CN109517722A - 一种捕获特定微量细胞的装置及其制作和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种捕获特定微量细胞的装置和该装置的制作及使用方法，该装置包括磁珠，连接核酸，含多拷贝适配体的长链核酸；磁珠通过亲和素‑生物素的结合方式或生物素‑链霉亲和素将连接核酸固定在磁珠上，连接核酸由重复序列的天然或化学修饰的核苷酸组成，其作用为连接磁珠和含多拷贝适配体的长链核酸，所述含多拷贝适配体的长链核酸是由多个单价核酸适配体和与连接核酸互补的间隔序列组成，具有捕获特定细胞的作用。相较于现用的微量细胞捕获方法，本发明装置操作简单，成本低，可重复利用；捕获细胞能力强，灵敏度，效率和纯度方面明显提高；灵活性强，所捕获的细胞能从磁珠上释放，且对细胞无损伤，可进行再培养和后续的细胞生物学实验。
Description
技术领域
本发明涉及细胞捕获技术领域，具体来说，涉及一种捕获特定微量细胞的装置和该装置的制作和使用方法。
背景技术
微量细胞的传统分离方法是流式细胞术和荧光激活细胞分离术(Fluorescenceactivated cell sorting,FACS)，这种基于荧光探针标记抗体来捕获CTCs的方法具有成本高，操作复杂，耗费时间长等缺点，在临床应用上受到了较大的限制。强生公司的Cell-Search系统是最早应用于循环肿瘤细胞分离的设备，也是目前唯一获FDA批准应用于临床的循环肿瘤细胞检测设备。但是，这种基于免疫磁珠捕获的方法具有成本高、准确性差，灵敏度较低的缺点，在临床上的推广和应用受到了较大的争议。因此，如何提高极微量的特异细胞的捕获和富集的纯度和灵敏度是如今面临的最大挑战之一。与抗体相比，核酸适配体与靶标结合具有很高的亲和力，可以提高检测的灵敏度，并具有热稳定性好，无免疫原性，容易进行化学修饰，成本低，灵活性强的优势，因此近年来大量应用于肿瘤诊断的设计和细胞捕获的应用中。但基于核酸适配体的捕获效率，以及核酸适配体与磁珠(或其它基质)结合后的空间位阻问题仍然是现今阶段中迫切需要解决的问题之一。专利CN102719353 B公开了一种用于外周血中循环癌细胞的特异性捕获的装置及方法，该专利的核酸适配体固定可一次性完成，可以实现对目标癌细胞高选择性和高特异性的捕获；但该专利捕获方法需要额外的仪器设备，在操作中可能对细胞有一定损伤；专利201611122625.0公开了一种高效捕获细胞的方法，其包括磁珠的活化、磁珠的修饰、免疫磁珠的制备以及特定细胞的捕获与分离富集，其通过使用特定的长链化合物进行修饰，形成的长链复合物具有立体网状结构，增加了抗体和细胞结合的效率，该专利通过增加链长，从而减少空间位阻，来增加细胞捕获的效率，但其需要在磁珠-长链化合物偶联抗体，通过抗体与特定细胞表面的抗原发生反应，从而实现对特定细胞的捕获，但该种方法成本高、准确性差，灵敏度较低、灵活性不够强；专利201710739689.3公开了一种肺癌肿瘤细胞捕获与活性检测、分析方法及其应用，其采用负向富集肺癌CTCs的基础上，通过对肺癌CTCs的捕获，捕获在滤膜上，通过联合检测细胞核形态与三种特定的mRNAs的表达量来识别肺癌CTCs，并对每例血液样本中捕获的疑似CTCs进行细胞核大小和形态学特征分析，结合TTF1 mRNA和pan-CK mRNA鉴别是否为TTF1阳性肺癌CTCs，进而依据MKI67 mRNA表达是否阳性将其归类为有增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs或无增殖活性的TTF1阳性肺癌CTCs。该方法操作复杂，耗费时间长，且捕获的纯度没法保证。
因此，急需研究出一种操作简单、灵活性和效率高的特定细胞捕获装置。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处，本发明提供一种捕获特定微量细胞的装置和该装置的制作方法，该装置制作方法简单，成本低，可重复多次使用；该装置提高细胞捕获的灵敏度和效率，提高灵活性，使捕获后的细胞能够重新释放出来进行后续应用。
为实现上述目的，所采取的技术方案：
一种捕获特定微量细胞的装置，包括磁珠、连接核酸、含多拷贝适配体的长链核酸；所述连接核酸一端固定在磁珠表面，另一端以碱基互补的形式连接含多拷贝适配体的长链核酸，所述连接核酸由天然或化学修饰的核苷酸组成，所述含多拷贝适配体的长链核酸是由多个单价核酸适配体和与连接核酸互补的间隔序列组成的单链核酸。
本发明主要针对样品复杂，所需的特异细胞量很少，样品珍贵的情况下，能够快速、高灵敏、准确地捕获所需细胞的装置。其主要包括有分离功能的磁珠和捕获细胞功能的多价核酸构成，并利用短链锁核酸将它们连接起来。本发明的制作方法简单、成本很低；灵敏度，捕获效率，和捕获细胞的纯度较高，直接适用于复杂样本；操作简单，通用性强，不需要额外的仪器设备，仅利用磁铁便能分离，适合于现场的快速即时细胞分离和检测；所捕获的细胞容易从磁珠上释放下来，进行后续的应用，具有较高的灵活性；所述装置和所有操作均对细胞的损伤很小，生物相容性强。经过细胞分离后的磁珠加热后可重新获得磁珠-连接核酸复合物，进而重复利用，真正实现绿色可再生循环的意义。
优选地，所述磁珠通过生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素结合方式将连接核酸固定在磁珠表面。
优选地，所述磁珠的粒径为0.1～25μm，更优选地，磁珠的粒径为0.1～15μm所述磁珠的表面包被生物素或亲和素或链霉亲和素。
