CN105543403B - 水牛泌乳相关基因Leptin作为分子标记的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及水牛产奶性状相关的Leptin基因G3683T位点作为分子标记在水牛泌乳性能研究上的应用。特征是Leptin基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中第3683处有一个G/T碱基突变，该位点与水牛品种的产奶量显著相关(P<0.05)。本发明公开了检测序列表SEQ ID NO：1的第3683处G/T碱基突变所需的上下游引物序列。本发明为水牛产奶性状标记提供了一种新的分子标记方法。
Description
【技术领域】
本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种水牛产奶性状基因Leptin作为分子标记的方法及其应用。
【背景技术】
水牛是我国南方特有的种畜资源，而较低的产奶量和繁殖性能已成为了影响其产业发展的两大科学问题。显然，利用先进的分子标记技术应用于优良奶水牛种质资源的选育将会有效的提高选种效率。
产奶性状是奶水牛的一个重要经济性状，由多种微效基因决定，是一种典型的由多基因控制的数量性状。克隆奶水牛泌乳性能相关基因并探讨其遗传特性，以提高奶水牛生产性能，为选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技术支撑和奠定理论基础。
Leptin基因又称肥胖基因，编码蛋白质为瘦素，由脂肪细胞分泌，可控制哺乳动物的采食量和体组成，对动物的生长、繁殖和泌乳性能具有重要作用。近些年，Leptin基因一直受到畜牧研究者的重视，尤其在探究Leptin基因与家畜重要经济性状间的相关性做出了大量的分析。Konfortov等(1999)率先从22头牛Leptin基因中筛查出20个单核苷酸多态性位点(Single Nuclease Polymorphism,SNP)，其中每89bp就存在一个SNP位点，且有6个SNP位于外显子上。随后，Yoon等(2005)对24头韩国牛Leptin基因的多态性进行筛查，共发现57个SNPs，其中有14个位于5’侧翼区，27个在内含子上，8个在外显子区域，其余8个位于3’侧翼区。研究表明Leptin基因的多态性分布于不同的家畜中且与不同的生产性状具有关联性，如Leptin基因C73T位点突变与成牛胴体脂肪沉积增多有关，Leptin基因的SNP位点A80V对牛的不返情率影响显著，Leptin-1238中G相对于C来说显著降低了牛的乳脂率和乳蛋白率等。显然，根据LEP基因功能，该基因可作为影响水牛产奶性状的候选基因，用于分子标记的开发和利用，为建立分子标记辅助选择技术奠定基础。而且，迄今为止，尚无有关水牛Leptin基因作为水牛产奶性状的分子标记研究报道。
【发明内容】
本发明提供了一种水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法，该分子标记的方法是通过PCR-DNA测序与高分辨率溶解曲线(HRM)技术完成的。
水牛产奶性状基因Leptin的基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中第3683处有一个G/T单碱基突变，该位点与水牛品种的产奶量显著相关(P<0.05)。
进一步提供一种检测序列SEQ NO:1第3683bp处G/T碱基突变的正反向引物对的DNA序列如下所示：
正向引物:5-GTGGTCTTGCTCATCAGGAAG-3，SEQ NO:2
反向引物:5-TGTCTGCTGTTATGGTCTTAGG-3，SEQ NO:3
本发明水牛产奶性状Leptin基因G3683T处SNP位点的获取方法，包括如下步骤：
(1)待测水牛基因组DNA提取；
(2)目的片段扩增及测序：随机50头水牛基因组DNA进行混池，以作为PCR反应模板，利用SEQ NO:2-3引物进行PCR技术扩增，获得的扩增产物委托深圳华大科技有限公司进行测序，利用DNAStar 7.0Seqman生物信息分析软件对测序结果进行比对，获取候选的Leptin基因SNP位点；
(3)基因分型：针对360头水牛基因组DNA样本，利用高分辨率溶解曲线(HRM)技术进行候选SNP位点的分型，得出各样本位点的基因型；
(4)关联分析：利用SAS软件GLM程序对水牛个体的SNP分型结果以及产奶量数据进行数据分析，获得与水牛产奶量显著相关的分子标记。
本发明水牛产奶性状基因Leptin作为分子标记的应用，具体步骤如下：
(1)对待选育水牛进行静脉采集提取总DNA；
(2)针对核苷酸序列SEQ ID NO：1的第3683bp处的G3683-T3683 SNP位点，采用高分辨率溶解曲线(HRM)技术检测上述步骤(1)中所述的DNA样本进行基因分型，得出GT基因型的水牛作为本发明所需的选育奶水牛。本发明为水牛分子标记辅助育种提供了新的分子标记。
所述的分子标记为水牛产奶性状的遗传标记。
