CN115341015A - 检测黄曲霉毒素b1的荧光生物传感器、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器、制备方法及应用，所述荧光生物传感器包括：识别探针、报告探针、信号放大元件、检测装置；所述识别探针由链霉亲和素磁珠和生物素化核酸适配体组成；所述识别探针和报告探针通过DNA双链的碱基互补配对作用进行连接；识别探针作为敏感元件直接感受被检测的AFB1，信号放大元件作用于未进行DNA双链连接的识别探针，释放与识别探针结合的AFB1，产生荧光强度信号，通过所述检测装置，光信号转换为电信号。本发明可以实现AFB1的特异性高灵敏的浓度检测，且成本低，方便快捷。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感检测技术领域，尤其涉及一种检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器的制备方法，并将其应用于黄曲霉毒素B1的检测应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1(AFB1)是由黄曲霉菌产生的次级代谢产物，具有较强的毒性、诱变性及致癌性，其理化性质稳定，很难被降解。根据国际癌症研究机构(IARC)分类，该毒素被归类为I类致癌物。欧盟(EC,No.1126/2007)和中国(GB2761-2017)分别将AFB1在谷物中的最大残留水平(MRLs)设定为2μg/kg和5μg/kg。传统的检测方法，例如：高性能液相色谱(HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)，可以进行AFB1检测，并且已经具有较高的灵敏度和成熟的技术。然而，这些方法依赖于昂贵的仪器设备和专业的技术实验室研究人员进行检测，同时提纯步骤繁琐，检测耗时较长。这些缺点在一定程度上限制了利用传统方法进行霉菌毒素检测的发展。
作为一种新兴的测定技术，生物传感器用于霉菌毒素的检测具有显著的优势。适配体是一段经筛选的寡核苷酸序列，能够与相应的靶标进行高亲和力和强特异性的结合。相比于抗体这一生物识别元件，适配体具有批间差异小、成本低、修饰简单和容易保存等特点。核酸外切酶I能够特异性地从3’→5’方向降解单链DNA，而不会作用于双链DNA或者3’末端磷酸化的单链DNA。
目前已有很多利用适配体双链竞争并结合酶切信号放大的方法应用于真菌毒素检测的报道。例如，Xuhan Xia等人利用双端互补的适配体探针，结合聚集诱导发光染料和酶切放大策略，报告了无标记的AFB1检测方法。Linyue Tang等人利用两段与适配体双端分别互补的序列，与适配体共同合成水凝胶，并通过酶切循环扩增，报告了使用电子天平读数的AFB1检测方法。尽管这些方法运用了酶切放大策略，但其检测灵敏度受限于互补序列的选择。
发明内容
本发明提供了一种检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器、制备方法及应用，本发明可以实现AFB1的特异性高灵敏的浓度检测，且成本低，方便快捷，详见下文描述：
本发明的荧光生物传感器以磁珠为载体，以AFB1的核酸适配体为识别元件，两者结合构成识别探针，以核酸适配体的部分互补序列标记荧光作为报告探针。其中，AFB1的核酸适配体序列为：5’-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT GTC TCG TGC CCT TCG CTA GGCCCA CA-3’，核酸适配体的部分互补序列为：5’-TTT AAG GGC ACG AGA CA-3’。AFB1的核酸适配体序列已公开(J.A.Cruz-aguado,(12)Patent Application Publication(10)Pub.No.:US 2012/0225494 A1,1(2012).)。
