CN114354591A - 黄曲霉毒素b1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法 - Google Patents
黄曲霉毒素b1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了黄曲霉毒素B1快速检测的比色/荧光双模式生物传感检测方法，所述生物传感检测方法中包括两种功能性探针，分别是信号探针AS‑AFB1、识别探针Fe3O4@COOH@Ab‑AFB1，基于所述功能性探针建立的双模式生物传感检测方法，具有裸眼可视化、检出限低、线性范围宽、检测灵敏度高、检测准确性高、检测时间短、操作简单等优点，能够满足对AFB1高灵敏和现场快速检测的需求，是一种直观高灵敏检测AFB1的方法，具有较好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于快速分析检测技术领域，具体而言，涉及一种比色/荧光双模式快速检测黄曲霉毒素B1的生物传感器及其制备方法和应用，以及检测黄曲霉毒素B1的方法及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素(Aspergillus flavus toxin，AFT)主要是由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的次生代谢产物，自然分布极为广泛的一类毒性超强的化合物，目前已分离鉴定出12种黄曲霉毒素，分别是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q1、H1、GM、B2a和毒醇，其中，黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2是粮油制品中黄曲霉毒素存在的主要形式(Machinski M Jr,Valente Soares LM,Sawazaki E,etal.Aflatoxins,ochratoxin A and zearalenone in Brazilian corn cultivars[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2001,81(10):1001-1007.)。世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)于1993年将黄曲霉毒素划定为Ⅰ类致癌物，受黄曲霉毒素污染的农产品严重威胁消费者的身体健康与生命安全，其主要作用于肝脏，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB1)最为多见，其毒性和致癌性也最强。1995年世界卫生组织规定：食品中AFB1最高允许浓度为15μg/kg，婴儿食品中不得检出。中国对AFB1的污染和控制十分重视，于1982年规定：大米、食用油中AFB1允许量标准为10μg/kg，其他粮食、豆类及发酵食品为5μg/kg，因此，AFT污染的有效检测对于保障食品安全具有重要意义，尤其是AFB1的有效检测。
目前，食品中AFB1限量已经成为限制出口的技术壁垒，为保障消费者的健康及出口贸易需要，相关研究者建立的检测黄曲霉毒素的方法已经达30余种，其中10余种由于其灵敏度不高已经较少使用，例如简单生物学方法和化学方法，目前，常用的检测黄曲霉毒素的方法可分为五大类：第一类是半定量检测方法，如薄层色谱法(Thin-layerchromatography，TLC)；第二类是定量检测方法，包括建立在色谱基础上的理化方法，如液相色谱法(Liquid chromatography，LC)、高效液相色谱法(High performance liquidchromatography，HPLC)等；第三类是建立在免疫化学基础上的快速测定的方法，如酶联免疫测定方法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和放射免疫测定(Radio-immunoassay，RIA)；第四类是免疫化学和仪器分析结合的方法，如免疫亲和柱-荧光分光光度法、亲和柱高效液相色谱法(Immunoaffinity column liquid chromatography-highperformance liquid chromatography，IAC-HPLC)等；第五类是建立在生物标记技术基础上的时间分辨免疫荧光分析技术(time-resolved fluoreimmuoassay，TRFIA)。
目前已建立的检测黄曲霉毒素的方法虽然多种多样，但均存在一定的技术缺陷和应用限制，例如，TLC法虽对设备的要求相对简单，但是检测的灵敏度和准确度较低；LC、HPLC和IAC-HPLC法虽灵敏度相对较高，但所需设备昂贵，检测成本高、检测时间长、步骤繁琐，对操作人员要求较高，不适合在基层广泛应用；ELISA法虽一次可测多个样品，成本低，但准确度差，只适合于对大量样品进行初筛；RIA法存在放射性元素污染的问题；TRFIA法虽同时具有酶标记技术、同位素标记技术两者的优点，但是存在灵敏度相对较低的缺点。随着国际和国内黄曲霉毒素限制的逐步加强，限量标准也在不断降低，所以亟需建立一种灵敏度和特异性高、简便快速直观、选择性好、响应速度快、低成本、容易普及应用的方法以用于检测黄曲霉毒素。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述技术缺陷和应用限制，本发明的目的在于提供了一种快速检测黄曲霉毒素B1的比色/荧光双模式生物传感检测方法，一种新型的AuNPs修饰链霉亲和素生物素化BSA-AFB1聚合体(AuNPs@SA@Bio-BSA-AFB1)被用作比色和荧光猝灭双功能信号探针，单克隆抗体修饰的磁性微球可选择性地捕获分析物。AuNPs@SA@Bio-BSA-AFB1信号探针可以根据分析物的竞争性结合实现信号响应。外部磁场收集上清液可进行初步的肉眼或比色法初步检测。如需要更灵敏的检测，上清液可进一步与罗丹明B荧光染料混合，在AuNPs@SA@Bio-BSA-AFB1荧光猝灭的基础上进行荧光检测。荧光模式使灵敏度提高了两个数量级。本发明建立的方法具有裸眼可视化、检出限低、线性范围宽、检测时间短、操作简单等优点，并且能够满足对AFB1现场和高灵敏快速检测的需求。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种用于比色/荧光双模式快速检测黄曲霉毒素B1的生物传感器。
进一步，所述生物传感器包括两种功能性的探针；
优选地，所述功能性的探针包括信号探针、识别探针；
更优选地，所述信号探针由金纳米颗粒、链霉亲和素、黄曲霉毒素B1全抗原构成；
更优选地，所述识别探针由磁性纳米颗粒、抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体构成；
最优选地，所述黄曲霉毒素B1全抗原为生物素修饰的黄曲霉毒素B1全抗原；
最优选地，所述磁性纳米颗粒为表面修饰有羧基基团的磁性纳米颗粒；
最优选地，所述磁性纳米颗粒包括表面修饰有羧基基团的Fe3O4、γ-Fe2O3、CoFe2O4、ZnFe2O4、FePd、CoPt3、MnFe2O4、MgFe2O4；
最优选地，所述磁性纳米颗粒为表面修饰有羧基基团的Fe3O4。
本发明的第二方面提供了本发明第一方面所述的生物传感器的制备方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)向金纳米颗粒溶液中加入链霉亲和素溶液，孵育、封闭、离心和重悬后得到金纳米颗粒-链霉亲和素聚集体；
(2)向步骤(1)得到的金纳米颗粒-链霉亲和素聚集体中加入生物素修饰的黄曲霉毒素B1全抗原，混合、离心和重悬后得到信号探针；
