CN115261485A - 一种地方鸡剩余采食量相关的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种地方鸡剩余采食量相关的分子标记及其应用。该SNP分子标记的位点在鸡的2号染色体第6369214号位，该位点的碱基由C突变为T。本发明通过MALDI‑TOF MS技术对PRKAG2中不同SNPs位点进行分型，并与饲料利用率性状进行关联分析，得到一组最佳的与剩余采食量RFI相关的位点，为鸡的饲料利用率性状的选育和分子标记辅助育种提供重要的参考依据，在高饲料利用率鸡新品种和新品系分子育种方面具有广阔的应用前景。

Description

一种地方鸡剩余采食量相关的分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种地方鸡剩余采食量相关的分子标记及其应用。

技术背景

家禽生产中，饲料成本占总成本的70％以上，提高畜禽的产出和生产价值，特别是肉用畜禽，努力提高饲料利用率是必然选项。

剩余采食量(FRI)是评价动物饲料效率的一个新的选择性状，它是实际采食量与预测采食量之间的差值。剩余采食量与机体组成、营养物质的消化率、新陈代谢能力、基础代谢、能量效率、活动量、免疫反应等生物学因素密切相关，选择低剩余采食量的个体可以提高饲料利用率，降低饲养成本，是提高经济家禽养殖效益关键因素之一。

地方鸡是家鸡因不同地区的自然条件、农业生产、饲养管理方式和社会需要等条件下，经长期选育出来的品种，目前我国地方鸡约有60种之多，其中包括文昌鸡、桃源鸡等优质品种。地方鸡是一种重要的地方家禽资源，其各具一定的优良特性或特征，特别是具有适应当地环境条件，耐粗饲，抗病力强，肉质优良等特点，是进行新品系选育或培育新品种重要的原始材料。

地方鸡种采食量就单纯采用常规选择，其遗传改良效率不高，利用基因标记进行分子标记辅助选育可以从遗传上根本改良选择性状，从而加速遗传进展。剩余采食量作为鸡遗传改良工作中的一种重要经济性状，尚缺乏用于鉴定的分子标记。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种地方鸡剩余采食量相关的SNP分子标记，该SNP分子标记的位点在地方鸡的2号染色体第6369214号位，该位点的碱基由C突变为T。所述地方鸡是指皖南三黄鸡或淮北麻鸡或淮南麻黄鸡或五华鸡或天长三黄鸡。

优选的，所述SNP分子标记的序列如SEQ ID NO：1所示，所述SEQ ID NO： 1所示序列自5’端起第450位碱基是T。

上述SNP分子标记的应用包括：所述SNP分子标记用于预测或辅助预测高饲料利用率地方鸡；或所述SNP分子标记用于选育不同饲料利用率地方鸡。

本发明提供一种用于检测如上述SNP分子标记的引物，其上游引物的序列如 SEQID NO.2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，延伸引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供一种上述SNP分子标记在制备检测地方鸡饲料利用率的试剂盒中的应用。

本发明提供一种用于检测上述SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测SNP分子标记的引物，所述引物中，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，延伸引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种利用上述SNP分子标记筛选高饲料利用率地方鸡的方法，具体为：检测地方鸡的2号染色体上第6369214号位点的基因型，基因型为CC 的个体为高饲料利用率鸡。

优选的，筛选高饲料利用率地方鸡的方法，包括以下步骤：

S1.提取待测地方鸡的总DNA，对提取到的DNA进行PCR扩增，得到PCR 扩增产物；所述PCR扩增使用的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO.2，下游引物的序列为SEQ IDNO.3；

S2.在PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；

S3.筛选出2号染色体上第6369214号位点的基因型为CC的个体。

本发明的有益效果在于：

本发明通过MALDI-TOF MS技术对地方鸡的PRKAG2中不同SNPs位点进行分型，并与饲料利用率性状进行关联分析，得到一组最佳的与剩余采食量RFI 相关的位点，为皖南三黄鸡、淮北麻鸡、淮南麻黄鸡等地方鸡的饲料利用率性状的选育和分子标记辅助育种提供重要的参考依据，在高饲料利用率鸡新品种和新品系分子育种方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例中提取DNA的凝胶电泳图。

