CN104928349B

CN104928349B - 一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法

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Publication number: CN104928349B
Application number: CN201510289305.3A
Authority: CN
Inventors: 赵永席; 陈锋; 赵越
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2018-01-05
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: CN104928349A

Abstract

本发明公开了一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，属于SNP检测技术领域。包括以下步骤：1)测定待测基因组的单核苷酸多态性SNP；2)为每个待测基因组的SNP中所有的等位基因设计互补的特异性引物；3)设计正向通用引物：设计不与特异性引物发生互补且能够避免自身的回文结构或茎环结构；4)以步骤2)和步骤3)所设计的引物，添加模板、纳米金胶液、蛋白质、缓冲液及各种所需的酶，混合均匀后进行实时等温扩增，得到高准确度单核苷酸多态性SNP位点信息。该方法能够实现简单、快速、高准确率的SNP检测，从而有效解决现有扩增技术中3’端碱基错配延生而造成的准确率不高、检测成本高的问题。

Description

一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法

技术领域

本发明属于SNP检测技术领域，涉及一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法。

背景技术

单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指基因组序列上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。SNP通常只有两个等位基因，三个或者四个出现的频率极低。SNP在人类基因组中分布广泛，大约每500～1000个碱基对就有一个SNP位点，总数量超过300万个。人群基因组序列不到1％的变异在很大程度上决定了个体之间的差异。而SNP占人类所有变异的90％以上，有极大的生物医学研究价值。SNP研究有助于我们寻找新的遗传病的致病基因或易感基因，认识人种、人群、个体间的遗传差异，以及疾病和药物反应与个体差异的关系。因此，SNP作为遗传标记具有高多态性、遗传稳定、基因组分布广、信息量大等诸多优点。

目前，检测SNP的金标准是测序，包括常规测序、焦磷酸测序等。测序的方法需要样本基因组提取，PCR扩增，纯化，测序等步骤。测序的方法虽然是金标准，而且能检测已知SNP和未知SNP，但是其步骤多、成本高、周期长、价格贵。

除了测序这种方法，等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,ASPCR)也是一种经典的区别等位基因的方法。此方法利用缺少3’-5’外切活性的taq DNA聚合酶和特殊设计的引物对(等位基因的正向通用引物和反相特异性引物)来区分SNP。以检测二等位基因为例，扩增反应前，分别向两个PCR反应体系中加入一对特异性引物和通用引物，当特异性引物的3’端碱基与等位基因互补时，扩增反应进行；当引物3’端碱基与该位点错配时，扩增停止或者效率降低。通过检测PCR产物的有无和量来检测等位基因。

如今，等温扩增已成为非常有潜力的PCR的替代方法。等温扩增例如依赖解旋酶DNA等温扩增技术(Helicase-dependent Amplification,HDA)能够快速、有效地在恒定温度下实现信号放大，不需要精确的热循环过程。相比于传统PCR，等温扩增技术快速、简便、易实现微型化，而且其检测灵敏度可与PCR相媲美，展示了该技术在生物学研究和诊断的巨大潜力。

依赖解旋酶DNA等温扩增技术模拟生物体内DNA复制过程，利用解旋酶在恒温条件下解开DNA双链，与此同时DNA单链结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SSB)结合在刚形成的单链上，稳定单链，这时引物与单链模板结合，在Bst 2.0DNA聚合酶的帮助下延伸。新合成的双链又在解旋酶和单链结合蛋白的作用下形成单链，进入上述的循环扩增，最终实现目的序列指数式扩增。

到目前为止，还未见将HDA用于基因组SNP检测的报道。HDA能否用于基因组SNP检测还不得而知。

基于等温扩增的以上优点，使用该技术来检测基因组SNP也许是一个很好的选择，但是在使用几种典型的DNA聚合酶(Bst 2.0DNA polymerase，Klenow Fragment exo－和Vent exo－DNA polymerase)来系统地评价所有12种3’端单碱基错配的等温扩增效率后，我们发现碱基错配扩增这种现象，且该现象的扩增效率不仅与错配类型和位置有关，还与DNA聚合酶的种类有关。除了几种错配类型(引物－模板：C－C，A－G，G－A和A－A)，其他类型的碱基错配大部分能够有效地延伸并引发类似于沃森－克里克配对(Watson－Crickpairs)的扩增信号。这个现象给使用等温扩增技术准确检测SNP带来了困难。2007年，Hayashizaki等人通过使用一种能与错配碱基特异性结合的蛋白和合理设计的非对称引物来抑制碱基错配引发的延伸，使等温扩增技术能准确地检测人类基因组SNP，但是此方法不仅过程复杂，且需要特殊的特异性错配结合蛋白，该蛋白价格昂贵，且不稳定，易失活，提高了检测成本。因此，一种新颖、简单、便宜的可抑制碱基错配技术来作为一个替代方法是迫切需要的。