(3)向磁性纳米颗粒重悬液中加入EDS和NHS进行活化，活化后磁性分离去上清，加入反应缓冲液得到表面修饰有羧基基团的磁性纳米颗粒重悬液；
(4)向步骤(3)得到的表面修饰有羧基基团的磁性纳米颗粒重悬液中加入抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行反应，反应后磁性分离去上清，封闭、重悬后得到识别探针。
进一步，步骤(1)中所述的金纳米颗粒溶液为pH为6.2-6.4的金纳米颗粒溶液；
优选地，所述金纳米颗粒为13-20nm的金纳米颗粒；
更优选地，所述金纳米颗粒为13nm的金纳米颗粒；
最优选地，所述金纳米颗粒溶液的用量为1-5mL；
最优选地，所述金纳米颗粒溶液的用量为2.5mL；
优选地，步骤(1)中所述的链霉亲和素的用量为1mg/mL、25μL；
优选地，步骤(1)中所述的孵育的条件为25℃、1h；
优选地，步骤(1)中所述的封闭的条件为采用BSA封闭液封闭30min；
更优选地，所述BSA封闭液的用量为10％BSA、250μL；
优选地，步骤(1)中所述的离心的条件为4℃、12000rpm、20min；
优选地，步骤(1)中所述的重悬的条件为采用PBS缓冲液进行重悬；
更优选地，所述PBS缓冲液的用量为pH 7.4、0.01M、1.25mL。
进一步，步骤(2)中所述的生物素修饰的黄曲霉毒素B1全抗原为生物素修饰的BSA-黄曲霉毒素B1全抗原；
优选地，所述生物素修饰的BSA-黄曲霉毒素B1全抗原的用量为2mg/mL、4μL；
优选地，步骤(2)中所述的金纳米颗粒-链霉亲和素聚集体的用量为1-1.5mL；
更优选地，步骤(2)中所述的金纳米颗粒-链霉亲和素聚集体的用量为1.25mL；
优选地，步骤(2)中所述的混合的条件为25℃、1h；
优选地，步骤(2)中所述的离心的条件为4℃、12000rpm、20min；
优选地，步骤(2)中所述的重悬的条件为采用PBS缓冲液进行重悬；
更优选地，所述PBS缓冲液的用量为pH 7.4、0.01M、1.25mL。
进一步，步骤(3)中所述的磁性纳米颗粒重悬液中磁性纳米颗粒的量为5-15mg；
优选地，所述磁性纳米颗粒重悬液中磁性纳米颗粒的量为10mg；
优选地，所述磁性纳米颗粒包括Fe3O4、γ-Fe2O3、CoFe2O4、ZnFe2O4、FePd、CoPt3、MnFe2O4、MgFe2O4；
更优选地，所述磁性纳米颗粒为Fe3O4；
优选地，步骤(3)中所述的EDS和NHS的用量分别为100μL、100μL；
优选地，步骤(3)中所述的活化的条件为25℃、混合30min；
优选地，步骤(3)中所述的反应缓冲液为MES缓冲液；
更优选地，所述MES缓冲液的用量为pH 5.0、100mM、500mL。
进一步，步骤(4)中所述的抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的用量为50-150μL；
优选地，所述抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的用量为100μL；
优选地，步骤(4)中所述的反应的条件为25℃、混合2h；
优选地，步骤(4)中所述的封闭的条件为采用Tris-HCl封闭缓冲液封闭1h；
更优选地，所述Tris-HCl封闭缓冲液的用量为pH 7.4、0.1M、1mL；
优选地，步骤(4)中所述的重悬的条件为采用PBS缓冲液进行重悬；
更优选地，所述PBS缓冲液的用量为pH 7.4、0.01M、1mL。
本发明的第三方面提供了一种比色和荧光双模式快速检测黄曲霉毒素B1的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测样品加入到权利要求1所述的识别探针中，混合孵育1-2h；
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入权利要求1所述的信号探针，混合孵育1-2h；
(3)对步骤(2)得到的溶液进行磁性分离，对上清液进行裸眼可视和/或紫外可见近红外光谱分析；
(4)向步骤(3)所述的上清液中加入荧光染料，混合孵育1-2h后，进行荧光光谱分析；
优选地，步骤(1)中所述的识别探针的用量为2.5mg/mL、50μL；
优选地，步骤(1)中所述的混合孵育的条件为37℃、30min；
优选地，步骤(2)中所述的信号探针的用量为100μL；
优选地，步骤(2)中所述的混合孵育的条件为37℃、30min；
优选地，步骤(3)中所述的紫外可见近红外光谱分析是对上清液在525nm处的紫外吸收值进行测定分析；
优选地，步骤(4)中所述的荧光染料包括罗丹明B、红色罗丹明、四甲基罗丹明、异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、四氯荧光素、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor610、AlexaFluor633、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；
更优选地，所述荧光染料为罗丹明B；
最优选地，所述荧光染料的用量为50μL；
优选地，步骤(4)中所述的混合孵育的条件为37℃、30min；
优选地，步骤(4)中所述的荧光光谱分析是对混合后的上清液在580nm处的荧光强度进行测定分析。
本发明的第四方面提供了一种用于检测黄曲霉毒素B1的试剂盒。
进一步，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的生物传感器；
优选地，所述试剂盒基于本发明第三方面所述的方法进行检测。
在本发明中，试剂盒还包括容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，以及附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒对待测样品中的黄曲霉毒素B1进行检测。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于本发明第一方面所述的生物传感器的检测来检测黄曲霉毒素B1的试剂均包含在本发明保护的范围内。
本发明的第五方面提供了本发明第一方面所述的生物传感器在裸眼可视化检测黄曲霉毒素B1、比色/荧光双模式快速检测黄曲霉毒素B1中的应用。
本发明的第六方面提供了本发明第一方面所述的生物传感器在制备用于检测黄曲霉毒素B1的产品中的应用；
优选地，所述产品包括试剂盒、试纸条、芯片。
相对于现有技术，本发明的优点和有益效果如下：
本发明制备了比色/荧光双模式快速检测黄曲霉毒素B1的生物传感器，所述生物传感器包括两种功能性探针，分别是信号探针AS-AFB1、识别探针Fe3O4@COOH@Ab-AFB1，基于所述生物传感器建立的双模式免疫传感检测黄曲霉毒素B1的方法，具有以下优点：裸眼可视化、检出限低、线性范围宽、检测灵敏度高、检测准确性高、检测时间短、操作简单、能够满足对AFB1高灵敏和现场快速检测的需求，是一种直观高灵敏检测AFB1的方法。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是五种不同粒径AuNPs纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图和日光下的照片，其中，a图：紫外可见吸收光谱图，b图：日光下的照片；
图2是五种不同粒径AuNPs的透射电镜图，其中，a：13nm AuNPs，b：20nm AuNPs，c：35nm AuNPs，d：50nm AuNPs，e：75nm AuNPs；