优选地，所述连接核酸的长度为10～200核苷酸单元，更优选地，连接核酸的长度为10～40核苷酸单元，连接核酸必须与多拷贝适配体的长链核酸序列中的部分序列互补配对。所述连接核酸是10～200个重复的A或者T序列，或者即使不是重复A或者T序列，但同样是与含多拷贝适配体的长链核酸序列中的部分序列互补配对的核酸序列。更优选地，连接核酸的配对序列是含多拷贝适配体的长链核酸序列中的间隔序列。更优选地，所述连接核酸是锁核酸或其他化学修饰的核酸，具有比天然核酸更高的酶学稳定性和热稳定性，因此，能抵抗生物组织样品或细胞培养液中的核酸酶的降解，并且具有与含多拷贝适配体的长链核酸的间隔片段有更好的结合能力。
优选地，所述连接核酸的3’或者5’端修饰生物素或亲和素或链霉亲和素。
优选地，所述含多拷贝适配体的长链核酸是长度为200～300000核苷酸单元的单链核酸，所述单价核酸适配体数量大于2，所述所述含多拷贝适配体的长链核酸中的间隔序列为3～40个核苷酸单元的重复T或者A序列，且与连接核酸互补。所述装置为先将磁珠与连接核酸结合，再与含多拷贝适配体的长链核酸连接。
优选地，所述含多拷贝适配体的长链核酸的合成方法采用聚合酶链式反应或核酸等温扩增技术。
本发明还提供了一种所简易微量细胞培养和计数的装置的制作方法，包括以下步骤：
1)将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；
2)与1)相对应结合的生物素或链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1～3h；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温下，磁性分离处理5～15min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与上述步骤4)中的复合物混合于PBS中，4～25℃下在摇床上反应1～3h；
6)将5)中的反应产物置于磁力架上，室温处理5～15min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为所述的捕获特定微量细胞的装置。
优选地，所述步骤3)中磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20～1010；连接核酸浓度越高，步骤3)所需的反应时间越短；优选地，所述步骤3)中磁珠和连接核酸的物质的量比为1:107；所述步骤5)中磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:2～106。长链核酸浓度越高，步骤5)所需的反应时间越短。
本发明还提供了一种使用捕获特定微量细胞的装置进行捕获细胞的方法，采用直接捕获法或间接捕获法，所述直接捕获法包括以下步骤：
1)将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的1～25μm磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；
2)与上述1)相应的生物素或链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1～3h；所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20～1010；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与上述步骤4)中的磁珠-连接核酸复合物混合于PBS中，室温在摇床上反应1～3h；所述磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:2～106。
6)将细胞混匀PBS中，加入步骤5)的混合后的复合物(即上述制作方法所制作得到的捕获特定微量细胞的装置)重悬于1×PBS中形成溶液，4～25℃下在摇床上反应10～60min；
7)将上述6)得到反应物在磁力架上放置5～30min，缓慢去除其中的液体，并用PBS清洗2次，此时获得捕获的细胞；
所述间接法包含以下步骤：
1)将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的0.1～1μm磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；
2)与1)相应的生物素或者链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1～3h；所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20～1010；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；该复合物并重新悬浮于PBS缓冲液中；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与细胞混悬液混合，4～25℃下在摇床上反应10～30min；离心，去除上清液，并重新悬浮于适量PBS缓冲液中，形成待分离靶细胞-长链核酸复合物；所述待分离靶细胞和含多拷贝适配体的长链核酸的个数比为1：103～1020；
6)将步骤5)中的混合液与上述步骤4)中的复合物混合，4～25℃下在摇床上反应1～3h；所述磁珠-连接核酸复合物和细胞-含多拷贝适配体的长链核酸复合物的个数比为2～105：1。得到反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-细胞复合物。
有益效果：
1、本发明所述的捕获细胞的装置制作方法简单，磁珠可重复利用，成本较低；
2、本发明的装置有较高的灵敏度，捕获效率和纯度，直接适用于复杂样本，甚至是1mL溶液中仅有少于10个靶细胞的复杂样本；
3、本发明的装置操作简单，通用性强，不需要额外的仪器设备，仅利用磁铁便能分离，适合于现场的快速即时细胞分离和检测；
