CN102787160A

CN102787160A - 一种高通量检测基因多态性的方法

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Publication number: CN102787160A
Application number: CN2011101264732A
Authority: CN
Inventors: 邵祥强; 肖华胜; 刘世旭; 林剑
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2011-05-17
Filing date: 2011-05-17
Publication date: 2012-11-21

Abstract

本发明涉及一种高通量检测基因多态性的方法。本发明以生物芯片技术为平台，并结合单碱基引物延伸法，开发了用于基因多态性检测的新方法，该方法可实现高通量、简便、快速检测，为基因的多态性检测提供了新的途径。

Description

一种高通量检测基因多态性的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种高通量检测基因多态性的方法。

背景技术

人类基因组计划(Human Genome Project，HGP)的完成推动了人类生物医学研究及遗传学进步，带动了基因组学和蛋白质组学等诸多分子生物领域的迅猛发展，并为生物技术，生物医学的研究与发展作出了杰出贡献。在人类基因组中发现了大量遗传变异，其中单核苷酸多态性(SNP)作为第三代遗传标记，在所有已知基因多态性中占90％以上，在疾病基因组学，药物基因组学和群体进化等理论研究中具有重大意义，可直接影响个体间对疾病易感性，药物代谢差异以及药物不良反应。遗传多态性在药物代谢方面或是药物效应方面的相关蛋白中非常普遍。

目前，SNP的检测方法主要有以下几种：(1)直接测序技术：对于一些比较小、外显子相对较少的基因的SNP检测可直接测序。其检测效率可以达到100％，其主要流程是：PCR扩增目的片段→纯化、回收→4种荧光标记(ddNTP)测序反应→过柱去除多余的荧光和引物→测序仪上电泳→用测序软件分析。(2)限制性片段长度多态性(RFLP)检测：限制性内切酶是一类识别DNA特异位点(通常4～6bp)，并在特异位点进行切割的酶类。酶切位点的特异性意味着对特定DNA等位基因的完全消化会产生同样的片段序列。而碱基的替换或插入、缺失可以产生或消除一个特定酶切位点，从而改变酶切割后产生片段的大小和数目。这些酶切片段带型的不同称为限制性片段长度多态性。如果SNP产生和消除了某个限制性内切酶位点，则可以通过对PCR产物进行酶切、电泳加以检测。用RFLP检测SNP位点具有一定准确性，方法简便、快速，可以进行大量样本的分析。但实际中大约一半的SNP位点并不改变限制性酶切位点。(3)质谱分析技术：质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间的荷质比(m/e)的差异来分离并确定分子量。目前用于SNP检测的质谱法主要是基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法(MALDI-TOF)。利用质谱分析一个样品只需几秒钟，一天可以分析数千个样品，具有快速、准确、自动化程度高等特点，但主要的问题是需对分析样品进行纯化后才能检测，纯化的要求非常高，且质谱仪器价格昂贵。

因此，研究和开发检测目的基因多态性的快速、准确、高通量的方法是非常重要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量检测基因多态性的方法。

在本发明的第一方面，提供一种检测基因多态性的方法(优选为体外非诊断性地)，所述方法包括：

(1)以待测基因中包括基因多态性位点的序列作为模板，进行单碱基延伸反应，单碱基延伸反应的引物的结构如下：

X-Y-Z；

其中，X表示Zip1碱基序列；Y表示与待测基因中基因多态性位点邻近序列互补的碱基序列；Z表示与待测基因中基因多态性位点处碱基互补的碱基；从而通过单碱基延伸反应在Z后面加上携带可检测标记物的碱基；

(2)将(1)的产物与芯片进行杂交；其中所述的芯片上固定有Zip2碱基序列；该Zip2碱基序列与Zip1碱基序列相互补，且不与待测基因互补；从而所述的PCR产物中各序列被固定到芯片上；

(3)读取芯片结果，存在可检测标记物则表明该多态性位点处存在与Z互补的碱基。

在另一优选例中，X的长度是5-50bp；较佳地是10-40bp；更佳地是15-30bp。

在另一优选例中，Y的长度是10-50bp；较佳地是10-40bp；更佳地是15-30bp。

在另一优选例中，检测的是待测基因DNA链上的正义链或反义链。

在另一优选例中，步骤(1)中，根据待测基因中多态性位点的数目，同时设计多条单碱基延伸反应的引物，每一引物的Zip1序列均是不同的；从而在芯片上一次判读多个多态性位点的结果。