2007年，李海阔等在PCR体系中加入纳米金(gold nano-particle,AuNP)，扩增特异性得到显著提高。纳米金具有独特的物理和化学性质，已被广泛的用于生物检测中。另外，纳米金对双链DNA和单链DNA展示了完全不同的亲和力：纳米金对单链DNA(引物)有很强的吸附能力，而对双链DNA(引物－模板杂交复合体)的吸附能力很弱。因此，在扩增体系中加入纳米金后，纳米金吸附引物分子，随着反应的进行，引物分子又能够释放到溶液中，使溶液中的游离的引物浓度长时间保持在一个相对低的值。这样就减少了引物非特异性结合模板或者引物二聚体的形成导致的非特异性扩增。

2011年，樊春海等在ASPCR体系中加入AuNP，有效地提高了单倍型分析的特异性，单倍体PCR产物可直接用于SNP基因分型。

目前为止，还未有在等温扩增体系中使用AuNP来提高扩增特异性的报道，AuNP是否能在等温体系中发挥类似于在PCR这样的变温体系中的作用还不得而知。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，该方法能够实现简单、快速、廉价、高准确率的SNP检测，从而有效解决现有扩增技术中3’端碱基错配延伸而造成的准确率不高或者检测成本高的问题。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，包括以下步骤：

1)测定待测基因组的单核苷酸多态性SNP；

2)为每个待测基因组的SNP中所有的等位基因设计互补的特异性引物；

3)设计正向通用引物：设计不与特异性引物发生互补且能够避免自身的回文结构或茎环结构；

4)以步骤2)和步骤3)所设计的引物，添加模板、纳米金胶液、蛋白质、缓冲液及各种所需的酶，混合均匀后进行实时等温扩增，得到高准确度单核苷酸多态性位点信息。

所述的纳米金胶液选用粒径为5nm的胶液。

实时等温扩增是在65℃下反应60min。

所述的特异性引物指3’末端的第一个碱基与目的DNA片段5’端的等位基因互补而与另一个等位基因不互补，同时其他碱基与目的DNA片段完全互补的一条单链寡核苷酸。

所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

步骤3)所述的正向通用引物的Tm值与特异性引物的Tm值接近。

所述的正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

所述待测基因组为多倍体基因组。

所述待测基因组为两倍体基因组。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明创新地用HDA这种等温扩增的方法来实现高准确度SNP检测，相比于要求精确控制温度的PCR而言，不需要精密的温度控制设备，所需条件简单，能耗低。

2、本发明相比于传统方法，通过在等温体系中加入纳米金粒子，利用纳米金对双链DNA和单链DNA的吸附能力的不同来达到高准确度检测SNP目的。扩增体系中的纳米金特异性地吸附单链引物分子，使引物分子浓度保持在一个相对低的范围内，达到减少引物的非特异性结合于模板或者形成引物二聚体的目的，从而抑制3’端碱基错配延伸，实现高准确度的SNP检测。

3、本发明相比于Hayashizaki等人的向反应体系中加入价格昂贵且易失活的蛋白来实现准确检测SNP的方法，仅需向等温扩增体系中加入常用易得而且稳定的纳米金胶液即可抑制对3’端碱基错配延伸，避免假阳性结果出现，易实现，成本低。

4、本发明可获得和SNP检测金标准测序一致的结果，准确度高，此方法非常适合应用于微型化、便携式检测。

附图说明

图1为本发明的方法流程示意图；

图2为CYP2C19两个等位基因野生型和突变形序列比(wild-type,Wt；mutant-type,Mt)，碱基放大位点为SNP位点，及正向通用引物(FP)、反向特异性引物(RP-W for Wt和RP-M for Mt)所在的位置和序列；

图3纳米金改善的HDA对人类全血样本提取物SNP的检测的影响结果；

其中，a，b分别为野生型纯合子在没有加入或加入纳米金的HDA中检测；c，d分别为野生型/突变型杂合子在没有加入或加入纳米金的HDA中检测。图a,b,c,d中的插图为电泳插图，从左到右依次为DNA分子梯度(Marker)、野生型互补的反向特异性引物和与突变型互补的反向特异性引物；