4、本发明的装置所捕获的细胞容易从磁珠上释放下来，进行后续的应用，具有较高的灵活性；
5、本发明的装置和所有操作均对细胞的损伤很小，生物相容性强。
附图说明
图1为本发明装置的结构图；
图2为核酸滚环扩增反应原理图；
图3为本发明装置捕获CCRF-CEM细胞的效率和纯度；
图4为本发明装置和传统磁珠-单价适配体捕获CCRF-CEM细胞的对比；
图5为利用本发明装置捕获全血中极微量CCRF-CEM细胞；
图6为释放后CCRF-CEM细胞的增殖和存活率；
图7为本发明装置循环利用后对捕获CCRF-CEM细胞效率的影响；
图8为利用本发明装置捕获全复杂样品中极微量的T47D细胞；
图9为利用本发明装置对白血病患者中PTK7高表达细胞的捕获和鉴定。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。故凡依本发明专利申请范围所述的方法具体如下：以下实施例所涉及各原料如无特别说明，均为市售通用产品。
实施例1
一种捕获特定微量细胞的装置，包括磁珠1、连接核酸2、含多拷贝适配体的长链核酸3；所述连接核酸2一端固定在磁珠1表面，另一端以碱基互补的形式连接含多拷贝适配体的长链核酸3；
所述磁珠1通过生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素结合方式将连接核酸2固定在磁珠1表面；所述磁珠的粒径为0.1～25μm，优选地，磁珠的粒径为0.1～15μm，所述磁珠的表面包被生物素或亲和素或链霉亲和素。所述连接核酸2由重复序列天然或化学修饰的核苷酸组成，所述连接核酸的长度为10～200核苷酸单元，所述连接核酸是多个重复的A或者T序列，或是与含多拷贝适配体3的长链核酸序列中的间隔序列互补配对的核酸序列。所述连接核酸的3’或者5’端修饰生物素或亲和素或链霉亲和素。所述含多拷贝适配体3的长链核酸是由多个单价核酸适配体4和与连接核酸互补的间隔序列组成的单链核酸；所述含多拷贝适配体3的长链核酸是长度为200～300000核苷酸单元的单链核酸，所述单价核酸适配体数量大于2，所述含多拷贝适配体的长链核酸中的间隔序列为3～40个核苷酸单元的重复T或者A序列，且与连接核酸互补。所述装置为先将磁珠1与连接核酸2通过碱基互补形成复合物，再与含多拷贝适配体的长链核酸连接，得到的反应产物通过磁力架或强磁铁实现分离。
优选地，所述含多拷贝适配体的长链核酸的合成方法采用聚合酶链式反应或核酸滚环扩增或其他核酸等温扩增技术。
实施例2
作为本发明一种捕获特定微量细胞的装置的制作方法的一种实施例，所述的实施例1的装置的制作方法，包括以下步骤：
1)将链霉亲和素标记的4μm磁珠洗涤、离心，重悬于1×PBS中；
2)生物素标记的连接核酸(序列为5’-TAG ATA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A/36-Bio/-3’)用1×PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，所述的磁珠和连接核酸物质的量比为1:20，混匀，室温在摇床上反应3h；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温下，磁性分离处理5min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与上述磁珠-连接核酸复合物混合于1×PBS中(含多拷贝适配体的长链核酸与磁珠-连接核酸复合物物质的量比为2：1)，室温在摇床上反应3h；
6)将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5min，缓慢吸取液体，剩余的即为本发明述的捕获特定微量细胞的装置。
实施例3
作为本发明一种捕获特定微量细胞的装置的制作方法的一种实施例，所述的实施例1的装置的制作方法，包括以下步骤：
1)将生物素标记的25μm磁珠洗涤、离心，重悬于1×PBS中；
2)与1)相对应结合的亲和素标记的连接核酸(序列为5’-TAG ATA AAA AAA AAAAAA AAA AAA A/36-Bio/-3’)用1×PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1h；所述的磁珠和连接核酸物质的量比为1:1000；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温下，磁性分离处理15min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与上述步骤4)中的磁珠-连接核酸复合物混合于1×PBS中(含多拷贝适配体的长链核酸与磁珠-连接核酸复合物物质的量比为200:1)，25℃下在摇床上反应3h；
6)将5)中的反应产物置于磁力架上，室温处理15min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为所述的捕获特定微量细胞的装置。
实施例4直接捕获法
作为本发明捕获特定微量细胞的装置进行细胞捕获的方法的一种实施例，包括以下步骤：1)将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的1μm/4μm/25μm磁珠洗涤、离心，重悬于1×PBS中；
2)与上述1)相应的生物素或链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用1×PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1h/1.5h/3h；所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20/1:107/1:1010；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与上述步骤4)中的磁珠-连接核酸复合物混合于PBS中，室温在摇床上反应1h/1.5h/3h；所述磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:2/1:103/1:106。