在另一优选例中，所述的可检测标记物是荧光标记物。

在另一优选例中，所述的荧光标记物选自：Cy3、Cy5。

在另一优选例中，所述的待测基因中包括基因多态性位点的序列通过PCR的方法扩增获得。

在另一优选例中，所述的待测基因是细胞色素P450基因。

在另一优选例中，所述的单碱基延伸反应的引物选自：SEQ ID NO：47-SEQ IDNO：100任意一条或多条。

在另一优选例中，所述的单碱基延伸反应的引物包括：SEQ ID NO：47-SEQ IDNO：100的引物。

在本发明的另一方面，提供一种用于检测细胞色素P450基因的多态性的引物，所述的引物的结构如下：

X-Y-Z；

其中，X表示Zip1碱基序列，其序列选自SEQ ID NO：47-SEQ ID NO：100所示的第1-20位序列；

Y表示与待测基因中基因多态性位点邻近序列互补的碱基序列；Z表示与待测基因中基因多态性位点处碱基互补的碱基；Y-Z的序列选自SEQ ID NO：47-SEQ IDNO：100所示的第21位-3’末端序列。

在本发明的另一方面，提供一种检测细胞色素P450基因的多态性的试剂盒，包含所述的引物。

在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：芯片，所述的芯片上固定有Zip2碱基序列，该Zip2碱基序列与Zip1碱基序列相互补，且不与细胞色素P450基因互补。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括选自下组的一对或多对引物：SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ IDNO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38；SEQ IDNO：39和SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：PCR扩增试剂(如DNA聚合酶，PCR缓冲液等)或芯片杂交试剂(如杂交液，洗涤液等)。

在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括：使用说明书。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明的方法的检测原理示意图。

图2、本发明的方法的实验流程示意图。

图3、单位点PCR扩增的电泳结果。其中Marker大小为100bp Ladder，泳道1-23分别为：2D6E1、2D6E2、2D6E3、2D6E4、2D6E6、2D6P1、3A5E4、2C9E7、2C19E4、2C19E1、2C19E5、2D6-2459、2C8-416、3A4-830、3A4-878、3A4-1399、2B6-516、2B6-785、2B6-1459、2C8-475、3A4-352、3A4-653、2C8-1196的引物的PCR扩增电泳结果。

图4、多重PCR结果电泳图。

图5、芯片杂交结果。

图6、部分SNP位点的测序结果。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，以生物芯片技术为平台，并结合单碱基引物延伸(SBE)法，开发了用于基因多态性检测的新方法，该方法可实现高通量、简便、快速检测，为基因的多态性检测提供了新的途径。

如本文所用，所述的“待测基因”没有特别的限制，包括任何的需要判定其碱基的多态性的基因。该“待测基因”并不限于疾病相关基因。所述的“待测基因”的来源没有特别的限制，例如可以是从血液、组织、细胞培养、口腔粘膜、全基因组扩增、石蜡包埋等样本中提取的核酸。

如本文所用，所述的“可检测标记物”可以是任何可通过物理、化学等手段被检测出的信号分子，如荧光信号。优选的可检测信号是荧光信号，从而可通过生物芯片的扫描仪器来读取结果。

如本文所用，所述的“芯片”是本领域人员均了解的，其通常包括一固相载体(或称为基片)，在该固相载体上点样有特定序列的核酸(探针)，用于捕获与其在序列上互补的核酸。所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基、异硫晴酸基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

检测方法

本发明人将DNA芯片与单碱基引物延伸(SBE)法相结合，研制了用于基因多态性检测的新方法。

SBE法是基于双脱氧测序技术的SNP检测方法。首先，针对每个SNP位点设计特定的引物，每条引物由3部分“X-Y-Z”组成，其中X为与目的基因无同源性的碱基序列(Zip1)，Y是与SNP检测位点上游互补的一段序列，Z则是与SNP位点互补的碱基。从基因组中获取含有目的SNP位点的片段后，用前述设计的与SNP位点特异互补的引物进行SBE反应，同时利用携带可检测标记物的双脱氧碱基在Z之后进行标记；若是目的基因中SNP位点与Z不互补，则无法进行标记。将SBE反应后的样本，与DNA芯片上的互补探针杂交，扫描检测芯片上各个“点”上的标记信号并进行分析计算，即可完成SNP的分型。