图2为选取的4个SNPs位点在695个个体上进行时间飞行质谱的分析，4 个位点均为有效位点；其中图2A为位点rs314488327，图2B为位点rs731773051，图2C为位点rs734287518，图2D为位点rs735988950。

具体实施方式

为了便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案做出更为具体的说明：

实施例1

1.试验材料

1.1试验动物

本试验中的试验动物为皖南三黄鸡，由安徽省级保种场所提供。选择体重相近、系谱记录完整、健康皖南三黄鸡，按照比例组建家系，进行人工授精，人工孵化并且收集鸡蛋。等出雏时，辨别公母、戴翅号，之后进行正常饲喂。本试验所有的鸡进行混合饲养一直到56日龄。之后放到个体笼里饲养，试验一直到98 日龄结束。

1.2饲养管理

56日龄进行称重，选取800只体重相近的鸡，之后放到个体笼里饲养，保证鸡自由采食和饮水。在此期间可以每天检查鸡槽里面的饲料量，出现采食量比较快的话，需及时补充饲料，并记录日期。一周一次称取剩余的饲料量，之后再重新放入新的饲料，然后再重复一次。试验一直到98日龄结束。试验鸡日粮表如表1所示，表中标注为质量比例。

表1试验鸡日粮表

记录56日龄体重(BW₅₆)、98日龄体重(BW₉₈)、采食量(FI)，计算日增重(averagedaily weight gain,ADG)以及日采食量(average daily feed intake,ADFI)、饲料转化率(feed conversion ratio,FCR)剩余采食量(residual feed intake,RFI)。剩余采食量(RFI)的计算公式如下：

RFI＝FI–(c₀+c₁×MBW^0.75+c₂×ADG)

其中，FI为个体日采食量；MBW^0.75为平均代谢体重；ADG为平均日增重； c₀为截距，c₁、c₂为回归系数。采用SAS 9.4软件中的线性拟合函数来计算RFI 值。

1.3组织样品采集

对表型数据进行统计分析，分析剩余采食量性状的变化规律。剔除表型不完整的个体后，随机选取695只鸡，翅下静脉采集血液1.5mL，并存于2.5mL抗凝管中，之后置于-20℃冰箱中保存备用。

1.4实验仪器

表2主要实验仪器及生产厂家

1.5主要药品与试剂

表3主要药品及生产厂家

2.实验过程及结果分析

2.1血液DNA提取

参考试剂盒说明书，血样从-20℃冰箱中取出并且混匀后取5μL的血样加入到2mL无RNA酶离心管中，然后在加缓冲液GA补足200μL，再加入20μL的蛋白酶K溶液，混匀。继续加GB 200μL缓冲液，然后进行颠倒混匀3min左右，再放到70℃的水浴锅中静置10min左右，加无水乙醇200μL，将其混匀15s，等待出现絮状沉淀。将得到的絮状沉淀放到吸附柱CB3中用12000rpm的转速离心30s，然后倒掉废液，将吸附柱CB3放到收集管中，依次加入含有缓冲液GD 的无水乙醇和含有漂洗液PW的无水乙醇，离心去除废液，将吸附柱放到无酶的离心管中，然后再向吸附膜中间部位悬空加100μL的洗脱缓冲液TE，在室温静置5min，12000rpm的转速再空转离心2min，最后将溶液收集到离心管中并放到-20℃冰箱中保存。

2.2DNA鉴定与浓度检测

制作一个浓度含有1.5％的琼脂糖凝胶，染料为EB(0.5μg/mL)；每个胶孔各加5μL：分别取出3μL ddH₂O、1μL 6×loading Buffer上样缓冲液以及2μL DNA 原液。然后进行混匀，混匀之后用移液枪分别吸5μL加到每个胶孔中，用Marker 作标记，电泳电压为5V/CM，电泳时间为25min。

然后用NanoDrop 2000核酸蛋白测定仪记录所提取的DNA原液浓度。先用 DEPC水清洗探针，并清洗3遍，然后再用最后稀释DNA的缓冲液将仪器调至到零，最后再吸取1μLDNA原液进行浓度测定。

琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，DNA条带单一且清晰可见，没有拖尾现象。说明提取的血液DNA质量好，可进行下一步试验。

2.3引物设计

PRKAG2(编码磷酸腺苷酸激活蛋白酶)，在细胞中是作为代谢感受器的角色，但是在是动物体中是作为物质代谢以及能量平衡调节的作用，同时对动物采食、消化及营养物质吸收具有重要的调控作用。

从NCBI数据库以及Ensembl数据库查询鸡PRKAG2基因的SNPs位点，选择处于启动子(promoter)区或外显子(exon)的SNPs位点。然后按照筛选出来的SNPs位点采取AssayDesign 3.1软件对每一个位点先设计引物多重PCR反应以及延伸物，之后选择出比较好的引物。最后对每对引物用PCR进行检测，看看引物的特异性，保证PCR反应效果。

选取的位点和设计的引物信息如下表4所示。

表4 PRKAG2基因SNPs位点引物设计

2.4 MALDI-TOF MS飞行质谱分析

2.4.1多重PCR反应

反应条件为：dddH₂O 1.8μL,10×buffer 0.5μL,MgCL₂ 0.4μL,dNTP 0.1μL,Hotstar 0.2μL,上游引物、下游引物各1.0μL,待检测DNA样品(20～50ng)1μL。反应总体积为5.0μL。

反应程序为：95℃预变性2min；再经过45个循环，每个循环包括95℃变性 30s、56℃复性30s、72℃延伸60s；然后72℃延伸5min、最后4℃保存；

2.4.2SAP消化

使用虾碱性磷酸酶(SAP酶)对PCR产物消化处理，可以消除上步反应残留的dNTP，保证下一步单碱基延伸的成功率。

过程为：加入dddH₂O 1.53μL,SAP Buffer 0.17μL,SAP Enzyme 0.30μL的顺序配制，总体积为2.0μL。SAP酶消化的反应程序为：37℃，40min，85℃，5min， 25℃停止反应。

2.4.3单碱基延伸反应

反应程序为：加入双蒸水0.619μL，10×iplex buffer 0.20μL，Terminator mix0.20μL，引物0.94μL，单碱基延伸酶0.041μL的顺序来制作单碱基延伸反应混合液(Mix)，整个发生反应的体积溶液为2.0μL。延伸反应程序为：94℃预变性 30s，40个外部循环：94℃，5s，52℃，5s，80℃，5s；5个内部循环：52℃， 5s，80℃，5s；72℃，3min；25℃停止反应。

2.4.4质谱仪检测反应产物

将已完成全部反应过程的产物进行上机检测。具体步骤为：将反应产物的384 孔板中加入16μL双蒸水，在离心机中离心2000转，离心3min；加入树脂，在反转摇匀仪上做树脂纯化反应35min，脱盐；反应完成后在离心机中离心3min (2000转/分)，将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。使用质谱芯片上机，质谱仪对孔芯片的每个孔随机进行次取样，分析处理并收集数据。

如图2A-2D所示，对4个SNPs位点MALDI-TOF MS飞行质谱的分析表明， 4个SNPs位点均有效。把PRKAG2基因的SNPs位点进行基因分型，得到鸡 PRKAG2基因SNPs位点的频率统计及其与生长性状的关联分析。

基因型频率是指一个群体中某一性状的各种基因型之间的比率。计算公式如下：

P_BB＝N_BB/N

其中P_BB代表某一位点的BB基因型频率；N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数；N为检测群体的总数量。

基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式可写成：

PB＝(2N_BB+N_Bb1+N_Bb2+N_Bb3+N_Bb4+……+N_Bbn)/2N

式中，P_B表示等位基因B频率，N_BB表示群体中具有BB基因型的个体数量， N_Bbi表示群体中具有Bbi基因型个体数量，b1～bn为等位基因B的n个互不相同的复等位基因。

如表5所示，PRKAG2基因rs314488327、rs731773051、rs734287518和 rs735988950位点都符合Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。rs314488327位点有三种类型基因型分别是AA、CA和CC；rs731773051位点有两种类型的基因型，分别是CC和CA；rs734287518位点有三种类型的基因型分别是TT、CT和CC；rs735988950位点有三种类型的基因型分别是TT、TC和CC。