优选的，磁珠表面修饰了链霉亲和素。
优选的，核酸适配体的5’末端增加了6个胸腺嘧啶(T)，以减少其与磁珠连接时的空间位阻。
优选的，核酸适配体的5’末端修饰了生物素。
优选的，部分互补序列的5’末端标记了荧光。
本发明还提供了上述荧光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
S1，在反应缓冲液中加入所述磁珠和所述核酸适配体，将所述核酸适配体偶联到所述磁珠的结合位点上；
S2，将S1步骤得到的磁珠和所述核酸适配体的部分互补序列在杂交缓冲液中反应15～60min，通过碱基互补配对，组成由磁珠、核酸适配体和荧光标记互补序列组成的生物传感器件。
优选的，步骤S1之前将所述核酸适配体在95℃变性5min中，随后立即置于-20℃冷却降温并保存直至使用。
该优选方案中，高温变形后立即冷却降温可以消除所述核酸适配体的二级结构，使其维持单链状态，有利于后续的杂交反应。
优选的，步骤S1中将所述核酸适配体偶联到所述磁珠的结合位点之后，还包括磁分离去除过量的核酸适配体单链，再将封闭剂连接到所述磁珠上进行封闭。
优选的，步骤S2中将磁珠与部分互补序列杂交之后，还包括磁分离去除过量的部分互补序列单链。
该优选方案中，使用封闭剂对磁珠上未结合的空余位点进行封闭处理，从而有利于减少检测过程中对荧光标记的部分互补序列的非特异性吸附，降低背景噪声，提高检测灵敏度。
进一步的，所述封闭剂为牛血清蛋白(BSA)或者脱脂奶粉。
进一步的，步骤S1中，所述反应缓冲液为Tris的盐缓冲液。
具体地，Tris盐缓冲液可包括10mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM EDTA,1M NaCl,0.01％～0.1％Tween-20。
进一步的，步骤S2中，所述杂交缓冲液为Tris的盐缓冲液。具体地，Tris盐缓冲液可包括10mM Tris-HCl(pH 7.5),120mM NaCl,0.01％～0.1％Tween-20。
本发明还提供了上述荧光生物传感器用于定量检测AFB1的方法，包括以下步骤：
A1，将10μL上述荧光生物传感器与100μL 0ng/mL～1000ng/mL的AFB1标准溶液在加入核酸外切酶I的结合缓冲液中混合孵育1h，经过磁分离后将沉淀重悬于检测缓冲液中，检测所述重悬液在520nm处的荧光强度；所述激发波长设置为480nm。
A2，将步骤A1中加样0ng/mLAFB1标准溶液检测到的荧光强度作为空白值F0，将步骤S1中加样0ng/mLAFB1标准溶液检测到的荧光强度作为信号值F，得出荧光强度下降值(F0-F)与AFB1浓度的标准曲线。
A3，将10μL上述荧光生物传感器与100μL 待测浓度的AFB1溶液在加入核酸外切酶I的结合缓冲液中混合孵育1h，经过磁分离后将沉淀重悬于检测缓冲液中，检测所述重悬液在520nm处的荧光强度，代入步骤S2中的标准曲线，得出待测溶液中AFB1的浓度。
优选的，步骤A1和A3中，结合缓冲液为Tris的盐缓冲液。具体地，Tris盐缓冲液可包括10mM Tris-HCl(pH 8.0),120mM NaCl,5mM MgCl2,5mM KCl,0.01％～0.1％Tween-20。
优选的，步骤A1和A3中，检测缓冲液为PBS缓冲液(pH 7.4)。
进一步的，所述标准曲线为y＝45663.29lg(x)+19998.21，R2＝0.991，其中x为AFB1的浓度，y为荧光强度下降值(F0-F)。
本发明提供的技术方案的有益效果是：
1、本发明采用链霉亲和素磁珠，有利于高效地实现适配体的修饰，并且便于后续方便快捷地完成分离步骤；
2、本发明采用设计的部分互补序列以及核酸外切酶I，将双链竞争策略和酶切辅助靶标循环策略相结合，有效地提高了AFB1的检测灵敏度；
