CN112746114A - 一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记及其鉴定方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记及其鉴定方法和应用，属于分子标记技术领域，该分子标记为基于氨基葡萄糖转运蛋白基因GLUT2开发的多态性突变位点，包括氨基葡萄糖转运蛋白GLUT2编码基因的第455位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，所述氨基葡萄糖转运蛋白GLUT2编码基因的第455位为A或T的多态性突变位点。本发明通过鉴定该分子标记在地方土鸡基因组中存在的类型，可以在早期通过分子标记筛选来判断土鸡的饲料转化效率，为地方土鸡饲料利用效率选育提供了直接的技术手段，通过早期选育，降低饲养成本、减少人力劳动消耗的同时，从遗传上根本改良了饲料转化率，从而加速遗传选育进展。

Description

一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记及其鉴定方法 和应用

技术领域

本发明涉及的是分子标记技术领域，尤其涉及一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记及其鉴定方法和应用，具体为一种基于氨基葡萄糖转运蛋白基因GLUT2的早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记及其鉴定方法和应用。

背景技术

肉鸡养殖中饲料成本高达养殖成本的70％，如何提高饲料效率成为肉鸡生产者们最为关注的问题。饲料转化率(FCR)常用于评价动物饲料效率的指标，通常用动物某一时间段的进食量与体增重或蛋重的比值表示，该指标计算和应用起来十分简单有效。经过长期的遗传选择改良，家禽饲料转化率得到了快速的改善，并显著提高了家禽养殖的经济效益。饲料转化率受多种因素影响，如遗传、饲料、饲养周期和饲养环境等。现代集约化养殖条件下，同一鸡舍肉鸡生长速度基本不受环境和营养水平影响，但同一鸡群中饲料效率有较大差异，这可能与个体差异或遗传有关。FCR的遗传力在0.25-0.4，为中度遗传力性状，因此可通过遗传选育提高FCR。传统的FCR选育手段是通过表型数据收集，保留饲料转化效率高的个体。传统选育手段是基于个体单笼饲养、个体饲喂和称重，以计算饲料转化效率的基础上实现的。该方法不仅人力劳动强度大，养殖成本高，并且耗时以及不能完全剔除杂合基因对饲料转化效率的影响。

饲料转化效率(FCR)属于经济性状，因采用表型选择而导致选育进展缓慢，利用分子标记辅助选择，可以加快肉鸡饲料转化率性状的遗传改良。关于肉鸡饲料转化率相关的分子标记目前已有报道，但基于氨基葡萄糖转运蛋白基因GLUT2的地方土鸡饲料转化率的分子标记开发，目前尚未报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记及其鉴定方法和应用，以基于氨基葡萄糖转运蛋白基因GLUT2开发一种新的与地方土鸡饲料转化率相关的分子标记及提供一种新的鉴别方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记，所述分子标记包括氨基葡萄糖转运蛋白GLUT2编码基因的第455位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，所述氨基葡萄糖转运蛋白GLUT2编码基因的核苷酸序列在NCBI的登录号为

Ensembl:ENSGALG00000009306，全长7707bp，所述氨基葡萄糖转运蛋白GLUT2编码基因的第455位为A或T的多态性突变位点。

作为本发明的进一步优化方案，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，为GLUT2基因PCR扩增区域的861bp核苷酸序列。

作为本发明的进一步优化方案，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，为GLUT2基因PCR扩增区域的290bp核苷酸序列。

本发明还提供了上述分子标记在地方土鸡饲料转化率早期选择中的应用。

本发明还提供了一种利用上述分子标记早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，即判断待测地方土鸡组织细胞中所含有的分子标记的多态性突变位点的碱基类型，若待测地方土鸡组织细胞中含有的分子标记的多态性突变位点的碱基类型为AA纯合型，则为饲料转化率高的地方土鸡品种，若为含有T的AT杂合型或TT纯合型，则为饲料转化率低的地方土鸡品种，进而实现对地方土鸡品种饲料转化率的筛选。

作为本发明的进一步优化方案，所述早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测地方土鸡鸡血总DNA；

