CN102604934B - 一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，提供一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法。所述固相载体表面固定有至少一个模板序列，所述方法包括以下步骤：A.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；B.对扩增载体上的模板序列进行扩增，得到扩增产物。该方法基于表面固定有模板序列的固相载体进行扩增，能够将扩增产物固定于固相载体表面，提高固相载体表面的扩增产物结合量；同时，利用该扩增方法得到的固相载体进行测序，能增强测序的检测信号，降低对检测仪器的要求，在同等检测条件下提高测序的准确性。

Description

一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地说，涉及一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法。

背景技术

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成扩增DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得到扩增。PCR技术出现之后，根据不同的需要被不断改进，广泛应用于基因分离、克隆和核酸序列检测等领域。

现有技术提供了一种基于固相载体进行扩增的方法，其实现步骤包括：（1）将待测样品与带有亲水性正离子的固相载体混合，使得待测样品中含有的一种或多种靶标核酸以单链核酸片段的形式结合到固相载体上；（2）将引物与带有靶标核酸的固相载体混合，使引物与靶标核酸杂交结合，得到带有引物-靶标核酸的固相载体；（3）利用带有引物-靶标核酸的固相载体进行PCR扩增，得到扩增产物。该技术利用固相载体进行扩增，采用引物直接与固相载体上固定的靶标核酸杂交结合，因此扩增反应之后，扩增产物游离于液相中，未结合于固相载体表面，因此固相载体表面结合的扩增产物量少。

利用该现有技术进行扩增，需以大量核酸分子为模板，当固相载体表面的模板较少时无法保证扩增的顺利进行，因此降低了固相载体的利用率，提高了成本；若以扩增反应结束后的固相载体进行测序，很容易出现由于固相载体表面带有的靶标核酸过少，检测信号过弱而无法准确读取靶标核酸序列的现象，因此该现有技术对检测仪器要求高，测序的准确性存在局限性。

因此需要一种新的基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法，能够提高固相载体表面的扩增产物结合量，确保扩增的顺利进行，从而提高固相载体的利用率，降低成本，进而增强核酸测序的检测信号，降低对检测仪器的要求，在同等检测条件下可以提高测序的准确性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法，能够提高固相载体表面的扩增产物结合量，确保扩增的顺利进行，从而提高固相载体的利用率，降低成本，进而增强核酸测序的检测信号，降低对检测仪器的要求，在同等检测条件下提高测序的准确性。

为实现本发明的目的之一，一种基于固相载体进行扩增的方法，所述固 相载体表面固定有至少一个模板序列，所述方法包括以下步骤：

A.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；

B.对扩增载体上的模板序列进行单分子扩增，得到扩增产物。

其中，步骤A所述引物包括用于对所述模板序列进行扩增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是与模板序列5’端互补结合的核酸序列，所述下游引物是与模板序列3’端序列相同的核酸序列。

其中，所述单分子扩增为乳液PCR扩增或桥式PCR扩增。

其中，所述引物结合于固相载体表面的方式为：

引物与固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现直接结合；

或通过连接子携带的基团分别与引物和固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现间接结合。

进一步的，所述配对连接的方式采用生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的至少一种。

其中，所述固相载体的材质采用玻璃、硅胶、陶瓷、塑料和金属中的至少一种。

其中，在步骤A之前还可以包括步骤：

A0.将模板序列通过基团配对方式结合于固相载体表面，得到固定有至少一个模板序列的固相载体。

进一步的，所述引物及模板序列与固相载体采用不同的基团配对进行结合，所述固相载体表面或连接子带有至少两种基团。

其中，步骤B之后还可以包括步骤：

B’.对扩增产物进行纯化回收。

为实现本发明的目的之二，一种基于固相载体进行核酸测序的方法，所述固相载体固定有至少一个模板序列，所述核酸测序的方法包括以下步骤：

A.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；

B.对扩增载体上的模板序列进行单分子扩增，得到扩增产物；

C.根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序，得核酸序列信息。

其中，步骤A中所述引物包括肿瘤类易感基因引物、心血管疾病类易感基因引物、营养指导基因引物和单基因疾病检测引物中的任一种。

其中，所述步骤C包括以下步骤：

C1.将扩增产物变性形成单链，得固定于固相载体的单链核酸片段；

C2.根据碱基互补原则对单链核酸片段进行核酸测序，得核酸序列信息。

其中，所述核酸测序的方法是大规模循环平行测序的方法。

进一步的，所述大规模循环平行测序的方法为基于聚合酶合成为基础的合成测序法，或者是基于络合连接为基础的连接测序法。

由上可知，本发明提供的基于固相载体进行扩增及进行核酸测序的方法，利用固相载体上固定的至少一个模板序列，将引物直接结合于固相载体表面上的引物结合位点，使得扩增产物结合于固相载体表面，提高了固相载体表面的扩增产物结合量；利用扩增载体上同时存在的模板序列和引物进行单分子扩增时，可以避免由于没有引物或没有模板序列而使得固相载体无法用于扩增，从而提高了固相载体的利用率，降低了成本；同时，利用该扩增方法得到的固相载体进行测序，因其表面固定有大量扩增产物，测序时增强了检测信号，降低了对检测仪器的要求，在同等检测条件下提高了测序的准确性。

附图说明

附图1是本发明一个实施例中基于固相载体进行扩增的方法流程图；

附图2是本发明一个实施例中基于固相载体进行核酸测序的方法流程图；

附图3是本发明一个实施例中对扩增产物进行核酸测序的方法流程图；

附图4是本发明一个实施例中基于固相载体进行扩增并进行核酸测序的方法示意图；

附图5是本发明一个实施例中基于固相载体进行扩增及核酸测序得到的荧光信号图；

附图6是本发明另一个实施例中基于固相载体进行扩增及核酸测序得到的荧光信号图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明提供了一种基于固相载体进行扩增及进行测序的方法，该方法是基于表面固定有至少一个模板序列的固相载体完成的，包括以下步骤：首先将扩增所用的引物结合于固相载体表面的引物结合位点处，得到固定有引物的扩增载体；然后对扩增载体上的模板序列进行扩增，可以得到表面固定结合有大量扩增产物的固相载体；利用扩增载体上同时存在的模板序列和引物进行单分子扩增时，可以避免在独立空间里由于没有引物或没有模板序列而 使得固相载体无法用于扩增，从而提高了固相载体的利用率，降低了成本；利用这种扩增后得到的固相载体进行核酸测序，可以增强测序时的检测信号，降低对检测仪器的要求，在同等检测条件下提高测序的准确性。

图1示出了本发明一种基于固相载体进行扩增的方法流程，该方法包括以下步骤：

S101.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；

S102.对扩增载体上的模板序列进行扩增，得到扩增产物。

利用本发明记载的基于表面固定有至少一个模板序列的固相载体进行扩增的技术方案，可以通过固定于固相载体表面的引物将扩增产物固定到固相载体表面，从而可以提高固相载体表面结合的模板序列数量。

针对本技术方案，需要说明的是：

步骤S101中所述引物，是用于对固相载体表面固定的模板序列进行扩增的核酸序列，包括上游引物和下游引物中的至少一种。所述上游引物，是与模板序列的5’端互补结合的核酸序列；所述下游引物，是与模板序列的3’端序列相同的核酸序列。在本发明的一个具体实施例中，将上游引物或下游引物结合于固相载体表面的引物结合位点，与上游引物和下游引物同时固定于固相载体表面的方案相比，可以在实现发明目的的同时减少试剂的种类；在本发明的另一个具体实施例中，将上游引物、下游引物按照一定的比例同时结合于固相载体表面的引物结合位点，可以在实现发明目的的同时加快扩增的速度。其中上游引物与下游引物的混合比例根据需要可变，优选为1∶2至2∶1的比例之间，更优选为1∶1。上述对于上游引物与下游引物之间的混合比例只是本发明所用的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

