CN105525030B - 与水牛泌乳相关基因insig2及其作为分子标记的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了与水牛泌乳相关基因INSIG2及其作为分子标记的应用，属于家畜分子标记领域，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中第1258bp、1350bp、12529bp、12670bp处的A1258G、A1350C、G12529A、C12670T单碱基突变，该位点与摩拉水牛和杂交水牛品种的产奶量显著相关。本发明公开了检测序列表SEQ ID NO:1的各碱基突变位点所需的上下游引物序列。本发明的应用，可以提高奶水牛产奶性能，为选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技术支撑和奠定理论基础。
Description
【技术领域】
本发明涉及技术领域，具体涉及一种动物分子标记领域。具体涉及与水牛泌乳相关基因INSIG2及其作为分子标记的应用。
【背景技术】
水牛是我国南方特有的种畜资源，而较低的产奶量和繁殖性能已成为了影响其产业发展的两大科学问题。显然，利用先进的分子标记技术应用于优良奶水牛种质资源的选育将会有效的提高选种效率。
产奶性状是奶水牛的一个重要经济性状，由多种微效基因决定，是一种典型的由多基因控制的数量性状。克隆奶水牛泌乳性能相关基因并探讨其遗传特性，以提高奶水牛生产性能，为选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技术支撑和奠定理论基础。
胰岛素诱导基因(Insulin Induced Gene，INSIG)在哺乳动物体内存在2种亚型,分别为INSIG1和INSIG2,是近年来发现的与脂肪代谢相关的新基因之一，在脂肪细胞分化和脂肪代谢的过程中发挥重要的作用。它们的主要功能是调控脂肪代谢,在细胞内固醇的参与下,影响固醇调节元件结合蛋白(SREBP)活化,对脂肪的形成具有重要作用。到目前为止，张衡等(2009)发现INSIG2基因的多态性与青少年肥胖及代谢异常相关。蒋明等(2015)证实了猪的INSIG2基因的多态性对肉质性状的影响具有显著关联性。刘等(2012)阐明了秦川牛INSIG2基因存在与其屠宰性状显著相关的4个SNP位点。Rincon等(2012)报道了荷斯坦奶牛INSIG2基因ss252452236位点等位基因C与饱和脂肪的下降以及多聚不饱和脂肪酸的上升相关。显然，根据INSIG2基因功能，该基因可作为影响水牛产奶性状的候选基因，用于分子标记的开发和利用，为建立分子标记辅助选择技术奠定基础。而且，迄今为止，尚无有关水牛INSIG2基因作为水牛产奶性状的分子标记研究报道。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供与水牛泌乳相关基因INSIG2及其作为分子标记的应用，以提高奶水牛产奶量生产性能，为选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技术支撑和奠定理论基础。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了与水牛泌乳相关基因INSIG2及其作为分子标记的应用，所述的分子标记的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，其中在SEQ NO:1的第1258bp、1350bp、12529bp、12670bp处分别有A1258G、A1350C、G12529A、C12670T单碱基突变，其引物对的DNA序列如下所示：
(ⅰ)A1258G；A1350C，获得这两个位点的引物序列为：
正向引物SEQ NO:2：5‘-TCCCTGGACAGTGGAAGAGT-3’；
反向引物SEQ NO:3：5‘-GATTCATGGGCTACGGACACT-3’；
(ⅱ)G12529A；C12670T，获得这两个位点的引物序列为：
正向引物SEQ NO:4：5’-CCGCTGAACACTCTGCCTTA-3’；
方向引物SEQ NO:5：5’-CTCTTCCCCTCCTTTGCCTG-3’。
所述的分子标记为水牛产奶性状的遗传标记，且与水牛产奶性状相关的INSIG2基因上的分子标记是通过PCR-DNA测序与飞行时间质谱法检测完成，而所述的应用为奶水牛的早期选育。
本发明水牛产奶性状INSIG2基因1258bp、1350bp、12529bp、12670bp处SNP位点的获取方法，包括如下步骤：
(1)待测水牛基因组DNA提取；
(2)目的片段扩增及测序：随机50头水牛基因组DNA进行混池，以作为PCR反应模板，利用引物对SEQ NO:2和SEQ NO:3以及SEQ NO:4和SEQ NO:5分别进行PCR扩增，获得的扩增产物进行测序，利用DNAStar 7.0Seqman生物信息分析软件对测序结果进行比对，获取候选的INSIG2基因SNP位点；
(3)基因分型：针对360头水牛基因组DNA样本，利用飞行时间质谱法进行候选SNP位点的分型，根据质谱峰图判读各样本位点的基因型；
(4)关联分析：利用SAS软件GLM程序对水牛个体的SNP分型结果以及产奶量数据进行数据分析，获得与水牛产奶量显著相关的分子标记。
本发明水牛产奶性状基因INSIG2作为分子标记的应用，具体步骤如下：
(Ⅰ)对待选育水牛进行静脉采取提取DNA样本；
(Ⅱ)针对针对核苷酸序列SEQ ID NO:1中1258bp、1350bp、12529bp、12670bp处的SNP位点，利用飞行时间质谱仪检测上述步骤(3)中所述的DNA并对样本进行基因分型，利用Typer4.0软件检测质谱峰并判读各样本位点基因型。
