展了几种较为完善的检测H2O2的方法，如电子自旋共振(ESR)光谱、化学发光、电化学传感和色谱。然而，这些方法往往会造成组织或细胞的破坏，这与活体生物样品中H2O2的原位监测一般是矛盾的。表面增强拉曼光谱(SERS)是一种用于生物分析和细胞研究的强有力的指纹光谱技术，广泛应用于化学或生物分子传感、成像和诊断。SERS的典型应用是直接探测附着在金属SERS基底上具有高拉曼截面的有机分子体系，但生物分子的拉曼截面通常太小而无法被检测到。为了克服这一限制，将金属纳米颗粒(NPs)和特定的有机拉曼报告分子结合的新型SERS纳米探针来实现信号放大。
经检索发现，专利号CN201811358258.3、授权公告号CN109540865B的发明专利公开了一种基于拉曼-荧光双模式探针的活细胞内细胞色素c的检测方法，其检测方法是基于表面增强拉曼散射和荧光共振能量转移的“开-关”转换，通过在AuNTs上组装Cyt c的适配体及其部分互补的修饰荧光团Cy5的DNA构建的纳米传感器实现双重信号的检测；其拉曼-荧光双模式探针是由AuNTs修饰Cyt c的适配体、与其适配体部分互补配对的修饰Cy5的互补链制得。
然而，基于荧光成像和SERS传感技术的双通道检测方法在生物环境中同时对caspase-3和H2O2进行快速检测的纳米探针尚未见报道。
发明内容
本发明的主要目的是：克服现有技术存在的问题，提出一种金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，及其制得的金纳米圆盘皇冠状纳米探针，该纳米探针在生物检测中以荧光、SERS双通道对生物环境中caspase-3和H2O2同时进行快速检测。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
一种金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、将金纳米圆盘溶液以纯化水稀释至预定浓度，用氢氧化钠溶液调节混合液酸碱度至碱性；
第二步、向第一步所得混合液中加入预定量的4-(氨基磺酰基)苯硼酸以及预定量的修饰荧光素的多肽，混匀；所述多肽的序列为DEVD；
第三步、将第二步所得混合液放置在1℃-4℃环境中进行连接反应至少24小时，即得金纳米圆盘皇冠状纳米探针成品。
该制备方法以金纳米圆盘(AuNPLs)为承载体，通过连接4-(氨基磺酰基)苯硼酸(即4-APBA)、以及修饰荧光素的多肽(Peptide-FITC)，从而获得金纳米圆盘皇冠状纳米探针(AuNPL-crown nanoprobe)。该纳米探针能以荧光、SERS双通道对caspase-3和H2O2快速检测，准确性高，灵敏度高。
本发明进一步完善的技术方案如下：
优选地，第一步中，所述预定浓度为5×10-5～1.2×10-4mol·L-1；调节酸碱度后溶液的pH值为8～9。
采用以上优选方案，可进一步优化第一步的关键参数。
优选地，第二步中，所述4-(氨基磺酰基)苯硼酸的终浓度为3±1×10-6mol·L-1；所述修饰荧光素的多肽的终浓度为3±1×10-6mol·L-1；所述修饰荧光素的多肽为FITC-DEVD-NH2。
采用以上优选方案，可进一步优化第二步的关键参数。
优选地，第一步中，所述金纳米圆盘溶液与纯化水的体积比为1：3～4；所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1±0.05mol·L-1。
采用以上优选方案，可进一步优化第一步的具体技术细节。
优选地，第一步中，所述金纳米圆盘采用以十六烷基三甲基溴化铵为稳定剂，在水溶液中通过种子介导先生长三角形金纳米粒子、再过度生长产生六边形金纳米粒子、最后通过氧化六边形金纳米粒子生成圆盘形金纳米粒子的逐步生长方法制备。
更优选地，所述金纳米圆盘溶液的具体制备过程为：
S1、新鲜配制0.1mol·L-1的硼氢化钠(NaBH4)溶液于2℃～6℃预冷；
S2、将1～1.5mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液、1～2mL的0.01mol·L-1柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液、35～40mL的去离子水混合，全程搅拌，且搅拌转速范围为1500～2000R/min；
S3、将1～2mL的S1所得硼氢化钠(NaBH4)溶液于30秒内注射到S2配制的混合水溶液中并搅拌2min，搅拌转速范围为1500～2000R/min，制得第一种子溶液；
S4、将S3制得的第一种子溶液于室温下保存2～6小时；室温指10℃～35℃；
S5、将8～10mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，0.2～0.3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.03～0.07mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第一生长溶液；