6)将细胞混匀PBS中，加入步骤5)中混合后的复合物重悬于1×PBS中形成的溶液，4～25℃下在摇床上反应10～60min；
7)将上述6)得到反应物在磁力架上放置5～30min，缓慢吸取液体，并用PBS清洗2次，此时获得捕获的细胞。
本实施例的所述磁珠的直径为1μm时，其所述的磁珠和连接核酸的物质的量比分别为1:20；步骤3)室温摇床反应时间为1h；所述磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:2；步骤5)室温摇床反应时间为1h。
当选用磁珠的直径为4μm时，其所述的磁珠和连接核酸的物质的量比分别为1:107；步骤3)室温摇床反应时间为1.5h；所述磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:103；步骤5)室温摇床反应时间为1.5h。
当选用磁珠的直径为25μm时，其所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:1010；步骤3)室温摇床反应时间为3h；所述磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:106；步骤5)室温摇床反应时间为3h。
本发明的捕获特定微量细胞的装置的制作方法与除去步骤6)后的直接捕获法相同。
实施例5间接捕获法
作为本发明捕获特定微量细胞的装置进行细胞捕获的方法的一种实施例，包括以下步骤：1)将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的0.1μm/0.25μm/1μm磁珠洗涤、离心，重悬于1×PBS中；
2)与1)相应的生物素或者链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用1×PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1h/1.5h/3h；所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20/1:107/1:1010；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；该复合物并重新悬浮于PBS缓冲液中；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与细胞混悬液混合，在4～25℃下摇床反应10～30min，离心，去除上清，并重新悬浮于适量PBS缓冲液中，形成待分离靶细胞-长链核酸复合物；所述待分离靶细胞和含多拷贝适配体的长链核酸分子的个数比为1:1010；
6)将步骤5)中的混合液与上述步骤4)中的复合物混合，4～25℃下在摇床上反应1h/1.5h/3h；所述磁珠-连接核酸复合物和细胞-含多拷贝适配体的长链核酸复合物的个数比为105:1/103:1/2:1混合。得到反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-细胞复合物。
本实施例的所述磁珠的直径为0.1μm时，其所述的磁珠和连接核酸的物质的量比分别为1:20；步骤3)室温摇床反应时间为3h；所述分离靶细胞和含多拷贝适配体的长链核酸的个数比为1:1010；所述磁珠-连接核酸复合物和细胞-含多拷贝适配体的长链核酸复合物的个数比为105:1混合；步骤6)摇床反应时间为1h。
当采用所述磁珠的直径为0.25μm时，其所述的磁珠和连接核酸的物质的量比分别为1:107；步骤3)室温摇床反应时间为1.5h；所述分离靶细胞和含多拷贝适配体的长链核酸的个数比为1:1010；所述磁珠-连接核酸复合物和细胞-含多拷贝适配体的长链核酸复合物的个数比为103:1混合；步骤6)摇床反应时间为1.5h。
当采用所述磁珠的直径为1μm时，其所述的磁珠和连接核酸的物质的量比分别为1:1010；步骤3)室温摇床反应时间为1h；所述分离靶细胞和含多拷贝适配体的长链核酸的个数为1:1010；所述磁珠-连接核酸复合物和细胞-含多拷贝适配体的长链核酸复合物的按个数比为2:1混合；步骤6)摇床反应时间为3h。
实施例6复杂样品中CCRF-CEM细胞的捕获(直接法)
在液体活检中，肿瘤细胞的检测对于肿瘤的诊断、治疗和预后有重要的作用。然而，在患者的血液中有大量的红细胞和白细胞，肿瘤细胞的含量十分少，如何获得高纯度，高效的肿瘤细胞是液体活检中亟待解决的问题之一。在本实施例中，所捕获的白血病细胞CCRF-CEM是PTK7蛋白高表达的细胞系，因此本发明以PTK7的核酸适配体为例。
PTK7含多拷贝适配体的长链核酸的合成参照核酸滚环扩增法，它是一个恒温的核酸扩增技术。当然不限于该种合成方法，如也可采用聚合酶链式反应等。如图2所示，在核酸滚环扩增反应中，将一段与环状模板互补的核酸链在特定的核酸酶或是RNA酶的作用下，以核苷酸作为构建原件，不断重复地对环状模板链进行复制，最后产生一条含有串联的重复序列的较长的核酸或者是核酸单链。具体步骤如下：
