CN111122847A - 一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素b1的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，属于分析化学及生物技术领域。该方法包括Helper修饰磁珠、AFTB1和AFTB1适配体混合物的制备、DNA的杂交、滚环扩增反应四个步骤。利用磁珠在外磁场作用下易于收集和分离的优点，以及生物素与链霉亲和素之间专一、迅速和稳定结合的特点，将生物素修饰的辅助DNA连接在链霉亲和素磁珠上，后加入到AFTB1和足量AFTB1适配体的混合物中，当AFTB1存在时，通过滚环扩增反应，反应液显蓝色，从而实现对AFTB1黄曲霉毒素B1的快速可视化检测。

Description

一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法
技术领域
本发明属于分析化学及生物技术领域，具体涉及一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法。
背景技术
黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。主要是由黄曲霉（Aspergillus flavus)和寄生曲霉 （Aspergillusparasiticus）产生的次生代谢产物。在天然条件下，它至少产生13种黄曲霉毒素，其中，黄曲霉毒素B1（AFTB1）分布最广，含量最高，毒性最强。1993年被世界卫生组织（WHO）列为I类致癌物。体内黄曲霉素含量在1 mg/kg的水平以上就可诱发癌症，其主要引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌、乳腺癌、卵巢癌等。许多国家和国际组织已对AFTB1在食品中的限量标准做出了严格的规定。目前检测黄曲霉毒素的方法主要有薄层色谱法（TLC）、超高效液相色谱法（UHPLC）、酶联免疫分析法（ELISA）、免疫亲和柱-荧光光度计联用法、免疫亲和柱-HPLC法、免疫亲和柱-HPLC-串联质谱法等。
TLC 法是早期测定AFTB1的主要方法，其优点在于所用设备简单、费用低廉，属于定性和半定量检测。但TLC法在检测AFTB1过程中需要使用有毒试剂，灵敏度较低，现已逐渐被其它方法所取代。
酶联免疫分析法（ELISA）是筛查AFTB1的重要方法，其基本原理是基于抗原抗体之间的特异性反应，先将AFTB1抗体包被到某一固相载体上，再按一定的程序加入AFTB1样品/标准品和AFTB1-HRP（AFTB1酶标记物）后，样品/标准品中的AFTB1和AFTB1-HRP竞争性结合固相载体上的AFTB1抗体，最后再加入HRP酶反应底物——TMB溶液进行显色。ELISA法虽然特异性强，灵敏度也较高，但是干扰因素多，特别容易受到温度和时间的影响，重现性不好；容易受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，容易出现结果失真、假阳性。
免疫亲和柱-HPLC分析法和免疫亲和柱-荧光光度计联用检测法同样是基于抗原抗体之间的反应来实现对AFTB1的检测方法，随着这两种方法的日渐成熟，逐渐成为了检测AFTB1的主流方法。这两种方法都是利用免疫亲和柱基于抗原抗体之间的反应对样品进行前处理后，再进行HPLC或者使用荧光分光光度计检测AFTB1的含量。虽然准确、灵敏，但却无法实现现场快速检测，都要进行比较繁杂的样品前处理，操作复杂、耗时；而且需要使用到大量的有机试剂，容易对环境造成污染；同时需要用到的试剂和材料比较多，导致成本较高。
无论是ELISA还是免疫亲和柱-荧光分光光度计联用检测法，或者是免疫亲和柱-HPLC分析法，都面临着免疫分析众所周知的缺陷：（1）抗体的制备需要免疫动物，操作复杂，过程周期较长，需要专门的技术人员，成本较高。（2）因制备过程的个性化，抗体的结合能力存在批次间差异。（3）抗体需要低温储藏、保质期较短。这些不足都在一定程度上限制了免疫分析法在现场快速检测中的应用。
核酸适配体(Aptamer)，又称核酸适体，是一类通过指数富集进化技术（SELEX）筛选得到的，能够特异性识别目标分子的一小段寡核苷酸序列，一般由十几到几十个核苷酸组成，可以是DNA也可以是RNA。滚环扩增技术（RCA）是从一条或多条DNA 引物开始，以一个环型DNA为扩增模板、在一种DNA 多聚酶（phi29聚合酶）以及dNTP的作用下，以这个环型DNA为模板, 催化dNTP 合成单链DNA 联聚分子，该分子由上千个反复衔接的环型DNA链的拷贝构成。其重复扩增是以指数级增长的，因此生物放大效果非常明显。并且，RCA 这种简单的环型扩增使得新合成的长链产物始终连接在固相支持物比如电极上，从而产生特定的信号。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法。该方法操作简便快捷，性能稳定，成本低廉，适于现场快速检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1（AFTB1）的方法，包括以下具体步骤：
