CN105463018A - 转录因子cdxa调控鸡肠道内糖转运蛋白glut2表达的方法 - Google Patents

转录因子cdxa调控鸡肠道内糖转运蛋白glut2表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属分子生物学和基因工程技术领域，目的在提供一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法。包括构建转录因子CDXA的真核表达载体pcDNA3.1-CDXA，鸡小肠上皮细胞体外分离培养鉴定，运用阳离子脂质体介导法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞，转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA，绝对PCR荧光定量测定cDNA中CDXA的表达量与糖转运蛋白基因<i>GLUT</i>2的表达量。为家禽营养和育种的研究提供了部分基因表达调控信息，为阐明糖代谢过程中各基因间互作机制提供理论依据，为培育具有高饲料转化率遗传特性的优良鸡种提供生物分子水平上的研究基础。而且为以提高饲料转化率为目的的选育实践提供理论参考。

Description

转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法。
背景技术
饲料转化率是畜牧业衡量经济效益的重要指标，是由基础代谢、蛋白质沉积、消化能力、食欲、行为等多种性状互作的结果，受遗传、环境、性别和营养组分比例等因素的影响。有研究发现，通过控制饲料中各营养组分的比例可以在一定程度上调节畜禽的饲料转化率，如增加饲料中能量、蛋白质比例会提高饲料转化率，但应该注意的是，此举同时也会提高饲养成本。
在家禽养殖生产经营过程中，饲料成本占生产成本中比例很大，约为70%，所以，将优质饲料尽可能转化为鸡的体增重或产蛋量，或者在不影响鸡产量的前提下，减少现有饲料中某些营养成分的比例以减少饲喂浪费，在提高养殖业的经济效益方面起很重要的作用。从长远眼光看，在分子水平上，利用遗传育种的方法是提高鸡饲料转化率的最终有效途径。
肠道是鸡消化吸收营养物质的最主要场所，肠道的发育情况直接影响其对饲料中营养成分的吸收和利用，进而影响鸡的生长速率与饲料转化率。葡萄糖等糖类营养物质是机体内主要的能源物质，也是生物体内细胞结构物质，具有重要的生物学功能。肠道对糖类营养物质的吸收过程主要由糖营养转运蛋白完成，而糖营养转运蛋白基因的表达受多个转录调控因子的调控。
畜禽饲料转化率的高低直接影响生产的投入与回报，而营养物质中糖分的利用主要源于肠粘膜上皮细胞中钠/葡萄糖转运载体（sodium/glucosecotransporter，SGLT）和葡萄糖转运载体（glucosetransporter，GLUT）两类转运载体共同协作完成。其中SGLT家族中SGLT1通过主动运输将肠道内葡萄糖吸收转运至上皮细胞中，GLUT5通过易化作用将果糖吸收到细胞中，而位于肠上皮细胞基底的GLUT2蛋白主要负责将胞内的葡萄糖、果糖向组织间隙液和血液中传送，三种糖转运蛋白相互协作完成机体对糖类物质的吸收。肠道糖运输过程见图1。
GLUT家族中GLUT2是一种生物体内普遍存在的葡萄糖转运蛋白。由524个氨基酸组成，蛋白质的二级结构由12个跨膜的α螺旋组成，GLUT2基因位于3号染色体，定位于3q26.1～q26.3,共有11个外显子。GLUT2是一个对葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖亲和力不高的转运体，但对葡萄糖胺有较高的亲和力，且具有葡萄糖感受功能。有研究表明十二指肠同源框蛋白（Pdx1）与神经分化因子（NeuroD1）能共同诱导与β细胞功能相关的Nkx6.1转录因子和GLUT2的表达，而过表达的非结构5A蛋白（NS5A）能降低GLUT2的启动子活性，Yamamoto等用链脲菌素诱导大鼠致糖尿病模型中发现，低胰岛素和高血糖水平能增加小肠和肝脏GLUT2的表达，而在糖尿病小鼠胰腺中的GLUT2表达量显著下降，这表明除了葡萄糖和胰岛素外，还有其他转录因子对GLUT2的表达有调节作用。Farrell等发现从各种草药、香料、种子等组成的草药补充品中提取的多酚粗提液能够减少肠细胞系Caco-2中葡萄糖的转运，这一过程通过与糖转运蛋白GLUT2的交互作用共同完成。Leturque等研究发现患有糖尿病的试验小鼠体内肝脏和内分泌腺中GLUT2mRNA的表达量很高。Mace等研究发现糖转运蛋白GLUT2调控K细胞和L细胞内肠肽的分泌，该肠肽能够感应营养物并为释放GIP、GLP-1和PYY等内分泌素提供信号通路。Kellett等将试验小鼠小肠处于葡萄糖浓度不断升高的环境中，研究发现，为了满足吸收高葡萄糖所需的能力，位于肠顶膜的糖转运蛋白GLUT2的浓度和内在活性持续提高。这一现象由很多研究者利用小鼠、大鼠、肥胖病人等通过多个独立试验所证实。Gu等以MIN6为研究模型发现，人参在肠道的中代谢化合物K通过上调糖转运蛋白GLUT2基因的表达显著影响胰岛素分泌。因此，糖转运蛋白GLUT2在小肠糖吸收中的作用十分重要，但在鸡的小肠中研究报道很少。
饲料中的碳水化合物只有在肠道被分解为单糖后才能被吸收，而且糖类在家禽体内循环中的主要形式是葡萄糖、果糖、半乳糖。糖转运蛋白对糖类物质的吸收过程及其重要。其中，葡萄糖易化转运载体GLUT2主要表达于肾脏和小肠吸收上皮基底部的上皮细胞内，参与葡萄糖的吸收释放或重吸收过程，在肠上皮细胞和血浆葡萄糖浓度之间发挥平衡作用。George等研究发现在一些情况下GLUT2可转运至肠上皮细胞的顶膜而调节肠道对葡萄糖的吸收。Cheeseman认为位于基底膜的GLUT2同时转运葡萄糖和果糖，它是目前已知的唯一的一个对葡萄糖和果糖都具有转运能力的糖转运蛋白。GLUT2介导的易化扩散机制既能使细胞吸收增强也不会消耗多余能量。