其中，本发明所述模板序列，是指固定于固相载体表面，用于作为扩增模板的单链核酸序列，可以是DNA、RNA或eDNA，其来源可以是通过固相载体从混合样品中捕获得到，也可以是通过直接将模板序列样品结合于固相载体表面得到。

本发明所述引物结合位点，是指固相载体表面用于固定引物的结合位点。

其中，本发明所述固相载体，可以是由不同材质构成的，其材质可以采用玻璃、硅胶、陶瓷、塑料和金属中的任意一种，而固相载体的表面无特殊要求，优选带有平滑表面的固相载体，固相载体的具体类型可以是现有技术中常用的固相载体，包括但不限于塑料珠、玻璃珠、玻片、磁珠和纳米金颗粒。本发明中优选采用磁珠作为固相载体，以使得扩增反应结束后扩增产物的分离纯化更加方便。上述只是本发明对于固相载体的一些具体实施例，并 不用以限制本发明的保护范围。

本发明所述的扩增载体，是指表面固定有至少一个模板序列，且同时还结合有引物的固相载体，此时模板序列和引物同时固定于固相载体表面，能够直接应用于扩增。

本发明中所述引物结合于固相载体表面时，不排除引物同时也与模板序列互补结合，这并不影响本发明的发明目的的实现。

上述引物结合于固相载体表面可以采用多种方式实现。在本发明的一个具体实施方案中，引物通过与固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现直接结合，可以简化操作。在本发明的另一个具体实施方案中，引物通过与连接子携带的其中一个基团连接，再通过连接子携带的另一个基团与固相载体表面携带的基团进行配对连接，从而实现引物与固相载体的间接连接；在本实施方案的另一个具体实施例中，连接子是类似于树脂结构的存在，使用该连接子除了可以实现引物与固相载体的间接连接之外，还可以进一步提高固相载体表面结合的引物数量。

其中，所述连接子用于连接引物与固相载体。所述连接子可以采用多种化合物，包括但不限于：烷烃、单链核苷酸分子或包含多聚物部分的化合物。

上述配对连接的方式多种多样，可以采用生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的任意一种。

在本发明的一个具体实施方案中，引物带有生物素标记，而固相载体本身已经经过链霉亲和素修饰，因此两者直接通过生物素与链霉亲和素之间的配对连接，实现直接连接。

在本发明的另一个具体实施方案中，固相载体表面带有氨基修饰，而引物经过羧基修饰，两者通过氨基-羧基进行配对连接，实现直接连接。

在本发明的另一个具体实施方案中，采用多聚化合物如树脂作为连接子，通过氨基分别与引物所带的羧基及固相载体表面携带的醛基进行配对连接，实现引物与固相载体表面的间接结合。

在本发明的另一个具体实施方案中，以烷烃分子作为连接子，其上带有氨基以及羧基，因此可以与羧基化的引物以及表面氨基化的固相载体进行配对连接，实现引物与固相载体表面的间接结合。

上述仅是本发明中引物结合于固相载体表面的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

本发明的发明目实现的基础是表面固定有至少一个模板序列的固相载 体，其表面固定的模板序列是用于扩增的单链核酸序列，其来源可以为多种途径，可以是直接固定有模板序列的固相载体，也可以是通过连接反应后固定有模板序列的固相载体，此时，需要在步骤S101开始之前，进行模板序列结合于固相载体表面的操作。

在本发明的一个具体实施方案中，直接在扩增之前对所要扩增的基因组进行片段化，然后利用接头与片段化得到的核酸片段两端连接，且固相载体表面进行相应的修饰处理，再将接完接头之后的片段固定于固相载体表面。

在本发明的另一个具体实施方案中，用于扩增的模板序列最初位于临床待测血液样品中。首先对固相载体表面进行链霉亲和素修饰，然后连接经过生物素修饰的捕获探针，得到带有捕获探针的固相载体。将带有捕获探针的固相载体直接与临床待测血液样品混合，从中进行模板序列的捕获。捕获结束后，利用离心分离，即可得到表面固定有模板序列的固相载体。

在本发明的另一个具体实施方案中，用于扩增的模板序列位于临床疾病患者的唾液中。为得到用于扩增的模板序列，首先利用相应的引物进行一般的PCR，将从患者的唾液中得到的模板序列进行放大，然后以凝胶电泳进行分离回收，回收产物再进行生物素化接头的连接，而固相载体采用链霉亲和素修饰的磁珠，两者混合结合，即可得到表面固定有至少一个模板序列的磁珠。

上述仅是本发明中固相载体表面固定的模板序列来源的一些具体实施例，并不用以限制本发明的保护范围。

固相载体表面进行模板序列的固定操作之后，在进行步骤S101的操作时，引物与固相载体表面的结合方式，可以与模板序列与固相载体表面的结合方式一致，也可以采取不一样的结合方式。在本发明的一个实施方案中，引物以及模板序列都采用与固相载体表面直接配对连接的方式。进一步的，在采用相同结合方式时，模板序列与引物还可以采用相同或者是不同的基团配对实现与固相载体的直接或间接配对连接。在本实施方案的一个具体实施例中，固相载体表面带有链霉亲和素修饰，而模板序列和引物都带有生物素修饰，模板序列和引物都通过链霉亲和生物素的作用固定于固相载体表面；在本实施方案的另一个具体实施例中，固相载体表面带有氨基修饰，而模板序列带有羧基修饰，引物带有醛基修饰，模板序列与引物通过不同的基团配对实现与固相载体的直接配对连接；在本实施方案的另一个具体实施例中，固相载体表面带有氨基修饰，而模板序列带有羧基修饰，引物带有异硫氰基修饰，模板序列与引物通过不同的基团配对实现与固相载体的直接配对连接；在本实施方案的另一个具体实施例中，固相载体经过不同的修饰处理后带有氨基以及链霉亲和素，而模板序列带有羧基修饰，引物带有生物素修饰，模板序 列与引物通过不同的基团配对实现与固相载体的直接配对连接；在本实施方案的另一个具体实施例中，固相载体表面带有树脂包埋，而模板序列与引物分别于树脂上所携带的相同或不同基团进行配对，从而都采用间接连接的方式实现与固相载体的连接。

在本发明的另一个实施方案中，模板序列与引物采用不同的固定方式与固相载体表面结合。在本实施方案的一个具体实施例中，固相载体表面带有链霉亲和素修饰，模板序列通过捕获探针实现与固相载体的间接配对连接，而引物通过链霉亲和生物素的作用实现与固相载体的直接配对连接，两者通过不同的结合方式与固相载体连接；在本实施方案的另一个具体实施例中，固相载体表面带有氨基修饰，模板序列利用羧基修饰实现与固相载体的直接配对连接，引物通过氨基与连接子上所带的醛基配对连接，然后再通过连接子上的醛基实现与固相载体的间接连接，从而实现模板序列与引物通过不同的结合方式与固相载体连接。

上述实施方案以及具体实施例只是本发明中模板序列与引物两者与固相载体表面结合方式的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

步骤S102中，利用扩增载体对模板序列进行扩增，是指利用一定的方法(如化学、酶促或其他类型的方法)使得模板序列的拷贝数增加或导致模板序列存在的信号增加。本发明利用扩增载体进行扩增时，除加入必须的扩增试剂外，还加入少量游离态的引物用以加速扩增的启动以及扩增的速度。加入的游离态引物量可根据固相载体上固定的引物种类和量的不同而进行相应的调整。