S6、将8～10mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，0.2～0.3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.03～0.07mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第二生长溶液；
S7、将80～100mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，2～3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.3～0.7mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.3～0.7mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.3～0.7mL的0.1mol·L-1坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第三生长溶液；
S8、将S4的0.7～1.3mL第一种子溶液加入S5的第一生长溶液中，倒置混匀3～7秒；
S9、将S8的0.7～1.3mL混合溶液加入S6的第二生长溶液中，倒置混匀3～7秒；
S10、将S9所得全部混合溶液加入S7的第三生长溶液中，倒置混匀10～15秒；
S11、将S10所得混合溶液于室温下静置过夜，即得三角形的金纳米粒子溶液；弃上清，加入35-45mL的去离子水或35～45mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)重新分散三角形金纳米粒子，即得第二种子溶液；
S12、将0.2～0.3mL的0.1mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，2.5～150μL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，体积为所加入0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液一半的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，用去离子水将总体积补至2mL，制得第一过生长溶液；
S13、通过去离子水将第一过生长溶液在紫外消光光谱主峰处的光密度值(optical density，OD)调整到3.0，得到第二过生长溶液；
S14、将S11的0.45～0.55mL第二种子溶液加入到S13的第二过生长溶液中，倒置混匀10～15秒；
S15、将S14的混合液于25℃～35℃恒温烘箱中，静置保存10小时以上，得到六边形的金纳米粒子溶液；
S16、将20～40μL的1mol·L-1盐酸(HCl)溶液，20～50μL的6％双氧水(H2O2)溶液加入到体积为5～7mL S15的六边形金纳米粒子溶液中，倒置混匀10～15秒；
S17、用紫外消光光谱法对S16的六边形金纳米粒子溶液的氧化过程进行监测，直至光谱只保留主峰；
S18、将S17的溶液通过离心再分散于0.01mol·L-1CTAB溶液中，得到圆盘形金纳米粒子溶液，即金纳米圆盘溶液。
采用以上优选方案，可进一步优化金纳米圆盘溶液的制备过程。
优选地，第二步中，先将4-(氨基磺酰基)苯硼酸、修饰荧光素的多肽分别以去离子水制成储备液，再将各储备液加入第一步所得混合液中。
采用以上优选方案，可进一步优化第二步的具体技术细节。
本发明还提出：
前文所述制备方法制得的金纳米圆盘皇冠状纳米探针。
前文所述金纳米圆盘皇冠状纳米探针用以检测生物细胞样品中细胞凋亡过程相关物质的应用，所述细胞凋亡过程相关物质为caspase-3和H2O2。
该纳米探针可基于荧光成像技术和SERS传感技术用于caspase-3和H2O2的同时段、双通道快速检测，准确性高，灵敏度高。
本发明还提出：
一种非诊断目的检测方法，其特征是，采用前文所述的金纳米圆盘皇冠状纳米探针；所述检测方法的检测目标为细胞凋亡过程相关物质caspase-3和H2O2；所述检测方法包括以下步骤：将金纳米圆盘皇冠状纳米探针与目标细胞共孵育后，加入caspase-3和H2O2并继续共孵育，然后进行荧光成像检测和拉曼光谱检测；所述荧光成像检测的参数为：FITC绿色荧光通道，激发波长为460nm～550nm，放大倍数为40×，每个样品都重复检验3次；所述拉曼光谱检测的参数为：激光波长为785nm，激光功率为5～10mw，积分时间即激光作用时间为0.01～0.05s，每个样品都重复检验3次。