1)在本实施例中，含多拷贝适配体的长链核酸中的间隔核酸为T20的核酸序列，PTK7单价适配体序列为5’-ATC TAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTAGA-3’，因此所设计的引物序列为：PTK7连接模板:5’-CTG CGC CGC CG G GAA AAT ACT G-3’；PTK7环状模板:5’-CGG CGG CGC AGC AGT TAG ATA AAA AAA AAA AAA AAA AAA ATCTAA CCG TAC AGT ATT TTC C-3’；PTK7滚环扩增法的引物:5’-CTG CGC CGC CG G GAA AATACT G-3’。
2)将16.3μL环状模板(500pmol)、10×磷酸酶缓冲液、1μL 100mM ATP、1μL多核苷酸激酶(PTK)、26.7μL超纯水混匀，37℃水浴反应30min，95℃处理5min，室温放置10min，此时完成环状模板的磷酸化；
3)7.6μL连接模板(600pmol)加入209.4μL超纯水中，90℃加热30s,室温放置10min；
4)将上述2)和3)溶液混合，加入30μL T4连接缓冲液、3μL T4连接酶，室温处理30min，此时完成环状核酸引物的合成；
5)将上述溶液用2％的琼脂糖凝胶纯化，得到的核酸引物经过乙醇沉淀后，-20℃保存备用；
6)4μL 29μM环状核酸，1μL 100μM滚环扩增法的引物，2μL反应缓冲液，13μL超纯水混匀，95℃加热5min，室温冷却放置30min；
7)将1μL 10mM dNTP混合液，2μL Phi29核酸聚合酶加入到上述6)溶液中，4℃反应6h，此时得到PTK7含多拷贝适配体的长链核酸，它的序列由100-1000个单价适配体(5’-ATCTAA CTG CTG CGC CGC CGG GAA AAT ACT GTA CGG TTA GA-3’)和间隔核酸序列(TTT TTTTTT TTT TTT TTT TT)组成；
8)将7)反应产物用1％琼脂糖凝胶纯化，切胶，乙醇沉淀，溶解于无菌超纯水中，-20℃保存备用。
本实施例的一种捕获特定微量细胞的装置的制作方法包括以下步骤：
1)将上述所得的PTK7含多拷贝适配体的长链核酸95℃加热5min，立即放放置于冰上10min；
2)取1×10-8nmol直径为4μm链霉亲和素标记的磁珠，洗涤，离心，重新分散于1×PBS中；
3)取1μL 100μM连接核酸(5’-TAG ATA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A/36-Bio/-3’)用1×PBS配成母液；再加入到上述2)溶液中，在摇床上室温反应2h；该磁珠与连接核酸的物质的量比为1:107。
4)将3)放置于磁力架上，室温下，磁性分离处理10min，缓慢去除其中的液体，得到的磁珠-连接核酸复合物；经过2次清洗后，重新分散在990μL1×PBS中；
5)将10μL 7.4nmol/L(即7.4×10-5nmol)PTK7含多拷贝适配体的长链核酸加入4)中并混合于1×PBS中，在摇床上室温反应3h；该磁珠-连接核酸复合物与含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1.35×103。
6)将5)放置于磁力架上处理10min后，缓慢去除其中的液体，得到的磁珠-含多拷贝适配体的长链核酸经过2次清洗后，重新分散在1mL 1×PBS中，得到磁珠-含多拷贝适配体的长链核酸复合物即为本发明用于捕获微量特定细胞的装置。
本实施例捕获细胞的方法采用直接捕获法，其步骤如下：
1)细胞先进行染色，如CCRF-CEM细胞用DIO染色，Ramos细胞和WBCs细胞用DII染色；
2)将细胞以一定浓度混匀在900μL PBS中，加入100μL的上述制备的磁珠-含多拷贝适配体的长链核酸溶液，在摇床上4℃反应30min；
3)将上述2)得到反应物在磁力架上放置10min，缓慢吸取液体，并用PBS清洗2次，此时获得捕获的细胞；
4)将得到的细胞进行流式细胞或精密细胞计数器进行计数，并计算其捕获效率和捕获纯度。
本发明将高表达PTK7的白血病细胞系CCRF-CEM作为捕获对象，低表达PTK7的白血病细胞系Ramos和普通白细胞(WBCs)作为阴性对照。CCRF-CEM细胞利用DIO染色使带绿色荧光，Ramos和WBCs利用DII染色使带红色荧光，CCRF-CEM和Ramos细胞以1:1，1:2的浓度比例溶于900μL PBS中(CCRF-CEM细胞终浓度为2000个/mL)，另将CCRF-CEM和WBCs混合于900μLPBS中，使CCRF-CEM细胞终浓度为2000个/mL，WBCs终浓度为1×107个/mL。在上述细胞混悬液中分别加入100μL的磁珠-含多拷贝适配体的长链核酸溶液，在摇床上室温反应30min，得到反应物在磁力架上放置10min，缓慢吸取液体，并用PBS清洗2次，最后所捕获得到的细胞进行计数，并计算其捕获效率和捕获纯度。如图3中的(a)和(b)所示，其对CCRF-CEM细胞(图(a)中的a1)的捕获效率达到95％，而对Ramos细胞(图(a)中的a2)的捕获效率均在10％以下；而对于混入大量的白细胞后，其捕获效率达到87％，捕获纯度达到96.7％，表明了该发明装置展现出对目的细胞较高的捕获效率和纯度。
液体活检的样本一般为复杂样本，将本发明应用于全血中CCRF-CEM细胞的捕获，并与传统的磁珠-单价适配体比较，如图4中的(a)和(b)所示，图4的(b)中的b1为本发明NanoOctopus，图4(b)中的b2为传统磁珠-单价适配体(MPs-Unit aptamer)，本发明(NanoOctopus)与传统的磁珠-单价适配体(MPs-Unit aptamer)相比，本发明从捕获效率和纯度方面上均有较大的优势，并在血液样本中能达到80％左右的捕获效率(CCRF-CEM细胞浓度为2500个/mL)，在微量细胞的复杂样品中，如10个/mL，25个/mL时，传统的磁珠-单价适配体的灵敏度较低，不能捕获目的细胞，而本发明装置的捕获效率依然能达到一定的捕获效率，表明本发明装置灵敏度高，适合微量细胞和复杂样本中的检测。