图3是五种不同粒径AuNPs的动态光散射图，其中，a：13nm AuNPs，b：20nm AuNPs，c：35nm AuNPs，d：50nm AuNPs，e：75nm AuNPs；
图4是AuNPs及AuNPs-SA的紫外可见吸收光谱图；
图5是AuNPs及AuNPs-SA的原子力显微镜图片，其中，a图：AuNPs，b图：AuNPs-SA；
图6是AuNPs、AuNPs-SA及AuNPs-SA-Biotin-BSA-AFB1的Zeta电位图；
图7是Fe3O4@COOH不同视野下的扫描电镜图；
图8是Fe3O4@COOH的元素分布图；
图9是Fe3O4@COOH@Ab-AFB1不同视野下的扫描电镜图；
图10是Fe3O4@COOH@Ab-AFB1的元素分布图；
图11是反应前后AFB1抗体的紫外吸收光谱图；
图12是五种不同粒径的AuNPs纳米颗粒对RhB荧光猝灭效率优化的结果图，其中，a图：五种粒径AuNPs与RhB的荧光发射图，b图：五种粒径AuNPs对RhB的荧光猝灭效率图，c图：五种不同粒径AuNPs与RhB混合后的实物图；
图13是对AuNPs纳米颗粒与链霉亲和素浓度优化的结果图；
图14是对AuNPs-SA与Biotin-BSA-AFB1浓度优化的结果图，其中，a图：AuNPs-SA与不同浓度biotin-BSA-AFB1混合的紫外吸收光谱图，b图：AuNPs-SA与不同浓度biotin-BSA-AFB1偶联前后的紫外吸收变化图；
图15是对荧光检测体系pH优化的结果图；
图16是对荧光染料RhB浓度优化的结果图；
图17是比色检测模式检测不同浓度AFB1的紫外吸收光谱图；
图18是紫外检测模式检测AFB1标准曲线建立的结果图，其中，a图：紫外检测不同浓度AFB1紫外吸收光谱图，b图：紫外检测AFB1的标准曲线；
图19是荧光检测模式检测AFB1标准曲线建立的结果图，其中，a图：荧光检测不同浓度AFB1荧光光谱图，b图：荧光检测AFB1的标准曲线；
图20是本发明双模式免疫传感检测方法的特异性检测结果图，其中，a图：紫外检测模式检测AFB1的特异性，b图：荧光检测模式检测AFB1的特异性；
图21是对直接竞争ELISA法检测AFB1的方法进行优化和检测的结果图，其中，a图：优化结果图，b图：直接竞争ELISA法检测AFB1的标准曲线；
图22是本发明双模式免疫传感检测方法检测AFB1的原理图，其中a图：原理图，b图：紫外吸收光谱图，c图：荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1信号探针AS-AFB1、识别探针Fe3O4@COOH@Ab-AFB1的制备
1、AuNPs的制备
所有玻璃器皿均在新鲜制得的王水(HNO3/HCl＝1：3)中浸泡，并在超纯水中彻底冲洗并干燥，通过柠檬酸钠还原法制备AuNPs：将100mL 0.01％(w/v)的氯金酸(HAuCl4)加入到250mL圆底烧瓶中，然后，将溶液在140℃，400rpm条件下加热至沸腾，迅速加入1％柠檬酸钠溶液(Na3C6H5O7·2H2O)，溶液颜色在5min内从浅黄色变为紫色，然后变为深红色，最后变为酒红色，继续加热15min后，冷却至室温，将制备的溶液保存在棕色磨口瓶中，4℃下保存备用。
2、AuNPs-SA聚集体的制备
(1)取2.5mL合成的13nm的AuNPs，加入75μL 0.1M K2CO3溶液调节pH为6.2-6.4；
(2)加入25μL 1mg/mL的链霉亲和素(SA)溶液，室温下(25℃)孵育1h，轻微震荡；
(3)加入250μL 10％BSA溶液，轻微震荡30min，以封闭AuNPs上多余的位点；
(4)12000rpm，20min，4℃离心，用1.25mL 0.01M pH 7.4的PBS重悬，4℃保存备用。
3、信号探针AS-AFB1的制备
(1)1.25mL AuNPs-SA加入4μL 2mg/mL BSA-AFB1全抗原，室温(25℃)混合1h；
(2)12000rpm，20min，4℃离心，用1.25mL 0.01M pH 7.4的PBS重悬，4℃保存备用。
4、识别探针磁性纳米颗粒-AFB1抗体(Fe3O4@COOH@Ab-AFB1)的制备
(1)将磁珠悬浮液混合均匀，取1mL磁珠(10mg)加入到2mL离心管中，磁性分离去除上清液；
(2)加入1mL 0.01M NaOH，混合均匀，磁性分离去除上清液(重复1次)；
(3)加入1mL去离子水重悬磁珠，磁性分离去除上清液(重复2次)；
(4)加入1mL反应缓冲液重悬磁珠，放置于旋转混合仪上；
(5)立即配制EDC溶液和NHS溶液；
(6)立即将混合仪上的磁珠液磁性分离去除上清液，并加入300μL反应缓冲液重悬磁珠；
(7)立即加入新鲜配制的100μL EDC溶液和100μL NHS溶液，混匀，室温旋转混合30min；
(8)磁性分离去除上清液，立即加入1mL反应缓冲液将磁珠重悬，磁性分离去除上清液(重复1次)；
(9)立即加入500μL反应缓冲液将磁珠重悬，加入100μL Ab-AFB1(提前溶解于反应缓冲液中)，用反应缓冲液将溶液总体积补至1mL，室温下旋转混合2h；
(10)磁性分离去除上清液，加入1mL封闭缓冲液，混合重悬磁珠，室温旋转混合1h，磁性分离去除上清液；
(11)加入1mL清洗缓冲液，混合重悬磁珠，室温旋转混合10-30min，磁性分离去除上清液(重复3-5次)；
(12)将上述磁珠分散于0.01M PBS(pH 7.4)中，4℃保存备用。
实施例2信号探针AS-AFB1、识别探针Fe3O4@COOH@Ab-AFB1的表征
1、AuNPs的表征和分析
使用柠檬酸钠还原法制备了五种不同粒径的胶体金，不同粒径胶体金的制备方法及特性见表1，图1a和b分别为五种不同粒径胶体金的紫外吸收光谱图和实物图照片，结果显示随着胶体金粒径的增大，紫外吸收峰的最大波长出现“红移”，即随着胶体金粒径从小到大，紫外吸收峰最大波长分别为518、522、528、532、543nm，同时胶体金的颜色也出现从橙红色、红色到紫色的变化；图2为五种不同粒径胶体金的透射电镜图，图中a-e分别为五种粒径胶体金在50nm透射电镜视野下的形态，结果显示整体粒径均一，呈圆球形且分散性较好，表明了通过改变加入还原剂柠檬酸钠的量成功合成了不同粒径的胶体金溶液，此外，对五种不同粒径的胶体金做了动态光散射的表征，见图3a-e，结果显示其平均粒径绝大部分分布在13nm、20nm、35nm、50nm和75nm，进一步证明了五种不同粒径胶体金的成功制备。
表1五种粒径胶体金的制备及特性
2、AuNPs-SA的表征和分析
本发明利用纳米金粒子与链酶亲和素之间的静电吸附实现AuNPs与链霉亲和素的成功偶联。图4是AuNPs和AuNPs-SA的紫外可见吸收光谱图，结果显示裸金AuNPs的最大紫外吸收峰在518nm处，而修饰了链霉亲和素的AuNPs的最大紫外吸收峰的位置发生“红移”，出现在522nm处，AuNPs的最大紫外吸收峰的位置与AuNPs的粒径直接相关，随着AuNPs粒径的增大，最大紫外吸收峰的位置会发生红移，所以相比于裸金而言，AuNPs-SA的最大紫外吸收峰的位置红移至522nm处，表明了加入SA后由于静电相互作用导致了AuNPs的聚集，证明了AuNPs-SA复合物的成功制备，此外，图4中的插图是AuNPs与AuNPs-SA的实物图照片，AuNPs相同浓度的条件下，AuNPs-SA比AuNPs的颜色更深，进一步证明了AuNPs与SA的成功偶联。
原子力显微镜表征的结果显示，裸金比较分散，很少有聚集态存在，而当加入链霉亲和素后，AuNPs大多都以聚集态存在(见图5a和b)，这是因为由于静电吸附作用，使一个SA分子周围吸附了多个AuNPs，所以出现了AuNPs的聚集态，这对于传感器的设计来说是至关重要的，因为不管AuNPs作为显色剂还是荧光猝灭剂，一个SA分子周围吸附多个AuNPs都可以使检测信号得到放大；图6是AuNPs、AuNPs-SA及AS-AFB1的Zeta电位图，采用经典的柠檬酸钠还原法合成的AuNPs纳米颗粒表面由于存在大量的柠檬酸根离子，所以带负电荷，加入SA后，由于静电相互作用，形成了AuNPs-SA聚集体，负电性降低，进一步证明了AuNP-SA的成功制备。