（1）Helper修饰磁珠：取2 µL 10 mg/mL链霉亲和素磁珠于1.5 mL的EP管中，加50 µL1x B&W清洗液混匀，借助外加磁场的作用，将上清液吸走，重复洗3次；最后加20 µL PBS-T缓冲液重悬，制成浓度为1 mg/mL的链霉亲和素磁珠，室温放置备用；取2 µL 1 mg/mL 制备好的链霉亲和素磁珠于1.5 mL的EP管中，再加入20 µL 0.1 µM 辅助DNA Helper，25℃孵育40 min后，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，清洗去多余的未结合上的辅助DNA Helper，获得Helper修饰磁珠；
（2）AFTB1和AFTB1适配体（AFTB1-aptamer）混合物的制备：先往1.5 mL的EP管中各加入20 µL 0.1 µM AFTB1适配体，再加入5µL一定浓度的AFTB1溶液，25℃孵育1 h，得到AFTB1和AFTB1适配体混合物；
（3）DNA的杂交：将（2）中得到的AFTB1和AFTB1适配体混合物转移到（1）的Helper修饰磁珠EP管中，再加入25 µL PBS-T缓冲液，在25℃孵育1 h，用100 µL PBS-T缓冲液清清洗3次；
（4）滚环扩增反应（RCA）：往步骤（3）的EP管中加入5µL 2x Quick Ligation Buffer和4µL 1µM 环形DNA (Circular)，25℃孵育30min后，加入 1 µL 350 U/µL 的 T4 DNA连接酶，25℃孵育5 min，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次；再加入2 µL 10xPhi 29 Buffer，2 µL 10 mM 的 dNTP，14.5 µL超纯水，0.5 µL 100x BSA和1 µL 10 U/µLPhi 29 DNA聚合酶，30℃孵育3 h；借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再加入24 µL PBS-T和2.5 µL 100 µM 信号DNA，25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再加48µL PBS-T缓冲液，2µL 0.02 mg/mL辣根过氧化物酶（HRP），25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用200 µL PBS-T缓冲液清洗5次，再加入200 µL TMB/H2O2显色底液进行显色观察。
上述步骤（1）中所述Helper的核苷酸序列为：5′-ACACGTGCCCAACTTTTTT- biotin- 3′。
上述步骤（2）中所述AFTB1适配体的核苷酸序列为：5′- GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC- biotin - 3′。
上述步骤（4）中所述Circular的序列为：5'-PO4-CACGTGTTCATATAAGTTGGTACCGCAGTATGAGTATCTCCTATGAGTACTAAGTGGAAGAAATCATGG-3′；所述信号DNA的序列为：5′-AAGTGGAAGAAAT- biotin - 3′。
上述方法中，所述 B&W清洗液的组成为：5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05 % Tween-20；所述PBS-T缓冲液的组成为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.05 % Tween-20。
上述方法中，步骤（2）中AFTB1溶液的浓度为：0~100µM。
本发明的技术原理为：
本发明利用纳米磁珠在外磁场作用下易于收集和分离的优点，以及生物素与链霉亲和素之间专一、迅速和稳定结合的特点，将生物素修饰的辅助DNA（DNA Helper）连接在链霉亲和素修饰的纳米磁珠上，获得辅助DNA修饰的功能化磁珠（MB-Helper），再将其加入到AFTB1和足量AFTB1适配体（Biotin-aptamer）的混合物中。在这个体系里，当AFTB1存在时，AFTB1适配体首先与AFTB1结合，磁珠上的辅助DNA获得较少与适配体杂交的机会，因此，大多数辅助DNA保持单链的状态。这样，如果AFTB1的量越多，与AFTB1结合的AFTB1适配体越多，余下的能与辅助DNA结合的AFTB1适配体越少，最终磁珠表面的单链辅助DNA就越多。接下来，向上面的磁珠分散液中加入经过特殊设计的能够与单链辅助DNA杂交的环形DNA（DNACircular），再加入T4连接酶及一系列进行恒温滚环扩增的试剂，扩增后包含了多个重复单元的DNA长链再与已经连接了辣根过氧化物酶HRP（Avidin-HRP）的信号DNA （DNA Biotin-Sig）杂交，之后经过外磁场的分离收集后，连接在纳米磁珠上的HRP高效催化H2O2氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB) 使溶液由无色变为蓝色。相反地，如果AFTB1不存在，AFTB1适配体未与AFTB1结合，磁珠上的辅助DNA就会与适配体杂交，最终在磁珠表面形成双链DNA。这样，将无法进行滚环扩增，从而最终无法使TMB溶液显示蓝色。据此，能够实现对AFTB1的灵敏、特异、可视化快速检测。该方法中，滚环扩增放大提高了方法的灵敏度，适配体的使用提高了方法特异性，可视化检测简便、直观。同时，该方法具有操作简单和成本低廉等特点，可用于黄曲霉素B1的现场快速检测。滚环扩增放大可视化检测AFTB1的示意图见图1。