同源盒基因(homeoboxgene)是在果蝇的研究中发现的一类基因，对生物的器官形成和细胞分化调控有着关键作用。在不同个体中其核酸序列中都含有一段180个碱基的保守序列，编码60个氨基酸，构成一个多肽区域，因此称之为同源盒(homeobox)或同源结构域(homeodomain)（同源盒基因在胃肠道发育与胃肠道肿瘤发生中有作用）。根据基因的序列及分布区域的不同，同源盒基因可以分为两大家族：HOX及PARAHOX家族，HOX家族包含HOX-A、B、C三个成员，PARAHOX则包含GSH、PDX和CDX。
CDX家族包括CDX1、CDX2和CDX4，CDX家族在小鼠发育时形态的形成过程中有重要的作用。尾侧型同源基因CDX1是属于同源盒基因CDX家族的一个转录因子，禽类中称之为CDXA，编码260个氨基酸，含有三个外显子和两个内含子，蛋白定位于细胞核，与其他同源盒基因一样，CDXA转录因子通过螺旋-转角-螺旋（Helix-turn-helix）结构识别并结合在受调控基因的5′调控区序列，对下游基因表达进行调控。有研究表明，通过同源重组对小鼠CDX1基因进行敲除，小鼠可以正常生长，但其颈椎发生了前移的异常现象。在小鼠胚胎直肠的形成时期，CDXA基因的异常表达可导致肛门直肠畸形（ARM）。现在国内外对CDXA基因的研究主要集中于胃癌与胃肠化生的预防和治疗中。文献报道，在正常胃黏膜中没有CDXA基因的表达，而在胃肠化生型组织中有CDXA基因的检出，因此认为CDXA转录因子能促进上皮细胞的分化成型。CDXA转录因子在鸡的消化道中特异表达于十二指肠至直肠，主要集中在小肠与小肠隐窝，而在其他正常的消化道中不表达。其促进上皮细胞生长分化，在消化道内皮的脱落补充过程中发挥重要的作用。在某些表达CDXA蛋白的报告基因表达系统中，含有CDXA元件的载体能够增强基因的转录活性。CDXA作为转录调控因子，特异表达于消化道的小肠中，其势必会对部分下游基因有调控作用。
尾侧型同源基因CDXA是属于同源盒基因CDXA家族的一个转录因子，主要控制肠上皮细胞的增殖与分化，并有研究发现CDXA转录因子过表达能促进葡萄糖-6-磷酸酶的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法。
本发明由如下技术方案实现的：一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法，包括构建转录因子CDXA的真核表达载体pcDNA3.1-CDXA，鸡小肠上皮细胞体外分离培养及鉴定，运用阳离子脂质体介导法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞，转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA，绝对PCR荧光定量测定cDNA中目的基因CDXA的表达量与糖转运蛋白基因GLUT2的表达量。
具体包括如下步骤：
1.构建真核表达载体pcDNA3.1-CDXA：
A.引物设计：NCBI中查找鸡转录调控因子CDXA基因序列信息，按查到的基因序列应用Primer3.0进行在线引物设计，在CDXA上下游引物的5′末端分别添加双限制性酶切位点HindIII和EcoRI；引物设计见表1，其中AAGCTT和GAATTC为添加的限制性内切酶位点；
表1引物
B.PCR扩增相应的基因片段：以鸡小肠总RNA反转录成的cDNA第一链为模板，采用设计好的PCR引物扩增基因CDXA的相应片段；
C.PCR产物的纯化回收、克隆与测序：按照北京全式金生物技术有限公司的割胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化回收，纯化得到的PCR产物连接转化，扩大培养的菌液进行测序，测序正确的菌液进行质粒的提取，用微量核酸测定仪测定质粒的浓度和纯度；
D.pcDNA3.1-CDXA的制备：用HindⅢ与EcoRⅠ分别酶切CDXA质粒和pcDNA3.1质粒，回收之后，将两者用T4DNA链接酶进行4℃过夜连接；
E.重组子的转化：所制备的pcDNA3.1-CDXA连接产物加入到感受态大肠杆菌DH5α中，在PCR仪中42℃90s热激反应，反应结束后将菌液中的菌体复苏；复苏后的菌体进行液体扩大培养，然后将扩大培养的菌体测序；
F.质粒的提取：测序正确的菌液进行质粒提取；具体操作步骤参照Omega公司去内毒素质粒提试剂盒。
2.鸡小肠上皮细胞体外分离培养及鉴定：取15日龄鸡胚，无菌操作取出小肠，去除肠系膜分离小肠并清洗干净小肠组织块；采用嗜热菌蛋白酶HEPES消化液进行酶消化组织块，使其形成细胞玄烨，采用相差贴壁法培养鸡小肠上皮细胞，培养好鸡小肠上皮细胞接种于细胞培养板，至于40℃7%CO2培养箱内培养；将培养好的鸡小肠上皮细胞采用倒置相差显微镜进行形态学鉴定，通过免疫组化进行细胞鉴定；
3.运用阳离子脂质体介导法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞；
4.转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA：首先收集转染后的鸡小肠上皮细胞，用37℃水浴30min预热好的PBS缓冲液反复冲洗的收集好的转染后的鸡小肠上皮细胞，然后提取细胞RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和稳定性，然后将RNA反转录为cDNA；
5.设计引物，在NCBI中，查找鸡转录调控因子CDXA与GLUT2基因序列信息，按照查到的基因序列应用Primer3.0进行在线引物设计，引物设计见表2，
表2引物