3、信号探针AS-AFB1的表征和分析
本发明利用链霉亲和素和生物素的特异性结合实现AuNPs-SA与生物素修饰的AFB1全抗原的偶联。Zeta电位分析结果见图6，偶联上biotin-BSA-AFB1的AuNPs-SA相比于未偶联AFB1全抗原的AuNPs-SA而言，负电性增大，这是由于生物素修饰的AFB1全抗原带负电荷的导致的，两者之间的电位变化证明了AuNPs-SA与生物素修饰的AFB1全抗原的偶联成功。
4、识别探针Fe3O4@COOH@Ab-AFB1的表征和分析
为了验证Fe3O4@COOH与AFB1抗体是否偶联成功，对Fe3O4@COOH及偶联反应后的Fe3O4@COOH进行了扫描电镜(SEM)、元素分布(SEM-mapping)及紫外光谱的表征，结果显示Fe3O4@COOH粒径约为800nm，呈圆球形，且单个分散开(见图7)，Fe3O4@COOH间出现粘连，且其表面出现类似胶状的物质，是AFB1抗体附着在Fe3O4@COOH表面导致的，表明了Fe3O4@COOH与AFB1抗体的成功偶联(见图9)，Fe3O4@COOH主要含有Fe、O及C等元素，几乎不含有N元素(见图8)，除了与单纯的Fe3O4@COOH共同含有Fe、C及O元素外，偶联抗体后，Fe3O4@COOH表面所含的N元素明显增多，而N元素是蛋白质的标志元素，证明了Fe3O4@COOH与AFB1抗体的成功偶联(见图10)，紫外吸收光谱图的结果显示，b(反应后上清液中剩余的AFB1抗体的紫外吸收光谱结果)相对于a(偶联反应前AFB1抗体的紫外吸收光谱结果)在280nm处的峰值有所下降(见图11)，表明了有部分AFB1抗体成功偶联到了Fe3O4@COOH表面。
实施例3实验条件的优化
1、AuNPs粒径的优化
(1)实验方法
由柠檬酸钠还原氯金酸得到的AuNPs被柠檬酸根保护，表面带负电荷，通过静电排斥作用使其保持稳定，将AuNPs与RhB(荧光染料罗丹明B)混合后，RhB分子可通过静电作用吸附在AuNPs表面，由于AuNPs对RhB分子间的荧光共振能量转移产生荧光猝灭效应。本实施例从比色和荧光猝灭两个角度来确定最优的AuNPs的粒径，因此，研究了不同粒径的AuNPs对RhB的猝灭效率。
(2)实验结果
结果表明，随着AuNPs粒径的增大，猝灭效率依次降低，同浓度的不同粒径的AuNPs与同浓度的RhB混合孵育后，随着AuNPs粒径从小到大，颜色出现由蓝色到红色的转变，即AuNPs的状态由聚集到分散(见图12a-c)，表明了AuNPs越聚集，AuNPs与RhB之间的静电作用越强，从而猝灭效率越高，由于柠檬酸钠还原法通常适合于合成10nm以上的AuNPs，所以最终选择13nm的AuNPs为最佳粒径的AuNPs。
2、AuNPs与SA浓度优化
(1)实验方法
本发明中AuNPs同时作为显色剂和荧光猝灭剂，所以AuNPs的量对于检测灵敏度至关重要，因此，本实施例对AuNPs与SA的浓度和比例进行了优化，AuNPs在盐溶液中不能稳定存在，易发生聚沉而使溶液颜色由红变蓝，经SA修饰后，SA分子可以保护AuNPs，使其可以在盐溶液稳定存在，因此通过SA-AuNPs在盐溶液中的聚沉情况判断SA在AuNPs表面的修饰情况，本实施例固定SA的量，对AuNPs的量进行了优化，优化的量分别为2mL、2.5mL、3mL、4mL、6mL、8mL和10mL，向修饰有不同浓度SA的AuNPs中加入NaCl溶液，使NaCl的最终浓度为0.2mol/L，观察各AuNPs复合物的聚沉情况。如发生聚沉，则表明AuNPs表面没有被足够的SA包裹。
(2)实验结果
结果显示，随着AuNPs量的增多，SA的量相对减少，以至于AuNPs表面没有足够的SA分子来保护由盐导致的聚集，所以AuNPs的最大紫外吸收峰的位置发生红移，AuNPs的颜色出现由红到紫再到蓝的转变，当AuNPs加入2.5mL时，AuNPs-SA还能保持红色(见图13)，因此选择2.5mL AuNPs作为最佳量。
3、AuNPs-SA与Biotin-BSA-AFB1浓度优化
(1)实验方法
由于加入过多的生物素修饰的AFB1全抗原会引起AuNPs-SA的团聚，理想情况下一个AuNPs-SA连接一个Biotin-BSA-AFB1分子，引起的比色信号和荧光猝灭信号最大，本实施例对AuNPs-SA和Biotin-BSA-AFB1的浓度进行了优化，分别测定了AuNPs-SA与不同浓度Biotin-BSA-AFB1混合的紫外吸光度，以及AuNPs-SA与不同浓度Biotin-BSA-AFB1偶联前后的紫外吸收变化。
(2)实验结果
在保证每个AuNPs-SA都偶联上Biotin-BSA-AFB1的前提下，加入的Biotin-BSA-AFB1越少越好(见图14a和b)，因此，选择1.25mL的AuNPs-SA中加入4μL(2mg/mL)Biotin-BSA-AFB1的比例为最优的条件。
4、荧光检测中溶液pH的优化
(1)实验方法
AuNPs对RhB的荧光猝灭作用是由于静电相互作用导致RhB吸附到AuNPs的表面，从而导致荧光猝灭。所以本实施例考察了体系酸碱度对荧光猝灭作用的影响，分别测定了荧光检测体系的pH为2、4、6、8、10时，AuNPs对RhB的荧光猝灭效果。
(2)实验结果
结果显示，当体系pH为8时，AuNPs对RhB荧光猝灭效果最好(见图15)，因此，选择pH8.0为最优的体系pH条件。
5、RhB的浓度优化
(1)实验方法
AuNPs对RhB的荧光猝灭受AuNPs量的影响，溶液的荧光强度随着AuNPs浓度增大而线性减弱，进一步研究表明RhB与AuNPs的比例对实验灵敏度影响非常大，相对AuNPs来说，如果RhB量过多，溶液中游离的RhB会导致背景荧光增大；如果RhB不足量，则会使检测的灵敏度降低，因此，本实施例分别测定了RhB的浓度为2.5、5、10、20μg/mL时，AuNPs对RhB的荧光猝灭效果。
(2)实验结果
结果显示，当体系中RhB的浓度为10μg/mL时，△F值最大(见图16)，即AuNPs对RhB的荧光猝灭作用最大，所以选择RhB的浓度为10μg/mL。
实施例4双模式免疫传感检测方法标准曲线的建立
使用0.01M pH 7.4的PBS对AFB1的标准溶液进行稀释，在最佳优化实验条件下，按照如下比色和荧光检测AFB1的方法进行操作，其中每个浓度经过紫外检测模式和荧光检测模式分别获得对应的525nm处的紫外吸光度值和580nm处的荧光强度值，同时分别以AFB1标准品的浓度和其对应的AFB1标准品的log10作为横坐标，分别绘制AFB1标准品的紫外标准曲线和荧光标准曲线。检出限＝Absorbance525nm，阴性+3SD空白，所求得的结果即为紫外检测模式方法的检出限；检出限＝(F0-F阴性)580nm+3SD空白，所求得的结果即为荧光检测模式方法的检出限；图22a-c为本发明双模式免疫传感检测方法检测AFB1的原理图；
比色检测AFB1方法：将50μL浓度为2.5mg/mL的识别探针Fe3O4@COOH@Ab-AFB1与50μL样品或不同浓度的AFB1标准溶液(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、75、100ng/mL)混合，37℃下孵育30min，然后加入100μL的AS-AFB1，并继续在37℃下孵育30min，磁性分离取上清液，测定525nm处的紫外吸收值；
荧光检测AFB1方法：将上述免疫竞争反应后的150μL上清液与50μL RhB荧光染料混合并在37℃条件下孵育30min，测定580nm处的荧光强度。
1、紫外标准曲线的建立
(1)实验方法