在本发明的一个实施方案中，固相载体表面固定的是上游引物，在一个具体实施例中，加入的游离态引物是下游引物；在另一个具体实施例中，为使扩增速度能够加快，加入大量游离态下游引物的同时，也加入了少量上游引物。

在本发明的另一个实施方案中，固相载体表面固定的是下游引物，在一个具体实施例中，加入的游离态引物是上游引物；在另一个具体实施例中，为使扩增速度能够加快，加入大量游离态上游引物的同时，也加入了少量下游引物。

在本发明的另一个具体实施方案中，上游引物与下游引物同时结合于固相载体表面，在一个具体实施例中，加入的游离态引物是上游引物或者是下游引物中的其中一种；在另一个具体实施例中，扩增时同时加入游离态的上游引物和下游引物，以便加快扩增的速度，且上游引物与下游引物的量以1∶1为佳，以其他比例亦可。

本发明可以采用多种扩增方式，包括但不限于常见的聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、Q-Beta复制和滚环扩增(RCA)，优选可以实现单分子扩增的乳液PCR(EPCR)、桥式PCR，其中桥式PCR又可分为水相桥式PCR和乳液桥式PCR两种。

本发明所述单分子扩增，是指对模板序列，以极微量(甚至是单个分子)的形式在空间上隔离(但这些模板序列整体上还是属于同一个反应体系)，在各自的空间内实现对模板序列的扩增，得到扩增均一的扩增产物，用以提升扩增后得到的扩增产物的信号。

其中，本发明中所述EPCR是利用乳浊液体系中各液滴形成的独立空间，对扩增载体上的模板序列进行独立扩增反应，用以生成大量均一的扩增产物的单分子扩增技术，其大致操作步骤是：将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。理想状态下，每个小水滴只含一个扩增载体，包含有足够的其它扩增试剂(包括DNA聚合酶、dNTP等)。在EPCR反应后，固相载体表面就固定有拷贝数目巨大的同来源的模板序列扩增产物。EPCR具体步骤可参考文献：BEAMing：single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions，Frank Diehl，Meng Li，Yiping He，nature methods，Vol.3，No.7，July 2006。

本发明中所述的桥式PCR是利用固定于固相载体上的上游引物或下游引物与模板序列形成桥状结构进行扩增，从而得到大量同源、均一扩增产物的单分子扩增技术。所述桥式PCR的基本原理是，桥式PCR的引物被固定在固相载体上，PCR过程中PCR扩增产物会被固定在固相载体上，且PCR扩增产物能够与固相载体上的引物互补配对，成桥状，然后互补配对的引物以与其成桥的扩增产物为模板进行扩增。通过控制初始模板加入的量，桥式PCR反应完成后，扩增产物在固相载体上以一簇簇的形式存在，且每一簇的扩增产物为同来源的DNA模板扩增产物。水相桥式PCR与乳液桥式PCR的主要区别在于，乳液桥式PCR是在乳液体系中隔离的独立空间中进行桥式PCR，同时具有水相桥式PCR与EPCR的特性。关于桥式PCR的具体原理和实施方案可参考以下文献：CN20061009879.X、US6227604和Dual primer emulsion PCR for nextgeneration DNA sequencing，Ming Yan Xu et al Benchmarks Vol.48No.5,2010。

在本发明的一个具体实施方案中，利用PCR方法对模板序列进行扩增，此方法操作简单，但缺点在于需要模板序列较多。

在本发明的一个优选实施方案中，利用RCA的方法对模板序列进行扩增， 此实施方案的优势在于能够形成单分子扩增，扩增结束后可以直接得到大量均一的扩增产物；也可以针对模板序列中存在的特异性核酸序列，利用特异性核酸内切酶对扩增产物进行酶切，可以得到大量特定位置且分布均一的扩增产物。所述特异性核酸内切酶，是指能识别模板序列中的特异性核酸序列，并在特定位置进行切割的内切酶。

在本发明的另一个优选实施方案中，利用EPCR对扩增载体表面固定的模板序列进行扩增，可以实现单分子扩增，以极少量甚至是单个模板序列完成扩增，而且得到大量均一的扩增产物。

在本发明的另一个优选实施方案中，利用桥式PCR对扩增载体表面固定的模板序列进行扩增，同样可以实现单分子扩增，以极少量甚至是单个模板序列完成扩增，得到大量均一的扩增产物。

在本实施方案中的一个具体实施例中，利用水相桥式PCR对固相载体表面固定的模板序列进行扩增；而在本实施方案中的另一个具体实施例中，利用乳液桥式PCR实现对固相载体表面固定的模板序列的扩增。

其中，本发明中所述的扩增产物，指的是经过扩增反应后，表面固定有大量扩增得到的核酸序列的固相载体。

上述优选实施方案中利用EPCR和桥式PCR进行单分子扩增，与只有引物或只有模板序列固定于固相载体的技术相比，可以避免由于缺少其中一种而无法进行扩增，从而可以提高固相载体用于扩增的效率，减少固相载体的使用量，降低成本。而且，与背景技术中提到的现有技术相比，同为固相载体上固定有模板序列的扩增技术，本发明所述技术方案的扩增产物全部结合于固相载体表面，可以提高带有扩增产物的固相载体在后续应用中的效率，进一步降低成本。

上述仅是本发明中用于扩增固相载体表面固定的模板序列的一些具体实施方式，并不用以限制本发明的保护范围。

步骤S102进行扩增后，得到的扩增产物里包含表面结合有扩增的模板序列的固相载体，以及其他未反应完的杂质，因此，若需要进一步进行后续操作，需要进行对扩增产物的纯化回收。纯化回收的目的在于将表面结合有扩增的模板序列的固相载体与杂质分离提纯出来，可以使用现有技术中的常用方法，包括但不限于离心分离提纯、柱分离纯化。

图2示出了本发明的一种基于固相载体进行核酸测序的方法，其中所述固相载体固定有至少一个模板序列，该方法包括以下步骤：

S201.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的 扩增载体；

S202.对扩增载体上的模板序列进行扩增，得扩增产物；

S203.根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序，得核酸序列信息。

本技术方案的优势在于，基于表面固定至少有一个模板序列的固相载体，在其表面结合引物进行扩增，可以提高固相载体表面扩增产物结合的数量，从而可以在后续的核酸测序过程中，增强核酸测序的检测信号，降低对检测仪器的要求，在同等检测条件下可以提高测序的准确性。

针对本技术方案，需要说明的是：

步骤S201中引物、固相载体表面固定的模板序列、引物与固相载体结合的方式以及相应的内容，遵循上一技术方案中步骤S101中所述，在此不再过多赘述。

鉴于本技术方案的优势所在，可将本发明所记载的技术方案应用于各种临床疾病相关基因的核酸序列检测，用以得到相关基因的核酸序列，在此基础上，结合后续进一步的分子生物学试验和临床试验、临床观察以及综合数据的统计分析，并建立一定的疾病模型，进而可以实现相应疾病的早期评估。

需要进一步说明的是，本技术方案中所述的引物并无特殊要求，包括上游引物和/或下游引物，是用于扩增模板序列的核酸序列。所述引物优选可以与临床应用结合，能用于扩增各种临床疾病相关基因序列的引物，包括但不限于肿瘤类易感基因引物、心血管疾病类易感基因引物、营养指导基因引物和单基因疾病检测引物。