开发新型纳米探针的制备方法及其在生物环境中的应用，具有重要的研究意义和应用价值。金纳米粒子与其他材料相比尤其受到关注，金纳米粒子具有优异的物理化学性能、易于修饰的表面、较低的细胞毒性等优点。目前，金纳米球(AuNPs)，金纳米棒(AuNRs)，金纳米双锥(AuBPs)等已被广泛用于环境传感和生物传感领域。在不同形状的金纳米颗粒中，金纳米圆盘(AuNPLs)因其独特的几何结构而具有独特的光学特性，表现出各种有趣的等离子体特性和应用。AuNPLs具有低的等离子体阻尼，圆形的对称性，以及两个巨大面积的原子表面。此外，不同于金纳米球等离子体共振波长的弱可调性，AuNPLs的偶极等离子体共振能量可以从可见光区到近红外区综合变化。这使得它们具有高指数灵敏度，易于构建具有多功能的SERS传感器等，在传感器探针领域越来越受到关注。4-APBA，属于芳基苯硼酸类化合物，在温和的条件下，可以被H2O2选择性地氧化以提供酚类物质，从而引起纳米传感器SERS光谱的变化。Peptide-FITC(包含天冬氨酸序列)，可以被Caspase-3(活性位点包含半胱氨酸残基)特异性地切割靶蛋白天冬氨酸残基上的肽键，从而释放出FITC，使其远离AuNPLs的能量辐射范围，即淬灭的荧光恢复(基于猝灭基团配对的荧光共振能量转移(FRET)技术)。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)基于荧光成像和SERS传感技术在生物环境中实现对Caspase-3和H2O2的快速检测；对于细胞凋亡的检测从双通道入手，两者相辅相成，具有潜在的应用前景。
(2)制备方法简单，操作方便，成本经济，流程易于商业化。
(3)通过控制各组分浓度，以及溶液酸碱度，即第一步和第二步的关键参数，能显著提高金纳米圆盘皇冠状纳米探针的重现性和稳定性。
(4)本发明以金纳米圆盘(AuNPLs)为承载体，通过连接4-(氨基磺酰基)苯硼酸(即4-APBA)、以及修饰荧光素的多肽(Peptide-FITC)，从而获得金纳米圆盘皇冠状纳米探针(AuNPL-crown nanoprobe)，该纳米探针能以荧光、SERS双通道对caspase-3和H2O2快速检测，准确性高，灵敏度高，为生物环境中caspase-3和H2O2的检测分析提供了潜力巨大的新平台。
附图说明
图1为本发明实施例1的主体流程示意图。
图2为本发明实施例1金纳米圆盘溶液制备过程中阶段性节点的透射电子显微镜图像。
图3为本发明实施例2的荧光光谱图、拉曼光谱图和相对应的统计图。
图4为本发明实施例3的拉曼光谱图和相对应的统计图。
图5为本发明实施例4的荧光光谱图、拉曼光谱图。
图6为本发明实施例4的各项统计图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例1
本实施例为金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，具体步骤包括：
第一步、将金纳米圆盘溶液以纯化水稀释至预定浓度，用氢氧化钠溶液调节混合液酸碱度至碱性。其中，该预定浓度为5×10-5～1.2×10-4mol·L-1；调节酸碱度后溶液的pH值为8～9。金纳米圆盘溶液与纯化水的体积比为1：3～4；氢氧化钠溶液的浓度为0.1±0.05mol·L-1。
第二步、向第一步所得混合液中加入预定量的4-(氨基磺酰基)苯硼酸以及预定量的修饰荧光素的多肽，混匀。其中，4-(氨基磺酰基)苯硼酸的终浓度为3±1×10-6mol·L-1；修饰荧光素的多肽的终浓度为3±1×10-6mol·L-1；修饰荧光素的多肽为FITC-DEVD-NH2，多肽的序列为DEVD(即序列表中的SEQ ID No.1)。
第三步、将第二步所得混合液放置在1℃-4℃环境中进行连接反应至少24小时，即得金纳米圆盘皇冠状纳米探针成品。
具体而言，第一步中，金纳米圆盘采用以十六烷基三甲基溴化铵为稳定剂，在水溶液中通过种子介导先生长三角形金纳米粒子、再过度生长产生六边形金纳米粒子、最后通过氧化六边形金纳米粒子生成圆盘形金纳米粒子的逐步生长方法制备。
例如：金纳米圆盘溶液的具体制备过程为：
S1、新鲜配制0.1mol·L-1的硼氢化钠(NaBH4)溶液于2℃～6℃预冷；
S2、将1～1.5mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液、1～2mL的0.01mol·L-1柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液、35～40mL的去离子水混合，全程搅拌，且搅拌转速范围为1500～2000R/min；
S3、将1～2mL的S1所得硼氢化钠(NaBH4)溶液于30秒内注射到S2配制的混合水溶液中并搅拌2min，搅拌转速范围为1500～2000R/min，制得第一种子溶液；
S4、将S3制得的第一种子溶液于室温下保存2～6小时；室温指10℃～35℃；
S5、将8～10mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，0.2～0.3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.03～0.07mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第一生长溶液；