(2)以所述分子标记设计特异性扩增引物，再以步骤(1)的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物；

(3)采用MfeⅠ-HF酶切PCR扩增产物，获得酶切产物，用于MfeⅠ-HF酶切识别位点为C/AATTG，因此，当该分子标记位点由A突变为T时，不能被MfeⅠ-HF酶识别；

(4)电泳检测酶切产物，判断基因型，通过基因型实现对地方土鸡饲料利用效率的快速遗传鉴定，即：

若酶切产物包含1个条带，分子量显示低于500bp，则为AA纯合型；

若酶切产物包含2个条带，则为AT杂合型；

若酶切产物包含1个条带，分子量为861bp，则为TT纯合型。

作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(2)的特异性扩增引物为：

F1：5'GGAACTGCCAGGGAAGAA 3'

R1：5'GACCTCACCCGCCTCAT 3'

扩增的分子标记序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明的进一步优化方案，所述早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，包括以下步骤：

(一)以已知为AA或TT基因型的地方土鸡作为参照组，提取待测地方土鸡样本和参照组地方土鸡鸡血总DNA；

(二)以所述分子标记设计特异性扩增引物，再以步骤(一)的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物；

(三)采用SSCP方法检测PCR扩增产物，判断基因型，通过基因型实现对地方土鸡饲料利用效率的快速遗传鉴定；

若扩增产物电泳出现3条带，则为AT杂合型；

若扩增产物电泳出现2条带，则通过比较待测样本带型是否与参照组的带型一致，若一致，则该待测地方土鸡的基因型与参照组相同，反之则不同。

作为本发明的进一步优化方案，所述步骤(二)的特异性扩增引物为：

F2：5’-GTTCCTGGCTGGTCTGATGG-3’

R2：5’-ATTCAGACAAGTAGGGGCTGC-3’

扩增的分子标记序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的原理为：饲料转化率与个体能量消耗密切相关，葡萄糖是维持细胞能量代谢和生命活动的重要原料，小肠吸收的葡萄糖通过血液循环流向体内的各个组织和器官，提供能源和其他碳水化合物的最初前体。小肠内葡萄糖运输依赖于小肠基底部上皮细胞膜上跨膜糖蛋白氨基葡萄糖转运蛋白(GLUT2)，GLUT2表达量在个体间存在明显差异，进而导致个体对饲料营养吸收存在差异。因此，本发明通过研究GLUT2在群体内个体间因遗传多样性而产生的表达差异，并与个体饲料转化效率关联分析，进而筛选出本发明的用于FCR性状选育的有效分子标记。

本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记及其鉴定方法和应用，该分子标记为基于氨基葡萄糖转运蛋白基因GLUT2开发的能够影响其表达量的多态性突变位点，通过鉴定该分子标记在地方土鸡基因组中存在的类型，可以在早期通过分子标记筛选来判断土鸡的饲料转化效率，为地方土鸡饲料利用效率选育提供了直接的技术手段，通过早期选育，降低饲养成本、减少人力劳动消耗的同时，从遗传上根本改良了饲料转化率，从而加速遗传选育进展。

附图说明

图1为该分子标记的核苷酸位点图；

图2为实施例1部分样本的PCR产物电泳图；

图3为实施例1部分样本的酶切产物电泳图；

图4为实施例2的PCR扩增产物SSCP电泳图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种利用所述分子标记早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，步骤包括：

(1)取585只待测地方土鸡为待测样本，分别提取该585只土鸡的鸡血总DNA。

(2)以SEQ ID NO.1所示的分子标记为模板设计特异性扩增引物，再以步骤(1)的DNA为模板，进行PCR扩增；其中：

特异性扩增引物为：

F1：5'GGAACTGCCAGGGAAGAA 3'

R1：5'GACCTCACCCGCCTCAT 3'

PCR扩增条件为：94℃预变性30min；94℃变性30s，60-66℃退火30s，72℃延伸1min，共30-40个循环；72℃延伸5min；4℃保存；

PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix(vazyme)，反应体系为F 0.5μl，R 0.5μl，全基因组DNA 1μl，ddH₂O 8μl，2×Taq PCR Master Mix 10μl，总计20μl体系。