所述的应用为奶水牛的早期选育。
该水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法及其应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、提供了一种水牛泌乳相关基因Leptin作为分子标记方法；
2、为提高奶水牛产奶量生产性能，选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技术支撑和奠定理论基础。
对本发明更详细描述可参见实例部分。
【附图说明】
图1为SNP分型结果展示。
【具体实施方式】
下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不可以以任何方式限制本发明。
实施例1：水牛基因组总DNA的制备
采用血液基因组DNA提取试剂盒制备水牛基因组总DNA(天根，北京)，具体操作步骤如下：
1、取全血500μL置于1.5mL离心管，加入等体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，12000rpm离心1min，吸取上清，留下沉淀；加入等体积的细胞裂解液CL，重复此步骤一次；加入4μL RNAase(100mg/mL)，振荡15sec，室温静置5min；
2、加入20μL Proteinase K溶液，混匀，加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮；
3、加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；此时可能会出现絮状沉淀；
4、将上述所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
5、向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
6、向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复此操作一次；
7、12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
8、将吸附柱CB3转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
9、存放于-20℃冰箱中保存备用。
实施例2：水牛产奶性状Leptin基因分子标记的获取
1、引物设计：以SEQ NO：1为模板，利用Primer5.0引物设计软件，经Oligo软件检测，确定用于扩增水牛Leptin基因的正方向引物，并委托大连宝生物技术有限公司合成，其中用于扩增所述基因的正反向引物的DNA序列如SEQ ID NO:2-3所示。
2、PCR扩增反应
随机选择50头水牛基因组DNA样本进行混池，以作为PCR反应的模板。
(1)PCR反应：反应总体积为40μL，其中水牛DNA混合池模板1μL，10X LA Taq Mix20μL，引物混合物(10mM each)2μL和ddH2O 17μL。
(2)PCR反应程序：94℃/3min；94℃/30sec，60℃/30sec，72℃/1.5min，30个循环；72℃10min；4℃保存
3、PCR产物测序、分析及分子标记初筛
将获得的扩增产物送至深圳华大科技有限公司测序。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的BLAST工具对测序结果进行分析，判定结果的真实性，并利用DNAStar 7.0Seqman生物信息分析软件对测序结果进行比对，获取候选的Leptin基因SNP位点，见表1。
表1水牛Leptin基因SNP位点
4、水牛Leptin基因SNP分型检测
选定190头水牛个体，基于Roche公司LightCycler480定量PCR仪器，利用HRM技术针对初步筛选的SNP位点进行水牛群体基因分型检测，其步骤如下：
(1)DNA样品质控：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，纯度和降解程度；通过紫外分光光度计检测OD260/OD280数值，调整DNA终浓度在30-50ng/μL之间。
(2)引物设计与合成：以SEQ NO：1为模板，利用Primer5.0引物设计软件，经Oligo软件检测，确定用于扩增水牛Leptin基因的正方向引物，其中目的片段扩增长度范围为156bp。委托大连宝生物技术有限公司合成，其中用于扩增所述基因的正反向引物的DNA序列如所示：
正向引物：5’-CTTCTCACGTAGTGGTCAT-3’；
反向引物：5’-ACAAGTAGGTGCTCAGTCT-3’。