在最佳的实验条件下，为了实现裸眼可视化检测的目的，将AFB1的标准品用PBS分别稀释至10μg/mL、1μg/mL、500ng/mL及0ng/mL；
为了提高检测的灵敏度，满足国标中对AFB1的限量标准，在最佳的实验条件下，借助紫外分光光度计建立了AFB1的紫外检测方法，AFB1的标准品用PBS分别稀释至5、10、20、50、75、100ng/mL，其中AFB1标准样品浓度越高，抗原抗体结合的量就越少，从而上清液中剩下的AS-AFB1越多，当用紫外分光光度计检测时，525nm处的紫外吸收峰就越高。
(2)实验结果
由于竞争原理，AFB1标准品浓度越高，抗原抗体结合的就越少，从而上清液中剩下的AS-AFB1越多，所以颜色越深，随着AFB1浓度的降低，溶液颜色逐渐变浅，裸眼可视的AFB1的检出限为500ng/mL(见图17)；
随着浓度的逐渐增加，紫外吸收峰值逐渐增加，并且在10-100ng/mL的浓度范围内，525nm处的紫外吸收值与AFB1的浓度具有显著的线性相关性，当体系中不存在AFB1样品时，525nm处的紫外吸收峰值最小(见图18a)，这表明抗体全部与AuNPs-SA上的抗原结合，上清液剩余的AS-AFB1最少，颜色最浅，图18b是该方法检测AFB1的标准曲线，以AFB1不同浓度作为横坐标，每个浓度所对应的525nm处的紫外吸收值作为纵坐标，从而建立起标准曲线，该检测模式的检测线性范围为10ng/mL-100ng/mL，线性方程为y＝4.662×10-4x+0.2023，R2＝0.9877，检出限为6.95ng/mL。
2、荧光标准曲线的建立
(1)实验方法
为了进一步提高检测的灵敏度，在最佳的实验条件下，同时建立了检测AFB1的荧光检测模式，AFB1的标准品用PBS分别稀释至0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、10ng/mL。其中AFB1标准样品浓度越高，竞争反应后上清液中剩下的AS-AFB1越多，因此对RhB的荧光猝灭程度就越大，所以在用荧光分光光度计检测时，580nm处的荧光强度就越低。
(2)实验结果
随着AFB1浓度的逐渐增加，荧光强度逐渐降低，并且在0.1ng/mL至10ng/mL的浓度范围内，580nm处的荧光强度与AFB1的浓度具有显著的线性相关性(见图19a)，图19b是该方法检测AFB1的标准曲线，以AFB1的浓度的对数值为横坐标，以580nm处AFB1为0时的荧光强度与各不同浓度AFB1的荧光强度的差值为纵坐标，从而建立起标准曲线，该检测方法的检测线性范围为0.1ng/mL-10ng/mL，线性方程为y＝695.0+508.6lgx，R2＝0.9899，检出限为0.07ng/mL。
实施例5双模式免疫传感检测方法的特异性检测
1、实验方法
为了评估已建立的AFB1双模式免疫传感检测方法的特异性，选择AFB1的结构类似物和功能类似物AFM1、AFM2，OTA和FB1作为干扰因子来评估该方法的特异性，在比色检测模式中，选择相同浓度(20ng/mL和50ng/mL两个浓度梯度)的毒素AFM1、AFM2、OTA和FB1作为非特异性抗原来评价传感器的特异性。在荧光检测模式中，则选择0.1ng/mL的毒素(AFB1、AFM1、AFM2、OTA及FB1)浓度来检验荧光检测通道的特异性。
2、实验结果
结果显示，即使在高浓度的AFM1、AFM2、OTA和FB1中也只测量到很小的非特异性信号，表明了本发明所建立的紫外检测方法具有优异的AFB1检测选择性(见图20a)；AFM1、AFM2、OTA和FB1中仅有很小的非特异性信号(见图20b)，表明了本发明所建立的荧光检测方法对AFB1有良好的选择性。
实施例6实际样品中黄曲霉毒素B1的检测
为了评估本发明开发的双模式免疫检测方法在真实样品检测中的准确性和实用性，选择玉米油、玉米和花生这三种常见的食物样品，通过在实际样品中加入不同浓度AFB1标准品进行回收率实验。
1、实验方法
(1)玉米油样品的预处理：对从当地超市购买的玉米油进行处理：将10g玉米油和20mL提取液(70:30甲醇/水，v/v)放入100mL锥形烧瓶中并涡旋用涡旋振荡器振荡2min，然后，移取1mL的混合物溶液，并以4000rpm离心1min，收集上清液。
(2)花生和玉米样品的预处理：对从当地超市购买的花生和玉米进行处理：使用研磨机将约20g玉米样品和花生样品磨碎，精确称取10g样品粉末，并将其添加到20mL的70％甲醇水溶液(v：v)中，摇动30min后，将混合物以5000rpm离心15min，收集上清液。
(3)加标回收率测定：将不同浓度的AFB1(50、20、1ng/mL)添加到样品中，制备不同污染程度的加标样品，并计算样品AFB1回收率，计算方法为：加标回收率(％)＝(C加标后-C样品)/C标准品×100％，其中，C加标后为样品加入AFB1标准品后的检测浓度，C样品为样品加入AFB1标准品前的检测浓度，C标准品为加入标准样品的浓度，每个浓度重复3次。
2、实验结果
结果显示，在三个加标水平上(加标浓度分别为0.5、10、20ng/mL)，所建立的双信号免疫传感检测方法的回收率在78.7％～127.9％之间(见表2)，表明该方法几乎不受基质的干扰，满足AFB1高灵敏度分析的需求。
表2双模式免疫传感方法AFB1实际样品检测及方法对照
对比例采用传统的ELISA法检测曲霉毒素B1以及方法学对比
本实施例以传统的ELISA为基础，通过优化相关实验条件，建立了直接竞争ELISA检测AFB1的方法，此外，通过高效液相色谱串联质谱法(LC-MS)以及AFB1 ELISA试剂盒法做了方法学对比实验。
1、实验条件的优化
通过棋盘法分别优化AFB1全抗原和AFB1单克隆抗体的最优浓度，其中AFB1全抗原的包被浓度分别为1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000倍稀释(用CBS液稀释)。AFB1单克隆抗体的浓度分别进行1:16000、1:32000、1:48000、1:64000、1:128000、1:256000倍稀释(用抗体稀释液稀释)，观察不同条件下的结果，确定AFB1全抗原和AFB1单克隆抗体的最优浓度，其中，阴性不加一抗，空白不加入一抗和二抗。
2、直接竞争ELISA方法的建立
(1)包被：使用CBS缓冲液将AFB1全抗原稀释至1:32000，以每孔100μL涂至酶标板，将其置于37℃的恒温恒湿箱孵育2h；
(2)洗涤：取出已包被有AFB1全抗原的酶联板，一次性大力甩出孔内液体并注意防止液体窜孔，于吸水纸上拍打数次后，直至孔内液体拍净，每孔加220μL PBST洗涤液，洗涤3次，每次3min；
(3)封闭：每孔加入200μL 1％BSA封闭液，37℃下孵育1h；
(4)洗涤：每孔220μL洗涤液，洗涤3次，每次3min，同步骤(2)；
(5)竞争反应：加AFB1抗原，每孔50μL，阴性孔加入抗体稀释液；同时加AFB1单克隆抗体50μL(稀释比例为1:48000)，37℃下孵育1h；
(6)加二抗：从-20℃取出辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，将其稀释为1:4000(取1μL二抗加入4mL抗体稀释液)，每孔加入100μL，酶标二抗的孵育时间为37℃，1h；
(7)洗涤：每孔220μL洗涤液洗涤3次，每次3min，步骤同(2)；
(8)TMB显色：每孔加入100μL TMB单组分显色液，37℃下显色15min；
(9)终止：每孔加入50μL的2M H2SO4，终止显色反应，加入后由蓝色变为黄色；
(10)读数：打开酶标仪总开关，打开软件，其进行自动测试，自动测试后将酶标板放在仪器检测框内，按软件的START键。仪器开始检测：震荡混匀、检测两次。使用酶标仪测OD450值。
3、标准曲线的绘制