(ⅲ)应用INSIG2中的A1258G-AA、A1350C-AA、G12529A-GG及C12670T-CC的基因型进行判定和选育高产摩拉水牛；而基于A1258G-GG、A1350C-CC、G12529A-AA及C12670T-TT的基因型进行判定和选育高产杂交奶水牛。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(一)提供一种与水牛泌乳相关基因INSIG2，并将其作为分子标记予以应用；
(二)提高奶水牛产奶量生产性能，为选育具有高产奶量的优良的奶水牛品种提供技术支撑和奠定理论基础。
对本发明更详细描述可参见实例部分。
【附图说明】
图1—SNP1258分型结果展示。
图2—SNP1350分型结果展示。
图3—SNP12529分型结果展示。
图4—SNP12670分型结果展示。
【具体实施方式】
实施例1：水牛基因组总DNA的制备
采用血液基因组DNA提取试剂盒制备水牛基因组总DNA(天根，北京)，具体操作步骤如下：
(1)取全血500μL置于1.5mL离心管，加入等体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，12000rpm离心1min，吸取上清，留下沉淀；加入等体积的细胞裂解液CL，重复此步骤一次；加入4μL RNAase(100mg/mL)，振荡15sec，室温静置5min；
(2)加入20μL Proteinase K溶液，混匀，加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮；
(3)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀；此时可能会出现絮状沉淀；
(4)将上述所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(5)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
(6)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复此操作一次；
(7)12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
(8)将吸附柱CB3转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TB，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
(9)存放于-20℃冰箱中保存备用。
实施例2：水牛产奶性状INSIG2基因分子标记的获取
1、引物设计：以SEQ NO：1为模板，利用Primer5.0引物设计软件，经Oligo软件检测，确定用于扩增水牛INSIG2基因的正方向引物，并委托大连宝生物技术有限公司合成，其中用于扩增所述基因的正反向引物的DNA序列如SEQ ID NO:2-5所示。
2、PCR扩增反应
随机选择50头水牛基因组DNA样本进行混池，以作为PCR反应的模板。
(1)PCR反应：反应总体积为40μL，其中水牛DNA混合池模板1μL，10X LA Taq Mix20μL，引物混合物(10mM each)2μL和ddH2O 17μL。
(2)PCR反应程序：94℃/3min；94℃/30sec，60℃/30sec，72℃/1.5min，30个循环；72℃10min；4℃保存
3、PCR产物测序、分析及分子标记初筛
将获得的扩增产物送至深圳华大科技有限公司测序。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的BLAST工具对测序结果进行分析，判定结果的真实性，并利用DNAStar 7.0 Seqman生物信息分析软件对测序结果进行比对，获取候选的INSIG2基因SNP位点，见表1。
表1水牛INSIG2基因SNP位点
4、水牛基因INSIG2的SNP分型检测
选定360头水牛个体，利用Sequenom公司的MALDI-TOF技术针对初步筛选的SNP位点进行基因分型检测，其步骤如下：
(a)DNA样品质控：通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，纯度和降解程度；通过紫外分光光度计检测OD260/OD280数值，调整DNA终浓度在30-50ng/μL之间。
(b)引物设计、合成与质检：根据候选的SNP位点通过Sequenom公司的ASSAYDESIGN3.1软件进行引物设计，委托大连宝生物技术有限公司合成引物，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)进行质检，检测实际分子量与理论分子量是否一致，引物纯度是否达到实验要求。随后进行引物稀释：①PCR引物储备液制备：配置PCR引物储备液，终浓度为100p(μmoL/L)；②单碱基延伸引物储备液制备：配置单碱基延伸引物储备液，500p(μmoL/L)。
(c)PCR反应：反应总体积为5μL，即ddH2O 1.8μL，10*Buffer 0.5μL，Mg2+0.4μL，dNTP 0.1μL，Hotstar 0.2μL，F primer/R primer 1μL，待检测DNA样品1μL(20-50ng)；反应条件为：95℃/2min；94℃/30sec，56℃/30sec,72℃/1min,45个循环；72℃延伸/5min；
(d)SAP酶消化反应：SAP反应总体积为2*460μL，即ddH2O 1.53*460μL，SAP Buffer0.17*460μL，SAP Enzyme0.3*460μL；SAP反应程序：37℃/40min；85℃/5min；25℃/保存；
(e)单碱基延伸反应：单碱基延伸反应总体积为2*460μL，即ddH2O 0.619*460μL，10*iplex buffer 0.2*460μL，Terminator mix 0.2*460μL，引物0.94*460μL，单碱基延伸酶0.041*460μL；单碱基延伸反应程序如下：