6.样品cDNA中目的基因表达量测定：用绝对荧光定量PCR测定pcDNA3.1-CDXA转染试验中空白对照组、阴性对照组和质粒转染组目的基因的表达量；
7.数据统计分析：应用SAS8.1统计软件中的Duncans方法对数据进行多重比较，分析CDXA基因的过表达对GLUT2基因的表达的影响。
所构建的真核表达载体pcDNA3.1-CDXA全长6411bp，CDXA插入位点为917～1894bp。
本发明将CDXA基因序列连接至pcDNA3.1真核表达载体，成功转入鸡小肠上皮细胞中。通过绝对荧光定量的方法，对转染细胞中各基因表达量的测定，显示在CDXA基因过表达后表达载体组GLUT2mRNA的表达量显著低于空细胞与阴性对照组。进一步说明转录因子CDXA过表达对小肠上皮细胞中GLUT2基因的表达有抑制作用。
选用的真核表达载体pcDNA3.1(+)属于哺乳动物细胞表达载体，含有CMV早期启动子、原核序列、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸序列等，可以携带外源基因在体外分离培养的细胞中稳定、高效表达。其中，CMV基因组大小为229kb，属疱疹病毒亚β科，CMV早期启动子具有很高的活性并且没有明显的组织特异性，所以能够使pcDNA3.1(+)在多种不同类型的细胞中具有活性，使其不受环境条件影响而稳定表达。另外，真核表达载体pcDNA3.1(+)有便于测序的T7通用引物进行DNA测序，使相关测序工作简单、易行。
本发明为家禽营养和育种的研究提供了部分基因表达调控信息，为阐明糖代谢过程中各基因间互作机制提供理论依据，而且为培育具有高饲料转化率遗传特性的优良鸡种提供生物分子水平上的研究基础。本发明不仅对研究鸡肠道营养吸收的分子调控机理有重要的理论意义，而且可以为以提高饲料转化率为目的的选育实践提供理论参考。
附图说明
图1为肠道糖运输过程图；图2为CDXA基因PCR扩增产物电泳图，图中：M表示DNA5000Marker；1表示CDXA基因PCR产物；图3为真核表达载体的酶切鉴定结果图，图中：M：DNA5000Marker；1：pcDNA3.1-CDXA基因双酶切产物；2：pcDNA3.1-CDXA环状质粒；图4为pcDNA3.1-CDXA质粒图，图5为CDXA在GLUT2基因调控区结合位点，图6为转染48h后鸡小肠上皮细胞形态变化图（×200），图中：A：空白对照组；B：阴性对照组；C：质粒转染组；图7为鸡小肠上皮细胞免疫组化鉴定图400×，图中：A：对照组；B：试验组；图8为pcDNA3.1-CDXA转染鸡小肠上皮细胞后RNA电泳图，图中：1：空白对照组；2：阴性对照组；3：质粒转染组；图9为鸡小肠基因GLUT2标准曲线见图9，图10为所获得的基因GLUT2熔解曲线；图11为鸡小肠基因CDXA标准曲线，图12为所获得的基因CDXA熔解曲线；图13为样品GLUT2基因熔解曲线；图14为pcDNA3.1-CDXA转染鸡小肠上皮细胞后GLUT2绝对表达量分析图，图中：*表示：P＜0.05，差异显著；**表示：P＜0.01，差异极显著。
具体实施方式
一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法，包括构建转录因子CDXA的真核表达载体pcDNA3.1-CDXA，鸡小肠上皮细胞体外分离培养及鉴定，运用阳离子脂质体介导法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞，转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA，绝对PCR荧光定量测定cDNA中目的基因CDXA的表达量与糖转运蛋白基因GLUT2的表达量。
具体包括如下步骤：
1.构建真核表达载体pcDNA3.1-CDXA：
A.引物设计：NCBI中查找鸡转录调控因子CDXA基因序列信息，按查到的基因序列应用Primer3.0进行在线引物设计。在设计引物时，通过对真核表达载体pcDNA3.1和转录因子CDXA基因序列酶切位点的分析，在CDXA上下游引物的5′末端分别添加双限制性酶切位点HindIII和EcoRI；引物设计见表1，其中AAGCTT和GAATTC为添加的限制性内切酶位点；
表1引物
设计的引物由北京华大基因公司合成。对引物进行稀释时，严格按照说明书将粉末状引物配制成为引物溶液。将公司合成的固体粉末状引物，在离心机中1000r/min离心3min以防止挥发，然后打开管盖，加灭菌超纯水稀释为100μmol/L的贮存液后充分震荡，再稀释成5μmol/L，分装后-20℃保存。
B.PCR扩增相应的基因片段：以鸡小肠总RNA反转录成的cDNA第一链为模板，采用设计好的特异性PCR引物扩增基因CDXA的相应片段，PCR反应体系见表3；扩增相应基因片段的方法具体为：在200μL的PCR管中按表3加入反应成分，震荡混匀离心后在PCR仪中进行PCR扩增反应。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min；60.8℃退火30s；72℃延伸2min，36个循环；72℃延伸8min。扩增完毕后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳条件为120V，30min。
表3PCR扩增的反应体系(20μL)
反应物 使用量（μL）
10×PCR缓冲液 2.0
dNTPs（2.5mM） 1.6
PCR正向引物（5uM） 0.5
PCR反向引物（5uM） 0.5
DNA模板 1.0
rTaq酶 0.2
无菌去离子水 14.2
上样量 20.0
C.PCR产物的纯化回收、克隆与测序：按照北京全式金生物技术有限公司的割胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化回收，操作步骤为：