图4-1为对基因型野生型纯合子(合成链)在没有加入纳米金的HDA的扩增产物的溶解曲线(温度与原始荧光强度的关系)；

图4-2为对基因型野生型纯合子(合成链)在没有加入纳米金的HDA的扩增产物的溶解曲线分析(温度与负的荧光信号改变速率的关系)；

图5-1为对基因型为野生型纯合子(合成链)在加入纳米金的HDA的扩增产物的溶解曲线(温度与原始荧光强度的关系)；

图5-2为对基因型为野生型纯合子(合成链)在加入纳米金的HDA的扩增产物的溶解曲线分析(温度与负的荧光信号改变速率的关系)；

图6-1为对基因型为野生型/突变型杂合子(合成链)在没有加入纳米金的HDA的扩增产物的溶解曲线(温度与原始荧光强度的关系)；

图6-2为对基因型为野生型/突变型杂合子(合成链)在没有加入纳米金的HDA的扩增产物的溶解曲线分析(温度与负的荧光信号改变速率的关系)；

图7-1为对基因型为野生型/突变型杂合子(合成链)在加入纳米金的HDA扩增产物的溶解曲线(温度与原始荧光强度的关系)；

图7-2为对基因型为野生型/突变型杂合子(合成链)在加入纳米金的HDA扩增产物的溶解曲线分析(温度与负的荧光信号改变速率的关系)；

图8-1野生型纯合子(Wt/Wt)实际样本的测序结果；

图8-2野生型/突变型杂合子(Wt/Mt)实际样本的测序结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明涉及一种纳米金改善的HDA区分SNP的方法，以待测样本基因组DNA为模版，用等位基因特异性引物和通用引物，通过纳米金改善的实时HDA反应，实现等位基因的特异性扩增和实时检测。

所述待测样本的基因组是：两倍体基因组。

所述的特异性引物是指：反向特异性引物，如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，是指3’末端的第一个碱基与目的DNA片段5’端的等位基因互补而与另一个等位基因不互补，其他碱基与目的DNA片段完全互补的一条单链寡核苷酸。

所述的通用引物是指：正向通用引物，如SEQ ID No.1所示，其Tm值与特异性引物的Tm值接近，且不与特异性引物发生互补，且避免自身的回文结构或者茎环结构。

所述的纳米金改善的HDA是指：在普通的HDA体系中加入适量浓度的纳米金粒子的胶液。

本发明的方法流程示意图参见图1，具体步骤包括：

1)测定待测基因组的SNP；

2)设计特异性反向引物：为每个待测SNP的所有等位基因设计互补的特异性引物，使特异性引物3’末端的第一个碱基与其中一个等位基因5’端互补而与另外的等位基因不互补。

3)设计正向通用引物：根据实际情况设计，但不与特异性引物发生互补，且避免自身的回文结构或者茎环结构；

4)将2和3设计的引物、模板、纳米金胶液和其他所需要的酶，蛋白，缓冲液混合，进行实时等温扩增，在对扩增产物进行检测，如电泳，分子信标，或者实时荧光等温扩增通过实时荧光曲线，得到SNP位点信息。

所述的纳米金是指：粒径在5nm的胶液。

所述的电泳为3.5％的琼脂糖凝胶电泳。

所述的HDA反应条件为：65℃，60分钟。

实施例1

以人群的CYP2C19基因上的多态位点G681A为例，这个基因与外源性物质的代谢有关，其等位基因分别为CYP2C19和CYP2C19＊2，SNP位点由G(野生型)变为A(突变型)。参见图2，CYP2C19两个等位基因野生型和突变形序列比(wild-type,Wt；mutant-type,Mt)，碱基放大位点为SNP位点，及正向通用引物(FP)、反向特异性引物(RP-W for Wt和RP-M for Mt)所在的位置和序列。

本发明用纳米金改善的等温扩增技术HDA来检测SNP，包括以下步骤：

1)基因组提取

采自志愿者全血样本。使用TIANamp Genomic DNAkit提取。

2)对上述基因组进行等温扩增

设计特异性反向引物：为每个待测SNP的所有等位基因设计互补的特异性引物，使特异性引物3’末端的第一个碱基与待测基因5’端其中一个等位基因5’端互补而与另外的等位基因不互补。设计正向通用引物：根据实际情况设计，但不与特异性引物发生互补，且避免自身的回文结构或者茎环结构；