(3)HRM反应：HRM反应均在LightCycler480定量PCR仪中运行完成。其中HRM基因分型体系为：10.0μL 2×HRM Analysis PreMix，1.0μL DNA基因组模板，正反向引物(10μM)各0.6μL，以及7.8μL RNase-Free ddH2O。PCR反应程序为：95℃预变性2min；95℃预变性10sec，60℃退火/延伸30sec，采集荧光，40个循环；溶解曲线分型，设置0.02℃收集一次荧光；40℃降温1sec。
(4)数据分析：运用LightCycler480定量PCR仪自带的LightCycler V 1.5.0软件进行数据分析，应用gene scanning程序进行基因型的判定。其步骤如下：选择中Analysis选项，点击GeneScanning按钮，进入基因分型判定工作框；点击Normalization选项，根据扩增产物的Tm进行溶解曲线分析区域；在Temperature Shif选项中，选择Threshold＝5为分析参数；最后在Difference Plot框中点击Calculate按钮进行数据分析。其中部分水牛产奶性状Leptin基因G3683T位点的基因分型结果见图1。
(5)G3683T位点分型验证：针对上述HRM基因分型结果，选择不同基因型个体的扩增产物样本委托深圳华大科技有限公司进行测序，根据测序峰图进一步验证HRM基因分型结果的可靠性。
5、关联分析：性状-标记关联分析的模型为：Yijklm＝μ+Yi+Pj+Sk+DIMl+Gm+eijklm,其中Yijklm为性状观察值；μ为均值,Yi为产犊效应,Pj为胎次效应,Sk为产犊季节效应；DIMl为泌乳天数效应,Gm为基因型效应,eijklm为随机误差。分析结果采用Bonferroni多重比较进行验证。关联分析结果表明，杂交奶水牛Leptin基因的G3683T位点与产奶量显著相关(P<0.05)。由此获取了水牛产奶性状Leptin基因的分子标记。
实施例3：水牛产奶性状基因Leptin作为分子标记的应用
试验水牛群的品种是我国杂交奶水牛个体。在水牛群中对Leptin基因G3683T位点的不同基因型与水牛产奶性状进行关联分析。
水牛Leptin G3683T位点关联分析结果见表2所示。由表中可以得出基因型与水牛产奶性状显著相关(P<0.05)，其中携带GT基因型的水牛个体产奶量高于GG和TT型个体，为优势基因型。
表2 Leptin基因G3683T位点与水牛产奶量的关联分析
注：同行数据，不同字母表示差异极显著(P<0.05)；相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法，其特征在于，该分子标记的方法是通过PCR-DNA测序与高分辨率溶解曲线(HRM)技术完成；水牛产奶性状Leptin基因G3683T处SNP位点的获取方法，包括如下步骤：
(1)待测水牛基因组DNA提取；
(2)目的片段扩增及测序：随机选择水牛基因组DNA进行混池，以作为PCR反应模板，利用正、反引物进行PCR扩增，对获得的扩增产物进行测序，对测序结果进行比对，获取候选的Leptin基因SNP位点；
(3)基因分型：针对头水牛基因组DNA样本，利用高分辨率溶解曲线(HRM)技术进行候选SNP位点的分型，得出各样本位点的基因型；
(4)关联分析：利用SAS软件GLM程序对水牛个体的SNP分型结果以及产奶量数据进行数据分析，获得与水牛产奶量显著相关的分子标记。
2.根据权利要求1所述的一种水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法，其特征在于，用于获得所述分子标记的正、反引物序列为：
正向引物:5-GTGGTCTTGCTCATCAGGAAG-3；
反向引物:5-TGTCTGCTGTTATGGTCTTAGG-3。
3.根据权利要求1所述的一种水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法，其特征在于：所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中在SEQ ID NO：1的第3683bp处的G3683-T3683单碱基突变，该位点与水牛产奶量显著相关。
4.根据权利要求1所述的一种水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法，其特征在于：所述的分子标记为水牛产奶性状的遗传标记。
5.一种根据权利要求1至4任意一项所述的水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法的应用，其特征在于，具体应用步骤为：
(1)对待选育水牛进行静脉取血，并提取基因组DNA样本；
(2)针对核苷酸序列SEQ ID NO：1的第3683bp处的G3683-T3683SNP位点，采用高分辨率溶解曲线技术检测上述步骤(1)中所述的DNA样本进行基因分型，得出GT基因型的水牛作为本发明所需的选育奶水牛。
6.根据权利要求5所述的一种水牛产奶性状相关基因Leptin作为分子标记的方法的应用，其特征在于：所述的应用为奶水牛的早期选育。
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