结果如图2所示，获得长度为861bp的PCR产物。

(3)采用MfeⅠ-HF酶切PCR扩增产物，获得酶切产物，用于MfeⅠ-HF酶切识别位点为C/AATTG，因此，当该分子标记位点由A突变为T时，不能被MfeⅠ-HF酶识别，电泳检测酶切产物，实现对地方土鸡饲料利用效率的快速遗传鉴定，具体为：

Ⅰ、包含1个条带，分子量显示低于500bp，则为AA纯合型；

Ⅱ、包含2个条带，则为AT杂合型，

Ⅲ、包含1个条带，分子量为861bp，则为TT纯合型。

结果如图3所示(部分样本结果)，其中AA为纯合型，共检测出287只，AT为杂合型，共检测出240只，TT为纯合型，共检测出58只。

检测各基因型样本土鸡10-16周龄间饲料消耗与体增重，计算料重比，结果如表1所示：

表1不同基因型料重比

料重比是指育牲畜增加1千克体重(活重)和需要消耗的饲料重量之比，也可称为饲料报酬或饲料利用效率，料重比越低，说明每千克饲料转化为体重的效率越高，即饲料转化率越高，表1结果与本发明的预测结果一致，证明了本发明可行性，即本发明的分子标记可以作为鉴别地方土鸡饲料利用效率的指标。

实施例2

本实施例提供的一种利用所述分子标记早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，步骤包括：

(一)以已知为AA基因型的地方土鸡作为参照组样本，以大群中所有公鸡为待测地方土鸡样本，提取待测样本和参照组样本鸡血总DNA；

(二)在实施例1基础上减小扩增长度，以SEQ ID NO.2所示的分子标记设计特异性扩增引物，再以步骤(一)的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物；其中：

特异性扩增引物为：

F2：5’-GTTCCTGGCTGGTCTGATGG-3’

R2：5’-ATTCAGACAAGTAGGGGCTGC-3’

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58-61℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸3min；4℃保存；

PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix(vazyme)，反应体系为F 0.5μl，R 0.5μl，全基因组DNA 1μl，ddH₂O 8μl，2×Taq PCR Master Mix 10μl，总计20μl体系。

(三)PCR扩增产物检测：采用SSCP方法检测PCR扩增产物；

若扩增产物电泳出现3条带，则为AT杂合型；

若扩增产物电泳出现2条带，则通过比较各待测样本带型是否与参照组样本的带型一致，若一致，则为AA纯合型，若不一致，则为TT纯合型。

如图4所示，已知的AA型参照组样本为第8泳道，1-7为部分待测样本，其中，泳道1、7扩增了3条带，为AT型；泳道2、3、4、6的带型与泳道8一致，为AA型，泳道5的带型与泳道8不一致，为TT型。同样，也可以以已知的TT型土鸡作为参照组样本，通过比较带型来判断基因型。

以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120>一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记及其鉴定方法和应用