本发明的检测原理还可参见图1，首先通过获取目的基因，利用SBE引物以及携带可检测标记物的双脱氧碱基进行SBE反应，最后将标记好的样本与芯片上相应的探针杂交。经过杂交和洗脱过程之后，通过芯片扫描获取探针的荧光信号值，判断SNP位点的变异类型，得出目的基因(待测基因)的基因型。SNP检测芯片的实验技术包括目的基因的扩增、样本标记、芯片点制、芯片杂交、芯片数据分析。

基因芯片的制备可采用生物芯片的常规制造方法。例如可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样本浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最适条件。

读取芯片结果时，根据可检测的标记物在基因芯片上的位置、强度等信息来判定。若扩增产物用荧光基团标记，可直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scanarray3000等)获取待测信息。

作为本发明的一种优选的方法，根据待测基因中多态性位点的数目，同时设计多条单碱基延伸反应的引物，从而在芯片上一次判读多个多态性位点的结果。该方法的一种优选的实验流程图见图2，利用多重PCR技术扩增基因组DNA中的目的基因片段(覆盖需检测的多个SNP位点)，通过基于单碱基延伸的芯片杂交技术判断目的基因的SNP变异类型。利用单碱基延伸反应在SNP对应位点下游引入一个标记的双脱氧单核苷酸，对带有相应SNP位点的目的基因进行特异性标记。之后通过基因芯片(芯片由与检测探针5’端互补的核酸序列点制而成)杂交后扫描获取图像，并根据数据分析判断该SNP位点等位基因的类型。

本发明的方法适用于检测任何的待测基因，只要其需要判定其中包含的SNP位点。作为本发明的一个实施例，本发明的方法被用于检测检测细胞色素P450基因(CYP450)的多态性。

在实施例中，本发明人通过设计特异性引物和探针，以及多重PCR、单碱基延伸标记，建立了用于CYP450基因变异检测的SNP芯片检测平台。通过对临床检测样本的检测结果进行直接测序验证，最终证明，芯片判定结果及测序结果完全一致，说明了本发明的检测方法是准确可靠的。同时，经验证，本发明的方法的可重复率为98％，DNA样本的灵敏度为1ng。

检测CYP450基因的试剂和试剂盒

CYP450是一类重要的药物代谢酶，研究表明其编码基因CYP450的多态性可导致不同的临床治疗结果，在实施治疗前可被用于个体治疗的预测。因此，许多与CYP450酶活性和CYP450基因表达相关的等位基因已经被鉴定，CYP450基因多态性的检测也成为药物遗传学的一个重要方面。CYP450基因的遗传信息的个体化诊断可为日后复杂疾病的分析提供判断依据。

本发明人根据CYP450基因的多态性特点，设计了特定的SBE引物，利用这些引物，可分别或同时检测CYP450基因上多个SNP位点的多态性。因此，作为本发明的优选方式，所述的SBE反应的引物选自：SEQ ID NO：47-SEQ ID NO：100任意一条或多条。经验证，这些引物的扩增效果良好，准确性高。

由于CYP450基因存在较多的多态性位点，因此当需要同时检测多个位点或全部位点的多态性时，为了获得良好地PCR扩增结果，本发明人根据各个SNP位点的特点，分别设计了不同长度的用于扩增目的的扩增引物，从而可进行多重PCR反应，实现程序简化且高通量检测。因此。作为本发明的优选方式，还提供了SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：46的扩增引物，这些引物的更详细的情况见表1。

本发明还提供了一种检测细胞色素P450基因的多态性的试剂盒，包含前面所述的一条或多条或全部的SBE引物。

较佳地，所述的试剂盒中还包括前面所述的用于扩增目的基因(待测基因)的引物(引物对)。

此外，所述试剂盒中还可包括：芯片，所述的芯片上固定有用于与SBE发生互补杂交的核酸探针。

所述的试剂盒中还可包括：PCR扩增试剂或芯片杂交试剂等。例如，包括但不限于：抽提液，扩增液，DNA聚合酶，PCR缓冲液，杂交液，洗涤液，酶，对照液等。

此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。所述的芯片图像分析软件比如：BaiO公司的BaiO ArrayDoctor 2.0，Media Cybernetics公司的Arraypro 4.0。