其中，所述肿瘤类易感基因引物，是指用于扩增各种肿瘤类易感基因的引物；所述肿瘤类易感基因，是指初步研究显示可能与某一种肿瘤有一定关联的基因，常见的包括但不限于肺癌易感基因、乳腺癌易感基因、结直肠癌易感基因、鼻咽癌易感基因、胰腺癌易感基因、肝癌易感基因和胃癌易感基因。其中，所述肺癌易感基因包括但不限于APE1、CASP7、CASP8、CASP9、CHEK2、COX-2、CYP1A1、CYP2E1、ERCC1、ERCC2和ERCC6；所述乳腺癌易感基因包括但不限于FGFR2、MTHFR和IL-1β；所述结直肠癌易感基因包括但不限于MMP2、SMAD7、ADH2、ALDH2、CYP1A2、MMP-1、MTHFR、TP53、VEGF和COX-2；所述鼻咽癌易感基因包括但不限于IL-2、MDM2、HLA-A、HLA-B、MDS1-EVI1、HCG9和ITGA9；所述胰腺癌易感基因包括但不限于MTHFR、COX-2、FasL、CASP8、THSD7B、ARL4C、LTF、FOXQ1和PARK2；所述肝癌易感基因包括但不限于IL-1B、TNF-α、EGF和TGF-β1；所述胃癌易感基因包括但不限于EGF、ALDH2、MTHFR、P53、IL-10、PSCA、TNFA、PLCE1、CYP1A1和CDH1。

所述心血管疾病类易感基因引物，是指用于扩增各种心血管类疾病易感 基因的引物；所述心血管疾病类易感基因，是指经初步研究显示与各种心血管类疾病有一定关联的基因，常见的包括但不限于冠状动脉性心脏病易感基因、动脉粥样硬化易感基因、老年性痴呆症易感基因、原发性高血压易感基因、家族性高胆固醇血症易感基因、心肌梗塞易感基因和帕金森综合症易感基因。其中，所述冠状动脉性心脏病易感基因包括但不限于MEF2A、PDGF、FGF、EGF、VEGF、COX-1和T-PA；所述动脉粥样硬化易感基因包括但不限于ALOX5AP、ApoE、LDLR、HUMARA、DCC和Rb；所述老年性痴呆症易感基因包括但不限于APP、PS-1、PS-2、ApoE、ACE、CH25H、CST3、CHRNB2和SORL1；所述原发性高血压易感基因包括但不限于AGT、ACE、AT1R、CYP11B2、G-β3、eNOS、RnBO、LDLR和LL；所述家族性高胆固醇血症易感基因包括但不限于LDLR、apoB 100和ApoE；所述心肌梗塞易感基因包括但不限于ALDH2、LTA、PSMA6、TAFI、ACE和MMP9；所述帕金森综合症易感基因包括但不限于SNCA、LRRK2、PINK1、UCH-L 1和Parkin。

所述营养指导基因引物，是指用于扩增各种营养指导基因的引物。所述营养指导基因，是指经初步研究显示与人体营养具有一定关联，可用于指导人体营养吸收消化能力的基因，常见的包括但不限于抗叶酸代谢指导基因、黄曲霉素代谢能力指导基因、嗜酒基因、吸烟损伤指导基因和乳糖代谢指导基因。所述叶酸代谢指导基因包括但不限于MTHFR、MTRR、CBS和SHMT1；所述黄曲霉素代谢能力指导基因包括但不限于GSTM1、GSTT1、EPHx、XRCC1和hOGG1；所述嗜酒基因包括但不限于ADH2、ADH3、ALDH2和CYP2E1；所述吸烟损伤指导基因包括但不限于p53和K-ras；所述乳糖代谢指导基因包括但不限于LCT、MCM6和ALDH2。

所述单基因疾病检测引物，是指用于扩增各种单基因疾病基因的引物。所述单基因疾病基因，是指与各种单基因疾病具有一定关联的单一基因，常见的包括但不限于苯丙酮尿症基因(PAH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因(G6PD)、半乳糖血症基因(GALT)、A型及B型血友病基因(F8及F9)、镰刀状细胞性贫血基因(HBB)和地中海贫血基因(HBA)。

上述仅是本发明中对于引物的一些具体实施例，并不用以限制本发明的保护范围。 

步骤S202中所述扩增，可以采用多种方式实现，为保证用于核酸测序的扩增产物的均一性，优选采用单分子扩增方式，包括但不限于EPCR和桥式PCR，相应的操作已经在之前进行了详细描述，在此也不作过多赘述。

利用扩增载体进行扩增反应，得到扩增产物后，为保证用于核酸测序时扩增产物的纯度，需要对扩增产物进行纯化回收，根据不同的扩增方式需要 采用不同的纯化回收方式，而这些纯化回收方式是本领域内成熟而且常知的技术内容，包括但不限于离心分离法、柱分离纯化回收法，若固相载体为特定的磁珠或磁球，也可以直接利用磁铁吸附的方法进行纯化回收。

若扩增方式优选为EPCR和乳液桥式PCR，则纯化回收步骤中还需要进行破乳释放扩增产物的操作，破乳释放的方法可以采用常见的方法，在本发明的一个具体实施方案中，往扩增反应结束后的产物中加入释放缓冲液，利用离心破乳的方式释放扩增产物；在本发明的另一个具体实施方案中，往扩增反应结束后的产物中加入异丙醇进行破乳释放扩增产物，然后通过离心分离的方式得到纯化后的扩增产物；在本发明的另一个具体实施方案中，往扩增反应结束后的产物中加入己烷进行破乳释放扩增产物，然后再离心分离得到纯化后的扩增产物。

上述仅是本发明中利用扩增载体进行扩增的一些具体实施例，并不用以限制本发明的保护范围。

步骤S203利用步骤S202中得到的扩增产物进行核酸测序，其具体操作如图3所示的方法流程实现，该方法包括以下步骤：

S2031.将扩增产物变性形成单链，得固定于固相载体的单链核酸片段；

S2032.根据碱基互补原则对单链核酸片段进行核酸测序，得核酸序列信息。

步骤S2031中，在对扩增产物进行核酸测序之前，由于扩增之后得到的扩增产物是双链核酸序列，因此需要进行变性形成单链，得到固定于固相载体表面的单链核酸片段。

步骤S2032中所述核酸测序，是指利用碱基互补原则，对扩增产物的碱基进行配对，以此来检测其核酸序列。进行核酸测序的方法可以采用多种方法，本发明基于固相载体表面带有大量扩增产物，优选采用大规模循环平行测序的方法，以此提高核酸测序的效率与准确性。本发明所述大规模循环平行测序的方法是指在固相载体表面构建扩增产物矩阵后，所有矩阵点上的测序反应都可以平行而且循环进行的测序方法。所述大规模循环平行测序的方法包括但不限于基于聚合酶合成为基础的合成测序法、基于络合连接为基础的连接测序法。

基于聚合酶合成为基础的合成测序法是基于带可去除标记的核苷酸进行的，在每次合成反应中，每个模板链至多只能延伸一次，然后收集该次加入的核苷酸的标记信号，然后根据碱基互补原则即可得到相应的待测核苷酸。基于聚合酶合成为基础的合成测序法的大致流程如下：

a.测序引物通过互补配对结合在单链核酸片段共有的已知序列上(该单链 核酸片段固定在固相载体表面上)，在DNA聚合酶的作用下，以带可去除标记的核苷酸进行单碱基延伸合成反应，收集该次加入核苷酸的标记信号，即可得到与测序引物3’最末端碱基互补的单链核酸片段的下一位的碱基序列信息。

b.切除可去除标记，然后在DNA聚合酶的作用下，以带可去除标记的核苷酸继续进行单碱基延伸合成反应，收集加入核苷酸的标记信号，即可得到与测序引物3’末端碱基互补的单链核酸片段的下两位的碱基序列信息。