<141> 2021-02-01

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 861

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 1

ggaactgcca gggaagaact tctgactcca gttgccacac aggcaagctg cagtggtctc 60

gaccacatga gctaaaagag taggtgtgag atgtgaggtg cggtggtggt aatgagctgt 120

ttgctgcgaa cagacctgac tgacccttgt aagagcaggg atgctaggga ctgatcatgc 180

atgtgtttct gcaggtcttc ctggtggaga aggcaggcag gcgctcgctg ttcctggctg 240

gtctgatggg catgttaatc agtgctgtgg ccatgacggt tggacttgtg ctcctggtaa 300

ggcttcatct ccactttttc tctgtatttt gcaaatgaga agagatagca ttcctcaagg 360

tgaaagcttt gcatgttcat cttcatctca tactggtttg gaaaatactt gtccctacaa 420

gggacaaaat ggcaattgct ggagctgttt tttgtcatgt agcgcctggg gacattgcac 480

tctttgtgtc ctgcatgtgc agcccctact tgtctgaata acgagtgatt tccgaaaaag 540

aaacttaatt aattagcagt aatcaatgag aatcgtgtca aaaccttaat accaagtgca 600

tcctcttgca gagccagttc gcctggatga gttatgtcag catggtcgcc atcttcctct 660

tcgttatatt cttcgaagtt gggcctgggc ccatcccctg gttcattgta gctgagctgt 720

tcagccaagg cccacgtcct gccgccatcg ccgttgctgg cttctgcaac tgggcctgca 780

acttcattgt gggaatgtgc ttccagtaca tcgcggtaag aaacctccct aaaacagtac 840

caacatgagg cgggtgaggt c 861

<210> 2

<211> 290

<212> DNA

<213> 鸡(chicken)

<400> 2

gttcctggct ggtctgatgg gcatgttaat cagtgctgtg gccatgacgg ttggacttgt 60

gctcctggta aggcttcatc tccacttttt ctctgtattt tgcaaatgag aagagatagc 120

attcctcaag gtgaaagctt tgcatgttca tcttcatctc atactggttt ggaaaatact 180

tgtccctaca agggacaaaa tggcaattgc tggagctgtt ttttgtcatg tagcgcctgg 240

ggacattgca ctctttgtgt cctgcatgtg cagcccctac ttgtctgaat 290

Claims (9)

1.一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记，其特征在于，所述分子标记包括氨基葡萄糖转运蛋白GLUT2编码基因的第455位碱基及其上下游碱基组成的核苷酸序列，所述氨基葡萄糖转运蛋白GLUT2编码基因的第455位为A或T的多态性突变位点。

2.根据权利要求1所述的一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的一种早期选择地方土鸡饲料转化率的分子标记，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.一种如权利要求1-3任一所述的分子标记在地方土鸡饲料转化率早期选择中的应用。

5.一种利用如权利要求1-3任一所述的分子标记早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，其特征在于，通过判断待测地方土鸡组织细胞中所含有的分子标记的多态性突变位点的碱基类型进行鉴定，若待测地方土鸡组织细胞中含有的分子标记的多态性突变位点的碱基类型为AA纯合型，则为饲料转化率高的地方土鸡品种，若为含有T的AT杂合型或TT纯合型，则为饲料转化率低的地方土鸡品种。

6.根据权利要求5所述的一种利用分子标记早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，其特征在于，所述早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测地方土鸡鸡血总DNA；

(2)以所述分子标记设计特异性扩增引物，再以步骤(1)的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物；

(3)采用MfeⅠ-HF酶切PCR扩增产物，获得酶切产物；

(4)电泳检测酶切产物，实现对地方土鸡饲料利用效率的快速遗传鉴定，即：

若酶切产物包含1个条带，分子量显示低于500bp，则为AA纯合型；

若酶切产物包含2个条带，则为AT杂合型；

若酶切产物包含1个条带，分子量为861bp，则为TT纯合型。

7.根据权利要求6所述的一种利用分子标记早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，其特征在于，所述步骤(2)的特异性扩增引物为：

F1：5'GGAACTGCCAGGGAAGAA 3'

R1：5'GACCTCACCCGCCTCAT 3'。

8.根据权利要求5所述的一种利用分子标记早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，其特征在于，所述早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，包括以下步骤：

(一)以已知为AA或TT基因型的地方土鸡作为参照组，提取待测地方土鸡样本和参照组地方土鸡鸡血总DNA；

(二)以所述分子标记设计特异性扩增引物，再以步骤(一)的DNA为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物；

(三)采用SSCP方法检测PCR扩增产物：

若扩增产物电泳出现3条带，则为AT杂合型；

若扩增产物电泳出现2条带，则通过比较待测样本带型是否与参照组的带型一致，若一致，则该待测地方土鸡的基因型与参照组相同，反之则不同。

9.根据权利要求8所述的一种利用分子标记早期鉴定地方土鸡饲料转化率的方法，其特征在于，所述步骤(二)的特异性扩增引物为：

F2：5’-GTTCCTGGCTGGTCTGATGG-3’

R2：5’-ATTCAGACAAGTAGGGGCTGC-3’。

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