本发明的主要优点在于：

高通量：可同时对多位点进行分析，实现高通量检测，从而降低检测成本，并降低因多次操作导致的背景干扰。

准确性高：准确率超过99％。

实验所需样本量要求少：本发明的检测方法只需要1ng的核酸就足够进行多重的检测。

操作简单，自动化程度高：实验基本操作仅包括PCR、类似测序反应的单碱基延伸反应、杂交，避免了繁琐的步骤，从PCR到最终分型结果，可以在一天之内完成。并且对实验环境要求不高，易于控制，普通的分子生物学实验室就可以完成所有的实验。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1.SNP位点的筛选及序列设计

(1).SNP位点的筛选

根据http://www.cypalleles.ki.se/网站公布的CYP450基因的变异位点，结合在NCBI网站的SNP数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)和TSC数据库(The SNP consortium，http://snp.cshl.org/)的数据，找出汉族人群中存在较高多态性的SNP位点，共选取了27个位于CYP450基因的变异位点。这27个SNP位点一共被包含于23个CYP450目的基因片段中(某些目的基因片段中包含多个SNP)。

(2).PCR引物设计

对23个目的基因片段，本发明人设计了23对目的基因片段的引物，用于目的基因的PCR扩增，经优化设计后的引物序列见表1。引物均进行了BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/Blast Gen.cgi？taxid＝9606)分析，以保证序列的特异性。并且，本发明人还通过SNP BALST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_blastByOrg.cgi)排除引物序列中可能含有的多态性位点，以免影响扩增效率。

表1、23个CYP450目的基因片段相应的CYP450PCR引物序列

表中“-F”表示正向引物；“-R”表示反向引物。

(3).Zipcode的设计

从λ噬菌体基因组中挑选出100条Zipcode特异性序列，分析和处理后选择其中54条用于本发明人的研究。寡核苷酸序列百分之一的错配将导致Tm降低1～1.5℃，内部的错配更明显降低杂交体的解链温度，因此在Zipcode探针设计过程中主要考虑以下因素：长度设计为20bp，Tm值为65℃～70℃(按照Oligo6.0软件公式计算)，G+C％含量在40％～60％。不同Zipcode探针的Tm值尽量接近；避免形成二聚体、发夹等结构，每个Zipcode之间序列相似度低，与其它部位序列的同源性低。经生物芯片上海国家工程研究中心的生物信息学平台的Basic Blast系统检测，其在“human genomic database”中结果均为“nohits found”，表明与人类基因组无同源性。Zipcode 1至Zipcode 54的序号见表2；Zipcode的序列则为SBE引物前20个碱基的互补序列。

(4).SBE引物设计

对于27个SNP位点，根据SNP位点变异类型设计了54条SBE引物，即每个位点设计一对引物，每条引物各对应于一种基因型。-SBE引物由3部分“X-Y-Z”组成，其中X为与目的基因无同源性的碱基序列(前20个碱基，斜体部分)，且与芯片上的Zipcode(简称Zip)是互补的；Y是与SNP检测位点上游互补的一段序列；Z则是与SNP位点互补的碱基。确定SBE引物的Tm值，并确定与Zipcode探针杂交的合适温度，每对引物均能准确检测相应位点的基因类型。54条SBE引物及对应的Zipcode序列见表2。

表2、SBE引物列表

表中，“＞”代表“变异为”；例如“C＞T”表示SNP位点上由“C”变异为“T”，其它变异形式以此类推。其中，SNP位点根据CYP450基因的正义链来描述，而相应的引物根据CYP450基因的正义链或反义链上的多态性来设计。

“del”表示相应位点发生1个碱基的缺失；例如“2459delA”表示第2459位缺失了碱基A，其它变异形式以此类推。

“ins”表示相应位点发生1个碱基的插入；例如“831insA”表示第831位增加了碱基A，其它变异形式以此类推。

实施例2、芯片的制备

(1).阳性参照的设计

芯片上阳性参照(阳性质控点，阳参)可以用于进行芯片的杂交质量控制，同时还可以对芯片上的矩阵进行定位。阳性质控点的杂交选择由Cy3标记的Oligo Pf-G1，序列是TTGGATTAGGTATAACAAAAGGACCAGCGGATTCTCCACCTATATCTATA(SEQ ID NO：101)。点在芯片上的对应的阳性质控探针序列是AGAATCCGCTG GTCC TTTTGT(SEQ ID NO：102)。15μL的阳参标记体系中包括TdT Buffer(pH 6.6，含0.2mol/L砷酸钾，0.025mol/L Tris-HCl)3.0μL，0.25g/L BSA 3.75μL，稀释40倍的Cy3-dCTP 0.4μL，TdT(terminaldeoxynucleotide transferase(Fermentas，Burlington，Canada)0.2μL)，2.67μmol/LOligo Pf-G1。在37℃进行标记反应1h，95℃10min终止反应。