重复b步骤，直至不能继续进行合成反应为止，从而获得单链核酸片段的全部序列信息。 

基于络合连接为基础的连接测序法是基于带荧光标记的寡核苷酸探针进行的，在每次连接反应中，每个模板链至多只连接一种特定位置带荧光标记的寡核苷酸探针，然后收集该次的荧光标记信号，然后根据碱基互补原则即可得到相应的待测核苷酸。其中一种连接酶的连接测序法是基于在特定位置带有荧光标记的寡核苷酸探针进行的，该寡核苷酸探针带有n个碱基，从其5’端数起的第a位带有荧光标记，其中不同的碱基对应特定的荧光标记，因为该寡核苷酸探针的3’端或5’端进行了特定的修饰，寡核苷酸探针之间不能直接相互连接，每次连接反应，每个单链核酸片段只能连接一个寡核苷酸探针。该连接测序法的大致流程如下：

A.测序引物通过互补配对结合在单链核酸片段共有的已知序列上，利用上述的寡核苷酸探针，在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，然后采集荧光信号，即可得到与单链核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a位碱基序列信息。

B.切除寡核苷酸上的荧光标记，在连接酶的作用下，以上述的寡核苷酸探针为原料，继续进行连接反应，然后采集荧光信号，从而得到单链核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第2a位的碱基序列信息。

重复B步骤，直至不能继续进行连接反应为止，从而获得单链核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a、2a、3a、4a......位的碱基序列信息。

然后将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单链核酸片段上变性洗脱下来，换用与之前的测序引物相比3’末端或5’末端少一个碱基的引物重复上述反应，从而获得单链核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a-1、2a-1、3a-1、4a-1......位的碱基序列信息。重复此步骤，最后获得单链待核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第a-(a-1)、2a-(a-1)、3a-(a-1)、4a-(a-1)......位的碱基序列信息，从而获得单链核酸片段的全部序列信息。

另一种连接酶的连接测序法同样也是基于带有荧光标记的寡核苷酸探针进行的，该寡核苷酸探针带有n个碱基，分为h(h≤n)组，同一组寡核苷酸探针的不同荧光标记对应同一特定位置的不同碱基序列，不同组之间的区别 在于：不同荧光标记对应的特定位置不同，因为该寡核苷酸探针的3’端或5’端进行了特定的修饰，寡核苷酸探针之间不能直接相互连接，每次连接反应，每个单链核酸片段只能连接一个寡核苷酸探针。该连接测序法大致流程如下：

a.测序引物通过互补配对结合在单链核酸片段共有的已知序列上，利用上述寡核苷酸探针中的一组(荧光标记对应的碱基位置为x，x≤h)，在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，然后采集荧光信号，即可得到与单链核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第x位碱基序列信息，将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单链核酸片段上变性洗脱下来。

b.然后重新将测序引物结合在单链核酸片段上，换用与a步骤不同的寡核苷酸探针组(荧光标记对应的碱基位置为y，y≤h)，在连接酶的作用下，将核酸探针与上述寡核苷酸链连接，然后采集荧光信号，即可得到与单链核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第y位碱基序列信息，将测序引物及其所连接的寡核苷酸探针从单链核酸片段上变性洗脱下来。

c.重复步骤b，直至h组寡核苷酸探针均分别进行过一次连接反应，从而获得单链核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前第1、2......、h位的碱基序列信息。

换用与之前的测序引物相比3’末端或5’末端多一个或多个通用碱基的引物按上述原理进行反应，能够延长获得的单链核酸片段共有的已知序列的3’末端后或5’末端前的碱基序列的读长。

这种基于络合连接为基础的连接测序法的原理和具体实施方案可参考CN200710170507.1。

基于合成酶合成为基础的合成测序法原理上与焦磷酸测序方法类似，因此焦磷酸测序法同样能够适用于本发明的检测方法。但是现有的焦磷酸测序法在测序过程中采用的是天然dNTP，使得其在测序过程中，对待测序文库上可能存在的连续单碱基重复序列的测定存在困难；而基于聚合酶的合成测序法中的核苷酸带有的可去除标记，能够保证每次只延伸一个碱基；基于连接酶的连接测序发中的带荧光标记的探针的3’端或5’端进行了修饰，保证每个单分子扩增产物的片段上只连接一个荧光探针；因此本发明的基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法的准确性较焦磷酸测序高。

此外，因为现有的焦磷酸测序仪器中的蚀刻光纤玻片(PTP板)上的小孔较大(55μm×44μm)，用于容纳测序之前的乳液PCR所得的扩增产物(乳液PCR的扩增产物被固定在10μm的珠上)，这大大限制了焦磷酸测序法的测序通量，使得其测序反应的试剂成本较高。此外，焦磷酸测序法在测序过程中还需往蚀刻光纤玻片(PTP板)的小孔内加入昂贵的含有多种蛋白的复合物以保证测序反应的顺利进行，而这将大大提高测序反应的试剂成本。

相对的，基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法可通过1μm的磁珠或者玻片来固定单分子扩增的产物，使得其通量更高，且除了需要带有可去除标记的核苷酸或在3’端或5’端进行了修饰的荧光标记的探针外，对所需的其他试剂无特殊要求，这大大降低了测序反应的试剂成本。在获得相同数据量的情况下，基于聚合酶的合成测序法和基于连接酶的连接测序法的测序成本为焦磷酸测序法的两千分之一或更少。因此本发明方案中优选基于聚合酶的合成测序法或基于连接酶的连接测序法对单分子扩增产物进行测序。

图4为本发明一个具体实施例中基于固相载体进行核酸测序的方法示意图，该图直观的展现了基于固相载体进行核酸测序的过程：

步骤1.将模板序列结合于表面经链霉亲和素修饰的磁珠表面，得到表面固定有至少一个模板序列的磁珠：利用链霉亲和素对磁珠表面进行修饰；以乳腺癌的GSTP1基因片段(SEQ ID NO：10)作为模板序列，采用生物素进行修饰；然后将经过修饰后的磁珠与模板序列混合孵育，使得模板序列结合于磁珠表面，得到表面固定有至少一个模板序列的磁珠。

步骤2.引物结合于磁珠表面的引物结合位点，得到扩增载体：将用于扩增模板序列的上游引物G1(SEQ ID NO：1)、下游引物G2(SEQ ID NO：2)进行生物素化修饰，然后与表面固定有至少一个模板序列的磁珠进行混合孵育，使得上游引物与下游引物结合到磁珠表面的引物结合位点处；孵育结束之后，利用磁铁吸附住磁珠进行分离纯化，得到用于扩增的扩增载体。

步骤3.利用扩增载体进行单分子扩增，得到扩增产物：利用深圳华因康基因科技有限公司的KE001乳浊液制备试剂盒，先制备油相体系，然后以扩增载体与其他扩增试剂(包括DNA聚合酶、少量上游引物和下游引物、缓冲液、镁离子、dNTP等)组合形成水相，采用注水入油方式在乳浊液制备装置上制成乳浊液体系；利用制备好的乳浊液体系进行EPCR单分子扩增，扩增结束之后以磁铁吸附，分离纯化得到扩增产物。

步骤4.对扩增产物进行核酸测序，得到核酸序列信息：将得到的扩增产物进行变性形成单链核酸片段，点样，在玻片表面形成核酸片段矩阵，然后将带有矩阵的玻片组装成测序反应小室，利用深圳华因康基因科技有限公司的Pstar-II测序平台进行连接测序法测序，经过生物信息学分析的手段得到模板序列的核酸序列信息。

针对上述各技术方案，为进一步说明，本发明给出具体的操作实施例：

本实施例以肺癌易感基因中的CYP1A1基因片段(SEQ ID NO：11)和XRCC1基因片段(SEQ ID NO：12)作为模板序列，利用本发明所述的技术方 案对其进行扩增并进一步对扩增产物进行核酸测序；为便于分离纯化操作，固相载体采用磁珠。