（1）预先准备一个无菌1.5mL离心管，称重后，用刀片小心切取琼脂糖凝胶中的目的DNA条带，放入离心管中再次称重，切胶时尽量少，如凝胶重为100mg，可视为100Μl。
（2）加入3倍体积试剂盒中所提供的溶液GSB，于55℃水浴溶胶6-10min，期间不停的摇匀，时间间断2-3min，使之充分的混合，确保胶块完全融化。在凝胶融化后，如果溶液的颜色为紫色，需要加入一定量的pH5.2的3mol醋酸钠进行溶液颜色的调整，最终和GSB颜色相同即黄色即可。在融化的凝胶溶液中加入1倍体积异丙醇可增加DNA的回收量。
（3）将上述溶液静置数分钟，待降至室温时，取650μL加入吸附柱中，室温静置1min，10000g离心1min，弃废液；如有剩余液体，按照重复步骤离心。
（4）在吸附柱中加入650μL的WB，10000g离心1min，弃废液。
（5）将吸附柱再次放入收集管中，10000g离心2～3min，去除残留的WB，以免影响后续实验。
（6）取一个1.5mL灭菌离心管，将吸附柱置于管中，室温下开盖静置1～2min，使乙醇挥发。然后在吸附柱中加入30-50μL灭过菌的超纯水，室温静置1～2min，使得DNA充分溶解在超纯水中。
（7）10000g离心1min，使得DNA离心到离心管中。将洗脱出的DNA于-20℃冰箱中保存。
PCR扩增产物经1％的琼脂糖凝胶电泳30min，电泳结果如图2显示，PCR所扩增的CDXA基因片段在750bp～1000bp处，引物设计时预计结果933bp在此范围内，表明经PCR扩增已获得CDXA基因片段。
纯化得到的PCR产物连接转化，步骤如下：
（1）纯化得到的PCR产物与PMD-18-T载体连接：预先准备一个0.2mL的PCR管，加入载体1μL、纯化产物4μL、10×T4DNALigationBuffer1μL、T4DNA连接酶(3U/μL)1μL和无菌去离子水3μL，加样完毕后，混匀稍离心置于16℃过夜连接。
（2）从-70℃冰柜中取出感受态大肠杆菌DH5α，将其置于在冰上融化，将连接产物加到100μL感受态大肠杆菌DH5α中，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30min。将离心管放入PCR仪中，42℃热激90s，快速将管转移到冰浴中冷却2min。
（3）在离心管中加入500μL无菌的不含氨苄的LB液体培养基，轻轻混匀，置于37℃摇床以220r/min的速度振动培养45min，使菌体复苏。
（4）复苏菌液后，观察菌液的浓度，充分混匀，吸取200μL已转化的感受态细胞加到含氨苄的LB固体培养基上，用无菌涂布棒轻轻的将细胞均匀涂开，置于37℃培养箱中先正面放置培养30min，封好培养皿后倒置平板，37℃过夜。
（5）小心挑取单菌落白斑，在100mL含氨苄的LB液体培养基中充分搅动，37℃、220r/min振荡过夜培养，使菌液充分扩大培养。
（6）将菌液送去公司进行测序。测序结果经BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）在线鉴定是否是目的基因序列。
测序正确的菌液进行质粒的提取，提取方法为：取测序正确的菌液200μL加入5mL含氨苄的LB液体培养基中，37℃，200r/min摇动培养12～16h。
（1）将上述菌液室温10000×g离心1min，小心吸取上清。
（2）在细菌沉淀中加入250μL的SolutionⅠ/Rnase，用移液枪上下吹打或涡旋，保证完全混匀，直到看不到细胞沉淀。
（3）在上述溶液中加入250μL的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀7～9次，直至得到澄清的裂解液，室温静置2min。
（4）在上述溶液中加入350μL的SolutionⅢ，颠倒混匀7～9次，直至出现白色絮状沉淀，需充分混匀，避免出现局部沉淀。
（5）室温下12000×g离心10min。
（6）取一个吸附柱，插入到2mL的收集管中，小心吸取上清至结合柱中，10000×g室温离心1min，每次至多700μL以保证所有的质粒能够通过结合柱，弃滤液。
（7）重复第6步骤直至所有上清都过滤完。
（8）加入500μL的BufferHB至结合柱中，使全部液体滤过柱子，弃滤液，室温下10000×g离心1min。
（9）加入700μL的DNAWashBuffer至结合柱中，10000×g室温离心1min，使全部液体滤过柱子，弃滤液。
（10）重复步骤9。
（11）把吸附柱再次套回收集管中，最大转速(≥13000×g)室温离心2～3min，用于干燥结合柱。
（12）预先准备一个灭菌的1.5mL离心管，把结合柱套入其中，加入30～50μL的ElutionBuffer（预先在60～70℃水浴中预热），室温静置1～2min，13000×g室温离心2min洗脱质粒DNA，将洗脱出的DNA置于-20℃冰箱保存，用微量核酸测定仪测定质粒的浓度和纯度。
D.pcDNA3.1-CDXA的制备：用HindⅢ与EcoRⅠ分别酶切CDXA质粒和pcDNA3.1质粒，反应体系见表4、表5，割胶回收之后，将两者用T4DNA链接酶进行4℃过夜连接，反应体系见表6。
表4CDXA酶切反应体系(20μL)
反应物 体积/μL(Volume/μL)
PCR反应体系 10
10×M酶切缓冲液 4
HindIII 1
EcoRI 1
无菌去离子水 4
表5：pcDNA-3.1酶切反应体系(20μL)
反应物 体积/μL(Volume/μL)
PCR反应体系 10
10×M酶切缓冲液 4
HindIII 1
EcoRI 1
无菌去离子水 4
表6：CDXA基因和pcDNA3.1载体连接反应体系(10μL)
反应物 体积/μL(Volume/μL)
pcDNA3.1酶切产物 1