(2)、芯片点制

实验中所使用的SNP芯片均由生物芯片上海国家工程研究中心的OmniGrid100芯片点样仪点制而成(所使用的片基为博奥生物有限公司生产的醛基化修饰芯片)，点制温度25℃，湿度50％。用TE将Zipcode探针(序列对应于表2中各引物的前20个碱基(斜体)，是它们的互补序列)稀释到50μmol/L，用点样缓冲液将Zipcode探针稀释至25μmol/L，加入384孔板中混合均匀，在冷冻水平离心机上离心2min去除气泡。OmniGrid接触式点样仪的裂隙针接触384孔板中探针样品溶液，通过毛细现象在针尖的细缝中形成一段样品液柱，再通过针尖轻触片基，将一定体积液体转移，形成样点。为了使探针分子于片基表面牢固结合，采用潮湿的环境保证水合反应充分进行。醛基化片基的后处理步骤为：水合30min(提供适宜的湿度环境以保证样品与片基表面在溶液状态下充分反应)；37℃孵育2小时。点制好的SBE芯片置于干燥箱中，室温保存备用。

芯片上Zipcode探针排列见表3。其中每个Zipcode探针在点制时平行重复三次。

实验中的阴性参照(阴参)设计为等量的ddH₂O代替Zipcode。

表3、探针排布

阳参

Zip1

Zip2

Zip3

Zip4

Zip6

Zip5

阳参

Zip13

Zip14

Zip18

Zip17

Zip19

Zip20

阳参

Zip7

Zip8

Zip9

Zip10

Zip11

Zip12

阳参

Zip31

Zip32

Zip15

Zip16

Zip33

Zip34

阳参

Zip21

Zip22

Zip23

Zip24

Zip47

Zip48

阳参

Zip25

Zip26

zip27

Zip28

Zip29

Zip30

阳参

Zip35

Zip36

Zip37

Zip38

Zip39

Zip40

阳参

Zip41

Zip42

Zip43

Zip44

Zip45

Zip46

阳参

Zip49

Zip50

Zip51

Zip52

Zip53

Zip54

阳参

阴参

空白

实施例3、单位点PCR扩增

PCR体系为：每种dNTP 100μmol/L，1×PCR Buffer，MgCl₂ 3.5mmol/L，每条引物2μmol/L，DNA模板20ng以及1.2×rTaq DNA聚合酶。PCR反应条件：95℃变性3min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，共30个循环；最后72℃延长5min。所选用DNA模板为外周血中抽提得到的全基因组DNA，样本由生物芯片上海国家工程研究中心提供。

经过PCR反应，电泳结果如图3。泳道1-20分别代表不同编号引物对应的目的片段大小。其中Marker大小为100bp Ladder，泳道1-23分别为：2D6E1、2D6E2、2D6E3、2D6E4、2D6E6、2D6P1、3A5E4、2C9E7、2C19E4、2C19E1、2C19E5、2D6-2459、2C8-416、3A4-830、3A4-878、3A4-1399、2B6-516、2B6-785、2B6-1459、2C8-475、3A4-352、3A4-653、2C8-1196。由图可见，所有引物均可特异性扩增目的片段。

实施例4、多重PCR扩增

23对PCR引物的扩增产物根据目的条带大小分为4组，多重PCR的反应体系为：每种dNTP 200μmol/L，1×PCR buffer，每条引物2μmol/L，DNA模板20ng以及1.2×Titanium Taq DNA聚合酶。多重PCR反应条件采用Touchdown程序：95℃变性3min；95℃变性30s，68℃退火30s，68℃延伸50s，每循环降0.5℃共10个循环；95℃变性30s，60℃退火30s，63℃延伸50s共25个循环；最后68℃延长5min。