一、模板序列与磁珠表面的结合

将作为模板序列的CYP1A1基因片段和XRCC1基因片段分别用生物素进行修饰，然后分别与表面经过链霉亲和素修饰的磁珠结合，通过螺旋振荡进行混匀，得到表面固定有至少一个模板序列的磁珠，每个反应体系及反应过程如下所示：

模板序列      0.015ng(约10⁸个分子)；

链霉亲和素修饰的Myone磁珠(1μm，10mg/mL；Invitrogen)  6μL；

螺旋振荡混匀，反应30min，以适量TE缓冲液，10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA)清洗两次，离心分离，将得到的磁珠以结合缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5；1mM EDTA；1M NaCl；0.01％Triton X-100)重悬保存。

二、引物结合于磁珠表面，得到扩增载体

将用于扩增CYP1A1基因片段的上游引物F1(SEQ ID NO：3)、下游引物R1(SEQ ID NO：4)以及用于扩增XRCC1基因片段的上游引物F2(SEQ IDNO：5)、下游引物R2(SEQ ID NO：6)分别结合于固定有模板序列的磁珠表面，得到相应的扩增载体；其中上游引物与下游引物都经过生物素化，采用1∶1的比例进行混合，具体的反应体系及反应过程为：

生物素化的上游引物与下游引物的混合物(100μM)    0.6μL；

磁珠悬浮液    10μL；

室温条件下(18～25℃)，螺旋振荡，孵育1h；

适量TE缓冲液清洗2次，离心，以6μL TE缓冲液重悬磁珠，得到扩增载体悬浮液，4℃保存备用。

三、利用扩增载体进行扩增，得到扩增产物

本实施方案中，利用扩增载体进行EPCR单分子扩增反应，得到扩增产物。

1.乳浊液体系制备

采用深圳华因康基因科技有限公司的KE001乳浊液制备试剂盒，根据使用说明：

首先对油相制备试剂以螺旋剧烈振荡进行混匀，置于室温30min，得到用于制备乳浊液体系的油相体系；

利用扩增载体及试剂盒中相应试剂制备PCR Mix水相体系，以150μL为例，该水相体系成分如下所示：

ddH₂O    112μL；

10×PCR buffer(650mM Tris-HCl，pH8.0；160mM(NH₄)₂SO₄；10mMDTT；11mM MgCl₂)    15μL；

50mM MgSO₄  3μL；

10mM dNTP  3μL；

10μM上游引物、下游引物混合物  1.2μL；

扩增载体悬浮液  6μL；

5U/μL DNA Taq酶  9μL；

上述成分混匀，制备成PCR Mix水相体系。

将制备好的油相体系与水相体系按照4∶1的比例放入EP管中混合，同时加入辅助混匀的固相颗粒，根据实验条件的不同，可以选择加入钢珠、玻璃珠或塑料珠，本实施方案中优选加入钢珠，将EP管置于乳浊液制备仪上夹紧，按照15HZ，10s，再转换17HZ，8s进行振荡混匀，制备成乳浊液体系。

2.EPCR单分子扩增

利用制备好的乳浊液体系进行EPCR单分子扩增。CYP1A1基因片段和XRCC1基因片段的单分子扩增可以在同一体系中同时进行，简化操作；也可以在两个体系中分别进行，这样可以直接对扩增产物进行区分。单分子扩增反应体系以及反应过程如下所示：

4min，94℃；

30s    94℃，

55s    64℃，

45s    72℃，循环数为3；

30s    94℃，

55s    61℃，

45s    72℃，循环数为3；

30s    94℃，

55s    58℃，

45s    72℃，循环数为3；

30s    94℃，

55s    57℃，

45s    72℃，循环数为100；

6min，72℃；

反应结束后10℃保存。

3.破乳释放扩增产物，分离提纯

在EPCR反应结束后的反应产物中加入适量异丙醇，螺旋震荡混匀后4000rpm，3min离心分离去上清，扩增产物以磁铁吸附。

扩增产物中加入适量的抽提缓冲液(Extraction buffer)，螺旋振荡混匀后4000rpm离心3min分层，用磁铁吸附磁珠，将液体清除；重复此操作数次。

然后加入适量TE，重复清洗数遍扩增产物，最后以适量的TE重悬磁珠。

四、利用扩增产物进行核酸测序，得到核酸序列信息

利用华因康基因科技有限公司的Pstar-II测序平台对扩增产物进行连接测序法测序，经过生物信息学分析的手段得到模板序列的核酸序列信息。

得到的扩增产物经过变性得到单链核酸片段，然后与测序用的缓冲液进行混合，在测序专用点样的玻片上进行矩阵点样。点样完成后，利用锡箔纸将放有已经点好样的固相载体的容器包住避光，室温下固定1h。

固定结束之后的玻片，以TE缓冲液进行洗涤，并用ddH₂O进行过洗。将洗涤过的玻片组装成测序小室，然后根据之前所述的经典连接测序法进行核酸测序，收集荧光信号图，如图5所示。利用生物信息学手段对荧光信号图进行分析，得到模板序列的核酸序列信号。

针对本发明所述有益效果中提到的固相载体利用率、增强测序时的检测信号、降低对检测仪器的要求以及同等条件下提高测序的准确性，本发明提供了一个实施例加以证明。

本实施例以CASP7基因中一段长度为160bp的核酸片段作为模板序列M1(SEQ ID NO：13)，设计并合成用于扩增M1的一对引物F3(SEQ ID NO：7)、R3(SEQ ID NO：8)，利用带有链霉亲和素修饰的Myone磁珠对其进行扩增并利用扩增得到的扩增产物进行核酸测序。

设计五个实验组，各实验组之间的区别在于进行EPCR反应的体系不同，对应的分别为体系P1、体系P2、体系P3、体系P4和体系P5。

一、各EPCR反应体系的构建

1.体系P1

1)模板序列结合于磁珠表面

将模板序列M1进行生物素修饰，然后与磁珠进行混合结合，得到表面固定有至少一个模板序列的磁珠，反应体系及反应过程为：

生物素化的模板序列M1    0.016ng(10⁸个分子)；

Myone磁珠(1μm，10mg/mL；Invitrogen)  6μL；

螺旋振荡混匀，反应30min，以适量TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA)清洗两次，离心分离，将得到的磁珠以6μL结合缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5；1mM EDTA；1M NaCl；0.01％Triton X-100)重悬保存。

2)引物结合于磁珠表面

将步骤1)得到的产物(结合有模板序列M1的磁珠悬浮液)与5’端带有生物素标记的引物(F3、R3)反应，使生物素化的F3、R3与模板序列M1同时结合在Myone磁珠表面，反应体系及过程如下：

生物素化的引物F3(100μM)  0.3μL；

生物素化的引物R3(100μM)  0.3μL；

步骤1)产物：磁珠悬浮液    6μL；

室温条件下(18～25℃)，螺旋振荡，孵育1h；

适量TE缓冲液清洗2次，离心，以6μL TE缓冲液重悬磁珠，得到磁珠悬浮液，4℃保存备用。

本体系中，用于与磁珠结合，并作为扩增模板的模板序列的摩尔数与磁珠的数量大致相同，因此，步骤2)所得的磁珠悬浮液中的一个磁珠表面只结合了极少量甚至是单个模板序列。

3)体系P1的制备

采用深圳华因康基因科技有限公司的KE001乳浊液制备试剂盒，根据使用说明制备乳浊液体系：

首先对油相制备试剂以螺旋剧烈振荡进行混匀，置于室温30min，得到用于制备乳浊液体系的油相体系；

利用步骤2)得到的磁珠悬浮液制备PCR Mix水相体系，以150μL为例，该水相体系如下：

ddH₂O  113μL；

10×PCR buffer(650mM Tris-HCl，pH8.0；160mM(NH₄)₂SO₄；10mMDTT；11mM MgCl₂)  15μL；

50mM MgSO₄  3μL；

10mM dNTP   3μL；

未生物素化的F3(10μM)  0.5μL；

未生物素化的R3(10μM)  0.5μL；

步骤2)得到的磁珠悬浮液  6μL；

5U/μL DNA Taq酶  9μL；

将上述成分混匀，制备成PCR Mix水相体系。

将制备好的油相体系与水相体系按照4∶1的比例放入EP管中混合，同时加入辅助混匀的钢珠，将EP管置于乳浊液制备仪上夹紧，按照15HZ，10s，再转换17HZ，8s进行振荡混匀，制备成用于单分子扩增的乳浊液体系P1。