CDXA酶切产物 7
T4DNA连接酶 1
10×连接缓冲液 1
E.重组子的转化方法为：
（1）预先准备两个0.2μLPCR管，将上述制备的pcDNA3.1-CDXA连接产物加入到50μL感受态大肠杆菌DH5α中，用手指轻弹离心管以混匀内容物，冰浴30min。
（2）将离心管放入PCR仪中，进行42℃90s热激反应，反应结束后迅速将离心管转移到冰浴中，使细胞冰浴2min。
（3）将离心管中的混合物加入500μL无菌的不含氨苄的LB液体培养基，混匀后置于摇床培养，37℃220r/min振动45min，使菌体复苏。
（4）菌液复苏后，观察菌液浓度，充分混匀离心管内菌液，吸取90μL感受态细胞液体加到含氨苄的LB固体培养基上，用无菌玻璃涂布棒轻轻的将菌液均匀涂开，需要在无菌环境下操作。封口膜封好培养皿后倒置平板，37℃培养过夜。
（5）次日观察平板，用灭菌后的牙签挑取单菌落白斑，加入50mL含氨苄的LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养，使得菌液扩大培养。
（6）取500μL的菌液加入1.5mL离心管中，将菌液进行测序。
F.质粒的提取：将测序正确的菌液进行质粒提取。具体操作步骤参照Omega公司去内毒素质粒提试剂盒。
试验前准备：在使用试剂前，迅速将RNaseA全部加到SolutionI中并置于4℃保存。按照说明书的要求，将80mL的无水乙醇加到DNAWashBuffer中，并置于室温保存。
具体操作为：
（1）取测序正确的菌液200μL加入5mL含氨苄的LB液体培养基中，37℃，220r/min摇动培养11～15h。
（2）取上述菌液10000×g室温离心1min收集菌体沉淀。
（3）小心吸取上清液，加250μLSolutionⅠ/Rnase，用移液枪上下吹打或涡旋保证菌液沉淀完全悬浮。
（4）加入250μLSolutionⅡ，轻柔颠倒5～8次保证完全混匀，得到澄清的裂解液，室温静置2～3min。
（5）加入125μL预冷的BufferN3，迅速轻柔颠倒混匀数次直至出现白色絮状沉淀，此时避免出现局部沉淀，室温静置2～3min，让其充分反应。
（6）室温12000×g离心12min后，小心吸取上清至一个新的离心管内。
（7）加入是上清体积1/10的ETRSolution，轻柔颠倒混匀8～10次，直至上清变浑浊。迅速冰浴10min，期间混匀数次，上清由浑浊变澄清。
（8）将上清42℃水浴5min，液体再次有澄清变浑浊，12000×g室温离心3-5min，此时在离心管的底部出现微量蓝色沉淀。
（9）小心吸取上清液至一个灭菌的1.5mL离心管中，加入上清液体积1/2的无水乙醇，轻柔颠倒混匀7～10次，室温静置2～3min。
（10）取一个吸附柱插入2mL收集管中，每次转移700μL上述混合液至吸附柱中，10000×g离心1min，弃滤液。
（11）重复第7步，直至所有上清都过滤完，弃滤液。
（12）加入500μLBufferHB到吸附柱中，10000×g离心1min，使全部液体滤过柱子，弃滤液。
（13）加入700μLDNA洗脱液到吸附柱中，10000×g离心1min使全部液体滤过，柱子，弃滤液。
（14）加入700μLDNA洗脱液到吸附柱中，10000×g离心1min使全部液体滤过柱子，弃滤液。
（15）把空吸附柱再次套入离心管中，最大转速（≥13000×g）离心2～3min干燥柱子。
（16）把吸附柱套入一个灭菌的1.5mL离心管中，加入30-50μL预先在60～70℃水浴中加热的去内毒素洗脱缓冲液，室温放置5～7min，最高转速（≥13000×g）离心1min洗脱质粒DNA。
（17）将洗脱出的质粒DNA用微量核酸测定仪测定质粒的纯度和浓度，并于-20℃冰箱中保存。
真核表达载体的酶切鉴定结果，如图3所示，真核表达载体pcDNA3.1-CDXA经过限制性内切酶HindIII与EcoRI进行双酶切，1％的琼脂糖凝胶电泳30min后，可清晰地看到酶切出的两个条带，其中，位于上方约5428bp处的是酶切后pcDNA3.1载体，位于下方约933bp处的是酶切后CDXA基因片段，与预期结果相符。通过真核表达载体的酶切鉴定，表明已成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-CDXA。pcDNA3.1-CDXA全长6411bp，CDXA插入位点为917～1894bp，如图4。
通过ModuleMaster1.4和TFbind等软件预测，在GLUT2基因上游1500bp处找到转录因子CDXA的结合位点。通过对位点的分值和P值进行筛查，在GLUT2基因的5′调控区筛选到转录因子CDXA的最大可能结合位点，如图5。
2.鸡小肠上皮细胞体外分离培养及鉴定：（1）取鸡胚小肠：选用由山西康牧禽业提供的白来航蛋鸡15日龄鸡胚，用分别蘸取碘伏和75%酒精的脱脂棉擦拭其外壳，晾干，置于已紫外消毒30min的超净台中。用已消毒的镊子钝头轻轻击破鸡蛋大头，打开气室，暴露出鸡胚，用镊子轻轻夹住鸡胚颈部取出鸡胚，使其腹部朝上置于无菌平皿中。用手术剪慢慢剪开腹部，用镊子轻轻捏住小肠慢慢将其取出，过程中用手术剪配合剪去肠系膜使取出的小肠尽可能完整。将取出的小肠放入盛有1号洗液的无菌平皿中。
（2）分离小肠、去除肠系膜：在1号洗液（38.0mLPBS中加入青链霉素混合液2.0mL，使双抗最终含量为5%）中短暂冲洗小肠1～2次，粗略去除血污等污物，移入2号小肠洗液（38.8mLPBS中加入青链霉素混合液1.2mL，使双抗最终含量为3%），仔细去除肠系膜，过程中用一支镊子轻轻夹住小肠，用另一支镊子轻轻捏住肠系膜，向各自方向分离，尽量不要拽断小肠。将分离得到的小肠置于5mL无菌离心管中，用3号小肠洗液（39.6mLPBS中加入青链霉素混合液0.4mL，使双抗最终含量为1%）洗涤2～3次，将小肠剪成1mm3的组织块，加入3号小肠洗液清洗，静置1min弃上清液，反复洗2～3次至上清液清透，吸弃洗液，清洗干净的组织块备用。