使用适配体(Aptamer)替代抗体，提高检测方法的特异性和稳定性。核酸适配体常被人们比喻为“化学抗体”。但实际上核酸适配体在以下性能方面都超过了抗体。（1）用于筛选适配体的随机寡核苷酸序列库是通过化学合成的方法得到的，不依赖于生物体，并且适配体的筛选过程无须在生理条件下进行，因此筛选出没有免疫原性或低免疫原性甚至具有毒性的靶分子的核酸适配体都是有可能的。（2）化学合成的适配体序列商业化程度极高，技术成熟，产物纯度高，几乎无批间差异，成本低廉，而抗体的合成是在细胞株或生物体内完成的，批间差异大，并且成本较高。（3）核酸适配体具有较高的热稳定性和化学稳定性，在pH2~12的宽范围内保持稳定，变性的适配体也很容易再生，利于长期存储。而抗体的蛋白本质决定了它的热稳定性较差，对温度等环境变化非常敏感，在脱离生理环境下很容易发生变性。（4）在不丧失与目标物亲和力的前提下，核酸适配体的末端易于连接一些活性基团，容易被固定在基质上，或可以通过检测方法的需要，在适配体末端修饰一些信号指示基团，便于进行检测，而抗体的修饰比适配体要困难得多。（5）适配体作为一种核酸，可以通过一定的设计，根据已经筛选出来的碱基序列，直接向生物工程公司订购，周期大概三天。（6）核酸适配体与靶分子之间的相互作用包括氢键作用、静电作用和范德华力等，目标范围广，靶目标可以是细胞、蛋白质、氨基酸、糖类等小分子，也可以是金属离子。因此，基于寡核苷酸适配体的识别与检测方法，正逐渐成为一种新的普遍适用的技术，为化学、生物化学与分子生物学以及医药学等领域提供了一种高效、快速的分析检测研究平台。
利用链霉亲和素修饰的纳米磁珠在外磁场作用下能快速进行分离富集的功能，使各种复杂的反应与最终测试场所分开，不仅可以降低基质效应，而且还能有效避免操作过程中其他物质的干扰。同时，因为纳米磁珠上修饰了链霉亲和素，可以通过链霉亲和素-生物素之间高度亲和力将修饰了亲和素的DNA稳定地连接在纳米磁珠上。
利用核酸放大技术提高检测的灵敏度；滚环扩增技术RCA虽然比PCR技术发展稍晚，但其因恒温操作、无需反复加热的仪器、扩增效果较PCR突出等优势越来越受到关注。与传统PCR技术相比，RCA循环放大技术存在如下优势：（1）PCR需要费用高且笨重的热循环仪，而RCA只需要非常廉价和小型的恒温设备即可。（2）PCR的热循环过程中可能产生有害物质对反应组分有影响，而RCA在常温下即可进行；（3）PCR中反应物和扩增产物会相互反应和干扰，会导致扩增效率和特异性的下降。而RCA是从一条引物开始，引物与模板杂交后，不断向后滚动复制成一条很长的单链，不存在反复解链杂交过程。
本发明的优点在于：
1. 利用纳米磁珠在外磁场作用下能快速进行分离富集的功能，使各种复杂的反应与最终测试场所分开，能够降低基质效应。
2.本发明通过使用滚环扩增技术（RCA）进行信号放大，提高检测的灵敏度。适配体作为一种核酸，能够通过一定的设计，利用核酸扩增方式进行信号放大，提高检测灵敏度。
3.本发明是通过相应的设计，实现对黄曲霉毒素B1的高灵敏度、高特异性可视化检测。
附图说明
图1滚环扩增放大可视化检测AFTB1的示意图。
图2本发明方法对不同浓度黄曲霉毒素B1的可视化检测。
图3本发明方法对不同浓度黄曲霉毒素B1检测吸光值图和建立的标准工作曲线。
图4本发明方法检测黄曲霉毒素B1的特异性验证。相对于3种浓度高于黄曲霉毒素B1（AFTB1）十倍的其他毒素（黄曲霉毒素B2即AFTB2、黄曲霉毒素G2即AFG2、赭曲霉毒素A即OTA），只有AFTB1存在时体系的颜色才发生明显变化。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
实施例1
一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，包括以下具体步骤：
（1）Helper修饰磁珠：取2 µL 10 mg/mL链霉亲和素磁珠（MB，购自于挪威奥斯陆Invitrogen科技有限公司）于1.5 mL的EP管中，加50 µL 1x B&W清洗液（5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05 % Tween-20），借助外加磁场的作用，将上清液吸走，重复清洗3次；最后加20 µL PBS-T（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，0.05% Tween-20）重悬，使其浓度为1 mg/mL，室温放置备用。取2 µL 1 mg/mL MB于1.5 mL的EP管中，再加入20 µL 0.1 µM Helper（序列为：5′-ACACGTGCCCAACTTTTTT- biotin - 3′，由上海生工生物工程有限公司合成），25℃孵育40 min后，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，清洗去多余的未结合上的Helper，获得Helper修饰磁珠。