3、本发明的制备和检测过程简单，且相较于传统的抗原抗体方法，显著降低了生物传感器的成本，同时提高了生物传感器的稳定性；
4、本发明提出的荧光生物传感器对AFB1的检出限为0.36ng/mL，适用于农副产品中AFB1的快速检测。
附图说明
图1为该荧光生物传感器检测AFB1的原理示意图；
图2为该荧光生物传感器可行性分析中不同溶液的荧光强度图；
图3为AFB1浓度与荧光强度下降值的线性关系图；
图4为加入不同真菌毒素时，对应的荧光强度下降值关系图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施方式作进一步地详细描述。
一种检测AFB1的荧光生物传感器的制备方法，具体通过如下技术方案实现：
以修饰链霉亲和素的磁珠为载体，该磁珠与生物素化的核酸适配体以及荧光标记的部分互补序列自组装构建功能化的荧光生物传感器。该生物传感器用于AFB1检测，利用磁珠的磁分离性能，将竞争脱离的荧光标记部分互补序列分离出体系。加入核酸外切酶I，可以降解已结合AFB1的核酸适配体单链，释放AFB1进而实现靶标循环的信号放大。对该生物传感器体系进行荧光强度的测定以确定相较于空白加样时的荧光强度下降值，从而得出样品中AFB1的浓度，实现高灵敏度测量。
该荧光生物传感器用于AFB1检测的可行性如下：
核酸适配体具有高特异性、高亲和力地与待测物结合的特性。在向荧光生物传感器的体系中加入AFB1样品时，相比于部分互补序列，它与适配体的结合能力更强，从而竞争性地结合适配体，进而通过磁分离步骤，互补序列将从磁珠上移除，该体系中的荧光强度会对应下降。同时在该体系中引入核酸外切酶I后，由于其切割单链的特性，结合AFB1的核酸适配体单链会被降解。结合物中的AFB1被释放，进一步竞争双链中的适配体，使得更多的互补序列从磁珠表面分离，该体系中的荧光强度下降更加明显。
实施例1
本发明实施例提供了一种检测AFB1的荧光生物传感器的制备方法，参见图1，该荧光生物传感器包括：识别探针(由链霉亲和素磁珠和生物素化核酸适配体组成)、报告探针(即荧光标记的部分互补序列)、信号放大元件(即核酸外切酶I)、检测装置。
该荧光生物传感器的制备方法的具体步骤包括：
将核酸适配体在95℃变性5min，随后立即放入-20℃冷却20min；
将10μL 1mg/mL链霉亲和素磁珠与20μL 500nM适配体在25℃振荡孵育20～30min，用反应缓冲液清洗2～3次，组成识别探针；
将10μL 1mg/mL上述识别探针与50μL 2％BSA在25℃振荡孵育1～2h，用杂交缓冲液清洗2～3次；
将10μL 1mg/mL上述识别探针与20μL 1μM部分互补序列在25℃振荡孵育15～60min，用杂交缓冲液清洗2～3次，得到荧光生物传感器；
将上述荧光生物传感器重悬于结合缓冲液，并于4℃保存。
在后续的检测过程中，向上述荧光生物传感器的溶液中加入核酸外切酶I，设置检测装置的激发波长为480nm，并读出该生物传感器体系在520nm处的荧光强度。
实施例2
下面结合图2对实施例1中的方法用于检测AFB1进行可行性分析：
构建的荧光生物传感器加入空白样品时，体系在520nm处有较高的荧光强度值。当向传感器体系中仅加入AFB1时，由于AFB1与适配体特异性结合，互补序列与适配体分离，经磁分离后随上清液一起被移除，此时荧光强度明显下降。当向传感器体系中仅加入核酸外切酶I时，考虑其对过量的互补序列的降解作用，进一步消除了其特异性吸附在磁珠表面而产生的背景噪声，荧光强度同样有所下降。当向传感体系中同时加入AFB1和核酸外切酶I时，由于其切割已经结合AFB1的核酸适配体单链，释放靶标进行信号放大，荧光强度下降更加明显。以上结果说明该荧光生物传感器体系可以实现AFB1的检测。
实施例3
下面进一步对实施例1中的方法用于检测AFB1进行灵敏度分析：