S6、将8～10mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，0.2～0.3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.03～0.07mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第二生长溶液；
S7、将80～100mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，2～3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.3～0.7mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.3～0.7mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.3～0.7mL的0.1mol·L-1坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第三生长溶液；
S8、将S4的0.7～1.3mL第一种子溶液加入S5的第一生长溶液中，倒置混匀3～7秒；
S9、将S8的0.7～1.3mL混合溶液加入S6的第二生长溶液中，倒置混匀3～7秒；
S10、将S9所得全部混合溶液加入S7的第三生长溶液中，倒置混匀10～15秒；
S11、将S10所得混合溶液于室温下静置过夜，即得三角形的金纳米粒子溶液；弃上清，加入35-45mL的去离子水或35～45mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)重新分散三角形金纳米粒子，即得第二种子溶液；
S12、将0.2～0.3mL的0.1mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，2.5～150μL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，体积为所加入0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液一半的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，用去离子水将总体积补至2mL，制得第一过生长溶液；
S13、通过去离子水将第一过生长溶液在紫外消光光谱主峰处的光密度值(optical density，OD)调整到3.0，得到第二过生长溶液；
S14、将S11的0.45～0.55mL第二种子溶液加入到S13的第二过生长溶液中，倒置混匀10～15秒；
S15、将S14的混合液于25℃～35℃恒温烘箱中，静置保存10小时以上，得到六边形的金纳米粒子溶液；
S16、将20～40μL的1mol·L-1盐酸(HCl)溶液，20～50μL的6％双氧水(H2O2)溶液加入到体积为5～7mL S15的六边形金纳米粒子溶液中，倒置混匀10～15秒；
S17、用紫外消光光谱法对S16的六边形金纳米粒子溶液的氧化过程进行监测，直至光谱只保留主峰；
S18、将S17的溶液通过离心再分散于0.01mol·L-1CTAB溶液中，得到圆盘形金纳米粒子溶液，即金纳米圆盘溶液。
具体而言，第二步中，先将4-(氨基磺酰基)苯硼酸、修饰荧光素的多肽分别以去离子水制成储备液，再将各储备液加入第一步所得混合液中。其中，4-(氨基磺酰基)苯硼酸可采用市售品，修饰荧光素的多肽可向生产厂家定制。
检测时，将金纳米圆盘皇冠状纳米探针与目标细胞共孵育后，加入caspase-3和H2O2并继续共孵育，然后进行荧光成像检测和拉曼光谱检测；荧光成像检测的参数为：FITC绿色荧光通道，激发波长为460nm～550nm，放大倍数为40×，每个样品都重复检验3次；拉曼光谱检测的参数为：激光波长为785nm，激光功率为5～10mw，积分时间即激光作用时间为0.01～0.05s，每个样品都重复检验3次。
本实施例主体流程如图1所示，金纳米圆盘溶液制备过程中阶段性节点的电镜图像如图2所示。
实施例2
本实施例为实施例1制得金纳米圆盘皇冠状纳米探针对于Caspase-3和H2O2浓度梯度的检测，从而验证该纳米探针对于Caspase-3和H2O2快速检测的灵敏度。
(1)采用实施例1制得纳米探针；配制一系列Caspase-3样品溶液，底液为去离子水，浓度范围为0ng/mL，0.01ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，4ng/mL，8ng/mL，12ng/mL。
检测时，先将制得的纳米探针成品于5000rpm，5min进行离心沉淀操作，沉淀加入不同浓度的Caspase-3样品溶液1mL于37℃环境中酶切作用3h，然后检测荧光光谱。