本发明将染色后的CCRF-CEM细胞混于10mL全血中，使目标细胞浓度约为1个/mL，再利用本发明的方法进行细胞捕获和检测。结果如图5所示，在平行的8个样本当中，每个样本均能检测到细胞，表明它的灵敏度极高，可以用于复杂样本中极微量细胞的检测。
将捕获后的细胞利用核酸酶剪切含多拷贝适配体的长链核酸，释放出来的细胞可进行后续再培养和分子生物实验。具体操作步骤如下：
1)在上述捕获的细胞和磁珠的复合物中加入核酸酶，使其终浓度为100U/mL，在37℃培养箱中放置20min，使核酸尽量被剪切完全；
2)将上述1)得到反应物在磁力架上放置10min，吸取液体置于离心管中，1000rpm，离心15min，得到的底部沉淀经过PBS洗涤后，得到的细胞即为所捕获得到的细胞。
本发明将所捕获的CCRF-CEM细胞经过核酸酶处理后，进行再培养。如图6中的(a)，与未处理的细胞相比，增殖速度基本一致。且图6中的(b)和(c)表明，七天后的存活率较高，与未处理的细胞相比没有显著性差异，表明本发明装置和所有操作均对细胞的增值和生存没有影响，具有较高的灵活性和生物相容性，其分离的细胞能够进行后续的细胞扩增、分子生物学、单细胞测序等操作和分析。
本发明所使用的连接锁核酸经过核酸酶的处理后不会被降解，其磁珠-连接锁核酸复合物可进行再生和重复利用，具体操作如下：
1)经过核酸酶处理后的磁珠经过超纯水洗涤一次后，重新分散于500μL超纯水中；
2)将1)溶液55℃水浴10min，立即插入冰上放置10min，使双链核酸解旋；
3)将它们放置于磁力架上，4℃分离30min，缓慢地吸走溶液，得到的即为磁珠-连接核酸复合物；
4)将上述3)磁珠-连接核酸复合物重新分散于1×PBS中，加入2μL 0.148μg/mL(即7.4×10-5nmol)PTK7含多拷贝适配体的长链核酸，在摇床上室温反应过夜；
5)将4)得到的溶液放置于磁力架上处理10min后，除去溶液部分，得到的磁珠-锁核酸复合物经过2次清洗后，重新分散在1mL 1×PBS中，得到磁珠-含多拷贝适配体的长链核酸复合物即再生为本发明用于捕获微量特定细胞的装置。
利用上述方法将本发明装置进行再生，在2000个/mL CCRF-CEM细胞浓度下进行循环8次实验，结果如图7所示，循环了八次后对目的细胞的捕获效率仍然能接近80％，且第一次和第八次在捕获效率上仅相差17.8％，表明本发明装置成本非常低，能够经过一定处理后进行重复利用，真正意义上实现绿色可再生循环，有较强的产业化应用前景。
实施例7复杂样品中复杂样品中T47D细胞的捕获(间接法)
在本实施例中，所捕获的乳腺癌细胞T47D是EpCAM蛋白高表达的细胞系，因此本发明以EpCAM的核酸适配体为例。
EpCAM含多拷贝适配体的长链核酸的合成参照实施例6的滚环扩增法，具体步骤如下：
1)在本实施例中，含多拷贝适配体的长链核酸中的间隔核酸为T20的核酸序列，EpCAM单价适配体序列为5-CAC TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGGGTT GGC CTG-3’，因此所设计的引物序列为：PTK7连接模板:5’-TCA TGG GGG GTT GGCCTG-3’；PTK7环状模板:5’-CCC CCA TGA CAA CGT GGG ACA GAC GCA ACC TCT GTA GTGAAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CAG GCC AAC-3’；PTK7滚环扩增法的引物:5’-TCA TGGGGG GTT GGC CTG-3’。
2)将16.3μL环状模板(500pmol)、10×磷酸酶缓冲液、1μL 100mM ATP、1μL多核苷酸激酶(PTK)、26.7μL超纯水混匀，37℃水浴反应30min，95℃处理5min，室温放置10min，此时完成环状模板的磷酸化；
3)7.6μL连接模板(600pmol)加入209.4μL超纯水中，90℃加热30s,室温放置10min；
4)将上述2)和3)溶液混合，加入30μL T4连接缓冲液、3μL T4连接酶，室温处理30min，此时完成环状核酸引物的合成；
5)将上述溶液用2％的琼脂糖凝胶纯化，得到的核酸引物经过乙醇沉淀后，-20℃保存备用；
6)4μL 29μM环状核酸，1μL 100μM滚环扩增法的引物，2μL反应缓冲液，13μL超纯水混匀，95℃加热5min，室温冷却放置30min；
7)将1μL 10mM dNTP混合液，2μL Phi29核酸聚合酶加入到上述6)溶液中，4℃反应6h，此时得到EpCAM含多拷贝适配体的长链核酸，它的序列由100-1000个单价适配体(5’-CAC TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG-3’)和间隔核酸序列(TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT)组成；
8)将7)反应产物用1％琼脂糖凝胶纯化，切胶，乙醇沉淀，溶解于无菌超纯水中，-20℃保存备用。
本实施例的磁珠-连接核酸复合物的合成方法包括以下步骤：
1)将上述所得的EpCAM含多拷贝适配体的长链核酸95℃加热5min，立即放放置于冰上10min；
2)取1×10-8nmol直径为250nm链霉亲和素标记的磁珠，洗涤，离心，重新分散于1×PBS中；
3)取1μL 100μM连接核酸(5’-TAG ATA AAA AAA AAA AAA AAA AAA A/36-Bio/-3’)用1×PBS配成母液；再加入到上述2)溶液中，在摇床上室温反应2h；该磁珠与连接核酸的物质的量比为1:107。