表5 PRKAG2基因SNPs位点的基因型频率和等位基因频率

2.5位点与饲料利用率显著性分析

用SPSS 20.0软件对PRKAG2多态性与鸡生长和饲料利用率性状的相关性分析，用SPSS软件一般线性模型分析，结果如下表6所示，PRKAG2基因rs314488327 位点与FCR显著相关(P<0.05)；rs731773051位点和ADFI、ADG、FCR、MBW^0.75和RFI无显著相关(P>0.05)；rs734287518位点与RFI显著相关(P<0.05)； rs735988950位点与FCR显著相关(P<0.05)。

由于饲料转化效率是一个比例性状，存在一些弊端，不能很好地反应维持和生长的采食量需要，因此很难对不同动物个体之间饲料利用率进行比较。综上，选取RFI作为衡量饲料利用率的重要指标，并选取与RFI极显著相关的位点 rs734287518作为主要研究对象。

表6 PRKAG2基因多态性与鸡饲料利用率性状的显著性分析

注：“*”表示差异显著P<0.05，标注“**表示差异极显著P<0.01.

2.6不同基因型与饲料利用率的关联性分析

将rs734287518位点与饲料利用率进行关联分析，得到如表7所示的结果。

表7不同基因型与饲料利用率的关联性分析

注：不同小写字母表示为差异显著(P<0.05)。

由表7可知，总个体数是695，其中CC型个体517个，CT型个体163个， TT型个体15个。CC型个体RFI值显著低于CT型和TT型个体(P<0.05)，因此，rs734287518位点的CC型个体即为最佳饲料利用率个体。

地方鸡由于长时间未受到系统选择，其群体中基因型频率比较稳定，不同品种之间的基因型频率差异很小。因此，根据皖南三黄鸡所挑选的基因也适用于淮南麻黄鸡、淮北麻鸡、五华鸡和天长三黄鸡等其他地方品种的鸡。

上述试验表明本发明所述的分子标记与鸡剩余采食量性状具有关联性，利用该分子标记对鸡剩余采食量进行检测是可行性的。

以上实施方式仅用以说明本发明的技术方案，而并非对本发明的限制；尽管参照前述实施方式对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种地方鸡剩余采食量相关的SNP分子标记，其特征在于，该SNP分子标记的位点在地方鸡的2号染色体第6369214号位，该位点的碱基由C突变为T，所述地方鸡是指皖南三黄鸡或淮北麻鸡或淮南麻黄鸡或五华鸡或天长三黄鸡。

2.根据权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的序列如SEQ IDNO：1所示，所述SEQ ID NO：1所示序列自5’端起第450位碱基是T。

3.一种如权利要求1或2所述的SNP分子标记的应用，其特征在于，所述SNP分子标记用于预测或辅助预测高饲料利用率的所述地方鸡；或所述SNP分子标记用于选育不同饲料利用率的所述地方鸡。

4.一种用于检测如权利要求1或2所述的SNP分子标记的引物，其上游引物的序列如SEQID NO.2所示，下游引物的序列如SEQ ID NO.3所示，延伸引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

5.一种如权利要求1或2所述的SNP分子标记在制备检测地方鸡饲料利用率的试剂盒中的应用。

6.一种用于检测如权利要求1或2所述的SNP分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测SNP分子标记的引物，所述引物中，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示，延伸引物的序列如SEQ ID NO.4所示。

7.一种利用如权利要求1或2所述的SNP分子标记筛选高饲料利用率地方鸡的方法，其特征在于，检测地方鸡的2号染色体上第6369214号位点的基因型，基因型为CC的个体为高饲料利用率鸡。

8.如权利要求7所述的筛选高饲料利用率地方鸡的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.提取待测地方鸡的总DNA，对提取到的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述PCR扩增使用的引物对，其上游引物的序列为SEQ ID NO.2，下游引物的序列为SEQ ID NO.3；

S2.在PCR扩增产物进行测序，获得测序结果；

S3.筛选出2号染色体上第6369214号位点的个体基因型为CC。

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