（3）酶消化组织块：将取出的小肠放入盛有2倍体积50μg/mL嗜热菌蛋白酶HEPES消化液，把离心管放入37℃80r/min的振荡培养箱内振荡消化120min，取出消化组织，加入少量预热的PBS将酶消化液稀释，使用胶头滴管轻轻吹打2～3min，使消化开的细胞团块尽量分散开，静置1min，吸取悬浮液，将其分装入4个15mL的灭菌离心管内，继续用PBS液悬浮细胞团块，吸取悬浮液直至其清亮为止，并去净液体中的白色絮状物，1000r/min离心5min，以除尽上清液。
（4）相差贴壁法培养：取1号管和2号管所得的2.5mL细胞悬液分别接种于25cm2的细胞培养瓶内，将3号管悬浮离心沉淀用含10%鸡血清的DMEM细胞培养液（内含1%青链霉素混合液，10%鸡血清，0.2μg/mL表皮生长因子，1g/L肝素钠，25mg/L胰岛素，5mmol/LL-谷氨酰胺）悬浮吹打均匀（3mL/鸡胚），待吹打均匀后取2.5mL细胞悬液接种于25cm2的细胞培养瓶内，将所有培养瓶放入40℃7%CO2培养箱内培养70min。
（5）细胞接种：取出培养瓶，慢慢竖直放置，分别用胶头滴管吸少许瓶底部细胞培养液轻吹贴有细胞的一面2～3次，将刚贴在壁上的细胞团块吹下来，收集细胞悬液分别于3个15mL灭菌离心管内（做好标记），800r/min离心5min，弃上清。
细胞沉淀分别用5mL含2.5%鸡血清的DMEM细胞培养液（内含1%青链霉素混合液，2.5%鸡血清，0.2μg/mL表皮生长因子，1g/L肝素钠，25mg/L胰岛素，5mmol/LL-谷氨酰胺）悬浮，用胶头滴管吹打均匀。取20μL细胞悬液与等体积台盼蓝（trypanblue）混合均匀于试管内，用血球计数板计数（3个或3个以上细胞为一个计数单位），并用预热的细胞培养液稀释，调整为细胞密度约为6.5×105/mL的细胞团块悬浮液。
各取3mL细胞悬液，用枪头对准孔中央缓慢滴加细胞悬液于6孔细胞培养板中，过程中让细胞悬液自行流遍整个孔。细胞悬液铺满后将细胞培养板在生物安全柜内静置10min，期间尽量减少孔内培养液的流动以保证使细胞最大程度地分布均匀。将所有接种好的细胞培养板平稳转移至40℃7%CO2培养箱内培养。在倒置显微镜下观察细胞贴壁生长状态，并依据细胞状态换细胞培养液。
将培养好的鸡小肠上皮细胞采用倒置相差显微镜进行形态学细胞鉴定：在细胞生长到一定阶段后，用倒置相差显微镜观察细胞生长状况及形态变化，并拍照。体外分离培养的鸡小肠上皮细胞培养至第6d时，从中挑选生长状态良好、长势大致相同的9孔细胞换完全培养液，培养12h后用Lipofectamine2000转染，转染48h后在倒置显微镜下观察质粒转染组、阴性对照组和空白对照组细胞生长状态，如图6。从图中可以观察到在正常培养条件下即空白对照组，鸡小肠上皮细胞之间紧密相连呈“铺路石状”分布，多为多角形、卵圆形和圆形，细胞明亮且边界清晰；而经过滴加有Lipofectamine2000的转染组和阴性对照组，鸡小肠上皮细胞形态发生明显的变化，鸡小肠上皮细胞变暗、形态不规则、边界不明显且细胞之间间隙加大失去原有的鸡小肠上皮细胞形态特点。通过观察比较空白对照组、阴性对照组和质粒转染组的鸡小肠上皮细胞形态变化，可以判断转染是成功的。
免疫组化细胞鉴定：（1）盖玻片处理：将盖玻片用磨刀石划开，划成4～6份均可，用1%的盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净，蒸馏水洗2～3遍；然后用95%乙醇浸泡30～60min，蒸馏水冲洗后放入小烧杯中高压灭菌，烘干备用。
（2）用盖玻片之前，用10%多聚赖氨酸浸泡5min取出，利于细胞贴片，37℃晾干，再将其放到一个盛有培养基的皿里，过一下使其再变成湿片，然后放到要培养细胞的培养板中。
（3）将小肠上皮细胞铺于培养板中置于40℃7%CO2培养箱内培养。
（4）小肠上皮细胞培养至铺满单层时取出盖玻片，用已经预热的PBS清洗3次，而后用胶头滴管滴加4%多聚甲醛于盖玻片固定30min，吸弃固定液，用PBS洗3次，室温晾干。
（5）加入φ=3%H2O2去离子水（无色液体）孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性，PBS洗3min×3次。
（6）滴加试剂A（蓝色液体封闭用正常兔血清工作液3ml、6ml或15ml），室温封闭10-15min，轻轻甩去多余液体（或倾去），不洗。
（7）加入1：150倍稀释的鼠抗鸡角蛋白单克隆抗体，4℃过夜，空白对照滴加等量的PBS代替一抗，其余步骤相同，PBS洗3min×3次。
（8）滴加试剂B（黄色液体，生物素化山羊抗小鼠IgG二抗工作液3ml、6ml或15ml），室温或37℃下孵育10-15min，PBS洗3min×3次。
（9）滴加试剂C（橙色液体辣根酶标记链霉卵白素工作液S-A/HRP3ml、6ml或15ml），室温或37℃孵育10～15min，PBS洗3min×3次。
（10）DAB显色：吸取2mLDAB底物缓冲液于5mL离心管中，滴加2滴DAB浓缩液，混合均匀后滴加至盖玻片，室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～10min，显色成功后用蒸馏水清洗以终止反应。
（11）梯度乙醇脱水，70%、80%、90％、95％、100%各3min。
（12）透明：二甲苯处理，Xylene1×1min→Xylene2×2min。
（13）中性树胶封片，显微镜观察。