4)将3)放置于磁力架上，室温下，磁性分离处理10min，缓慢除去其中的液体，经过2次清洗后，重新分散在990μL 1×PBS中，得到磁珠-连接核酸复合物；
本实施例捕获细胞的方法采用间接捕获法，其步骤如下：
1)细胞先进行染色，如T47D细胞用DIO染色，MDA-MB-231细胞和WBCs细胞用DII染色；
2)将细胞以一定浓度混匀在900μL PBS中，加入2μL 0.148μg/mL(即7.4×10- 5nmol)的上述合成的EpCAM适配体的长链核酸，在摇床上25℃反应30min；
3)将上述2)得到反应物1000rpm，离心5min，得到的沉淀用PBS清洗1次，得到多拷贝适配体的长链核酸-细胞复合物；
4)将上述2)得到反应物加入50μL磁珠-连接核酸复合物，在摇床上4℃反应1.5h；
5)将4)放置于磁力架上，室温下，磁性分离处理10min，缓慢除去其中的液体，经过2次清洗后，重新分散在1000μL 1×PBS中，得到磁珠-细胞复合物；
6)将得到的细胞进行流式细胞或精密细胞计数器进行计数，并计算其捕获效率和捕获纯度。
本发明将高表达EpCAM的乳腺癌细胞系T47D作为捕获对象，低表达EpCAM的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和作为阴性对照。T47D细胞利用DIO染色使带绿色荧光，MDA-MB-231利用DII染色使带红色荧光，T47D和MDA-MB-231细胞均以1:100的浓度比例溶于1000μL PBS中(T47D细胞终浓度为10个/mL)，另将T47D混于1mL健康人全血中，使T47D细胞终浓度为10个/mL。在上述细胞混悬液中分别加入2μL EpCAM适配体的长链核酸溶液，在摇床上室温反应30min，得到反应物1000rpm，离心5min，沉淀用PBS清洗2次，重悬于950μL PBS中，再加入50μL磁珠-连接核酸复合物，在摇床上4℃反应1.5h，将其放置于磁力架上，室温下，磁性分离处理10min，缓慢除去其中的液体，经过2-5次清洗后，重新分散在1000μL 1×PBS中，得到磁珠-细胞复合物；最后所捕获得到的细胞进行计数，并计算其捕获效率和捕获纯度。如图8所示，在T47D仅仅只有10个/mL的微量浓度下，即使混入较多的MDA-MB-231细胞，其对T47D细胞的捕获效率达到80％，捕获纯度约为70％；而对于将10个/mL T47D细胞混入到1mL健康人的全血中，其捕获效率达到60％，捕获纯度达到37％，表明了该发明装置展现出对目的细胞较高的捕获效率和纯度。
实施例8白血病患者中高表达PTK7细胞的捕获
本实施例与实施例6的装置和制作方法相同，并应用于临床上10位白血病患者的PTK7高表达细胞的捕获和验证。
在0.5mL的患者血样中分别加入100μL磁珠-含多拷贝适配体的长链核酸溶液，室温在摇床上反应1h，得到的反应物经过磁力架分离10min，除去液体后重新分散于PBS中，洗涤2～3次，最终得到的细胞即为目标细胞。如图9中(a)所示，10位白血病患者均能检测到肿瘤细胞，最高为240个/mL，最低为20个/mL，对捕获后的细胞进行分子验证(图9中的(b))，所捕获的细胞有PTK7的表达，无CD45(白细胞的生物标记物)表达，说明所捕获的细胞不是白细胞，而是肿瘤细胞。本实施例表明，本发明所制作出的细胞捕获的装置可以应用于临床样本中特定的微量的细胞富集和分离。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (11)
1.一种捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，包括磁珠、连接核酸和含多拷贝适配体的长链核酸；所述连接核酸一端固定在磁珠表面，另一端以碱基互补的形式连接含多拷贝适配体的长链核酸。
2.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述连接核酸由天然或化学修饰的核苷酸组成，所述含多拷贝适配体的长链核酸是由多个单价核酸适配体和与连接核酸互补的间隔序列组成的单链核酸。
3.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述磁珠通过生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素结合方式将连接核酸固定在磁珠表面。
4.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述磁珠的粒径为0.1～25μm，所述磁珠的表面包被生物素或者亲和素或链霉亲和素。
5.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述连接核酸的长度为10～200核苷酸单元，所述连接核酸与多拷贝适配体的长链核酸序列中部分序列互补配对；所述连接核酸是多个重复的A或者T序列，或者是其他与含多拷贝适配体的长链核酸序列中的部分序列互补配对的核酸序列。
6.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述连接核酸的3’或者5’端修饰生物素或亲和素或者链霉亲和素。
7.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述含多拷贝适配体的长链核酸的长度为200～300000核苷酸单元，优选地，所述含多拷贝适配体的长链核酸中的间隔序列为3～40个核苷酸单元的重复T或者A序列，且与连接核酸互补。
8.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述含多拷贝适配体的长链核酸的合成方法采用聚合酶链式反应或核酸等温扩增技术。