在结合缓冲液中，向制备的荧光生物传感器加入不同浓度的AFB1样品(1，5，10，50，100，500，1000ng/mL)，在37℃孵育60min，并用结合缓冲液清洗2～3次；
在室温下分别检测上述溶液在520nm处的荧光强度，获得荧光强度下降值与AFB1浓度的标准曲线如图3所示；线性方程为：y＝45663.29lg(x)+19998.21，相关系数R2＝0.991，其中x为AFB1的浓度，y为荧光强度下降值(F0-F)。该方法应用于AFB1浓度的检测限为0.36ng/mL(S/N＝3)。
实施例4
下面进一步对实施例1中的方法用于检测AFB1进行特异性分析：
在结合缓冲液中，向制备的荧光生物传感器加入不同待检测的毒素样品，其中AFB1浓度为100ng/mL，赭曲霉素A(OTA)浓度为1000ng/mL，玉米赤霉烯酮(ZEN)浓度为1000ng/mL，混合溶液1(Mix1)包括：OTA和ZEN，混合溶液2(Mix2)包括：OTA,ZEN和AFB1，在37℃孵育60min，并用结合缓冲液清洗2～3次。
在室温下分别检测上述溶液在520nm处的荧光强度，获得荧光强度下降值与加入不同样品溶液的关系如图4所示。以上结果说明该荧光生物传感器体系可以实现AFB1特异性检测。
本发明实施例对各器件的型号除做特殊说明的以外，其他器件的型号不做限制，只要能完成上述功能的器件均可。
本领域技术人员可以理解附图只是一个优选实施例的示意图，上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器，其特征在于，所述荧光生物传感器包括：识别探针、报告探针、信号放大元件、检测装置；
所述识别探针由链霉亲和素磁珠和生物素化核酸适配体组成；所述识别探针和报告探针通过DNA双链的碱基互补配对作用进行连接；识别探针作为敏感元件直接感受被检测的AFB1，信号放大元件作用于未进行DNA双链连接的识别探针，释放与识别探针结合的AFB1，产生荧光强度信号，通过所述检测装置，光信号转换为电信号。
2.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器，其特征在于，所述报告探针为标记荧光的部分互补序列，其核苷酸序列为5’-TTT AAG GGC ACG AGA CA-3’；所述信号放大元件为核酸外切酶I。
3.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光生物传感器，其特征在于，所述检测装置为荧光酶标仪，采用480nm的激发波长和520nm的发射波长。
4.一种用于权利要求1-3中任一权利要求所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)磁珠与适配体通过链霉亲和素-生物素系统连接，合成识别探针；
(2)封闭识别探针的未结合位点；
(3)识别探针与报告探针通过碱基互补配对进行自组装。
5.根据权利要求4所述的荧光生物传感器的制备方法，其特征在于，所述封闭识别探针的未结合位点的步骤中，采用牛血清蛋白或者脱脂奶粉。
6.一种荧光生物传感器的应用，其特征在于，所述荧光生物传感器用于AFB1浓度的检测。
7.根据权利要求6所述的一种荧光生物传感器的应用，其特征在于，所述AFB1浓度的检测步骤具体为：
向荧光生物传感器中加入核酸外切酶I，并与不同浓度的AFB1溶液振荡孵育1h，磁分离洗样后，记录重悬溶液在520nm的荧光强度，获得相较于空白加样的荧光强度下降值，并绘制标准曲线，利用标准曲线计算AFB1的浓度。
8.根据权利要求7所述的一种荧光生物传感器的应用，其特征在于，所述标准曲线为：
y＝45663.29lg(x)+19998.21，R2＝0.991，
其中，x为AFB1的浓度，y为荧光强度下降值(F0-F)，R2为相关系数。
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