在设置条件为40℃、7%CO2培养箱内培养第7d时细胞进入对数生长期，贴壁生长的细胞多为多角形、卵圆形和圆形，汇合成片呈“铺路石状”分布，很少有单个细胞单独贴壁生长现象。细胞角蛋白18（Cytokeratin18，CK18）是上皮组织特异性的抗原蛋白，小肠黏膜消化分离得到的细胞多为成纤维细胞、平滑肌细胞和上皮细胞。其中，成纤维细胞和平滑肌细胞角蛋白呈阴性，所以免疫组化得到的阳性细胞即为上皮细胞。试验组选用了鼠抗鸡CK18单克隆抗体对培养的鸡IEC进行免疫组化鉴定，对照组滴加等量的PBS代替一抗。光学倒置显微镜下观察如图7所示，试验组细胞浆呈棕黄色，为阳性。
3.运用阳离子脂质体介导法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞：体外分离培养的IEC培养至第6d时，从中挑选生长状态良好、长势大致相同的9孔细胞换完全培养液，12h后，进行转染试验。预先准备12个灭菌的2mL离心管，配制溶液1与溶液2。溶液1：在6个准备好的离心管中，加入95μL低糖DMEM培养液，并向其中各加5μLLipofectamine2000Reagent，室温孵育5～10min。溶液2：另6个离心管中，质粒最终添加量为2500ng，先根据所测质粒浓度确定质粒添加体积，低糖DMEM培养液的添加量要确保每个离心管中最终溶液体积为100μL，详细情况见表7。用移液枪将溶液2缓慢逐滴加入溶液1中，轻轻晃匀，室温孵育10min。将混合液分别逐滴滴入已挑选好的9孔细胞中，将细胞培养板置于40℃，7%CO2培养箱内培养48h。待48h后，观察细胞形态学变化，准备收集细胞。
表7转染反应体系（单位：μL）
4.转染后收集鸡小肠上皮细胞：收集鸡小肠上皮细胞前，将安全柜用紫外灭菌30min，分装PBS缓冲液并37℃水浴30min。预先准备9个5mL离心管，在管壁上做好标记。取出细胞培养板，用移液器吸弃原培养液，用预热好的PBS轻轻冲洗每孔细胞3次，操作过程要轻柔。每孔中各加入1mLPBS，反复用移液器轻柔地冲打细胞至悬浮状态，将每孔细胞收集到对应的离心管中，1000r/min离心5min，吸弃上清液，重复洗2次，避免在鸡鸡小肠上皮细胞表面残留有质粒DNA影响后续的试验结果。
细胞RNA的提取：向收集有IEC的离心管中分别加入1mLPBS，吹打混匀，移入1.5mLRNaseFree的离心管中，800r/min离心5min，吸弃上清液。向离心管中分别加入1mLTriZol裂解液，迅速用1mL移液器反复吹打，使IEC尽可能溶于TriZol裂解液中，室温15～30℃静置10min，以提高RNA获得率。向离心管中分别加入0.20mL氯仿，漩涡震荡离心管，充分震荡混匀15s，室温15～30℃静置15～20min。4℃，14000r/min，离心15min。向离心管中分别加入0.15mL氯仿，漩涡震荡离心管，充分震荡混匀15s，室温静置15～20min。4℃，14000r/min，离心15min。将上清液转移到已加入等体积的-20℃预冷的异丙醇1.5mLRNaseFree的离心管中，上下轻轻颠倒离心管使其充分混匀，室温静置10min。4℃，12000r/min，离心10min，离心管底部出现微量的白色沉淀。小心吸弃上清，在RNaseFree离心管中加入1mL4℃预冷的75%乙醇，充分颠倒清洗RNA沉淀。4℃，12000r/min，离心5min。小心吸弃上清，再向RNaseFree离心管中加入1mL4℃预冷的75%乙醇，充分颠倒清洗RNA沉淀。4℃，12000r/min，离心5min。弃上清，4℃，10000r/min，离心5min，用移液器小心吸弃残留液，室温干燥5min。加入25μLDEPC水，使RNA沉淀完全溶解，吸取少量用微量核酸测定仪测定RNA的浓度和纯度，并取适量RNA样品，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和稳定性，将其余RNA存放于-80℃冰箱保存。
RNA琼脂糖凝胶电泳如图8，从左到右依次为空白对照组、阴性对照组和质粒转染组，从图中可以看到3条条带均没有出现弥散现象，28s和18s条带较亮，5s条带较暗，说明所提取RNA完整度较好。用微量核酸测定仪测定所提取的RNA的浓度和纯度，A260/A280的值在1.8～2.0之间，表明所提的RNA纯度较高，可以用于做下一步试验。
RNA反转录为cDNA：根据下列组分配制RT反应液，去除在提取RNA过程中残留的质粒DNA（反应液配制均在冰上进行)，如表8。轻柔混合后，在PCR仪中42℃反应2min后4℃保存。按照表9组分配制RT反应液(反应液配制在冰上进行)。轻弹离心管底部，混匀反应液后进行反转录反应，条件如下：37℃反转录反应15min；85℃反转录酶的失活反应5sec；4℃保存。反应结束后可分装出少量进行浓度测定，其余-20℃保存，若结果理想，即以所得到的cDNA作为模板进行荧光定量PCR检测目的基因表达量。
表8去除RNA中质粒DNA的反应液组分及使用量(10μL)
试剂 体积μL (Volume/μL)
5×gDNA Eraser Buffer（除gDNA污染缓冲液） 2
gDNA Eraser（除gDNA污染试剂） 1
Total RNA（总RNA） 1 μg
RNase Free dH2O（无菌除RNA酶去离子水） up to 10 μL
表9：RT-PCR反应液组分及使用量(10μL)
试剂 (Reagent) 体积μL (Volume/μL)
5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) （反转录酶缓冲液） 4
PrimeScript RT Enzyme MixⅠ（反转录酶缓冲混合物） 1
RT Primer Mix（反转录引物缓冲混合物） 1
1的反应液 10
RNase Free dH2O（无菌除RNA酶去离子水） 4
5.设计引物，在NCBI中，查找鸡转录调控因子CDXA与GLUT2基因序列信息，按照查到的基因序列应用Primer3.0进行在线引物设计，引物设计见表2，