9.一种如权利要求1至8任一项所述的捕获特定微量细胞的装置的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；
2)与1)相对应结合的生物素或链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1～3h；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温下，磁性分离处理5～30min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与上述步骤4)中的复合物混合于PBS中，室温在摇床上反应1～3h；
6)将5)中的反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢吸取去除其中的液体，剩余的即为所述的捕获特定微量细胞的装置。
10.根据权利要求9所述的捕获特定微量细胞的装置的制作方法，其特征在于，所述步骤3)中磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20～1010；所述步骤5)中磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:2～106。
11.一种利用权利要求1至8的捕获特定微量细胞的装置进行捕获细胞的方法，其特征在于，所述方法为直接法或间接法，所述直接法包含以下步骤：
1)将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的1～25μm磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；
2)与上述1)相应的生物素或链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1～3h；所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20～1010；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与上述步骤4)中的磁珠-连接核酸复合物混合于PBS中，室温在摇床上反应1～3h；所述磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:2～106。
6)将细胞混匀PBS中，将步骤5)中的混合后的复合物重悬于PBS中形成的溶液，4～25℃下在摇床上反应10～60min；
7)将上述6)得到反应物在磁力架上放置5～30min，缓慢吸取液体，并用PBS清洗2次，此时获得捕获的细胞；
所述间接法包含以下步骤：
1)将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的0.1～1μm磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；
2)与1)相应的生物素或者链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用1×PBS配成母液；
3)取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1～3h；所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20～1010；
4)将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；该复合物并重新悬浮于PBS缓冲液中；
5)将含多拷贝适配体的长链核酸与细胞混悬液混合，在4～25℃下摇床反应10～30min，离心，去除上清，并重新悬浮于适量PBS缓冲液中，形成待分离靶细胞-长链核酸复合物；所述待分离靶细胞和含多拷贝适配体的长链核酸的个数比为1：103～1020；
6)将步骤5)中的混合液与上述步骤4)中的复合物混合，4～25℃下在摇床上反应1～3h；所述磁珠-连接核酸复合物和细胞-含多拷贝适配体的长链核酸复合物的个数比为2～105：1，得到反应产物置于磁力架上，室温处理5～30min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-细胞复合物。
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Effective date of registration: 20200827 Address after: Room 1506-13, building 2, No. 371, Mingxing Road, Xiaoshan Economic and Technological Development Zone, Xiaoshan District, Hangzhou City, Zhejiang Province Applicant after: Debye Zhizhen medical technology (Hangzhou) Co., Ltd Address before: 310000 1506-6, building 2, No. 371, Mingxing Road, Xiaoshan Economic and Technological Development Zone, Xiaoshan District, Hangzhou City, Zhejiang Province Applicant before: Hangzhou Debai Biotechnology Co.,Ltd. |
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