荧光光谱检测时的参数设置为：激发波长为492nm，每个样品都重复检验3次。荧光光谱图见图3的A图。图3的B图是不同浓度的Caspase-3样品溶液在0-180min范围内的荧光光谱图统计图。
工作曲线绘制：不同浓度(0ng/mL，0.01ng/mL，0.05ng/mL，0.1ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，2ng/mL，4ng/mL，8ng/mL，12ng/mL)的Caspase-3溶液的响应荧光光谱强度记作Intensity，Intensity与作用时间time之间成曲线关系，绘制I－time工作曲线；荧光光谱检测时的参数设置为：激发波长为492nm，每个样品都重复检验3次。
由以上结果可知，由于纳米金粒子静电掺杂，在没有caspase-3的金纳米圆盘皇冠状纳米探针中可以检测到微小幅度的荧光强度。当将caspase-3引入探针系统时，金纳米圆盘皇冠状纳米探针的荧光强度开始恢复，随caspase-3浓度的增加而逐渐增加。在添加caspase-3后，由于浓度的限制，caspase-3的浓度达到1ng/mL才开始显著起作用，在20分钟内观察到显著的荧光恢复，在80min左右接近饱和。
(2)采用实施例1制得的纳米探针；配制一系列H2O2样品溶液，底液为去离子水，浓度范围为1μmol·L-1，3μmol·L-1，5μmol·L-1，10μmol·L-1，15μmol·L-1，30μmol·L-1，50μmol·L-1，70μmol·L-1，100μmol·L-1。
检测时，先将制得的纳米探针成品于5000rpm，5min进行离心沉淀操作，沉淀加入不同浓度的H2O2样品溶液1mL于37℃环境中混匀作用3h，然后检测拉曼光谱。
拉曼光谱检测时的参数设置为：激光波长为785nm，激光功率为20～30mw，积分时间(激光作用时间)为10s，每个样品都重复检验3次。拉曼光谱图见图3的C图。图3的D图是不同浓度的H2O2样品溶液对于4-APBA被氧化后生成的产物在876cm-1这一拉曼特征处的拉曼光谱强度统计图。
工作曲线绘制：不同浓度(1μmol·L-1，3μmol·L-1，5μmol·L-1，10μmol·L-1，15μmol·L-1，30μmol·L-1，50μmol·L-1，70μmol·L-1，100μmol·L-1，曲线a～曲线i)的H2O2溶液的响应拉曼光谱强度记作Intensity，Intensity与H2O2的浓度之间做直方图比对；拉曼光谱检测时的参数设置为：激光波长为785nm，激光功率为20～30mw，积分时间(激光作用时间)为10s，每个样品都重复检验3次。
由以上结果可知，当H2O2引入金纳米圆盘皇冠状纳米探针后，4-(氨基磺酰基)苯硼酸和H2O2反应，其反应物的拉曼特征峰为876cm-1。强度随着H2O2浓度的增加(1μmol·L-1到100μmol·L-1)而逐渐增加，每组之间存在统计学意义。
实施例3
本实施例为实施例1制得金纳米圆盘皇冠状纳米探针的稳定性考察，从而验证该纳米探针稳定性和实用性。
采用实施例1制得纳米探针；检测时，先将制得的纳米探针成品于5000rpm，5min进行离心沉淀操作，沉淀加入1mL纯化水重悬纳米探针(去除未连接物质，降低杂质干扰)，然后检测拉曼光谱以确定其稳定性，共检测10个样本。
拉曼光谱检测时的参数设置为：激光波长为785nm，激光功率为20～30mw，积分时间(激光作用时间)为10s。拉曼光谱图见图4的A图。图4的B图是纳米探针在1186cm-1这一拉曼特征处的拉曼光谱强度统计图。
工作曲线绘制：不同样本编号的纳米探针的响应拉曼光谱强度记作Intensity，Intensity与不同纳米探针之间做直方图比对，其相对标准偏差(RSD)结果为13.9％，表明制备的纳米探针成品稳定性高，实用性强；拉曼光谱检测时的参数设置为：激光波长为785nm，激光功率为20～30mw，积分时间(激光作用时间)为10s，每个样品都重复检验3次。
由以上结果可知，金纳米圆盘皇冠状纳米探针的1186cm-1这一拉曼特征处的拉曼光谱强度的相对标准偏差(RSD)为13.91％，符合稳定性考察的要求，验证了该纳米探针具有高度的稳定性和实用性。
实施例4
本实施例为实施例1制得金纳米圆盘皇冠状纳米探针对细胞凋亡过程中caspase-3和H2O2的检测，验证该纳米探针在生物环境中应用的可行性。
实例a、细胞+纳米探针：本实例采用实施例1制得的纳米探针，并采用腺癌人类肺泡基底上皮细胞(A549细胞)。检测时，先将制得的纳米探针于5000rpm，5min进行离心沉淀操作，沉淀加入1mL细胞完全培养基重悬纳米探针(去除未连接物质，降低杂质干扰)，然后将纳米探针加入到细胞培养皿中共孵育3h。待纳米探针基本被细胞吞入后，去除培养皿中的液体，用PBS清洗3遍，再加入细胞完全培养基进行细胞培养3h。
实例b、细胞+纳米探针+Caspase-3：本实例在实施a的基础上进行。待纳米探针基本被细胞吞入后，去除培养皿中的液体，用PBS清洗3遍，再加入含有12ng/mL Caspase-3的细胞完全培养基共孵育3h。