用抗体稀释液将AFB1的标准品分别稀释为40、20、10、5、2.5、1.25ng/mL，在上述优化的条件下，按照上述实验步骤进行操作，计算各浓度标准样品的OD450值，并以此为纵坐标，同时以标准样品浓度的对数值作为横坐标绘制标准曲线，对10份空白样品进行检测，最低检出信号＝空白样品的OD平均值+3空白样品OD值的标准偏差，计算该方法的检出限。
4、方法学对比
本实施例通过高效液相色谱串联质谱法(LC-MS)以及AFB1 ELISA试剂盒法做了方法学对比实验，即也是通过实际样品分别添加三个加标水平来考察回收率验证，LC-MS具体操作方法为：制备含有3种不同AFB1浓度(0.5、10、20ng/mL)的溶液，上样检测；AFB1 ELISA试剂盒的具体操作方法按照试剂盒中的步骤操作。
5、实验结果
确定最优的实验条件(见图21a)，即AFB1全抗原、AFB1单克隆抗体、二抗浓度最佳稀释比例分别为：1:32000、1:48000和1:4000的条件下，使用抗体稀释液将AFB1标准品稀释成40、20、10、5、2.5、1.25ng/mL，通过直接竞争ELISA方法得到AFB1的标准曲线，通过直接竞争ELISA方法结果表明，AFB1在2.5～40ng/mL的浓度范围内具有良好的线性关系，线性方程为y＝0.651-0.344X，R2＝0.987，检出限为0.113ng/mL(见图21b)，但该方法操作复杂，耗时长，且辣根过氧化物酶的催化能力有限，难以满足对AFB1高灵敏和现场快速检测的需求；
本发明构建的双模式免疫检测方法的检出限为0.07ng/mL，显著优于经条件优化后的传统的ELISA法(检出限为0.113ng/mL)，且比市售的AFB1 ELISA试剂盒的灵敏度高，线性范围宽，双模式免疫检测方法的检出结果与LC-MS法检出的结果具有较好的一致性(见表2)，验证了本发明方法的准确性。此外，该双模式免疫检测方法可实现裸眼可视化检测，通过颜色的深浅直观地实现了AFB1的检测，检出限低，线性范围宽，检测时间短，操作简单、该双模式免疫检测方法的全程检测时间在2h以内，满足快速检测的要求，因此，是一种直观高灵敏检测AFB1的方法。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于比色/荧光双模式快速检测黄曲霉毒素B1的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器包括两种功能性的探针；
优选地，所述功能性的探针包括信号探针、识别探针；
更优选地，所述信号探针由金纳米颗粒、链霉亲和素、黄曲霉毒素B1全抗原构成；
更优选地，所述识别探针由磁性纳米颗粒、抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体构成；
最优选地，所述黄曲霉毒素B1全抗原为生物素修饰的黄曲霉毒素B1全抗原；
最优选地，所述磁性纳米颗粒为表面修饰有羧基基团的磁性纳米颗粒；
最优选地，所述磁性纳米颗粒包括表面修饰有羧基基团的Fe3O4、γ-Fe2O3、CoFe2O4、ZnFe2O4、FePd、CoPt3、MnFe2O4、MgFe2O4；
最优选地，所述磁性纳米颗粒为表面修饰有羧基基团的Fe3O4。
2.权利要求1所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)向金纳米颗粒溶液中加入链霉亲和素溶液，孵育、封闭、离心和重悬后得到金纳米颗粒-链霉亲和素聚集体；
(2)向步骤(1)得到的金纳米颗粒-链霉亲和素聚集体中加入生物素修饰的黄曲霉毒素B1全抗原，混合、离心和重悬后得到信号探针；
(3)向磁性纳米颗粒重悬液中加入EDS和NHS进行活化，活化后磁性分离去上清，加入反应缓冲液得到表面修饰有羧基基团的磁性纳米颗粒重悬液；
(4)向步骤(3)得到的表面修饰有羧基基团的磁性纳米颗粒重悬液中加入抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行反应，反应后磁性分离去上清，封闭、重悬后得到识别探针。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的金纳米颗粒溶液为pH为6.2-6.4的金纳米颗粒溶液；
优选地，所述金纳米颗粒为13-20nm的金纳米颗粒；
更优选地，所述金纳米颗粒为13nm的金纳米颗粒；
最优选地，所述金纳米颗粒溶液的用量为1-5mL；
最优选地，所述金纳米颗粒溶液的用量为2.5mL；
优选地，步骤(1)中所述的链霉亲和素的用量为1mg/mL、25μL；
优选地，步骤(1)中所述的孵育的条件为25℃、1h；
优选地，步骤(1)中所述的封闭的条件为采用BSA封闭液封闭30min；
更优选地，所述BSA封闭液的用量为10％BSA、250μL；
优选地，步骤(1)中所述的离心的条件为4℃、12000rpm、20min；
优选地，步骤(1)中所述的重悬的条件为采用PBS缓冲液进行重悬；
更优选地，所述PBS缓冲液的用量为pH 7.4、0.01M、1.25mL。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的生物素修饰的黄曲霉毒素B1全抗原为生物素修饰的BSA-黄曲霉毒素B1全抗原；
优选地，所述生物素修饰的BSA-黄曲霉毒素B1全抗原的用量为2mg/mL、4μL；
优选地，步骤(2)中所述的金纳米颗粒-链霉亲和素聚集体的用量为1-1.5mL；
更优选地，步骤(2)中所述的金纳米颗粒-链霉亲和素聚集体的用量为1.25mL；
优选地，步骤(2)中所述的混合的条件为25℃、1h；
优选地，步骤(2)中所述的离心的条件为4℃、12000rpm、20min；
优选地，步骤(2)中所述的重悬的条件为采用PBS缓冲液进行重悬；
更优选地，所述PBS缓冲液的用量为pH 7.4、0.01M、1.25mL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的磁性纳米颗粒重悬液中磁性纳米颗粒的量为5-15mg；
优选地，所述磁性纳米颗粒重悬液中磁性纳米颗粒的量为10mg；
优选地，所述磁性纳米颗粒包括Fe3O4、γ-Fe2O3、CoFe2O4、ZnFe2O4、FePd、CoPt3、MnFe2O4、MgFe2O4；
更优选地，所述磁性纳米颗粒为Fe3O4；
优选地，步骤(3)中所述的EDS和NHS的用量分别为100μL、100μL；
优选地，步骤(3)中所述的活化的条件为25℃、混合30min；
优选地，步骤(3)中所述的反应缓冲液为MES缓冲液；
更优选地，所述MES缓冲液的用量为pH 5.0、100mM、500mL。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的用量为50-150μL；
优选地，所述抗黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的用量为100μL；
优选地，步骤(4)中所述的反应的条件为25℃、混合2h；
优选地，步骤(4)中所述的封闭的条件为采用Tris-HCl封闭缓冲液封闭1h；
更优选地，所述Tris-HCl封闭缓冲液的用量为pH 7.4、0.1M、1mL；
优选地，步骤(4)中所述的重悬的条件为采用PBS缓冲液进行重悬；
更优选地，所述PBS缓冲液的用量为pH 7.4、0.01M、1mL。
7.一种比色和荧光双模式快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测样品加入到权利要求1所述的识别探针中，混合孵育1-2h；
(2)向步骤(1)得到的溶液中加入权利要求1所述的信号探针，混合孵育1-2h；
(3)对步骤(2)得到的溶液进行磁性分离，对上清液进行裸眼可视和/或紫外可见近红外光谱分析；