2.体系P2

1)引物结合于磁珠表面

将Myone磁珠与5’端带有生物素标记的引物(F3、R3)反应，使生物素化的F3、R3结合在磁珠表面，反应体系及过程如下：

生物素化的引物F3(100μM)    0.3μL；

生物素化的引物R3(100μM)    0.3μL；

Myone磁珠           6μL；

室温条件下(18～25℃)，螺旋振荡，孵育1h；

适量TE缓冲液清洗2次，离心，以6μL TE缓冲液重悬磁珠，得到磁珠悬浮液，4℃保存备用。

2)体系P2的制备

采用深圳华因康基因科技有限公司的KE001乳浊液制备试剂盒，根据使用说明制备乳浊液体系：

首先对油相制备试剂以螺旋剧烈振荡进行混匀，置于室温30min，得到用于制备乳浊液体系的油相体系；

利用步骤1)得到的磁珠悬浮液制备PCR Mix水相体系，以150μL为例，该水相体系如下：

ddH₂O  111μL；

10×PCR buffer(650mM Tris-HCl，pH8.0；160mM(NH₄)₂SO₄；10mMDTT；11mM MgCl₂)    15μL；

50mM MgSO₄    3μL；

10mM dNTP     3μL；

未生物素化的M1模板序列  0.016ng(10⁸个分子)；

未生物素化的F3(10μM)    0.5μL；

未生物素化的R3(10μM)    0.5μL；

步骤1)得到的磁珠悬浮液   6μL；

5U/μL DNA Taq酶    9μL；

将上述成分混匀，制备成PCR Mix水相体系。

将制备好的油相体系与水相体系按照4∶1的比例放入EP管中混合，同时加入辅助混匀的钢珠，将EP管置于乳浊液制备仪上夹紧，按照15HZ，10s，再转换17HZ，8s进行振荡混匀，制备成用于单分子扩增的乳浊液体系P2。

3.体系P3

1)模板序列结合于磁珠表面

将模板序列M1进行生物素修饰，然后与磁珠进行混合结合，得到表面固定有至少一个模板序列的磁珠，反应体系及反应过程为：

生物素化的模板序列M1    0.016ng(10⁸个分子)；

Myone磁珠(1μm，10mg/mL；Invitrogen)  6μL；

螺旋振荡混匀，反应30min，以适量TE缓冲液清洗两次，离心分离，将得到的磁珠以结合缓冲液重悬保存。

2)引物结合于磁珠表面

将步骤1)得到的产物(结合有模板序列M1的磁珠悬浮液)与5’端带有生 物素标记的F3反应，使生物素化的F3与模板序列M1同时结合在Myone磁珠表面，反应体系及过程如下：

生物素化的引物F3(100μM)    0.6μL；

步骤1)产物：磁珠悬浮液      6μL；

室温条件下(18～25℃)，螺旋振荡，孵育1h；

适量TE缓冲液清洗2次，离心，以6μL TE缓冲液重悬磁珠，得到磁珠悬浮液，4℃保存备用。

本体系中，用于与磁珠结合，并作为扩增模板的模板序列的摩尔数与磁珠的数量大致相同，因此，步骤2)所得的磁珠悬浮液中的一个磁珠表面只结合了极少量甚至是单个模板序列。

3)体系P3的制备

采用深圳华因康基因科技有限公司的KE001乳浊液制备试剂盒，以步骤2)中得到的磁珠悬浮液，按照制备体系P1的相同操作，制备成用于单分子扩增的乳浊液体系P3。

4.体系P4

1)引物结合于磁珠表面

将Myone磁珠与5’端带有生物素标记的F3反应，使生物素化的F3结合在磁珠表面，反应体系及过程如下：

生物素化的引物F3(100μM)    0.6μL；

Myone磁珠                   6μL；

室温条件下(18～25℃)，螺旋振荡，孵育1h；

适量TE缓冲液清洗2次，离心，以61μL TE缓冲液重悬磁珠，得到磁珠悬浮液，4℃保存备用。

2)体系P4的制备

采用深圳华因康基因科技有限公司的KE001乳浊液制备试剂盒，以步骤1)中得到的磁珠悬浮液，按照制备体系P2的相同操作，制备成用于单分子扩增的乳浊液体系P4。

5.体系P5

1)模板序列结合于磁珠表面

将模板序列M1进行生物素修饰，然后与磁珠进行混合结合，得到表面固定有至少一个模板序列的磁珠，反应体系及反应过程为：

生物素化的模板序列M1       0.016ng(10⁸个分子)；

Myone磁珠(1μm，10mg/mL；Invitrogen)    6μL；

螺旋振荡混匀，反应30min，以适量TE缓冲液清洗两次，离心分离，将得到的磁珠以结合缓冲液重悬保存。

2)体系P5的制备

采用深圳华因康基因科技有限公司的KE001乳浊液制备试剂盒，根据使用说明制备乳浊液体系：

首先对油相制备试剂以螺旋剧烈振荡进行混匀，置于室温30min，得到用于制备乳浊液体系的油相体系；

利用步骤1)得到的磁珠悬浮液制备PCR Mix水相体系，以150μL为例，该水相体系如下：

ddH₂O    113.4μL；

10×PCR buffer(650mM Tris-HCl，pH8.0；160mM(NH₄)₂SO₄；10mMDTT；11mM MgCl₂)     15μL；

50mM MgSO₄    3μL；

10mM dNTP    3μL；

未生物素化的F3(100μM)  0.3μL；

未生物素化的R3(100μM)  0.3μL；

步骤1)得到的磁珠悬浮液  6μL；

5U/μL DNA Taq酶        9μL；

将上述成分混匀，制备成PCR Mix水相体系。

将制备好的油相体系与水相体系按照4∶1的比例放入EP管中混合，同时加入辅助混匀的钢珠，将EP管置于乳浊液制备仪上夹紧，按照15HZ，10s，再转换17HZ，8s进行振荡混匀，制备成用于单分子扩增的乳浊液体系P5。

二、EPCR扩增

采用EPCR单分子扩增技术对上述建立的乳浊液体系(P1、P2、P3、P4、P5)分别进行扩增。其中，各体系进行EPCR的反应流程和方法，以及EPCR扩增反应结束后的破乳释放均如之前实施例的步骤三中所述，在此不再赘述。

为比较磁珠在扩增反应中的利用效率，分别将各反应体系中破乳释放并经过清洗的磁珠悬浮液平均分为两部分，保留其中的一半，对其中的一半进行富集回收操作，以大体积的塑料珠(40～50μm)作为富集微珠对扩增产物进行富集，得到富集产物。其中，富集微珠上固定有捕获探针(SEQ ID NO：9)。富集之前，利用富集微珠与类似之前步骤2中表面只固定了少量乃至只有一个模板序列的磁珠混合，发现只有很少数磁珠被富集出来，因此在富集过程中，可认为表面没有结合扩增产物而只有原来固定的模板序列的磁珠对扩增产物的富集结果影响不大，在可接受的误差范围之内。