实例c、细胞+纳米探针+Caspase-3+H2O2：本实例在实施b的基础上进行。待纳米探针基本被细胞吞入后，去除培养皿中的液体，用PBS清洗3遍，再加入含有12ng/mL Caspase-3和200μmol·L-1H2O2的细胞完全培养基共孵育3h。
将上述3个实例分别去除培养皿中的液体，用PBS清洗3遍，然后进行荧光成像和拉曼光谱检测。荧光成像检测参数为：FITC绿色荧光通道，激发波长为460nm～550nm，放大倍数为40×，每个样品都重复检验3次。SERS传感检测参数为：激光波长为785nm，激光功率为5～10mw，积分时间即激光作用时间为0.01～0.05s，每个样品都重复检验3次。所得的细胞明场成像、荧光成像和拉曼成像如图5的A图(荧光成像)、B图(拉曼成像)所示，所得拉曼光谱图如图6的B图所示。
工作曲线绘制：不同实例的响应荧光强度记作Intensity，Intensity与不同实例之间做直方图比对；荧光成像检测参数为：FITC绿色荧光通道，激发波长为460nm～550nm，放大倍数为40×，每个样品都重复检验3次。统计结果图见图6的A图所示。不同实例的响应拉曼光谱强度记作Intensity，Intensity与不同实例之间做直方图比对；SERS传感检测参数为：激光波长为785nm，激光功率为5～10mw，积分时间即激光作用时间为0.01～0.05s，每个样品都重复检验3次。1186cm-1处纳米探针特征峰的统计结果图见图6的C图所示，876cm-1处纳米探针与H2O2反应后得到的拉曼特征峰的统计结果图见图6的D图所示。
由以上结果可知，不同条件(实例)下细胞的荧光强度和拉曼光谱强度有着统计学差异，表明金纳米圆盘皇冠状纳米探针可以很好的应用于细胞环境下的Caspase-3和H2O2的检测分析，通过荧光成像和拉曼传感技术，双通道同时进行快速检测。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 金纳米圆盘皇冠状纳米探针、其制备方法及其在生物检测中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Glu Val Asp
1

Claims (10)

1.一种金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，其特征是，包括以下步骤：
第一步、将金纳米圆盘溶液以纯化水稀释至预定浓度，用氢氧化钠溶液调节混合液酸碱度至碱性；
第二步、向第一步所得混合液中加入预定量的4-(氨基磺酰基)苯硼酸以及预定量的修饰荧光素的多肽，混匀；所述多肽的序列为DEVD；
第三步、将第二步所得混合液放置在1℃-4℃环境中进行连接反应至少24小时，即得金纳米圆盘皇冠状纳米探针成品。
2.根据权利要求1所述的金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，其特征是，第一步中，所述预定浓度为5×10-5～1.2×10-4mol·L-1；调节酸碱度后溶液的pH值为8～9。
3.根据权利要求2所述的金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，其特征是，第二步中，所述4-(氨基磺酰基)苯硼酸的终浓度为3±1×10-6mol·L-1；所述修饰荧光素的多肽的终浓度为3±1×10-6mol·L-1；所述修饰荧光素的多肽为FITC-DEVD-NH2。
4.根据权利要求2所述的金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，其特征是，第一步中，所述金纳米圆盘溶液与纯化水的体积比为1：3～4；所述氢氧化钠溶液的浓度为0.1±0.05mol·L-1。
5.根据权利要求2所述的金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，其特征是，第一步中，所述金纳米圆盘采用以十六烷基三甲基溴化铵为稳定剂，在水溶液中通过种子介导先生长三角形金纳米粒子、再过度生长产生六边形金纳米粒子、最后通过氧化六边形金纳米粒子生成圆盘形金纳米粒子的逐步生长方法制备。
6.根据权利要求5所述的金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，其特征是，所述金纳米圆盘溶液的具体制备过程为：
S1、新鲜配制0.1mol·L-1的硼氢化钠(NaBH4)溶液于2℃～6℃预冷；
S2、将1～1.5mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液、1～2mL的0.01mol·L-1柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O)溶液、35～40mL的去离子水混合，全程搅拌，且搅拌转速范围为1500～2000R/min；
S3、将1～2mL的S1所得硼氢化钠(NaBH4)溶液于30秒内注射到S2配制的混合水溶液中并搅拌2min，搅拌转速范围为1500～2000R/min，制得第一种子溶液；