将23对引物根据目的片段的大小分成4组(表4)进行多重PCR反应。

表4、多重PCR分组

多重PCR扩增产物的电泳结果如图4。从电泳图可以看出，每组目的片段之间条带大小差异可在电泳图片中肉眼显著区分。

实施例5、PCR产物的纯化

大肠杆菌核酸外切酶I(Exonuclease I Nuclease，ExoI)是单链特异性3’→5’核酸外切酶，从ssDNA的3’-OH末端分解生成5’-单核苷酸，对单链DNA的特异性非常高，不分解双链DNA及RNA。使用Exo I可以分解PCR反应后残存多余的引物，同时使用虾碱性磷酸酶(Sarimp Alkaline Phosphatase，SAP)可降解多余的dNTP。用SAP-ExoI法纯化PCR产物，按照每10μL产物加入2U SAP和4U ExoI，体系中其它组分为75mmol/L Tris-HCl(pH8.5)，7.5mmol/L MgCl₂，在37℃温育30min，95℃10min热处理充分灭活酶，4℃保存备用。

实施例6、单碱基延伸荧光标记反应

将SBE引物分别稀释到25μmol/L，Cy3-ddCTP、Cy3-ddGTP及Cy3-ddUTP分别稀释至0.01mmol/L。每5μL SAP-ExoI纯化后的多重PCR产物中加入10μLSBE反应混合液，组成成分为1×反应缓冲液(pH 9.3，0.050mol/L KCl，0.002mol/L MgCl₂)，1U Thermo Sequenase^TM，Cy3-ddCTP、Cy3-ddGTP及Cy3-ddUTP各0.2μmol/L，每条SBE引物0.2μmol/L，SBE反应的总体系为15μL，反应程序为96℃变性2min，45个循环(94℃15s，℃25s，72℃15s)，标记产物避光保存于4℃，稀释过程注意避光操作，防止荧光淬灭。

实施例7、芯片杂交与洗片

(1)杂交液的配方

芯片预杂交液：吸取20×SSC 30ul，20％SDS 3ul，10mg/ml BSA 30ul之后，加水定容至300ul。

芯片杂交液：分别吸取20×SSPE 135μl，10％Triton X-10 17μl，10×Denhardt’s 90μl，DMSO 35μl后，混合均匀，于常温保存。

芯片洗涤液Ⅰ：20×SSC 4ml，10％SDS 4ml，ddH₂O定容至40ml。

芯片洗涤液Ⅱ：20×SSC 2ml，10％SDS 0.8ml，ddH₂O定容至40ml。

芯片洗涤液Ⅲ：20×SSC 1.2ml，ddH₂O定容至40ml。

(2)预杂交

将制备好的带有探针的芯片浸入事先配置好的预杂交液中，封闭杂交盒，常温下反应1h。然后ddH₂O中润洗2次，甩干备用。

(3)芯片准备

使用晶芯

芯片围栏粘贴工具对点样后的芯片进行围栏粘贴，能够保持一张芯片上的数个样品独立进行反应，避免样品间交叉污染。在晶芯

基因芯片杂交盒中两端各加入20μl的ddH₂O，保证杂交过程中的湿度恒定，防止干片。将点样后芯片放在杂交盒中，放置在48℃杂交炉中迅速将芯片表面预热，可以减少非特异性吸附，从而有效避免荧光背景信号过高。

(4)杂交

每个样本杂交反应体系为15μl，加样体系中包括10μl SBE标记产物、0.2μl的阳性质控标记产物、1.33×SSC及0.067％SDS，于95℃变性5min，变性后反应立即插于冰上，避免产物复性或形成发夹结构。将加样体系缓缓加样于贴好围栏的芯片矩阵上，加样体积以反应液能完全充满点阵为原则，每个矩阵的加样体积为15μl。小心加盖盖片，避免加样及覆盖过程中出现气泡。置于杂交盒内密闭封好后，放于杂交炉中，杂交温度为48℃，杂交时间为120min。加样及盖片过程注意避光操作，防止荧光信号分子淬灭。

(5)洗片

杂交后芯片迅速去除围栏，浓度梯度洗涤。洗液预热至48℃。分别于洗液I和洗液II中，均匀洗涤6min；于洗液III中洗涤3min。最后在ddH₂O中洗涤10s。从ddH₂O中取出芯片后立即置于避光的50ml离心管中在台式冷冻离心机上2000g离心3min以甩干。洗涤和甩干过程注意避光操作。甩干后的芯片在避光盒中备用。