(4)向步骤(3)所述的上清液中加入荧光染料，混合孵育1-2h后，进行荧光光谱分析；
优选地，步骤(1)中所述的识别探针的用量为2.5mg/mL、50μL；
优选地，步骤(1)中所述的混合孵育的条件为37℃、30min；
优选地，步骤(2)中所述的信号探针的用量为100μL；
优选地，步骤(2)中所述的混合孵育的条件为37℃、30min；
优选地，步骤(3)中所述的紫外可见近红外光谱分析是对上清液在525nm处的紫外吸收值进行测定分析；
优选地，步骤(4)中所述的荧光染料包括罗丹明B、红色罗丹明、四甲基罗丹明、异硫氰酸荧光素、羟基荧光素、四氯荧光素、Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、AlexaFluor350、AlexaFluor405、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor610、AlexaFluor633、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；
更优选地，所述荧光染料为罗丹明B；
最优选地，所述荧光染料的用量为50μL；
优选地，步骤(4)中所述的混合孵育的条件为37℃、30min；
优选地，步骤(4)中所述的荧光光谱分析是对混合后的上清液在580nm处的荧光强度进行测定分析。
8.一种用于检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的生物传感器；
优选地，所述试剂盒基于权利要求7所述的方法进行检测。
9.权利要求1所述的生物传感器在裸眼可视化检测黄曲霉毒素B1、比色/荧光双模式快速检测黄曲霉毒素B1中的应用。
10.权利要求1所述的生物传感器在制备用于检测黄曲霉毒素B1的产品中的应用；
优选地，所述产品包括试剂盒、试纸条、芯片。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN115341015A (zh) * | 2022-09-06 | 2022-11-15 | 天津大学 | 检测黄曲霉毒素b1的荧光生物传感器、制备方法及应用 |
| CN115728254A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-03-03 | 中国海洋大学 | 一种电化学比色双信号传感器、其制备方法及应用 |
| JP7455442B1 (ja) | 2023-06-16 | 2024-03-26 | 青▲島▼▲農▼▲業▼大学 | Ｎｈ２－ｍｉｌ－５３に基づくアフラトキシンｂ１の検出方法 |
Citations (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4859611A (en) * | 1985-02-28 | 1989-08-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Affinity column and process for detection of low molecular weight toxic substances |
| WO2002018951A2 (en) * | 2000-08-29 | 2002-03-07 | The Rockefeller University | Methods employing fluorescence quenching by metal surfaces |
| WO2006088425A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Midorion Ab | Sensor for detection of single molecules |
| CN102137936A (zh) * | 2007-02-09 | 2011-07-27 | 西北大学 | 检测细胞内标靶的颗粒 |
| CN102161645A (zh) * | 2009-08-20 | 2011-08-24 | 上海交通大学 | 基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法 |
| CN102507551A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-06-20 | 国家纳米科学中心 | 一种检测AChE的检测试剂及其制备方法 |
| US20130071947A1 (en) * | 2011-09-20 | 2013-03-21 | Libing Wang | Chirality sensor and method for detection of aflatoxin by using the sensor |
| CN106771221A (zh) * | 2016-12-16 | 2017-05-31 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种毒死蜱分析测定试剂盒及其应用 |
| CN107389628A (zh) * | 2017-06-09 | 2017-11-24 | 福建医科大学孟超肝胆医院 | 一种细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用 |
| CN107723347A (zh) * | 2017-08-14 | 2018-02-23 | 樊之雄 | 一种测定赭曲霉毒素a的超灵敏比色传感检测方法 |
| WO2018111782A1 (en) * | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Cepheid | Integrated immuno-pcr and nucleic acid analysis in an automated reaction cartridge |
| CN108226105A (zh) * | 2017-01-14 | 2018-06-29 | 安庆师范大学 | 一种对毒死蜱及其水解产物具有可视化检测的罗丹明b修饰金纳米颗粒探针及其制备方法 |
| CN109709322A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-05-03 | 湖北工业大学 | 一种检测黄曲霉毒素b1的检测方法 |
| CN110873791A (zh) * | 2018-08-29 | 2020-03-10 | 中国农业大学 | 一种基于双标记信号放大的间接背景荧光胶体金免疫层析试纸条及其应用 |
| CN211528427U (zh) * | 2020-01-10 | 2020-09-18 | 陈琪 | 一种分离磁微粒的装置及设备 |
| CN113075191A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-06 | 南通大学 | 一种基于拉曼光谱法的miRNA的高灵敏度检测方法 |
| CN113092766A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-09 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用 |
| CN113218937A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-08-06 | 江苏科技大学 | 一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器及其制备与应用 |