S4、将S3制得的第一种子溶液于室温下保存2～6小时；室温指10℃～35℃；
S5、将8～10mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，0.2～0.3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.03～0.07mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第一生长溶液；
S6、将8～10mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，0.2～0.3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.03～0.07mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.03～0.07mL的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第二生长溶液；
S7、将80～100mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，2～3mL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，0.3～0.7mL的0.1mol·L-1氢氧化钠(NaOH)溶液，0.3～0.7mL的0.01mol·L-1碘化钾(KI)溶液，0.3～0.7mL的0.1mol·L-1坏血酸(C6H8O6)溶液混合，制得第三生长溶液；
S8、将S4的0.7～1.3mL第一种子溶液加入S5的第一生长溶液中，倒置混匀3～7秒；
S9、将S8的0.7～1.3mL混合溶液加入S6的第二生长溶液中，倒置混匀3～7秒；
S10、将S9所得全部混合溶液加入S7的第三生长溶液中，倒置混匀10～15秒；
S11、将S10所得混合溶液于室温下静置过夜，即得三角形的金纳米粒子溶液；弃上清，加入35-45mL的去离子水或35～45mL的0.05mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)重新分散三角形金纳米粒子，即得第二种子溶液；
S12、将0.2～0.3mL的0.1mol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液，2.5～150μL的0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液，体积为所加入0.01mol·L-1氯金酸(HAuCl4)溶液一半的0.1mol·L-1抗坏血酸(C6H8O6)溶液混合，用去离子水将总体积补至2mL，制得第一过生长溶液；
S13、通过去离子水将第一过生长溶液在紫外消光光谱主峰处的光密度值(opticaldensity，OD)调整到3.0，得到第二过生长溶液；
S14、将S11的0.45～0.55mL第二种子溶液加入到S13的第二过生长溶液中，倒置混匀10～15秒；
S15、将S14的混合液于25℃～35℃恒温烘箱中，静置保存10小时以上，得到六边形的金纳米粒子溶液；
S16、将20～40μL的1mol·L-1盐酸(HCl)溶液，20～50μL的6％双氧水(H2O2)溶液加入到体积为5～7mL S15的六边形金纳米粒子溶液中，倒置混匀10～15秒；
S17、用紫外消光光谱法对S16的六边形金纳米粒子溶液的氧化过程进行监测，直至光谱只保留主峰；
S18、将S17的溶液通过离心再分散于0.01mol·L-1CTAB溶液中，得到圆盘形金纳米粒子溶液，即金纳米圆盘溶液。
7.根据权利要求3所述的金纳米圆盘皇冠状纳米探针的制备方法，其特征是，第二步中，先将4-(氨基磺酰基)苯硼酸、修饰荧光素的多肽分别以去离子水制成储备液，再将各储备液加入第一步所得混合液中。
8.权利要求1至7任一项所述制备方法制得的金纳米圆盘皇冠状纳米探针。
9.权利要求8所述金纳米圆盘皇冠状纳米探针用以检测生物细胞样品中细胞凋亡过程相关物质的应用，所述细胞凋亡过程相关物质为caspase-3和H2O2。
10.一种非诊断目的检测方法，其特征是，采用权利要求8所述的金纳米圆盘皇冠状纳米探针；所述检测方法的检测目标为细胞凋亡过程相关物质caspase-3和H2O2；所述检测方法包括以下步骤：将金纳米圆盘皇冠状纳米探针与目标细胞共孵育后，加入caspase-3和H2O2并继续共孵育，然后进行荧光成像检测和拉曼光谱检测；所述荧光成像检测的参数为：FITC绿色荧光通道，激发波长为460nm～550nm，放大倍数为40×，每个样品都重复检验3次；所述拉曼光谱检测的参数为：激光波长为785nm，激光功率为5～10mw，积分时间即激光作用时间为0.01～0.05s，每个样品都重复检验3次。
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