(6)芯片杂交结果

经过对多重PCR、多重SBE、芯片杂交等试验条件的优化，得到图5所示的芯片扫描图。获取图像分析数据，进行基因型的分析计算。

(7)基因型判读

用于检测SNP位点等位基因的两条SBE引物中，一条用于检测野生型，另一条用于检测突变基因，因此会出现3种可能情况：2种纯合子类型及一种杂合子类型。若一条探针带有特异的荧光信号则定义为纯合型，若两条探针都带有特异性信号则定义为杂合型。提取每条探针的荧光强度信号值后，计算平行三次寡核苷酸探针荧光信号数据的平均值。数据分析时，选取信噪比SNR＞＝2.5的信号为有效信号。将目的探针的信号强度中值减去背景信号强度中值即视为目的基因的真实荧光强度值，SNR＜＝2.5的信号的荧光强度值计为0。等位基因计算方法按照下列公式计算：AF＝等位基因B/(等位基因A+等位基因B)。理论上，纯合等位基因A的AF为0，杂合子的AF值为0.5，纯合等位基因B的AF值的为1。但在实验过程中，AF阈值通常受到非特异性杂交、标记差异等诸多影响因素，因此以10个经测序的样本作为标准品，用于鉴定AF阈值。根据芯片和测序结果相一致的原则，AF阈值规定如下：AF≤0.25为等位基因A纯合子，0.25＜AF＜0.75为杂合子AB，AF≥0.75为等位基因B纯合子。

结果，图5芯片上各zipcode相应的荧光扫描值及各SNP位点基因型判读结果如表5所示。

表5

实施例8、基因测序验证实验结果

为了验证芯片结果的准确性，每个SNP均经单对引物扩增后，进行双向DNA测序。扩增反应总体积为15μL，反应体系为：dNTPs 200μmol/L(Takara，大连，中国)，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，100mM KCl，2mM MgCl₂，引物各0.2μM，20ng DNA及1.2U Taq DNA聚合酶(Takara，大连，中国)。PCR反应条件为95℃30s，62℃30s，72℃50s，30个循环。PCR产物用PCR PurificationKit(Qiagen，Hilden，Germany)纯化。以扩增引物作为测序引物进行双向测序，测序仪器为ABI 3730测序仪，测序试剂为Big Dye terminator v 3.1(AppliedBiosystems，Foster City，CA，USA)。测序反应按照ABI提供的操作进行。

选取部分样本进行DNA测序验证，测序结果与芯片上SNP位点等位基因鉴定结果相同，验证了芯片检测结果的正确性。部分测序结果见图6。

图6用测序的方法验证了4个SNP位点，即7号位点2D6-2613delT；1号位点2D6-100C＞T；2号位点2D6-883G＞C；3号位点2D6-1661G＞C是否存在SNP。测序的判读结果为7号位点基因型非缺失；1号位点基因型C/T杂合子；2号位点基因型G纯合子；3号位点基因型G/C杂合子。对比芯片扫描计算判读结果，发现测序的结果与用芯片检测的结果(表5)是一致的，这说明该检测方法是准确的。

重复以上单碱基延伸以及芯片检测方法若干次，结果发现，以上检测方法的可重复率为98％，DNA样本的灵敏度为1ng。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种检测基因多态性的方法，其特征在于，所述方法包括：

X-Y-Z；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，根据待测基因中多态性位点的数目，同时设计多条单碱基延伸反应的引物，每一引物的Zip1序列均是不同的；从而在芯片上一次判读多个多态性位点的结果。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可检测标记物是荧光标记物。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测基因中包括基因多态性位点的序列通过PCR的方法扩增获得。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的待测基因是细胞色素P450基因。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的单碱基延伸反应的引物选自：SEQ ID NO：47-SEQ ID NO：100任意一条或多条。

7.一种用于检测细胞色素P450基因的多态性的引物，其特征在于，所述的引物的结构如下：

X-Y-Z；

8.一种检测细胞色素P450基因的多态性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的引物。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：芯片，所述的芯片上固定有Zip2碱基序列，该Zip2碱基序列与Zip1碱基序列相互补，且不与细胞色素P450基因互补。

10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括选自下组的一对或多对引物：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14；SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28；SEQ IDNO：29和SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38；SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42；SEQ IDNO：43和SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。