150ng基因组DNA与一对引物(特异性引物和通用引物)混合，然后变性(95℃，5分钟)、退火(60℃，10分钟)。然后加入25μL反应混合物包括0.75μL酶混合物，1.7μLdNTP，2.5μL10x退火缓冲液II，1μL100mM MgSO₄,2μL 500mM NaCl,1μL 5xSYBR Green I,1μL 5μM正向引物和1μL 5μM特异性反向引物。对于纳米金改善的等温扩增，要加入3μL 90nM纳米金胶液。整个反应在LightCycler 96中进行，温度65℃，时间60分钟。

3)根据实时荧光曲线扩增结果得出SNP类型

实时荧光曲线和扩增产物电泳图如图3中a-d所示，等温扩增产物溶解曲线如图(4-1、4-2、5-1、5-2、6-1、6-2、7-1及7-2)所示。该组图证明了在没有纳米金的HDA扩增体系中会有错配延伸，在图3a中，随着时间变化，在只有野生型纯合子(Mt/Mt)存在的体系中，加入不同引物(RP-W和RP-M)后荧光强度都升高，说明RP-M和Mt/Mt发生了错配延伸；附图4-1和4-2的扩增产物溶解曲线和溶解曲线分析也证明了扩增现象的发生。在纳米金改善的HDA扩增体系中错配延伸被消除，在图3b中，随着时间变化，在只有野生型纯合子(Mt/Mt)存在的体系中，加入不同引物(RP-W和RP-M)后，荧光只在加入RP-W后升高，说明完全互补的引物－模板(RP-W和Mt)得到延伸，而错配的引物－模板被抑制，在足够长的检测时间内没有荧光加强，说明3’末端错配得到抑制；附图5-1和5-2的扩增产物溶解曲线和溶解曲线分析也证明了完全互补扩增现象的发生和错配扩增受到抑制。在有纳米金存在的HDA扩增体系中，正常的延伸也不会被抑制，如附图3c、3d所示，无论是否加入纳米金，体系都能正常的进行扩增反应，附图6-1、6-2、7-1、7-2对扩增产物的分析也证实了加入纳米金之后反应体系不受影响。

样本中野生型纯合子和杂合子的测序结果和本方法得出的结论一致，如附图8-1和8-2所示，虚线表示SNP突变位点所在位置，图8-1的虚线框只有一个峰都是G，表示野生型纯合子，图8-2中的虚线框有两个重合的峰分别出现A和G，用R标注，表示突变型/野生型杂合子。测序结果和本发明所测结果一致，说明本发明具有高准确度，能够简单、有效地区分SNP。

综上所述，本发明在HDA体系中创新地加入纳米金，有效地提高特异性引物的特异性，来实现简单、快速、高准确率的SNP检测，以解决现有扩增技术3’端碱基错配延伸造成的准确率不高、成本高的问题；得到的扩增产物可直接用于SNP检测，如分子信标，电泳，或者实时荧光等温扩增通过实时荧光曲线直接得出SNP检测结果。

Claims

1.一种非疾病治疗诊断目的的基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)测定待测基因组的单核苷酸多态性SNP；

2)为每个待测基因组的SNP中所有的等位基因设计互补的特异性引物；所述的特异性引物指3’末端的第一个碱基与目的DNA片段5’端的等位基因互补而与另一个等位基因不互补，同时其他碱基与目的DNA片段完全互补的一条单链寡核苷酸；

所述的正向通用引物的Tm值与特异性引物的Tm值接近；

4)以步骤2)和步骤3)所设计的引物，添加模板、纳米金胶液、蛋白质、缓冲液及各种所需的酶，混合均匀后进行实时等温扩增，在65℃下反应60min，得到高准确度单核苷酸多态性位点信息。

2.根据权利要求1所述的一种非疾病治疗诊断目的的基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，所述的纳米金胶液选用粒径为5nm的胶液。

3.根据权利要求1所述的一种非疾病治疗诊断目的的基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。

4.根据权利要求1所述的一种非疾病治疗诊断目的的基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，所述的正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求1所述的一种非疾病治疗诊断目的的基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，所述待测基因组为多倍体基因组。

6.根据权利要求5所述的一种非疾病治疗诊断目的的基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，所述待测基因组为两倍体基因组。