富集结束后，利用Thermo Scientific的Nanodrop DR1000对各反应体系的富集产物以及相当于各体系富集时的相同量Myone磁珠原液进行吸光度测量。首先将Myone磁珠原液进行梯度稀释后检测，测得一条磁珠浓度与260nm处吸 光度OD₂₆₀的关联标准直线图。然后再对各反应体系中的富集产物进行OD₂₆₀测量，分别得到OD₂₆₀1、OD₂₆₀2、OD₂₆₀3、OD₂₆₀4和OD₂₆₀5，将测得的数据与标准直线进行比对，得到各体系经过富集后得到的磁珠相对数量，进而可以得到各体系中富集产物与磁珠原液的浓度比值。

本实施例中，得到的数据表明，体系P1中富集产物与磁珠原液的比值为48.6％，体系P2中为15.2％，体系P3中为45.6％，体系P4中为13.4％，P5体系中为0.4％。由上述数据可以得知，利用本发明所记载技术方案进行单分子扩增时的磁珠利用率，较之磁珠表面只固定有引物的技术方案进行单分子扩增时提高了2倍多，而P5体系中的结果可以进一步认定在富集过程中只固定有模板序列而没有结合增加的扩增产物的磁珠对扩增产物的富集结果影响不大。由此可知本发明所记载的技术方案可以大大提高磁珠在扩增过程中的利用效率，减少扩增过程中的磁珠损耗，降低成本。

对于保留的另一半磁珠悬浮液中的扩增产物，利用上一实施例步骤四中的测序步骤和方法，根据华因康基因科技有限公司的Pstar-II测序平台对磁珠悬浮液进行连接测序法测序，以相同的检测和采图条件，20×物镜，曝光时间2s，对上述体系的测序反应进行采图，其中，图6A是针对体系P1的测序反应进行采图后得到的荧光信号图中的一幅具有代表性的图，图6B、图6C、图6D和图6E分别是体系P2、体系P3、体系P4和体系P5经测序反应采图后得到的代表性荧光信号图。从得到的荧光信号图也可以直观的看出，图6A、图6C中的荧光信号较之图6B、图6D中的荧光信号更密集，且荧光信号强度更为均一。由此也可以直观的看出，利用本发明所记载技术进行扩增和测序时可以提高磁珠在扩增时的利用效率，增强测序的检测信号，降低对检测仪器的要求。

根据得到的荧光信号图，以深圳华因康基因科技有限公司的IPB处理软件进行处理，利用生物信息学分析的手段对测序的结果进行分析，分析结果如下表1所示(其中不再对体系5进行数据分析)：

表1.测序分析结果

项目	全部读长数	序列读出数	正确读长数	序列读出率	读出正确率
						体系P1	1483248	1264321	1240046	85.24％	98.08％
体系P2	1122543	808430	741755	72.02％	91.75％
						体系P3	1395646	1167039	1137280	83.62％	97.45％
体系P4	1106845	792944	724354	71.64％	91.35％

由上表中数据可以得知，在同等的检测及采图条件下，使用本发明所述技术方案进行扩增和测序的体系P1、P3，其全部读长数、序列读出数皆高于只使用引物固定于固相载体表面技术的体系P2、P4，这与前面得到的富集结果也相符合。根据表中数据也可以知道，与体系P2、P4两者相比，体系P1、 P3的序列读出率和读出正确率也高。 

从上述实验数据和结果分析可以得知，使用本发明所述的技术方案进行扩增和测序，可以增加固相载体表面结合扩增产物的数量，提高固相载体的利用效率，降低成本；测序时可以提高测序的检测信号，降低对检测仪器的要求，在同等检测条件下能提高测序的准确性。

应当说明的是，本发明典型的应用但不限于基于固相载体进行扩增及进行核酸测序，任何其他类似的应用均应包含在本发明的保护范围之内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种基于固相载体进行扩增的方法，所述固相载体的表面固定有至少一个模板序列，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；

B.对扩增载体上的模板序列进行单分子扩增，得到扩增产物；

所述单分子扩增为乳液PCR扩增或桥式PCR扩增；

所述引物结合于固相载体表面的方式为：

引物与固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现直接结合；

或通过连接子携带的基团分别与引物和固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现间接结合；

在步骤A之前还包括步骤：

A0.将模板序列通过基团配对方式结合于固相载体表面，得到固定有至少一个模板序列的固相载体。

2.根据权利要求1所述的基于固相载体进行扩增的方法，其特征在于，步骤A所述引物包括用于对所述模板序列进行扩增的上游引物和/或下游引物，所述上游引物是与模板序列5’端互补结合的核酸序列，所述下游引物是与模板序列3’端序列相同的核酸序列。

3.根据权利要求1所述的基于固相载体进行扩增的方法，其特征在于，所述连接子为烷烃、单链核苷酸分子或包含多聚物部分的化合物。

4.根据权利要求1所述的基于固相载体进行扩增的方法，其特征在于，所述配对连接的方式采用生物素-亲和素/链霉亲和素、纳米金/碘乙酰-巯基、氨基-醛基/羧基/异硫氰基、丙烯酰胺-硅烷基/聚丙烯酰胺中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的基于固相载体进行扩增的方法，其特征在于，所述固相载体的材质采用玻璃、硅胶、陶瓷、塑料和金属中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的基于固相载体进行扩增的方法，其特征在于，所述步骤B进行扩增时，除加入必须的扩增试剂外，还加入少量游离态的引物。

7.根据权利要求6所述的基于固相载体进行扩增的方法，其特征在于：

所述引物及模板序列与固相载体采用不同的基团配对进行结合，所述固相载体表面或连接子带有至少两种基团。

8.根据权利要求1所述的基于固相载体进行扩增的方法，其特征在于，步骤B之后还包括步骤：

B’.对扩增产物进行纯化回收。

9.一种基于固相载体进行非疾病诊断目的的核酸测序的方法，所述固相载体固定有至少一个模板序列，其特征在于，所述核酸测序的方法包括以下步骤：

A.将引物结合于固相载体表面上的引物结合位点，得到固定有引物的扩增载体；

B.对扩增载体上的模板序列进行单分子扩增，得到扩增产物；

C.根据碱基互补原则对扩增产物进行核酸测序，得核酸序列信息；

所述单分子扩增为乳液PCR扩增或桥式PCR扩增；

所述引物结合于固相载体表面的方式为：

引物与固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现直接结合；

或通过连接子携带的基团分别与引物和固相载体表面携带的基团进行配对连接，实现间接结合；

在步骤A之前还包括步骤：

A0.将模板序列通过基团配对方式结合于固相载体表面，得到固定有至少一个模板序列的固相载体。

10.根据权利要求9所述的基于固相载体进行非疾病诊断目的的核酸测序的方法，其特征在于，步骤A中所述引物包括肿瘤类易感基因引物、心血管疾病类易感基因引物、营养指导基因引物和单基因疾病检测引物中的任一种。

11.根据权利要求9所述的基于固相载体进行非疾病诊断目的的核酸测序的方法，其特征在于，所述步骤C包括以下步骤：

C1.将扩增产物变性形成单链，得固定于固相载体的单链核酸片段；

C2.根据碱基互补原则对单链核酸片段进行核酸测序，得核酸序列信息。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的基于固相载体进行非疾病诊断目的的核酸测序的方法，其特征在于，所述核酸测序的方法是大规模循环平行测序的方法。

13.根据权利要求12所述的基于固相载体进行非疾病诊断目的的核酸测序的方法，其特征在于，所述大规模循环平行测序的方法为基于聚合酶合成为基础的合成测序法，或者是基于络合连接为基础的连接测序法。