（2）AFTB1和AFTB1适配体（AFTB1-aptamer）混合物的制备：先往1.5 mL的EP管中各加入20 µL 0.1 µM AFTB1-aptamer（序列为：5′- GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC- biotin - 3′，由上海生工生物工程有限公司合成），再加入5µL 一定浓度的AFTB1溶液，25℃孵育1 h，得到AFTB1和AFTB1-aptamer混合物。
（3）DNA的杂交：将（2）中得到的AFTB1和AFTB1-aptamer混合物转移到（1）中对应的EP管中，再加入25 µL PBS-T缓冲液，在25℃孵育1 h，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次。
（4）RCA：往EP管中加入5µL 2x Quick Ligation Buffer和4 µL 1 µM Circular（序列为：5'-PO4 CACGTGTTCATATAAGTTGGTACCGCAGTATGAGTATCTCCTATGAGTACTAAGTGGAAGAAATCATGG- 3′，由上海生工生物工程有限公司合成），25℃孵育30min后，再加1 µL 350 U/µL T4 DNA连接酶，25℃孵育5 min，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次；再加入2 µL10x Phi 29 Buffer，2 µL 10 mM dNTP，14.5 µL超纯水，0.5 µL 100x BSA和1µL 10 U/µL Phi 29 DNA聚合酶，30℃孵育3 h；借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再分别加入24 µL PBS-T缓冲液和2.5 µL 100 µM 信号DNA（序列为：5′-AAGTGGAAGAAAT- biotin - 3′，由上海生工生物工程有限公司合成），25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，各加48µL PBS-T缓冲液，2µL 0.02mg/mL 辣根过氧化物酶（HRP），25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用200 µL PBS-T缓冲液各清洗5次，再分别加入200 µL TMB/H2O2显色底液进行显色观察。
实施例2
实施例1步骤（2）中再加入AFTB1溶液的浓度分别设置为：0µM、1.0µM、5.0µM、20µM、50µM、100µM，其余步骤同实施例1。实现对不同浓度黄曲霉毒素B1的可视化检测。检测结果见图2。从图2结果看出，随黄曲霉毒素B1的浓度增大，反应液的颜色逐渐变深，从浅蓝变为深蓝色，目视检测限为1.0 µM。
检测显色15 min时溶液检测吸光值建立标准曲线（图3），实现对黄曲霉毒素B1的定量检测。
实施例3 特异性验证
实施例1步骤（2）中的AFTB1溶液替换为浓度皆为 1.0 mM 的黄曲霉毒素B2即AFTB2、黄曲霉毒素G2即AFG2、赭曲霉毒素A即OTA，其余步骤同实施例1，验证本发明方法的特异性。结果见图3。图3结果表明，黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2、赭曲霉毒素A的反应液皆为无色，只有AFTB1的反应液为蓝色，说明本发明的方法特异性强，能够特异性检测AFTB1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建中医药大学
<120> 一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
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<400> 1
acacgtgccc aactttttt 19
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gttgggcacg tgttgtctct ctgtgtctcg tgcccttcgc taggccc 47
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<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