| CN113720794A (zh) * | 2021-06-11 | 2021-11-30 | 海南大学 | 基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法 |
-
2022
- 2022-01-10 CN CN202210021412.8A patent/CN114354591B/zh active Active
Patent Citations (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4859611A (en) * | 1985-02-28 | 1989-08-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Affinity column and process for detection of low molecular weight toxic substances |
| WO2002018951A2 (en) * | 2000-08-29 | 2002-03-07 | The Rockefeller University | Methods employing fluorescence quenching by metal surfaces |
| WO2006088425A1 (en) * | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Midorion Ab | Sensor for detection of single molecules |
| CN102137936A (zh) * | 2007-02-09 | 2011-07-27 | 西北大学 | 检测细胞内标靶的颗粒 |
| CN102161645A (zh) * | 2009-08-20 | 2011-08-24 | 上海交通大学 | 基于青霉烯酸硫醇汞盐的全抗原制备方法 |
| US20130071947A1 (en) * | 2011-09-20 | 2013-03-21 | Libing Wang | Chirality sensor and method for detection of aflatoxin by using the sensor |
| CN102507551A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-06-20 | 国家纳米科学中心 | 一种检测AChE的检测试剂及其制备方法 |
| WO2018111782A1 (en) * | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Cepheid | Integrated immuno-pcr and nucleic acid analysis in an automated reaction cartridge |
| CN106771221A (zh) * | 2016-12-16 | 2017-05-31 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种毒死蜱分析测定试剂盒及其应用 |
| CN108226105A (zh) * | 2017-01-14 | 2018-06-29 | 安庆师范大学 | 一种对毒死蜱及其水解产物具有可视化检测的罗丹明b修饰金纳米颗粒探针及其制备方法 |
| CN107389628A (zh) * | 2017-06-09 | 2017-11-24 | 福建医科大学孟超肝胆医院 | 一种细胞凋亡双色检测和成像探针及其应用 |
| CN107723347A (zh) * | 2017-08-14 | 2018-02-23 | 樊之雄 | 一种测定赭曲霉毒素a的超灵敏比色传感检测方法 |
| CN110873791A (zh) * | 2018-08-29 | 2020-03-10 | 中国农业大学 | 一种基于双标记信号放大的间接背景荧光胶体金免疫层析试纸条及其应用 |
| CN109709322A (zh) * | 2019-01-15 | 2019-05-03 | 湖北工业大学 | 一种检测黄曲霉毒素b1的检测方法 |
| CN211528427U (zh) * | 2020-01-10 | 2020-09-18 | 陈琪 | 一种分离磁微粒的装置及设备 |
| CN113075191A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-06 | 南通大学 | 一种基于拉曼光谱法的miRNA的高灵敏度检测方法 |
| CN113092766A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-09 | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 | 多种真菌毒素的检测试剂盒，其制备方法及检测方法和应用 |
| CN113218937A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-08-06 | 江苏科技大学 | 一种黄曲霉毒素磁性多重增敏传感器及其制备与应用 |
| CN113720794A (zh) * | 2021-06-11 | 2021-11-30 | 海南大学 | 基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JIHEA MOON 等: "A Gold Nanoparticle and Aflatoxin B1-BSA Conjugates Based Lateral Flow Assay Method for the Analysis of Aflatoxin B1", 《MATERIALS》, no. 5, pages 634 - 643 * |
| LIMEI AO 等: "Fluoroimmunoassay for Antigen Based on Fluorescence Quenching Signal of Gold Nanoparticles", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》, vol. 78, no. 4, pages 1104 - 1106 * |
| 沈洋;胡继文;刘婷婷;郜洪文;胡张军;: "纳米光学传感器用于检测汞离子", 化学进展, no. 04, pages 54 - 67 * |
| 霍冰洋;苑帅;张曼;宁保安;彭媛;白家磊;徐艳阳;高志贤;: "金黄色葡萄球菌肠毒素B检测方法的研究进展", 食品安全质量检测学报, no. 09, pages 75 - 81 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115341015A (zh) * | 2022-09-06 | 2022-11-15 | 天津大学 | 检测黄曲霉毒素b1的荧光生物传感器、制备方法及应用 |
| CN115728254A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-03-03 | 中国海洋大学 | 一种电化学比色双信号传感器、其制备方法及应用 |
| JP7455442B1 (ja) | 2023-06-16 | 2024-03-26 | 青▲島▼▲農▼▲業▼大学 | Ｎｈ２－ｍｉｌ－５３に基づくアフラトキシンｂ１の検出方法 |
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