(f)树脂纯化：将384孔板中的反应产物加入16μL三蒸水，在离心机中离心2000转离心3min；加入树脂，在反转摇匀仪上做树脂纯化反应35min，脱盐；反应完成后在离心机2000转离心3min；将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶；
(g)质谱检测及数据收集与分析：运行MALDI-TOF-MS反应，利用Typer4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本位点基因型。其中水牛产奶性状INSIG2基因A1258G、A1350C、G12529A、C12670T位点的基因分型结果见图1至图4。
5、关联分析
性状-标记关联分析的模型为：Yijklm＝μ+Yi+Pj+Sk+DIMl+Gm+eijklm,其中Yijklm为性状观察值；μ为均值,Yi为产犊效应,Pj为胎次效应,Sk为产犊季节效应；DIMl为泌乳天数效应,Gm为基因型效应,eijklm为随机误差。分析结果采用Bonferroni多重比较进行验证。结果表明，摩拉和杂交奶水牛INSIG2基因的A1258G、A1350C、G12529A、C12670T位点与产奶量显著相关(P<0.05)。由此获取了水牛产奶性状INSIG2基因的分子标记。
实施例3：与水牛泌乳相关基因INSIG2及其作为分子标记的应用
试验水牛群的品种是摩拉水牛、尼里-拉菲水牛及其杂交水牛群。在水牛群中对INSIG2基因A1258G、A1350C、G12529A、C12670T位点的不同基因型与水牛产奶性状进行关联分析。
水牛INSIG2A1258G、A1350C、G12529A、C12670T位点关联分析结果见表2所示。由表2中可以得出基因型与水牛产奶性状显著相关(P<0.05)。对A1258G位点，携带AA基因型的摩拉水牛个体产奶量高于GA和GG型个体；携带GG基因型的杂交水牛个体产奶量高于GA和AA型个体。对A1350C位点，携带AA基因型的摩拉水牛个体产奶量高于其他基因型的个体，而携带CC基因型的杂交水牛个体则较高。对G12529A而言，携带GG基因型的摩拉水牛个体产奶量高于AG和AA型个体；携带AA基因型的杂交水牛个体产奶量高于AG和GG型个体。对C12670T位点，携带CC基因型的摩拉水牛产奶量高于CT和TT基因型的个体，携带TT基因型的杂交水牛个体产奶量高于CC和CT基因型的个体。综上，可以应用INSIG2A1258G-AA、A1350C-AA、G12529A-GG以及C12670T-CC等基因型进行摩拉水牛的判定，选育高产摩拉水牛。而基于A1258G-GG、A1350C-CC、G12529A-AA以及C12670T-TT等基因型进行判定和选育高产杂交奶水牛。这对于组建高产奶水牛核心群具有重要意义。
表2 INSIG2基因A1258G、A1350C、G12529A、C12670T位点与水牛产奶量的关联分析
注：同行数据，不同字母表示差异极显著(P<0.05)；相同字母表示差异不显著(P>0.05)。
Claims (4)
1.与水牛泌乳性状相关的INSIG2基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中第1258bp、1350bp、12529bp、12670bp处有A1258G、A1350C、G12529A、C12670T单碱基突变，且该组SNP位点与水牛产奶量显著相关。
2.根据权利要求1所述的与水牛泌乳性状相关的INSIG2基因作为分子标记的应用，其特征在于：所述的应用是指用于奶水牛的选育。
3.根据权利要求2所述的与水牛泌乳性状相关的INSIG2基因作为分子标记的应用，其特征在于：所述奶水牛的选育包括以下具体步骤：
①对选育水牛进行静脉采取提取DNA样本；
②针对核苷酸序列SEQ ID NO:1中1258bp、1350bp、12529bp、12670bp处的SNP位点，利用飞行时间质谱仪检测上述步骤①中所述的DNA样本进行基因分型，利用Typer4.0软件检测质谱峰并判读各样本位点基因型。
4.根据权利要求3所述的与水牛泌乳性状相关的INSIG2基因作为分子标记的应用，其特征在于：应用INSIG2中的A1258G -AA、A1350C -AA、G12529A -GG及C12670T-CC的基因型进行判定和选育高产摩拉水牛；而基于A1258G -GG、A1350C -CC、G12529A -AA及C12670T-TT的基因型进行判定和选育高产杂交奶水牛。
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Application publication date: 20160427 Assignee: Guangxi Xingye Daoxiang Ecological Agriculture Technology Co.,Ltd. Assignor: GUANGXI ZHUANG AUTONOMOUS REGION BUFFALO INSTITUTE Contract record no.: X2023980045101 Denomination of invention: The INSIG2 gene related to buffalo lactation and its application as a molecular marker Granted publication date: 20180724 License type: Common License Record date: 20231102 |
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