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cacgtgttca tataagttgg taccgcagta tgagtatctc ctatgagtac taagtggaag 60
aaatcatgg 69
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagtggaaga aat 13

Claims (6)

1.一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
（1）Helper修饰磁珠：取2 µL 10 mg/mL链霉亲和素磁珠于1.5 mL的EP管中，加50µL 1xB&W清洗液混匀，借助外加磁场的作用，将上清液吸走，重复洗3次；最后加20 µL PBS-T缓冲液重悬，制成浓度为1 mg/mL的链霉亲和素磁珠，室温放置备用；取2 µL 1 mg/mL 制备好的链霉亲和素磁珠于1.5 mL的EP管中，再加入20 µL 0.1 µM 辅助DNA Helper，25℃孵育40min后，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，清洗去多余的未结合上的Helper，获得Helper修饰磁珠；
（2）AFTB1和AFTB1适配体混合物的制备：先往1.5 mL的EP管中各加入20 µL 0.1 µMAFTB1适配体，再加入5µL一定浓度的AFTB1溶液，25℃孵育1 h，得到AFTB1和AFTB1适配体混合物；
（3）DNA的杂交：将（2）中得到的AFTB1和AFTB1适配体混合物转移到（1）的Helper修饰磁珠EP管中，再加入25 µL PBS-T缓冲液，在25℃孵育1 h，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次；
（4）滚环扩增反应：往步骤（3）的EP管中加入5µL 2x Quick Ligation Buffer和4 µL 1µM 环形DNA，25℃孵育30min后，加入 1 µL 350 U/µL 的T4 DNA连接酶，25℃孵育5 min，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次；再加入2 µL10x Phi 29 Buffer，2 µL10 mM 的 dNTP，14.5 µL超纯水，0.5 µL 100x BSA和1 µL 10 U/µL Phi 29 DNA聚合酶，30℃孵育3 h；借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再加入24 µL PBS-T和2.5 µL 100 µM 信号DNA，25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用100 µL PBS-T缓冲液清洗3次，再加48µL PBS-T缓冲液，2µL 0.02 mg/mL辣根过氧化物酶，25℃孵育30 min后，借助外磁场的作用力，用200 µL PBS-T缓冲液清洗5次，再加入200 µL TMB/H2O2显色底液进行显色观察。
2.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（1）中所述Helper的核苷酸序列为：5′-ACACGTGCCCAACTTTTTT- biotin - 3′。
3.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（2）中所述AFTB1适配体的核苷酸序列为：5′- GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCC- biotin - 3′。
4.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（2）中所述AFTB1溶液的浓度为：0~100µM。
5.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：步骤（4）中所述环形DNA 的序列为：5'-PO4-CACGTGTTCATATAAGTTGGTACCGCAGTATGAGTATCTCCTATGAGTACTAAGTGGAAGAAATCATGG-3′；所述信号DNA的序列为：5′-AAGTGGAAGAAAT- biotin - 3′。
6.根据权利要求1所述的一种基于适配体的现场快速检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于：所述方法中所述 B&W清洗液的组成为：5 mM Tris-HCl，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05 % Tween-20；所述PBS-T缓冲液的组成为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，0.05 % Tween-20。
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