表2引物
6.样品cDNA中目的基因表达量测定：用绝对荧光定量PCR测定pcDNA3.1-CDXA转染试验中空白对照组、阴性对照组和质粒转染组目的基因的表达量；CDXA、GLUT2的反应体系和扩增条件见下表10、11、12和13。
表10：CDXA基因AFQ-PCR反应体系
反应物 使用量（μL）
PCR正向引物（5uM） 1.0
PCR反向引物（5uM） 1.0
DNA模板 1.0
双蒸水 9.5
SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）(嵌合荧光核酸染料) 12.5
总加样量 25.0
表11：GLUT2基因AFQ-PCR反应体系
反应物 使用量（μL）
PCR正向引物（5uM） 0.5
PCR反向引物（5uM） 0.5
DNA模板 1.0
ddH2O 10.5
SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（嵌合荧光核酸染料）（2×） 12.5
总加样量 25.0
表12：CDXA基因AFQ-PCR扩增条件
表13：GLUT2基因AFQ-PCR扩增条件
GLUT2绝对荧光定量标准曲线和熔解曲线：鸡小肠基因GLUT2标准曲线见图9，所获得的基因GLUT2熔解曲线见图10，基因GLUT2标准曲线的回归方程为：Y=-3.181X+35（其中，Y：Ct值；X：起始拷贝数对数值）。所得到的标准曲线的E=106.2%，表明梯度稀释的质粒标准品线性相关性较好；R2=0.994，表明引物与模板结合能力及PCR的效率较高。所获得的基因GLUT2熔解曲线如图10所示，可以观察到只有单一峰，表明PCR扩增过程中没有产生引物二聚体，也没有出现非特异性产物，即PCR扩增产物的特异性很好。综上所述，在该基因GLUT2标准曲线的基础上测量未知样品的起始拷贝数所获得的值接近实际值。
CDXA基因绝对荧光定量标准曲线和熔解曲线：鸡小肠基因CDXA标准曲线见图11，所获得的基因CDXA熔解曲线见图12，如图11，基因CDXA标准曲线的回归方程为：Y=-3.328X+36（其中，Y：Ct值；X：起始拷贝数对数值）。所得到的标准曲线的E=99.8%，表明梯度稀释的质粒标准品线性相关性较好；R2=0.983，表明引物与模板结合能力及PCR的效率较高。所获得的基因CDXA熔解曲线如图12所示，可以观察到只有单一峰，表明PCR扩增过程中没有产生引物二聚体，也没有出现非特异性产物，即PCR扩增产物的特异性很好。综上所述，在CDXA基因标准曲线的基础上测量未知样品的起始拷贝数所获得的值接近实际值。
目的基因mRNA的表达量检测结果：用绝对荧光定量PCR分别测定空白对照组、阴性对照组和质粒转染组GLUT2mRNA表达量，从图13可知，加样后样品GLUT2熔解曲线只有单一峰，说明PCR扩增过程中没有产生引物二聚体及非特异性产物，是特异性扩增，所得数据具有说服力。
7.数据统计分析：应用SAS8.1统计软件中的Duncans方法对数据进行多重比较，*表示差异显著，**表示差异极显著。结果见图14。如图14所示，真核表达载体pcDNA3.1-CDXA成功转染进入鸡小肠上皮细胞后,转染组中CDXA的表达量显著高于空细胞与阴性对照组（P<0.01），而空细胞与阴性对照组之间差异不显著（P>0.05），表明真核表达载体pcDNA3.1-CDXA成功转染鸡小肠上皮细胞并表达。经统计分析得到，在表达载体组中GLUT2基因的表达量明显低于空白对照组和阴性对照组（P<0.05），在空白对照组与阴性对照组间差异不显著（P>0.05），其中，质粒转染组GLUT2mRNA表达量是空白对照组的0.76倍，质粒转染组GLUT2mRNA表达量是阴性对照组的0.67倍。试验结果表明：CDXA基因的过表达对GLUT2基因的表达有调控或协同调控,且为抑制作用。

Claims (3)

1.一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法，其特征在于：包括构建转录因子CDXA的真核表达载体pcDNA3.1-CDXA，鸡小肠上皮细胞体外分离培养及鉴定，运用阳离子脂质体介导法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞，转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA，绝对PCR荧光定量测定cDNA中目的基因CDXA的表达量与糖转运蛋白基因GLUT2的表达量。
2.根据权利要求1所述的一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
1).构建真核表达载体pcDNA3.1-CDXA：
A.引物设计：NCBI中查找鸡转录调控因子CDXA基因序列信息，按查到的基因序列应用Primer3.0进行在线引物设计，在CDXA上下游引物的5′末端分别添加双限制性酶切位点HindIII和EcoRI；引物设计见表1，其中AAGCTT和GAATTC为添加的限制性内切酶位点；
表1引物
B.PCR扩增相应的基因片段：以鸡小肠总RNA反转录成的cDNA第一链为模板，采用设计好的PCR引物扩增基因CDXA的相应片段；
C.PCR产物的纯化回收、克隆与测序：按照北京全式金生物技术有限公司的割胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化回收，纯化得到的PCR产物连接转化，扩大培养的菌液进行测序，测序正确的菌液进行质粒的提取，用微量核酸测定仪测定质粒的浓度和纯度；
D.pcDNA3.1-CDXA的制备：用HindⅢ与EcoRⅠ分别酶切CDXA质粒和pcDNA3.1质粒，回收之后，将两者用T4DNA链接酶进行4℃过夜连接;
E.重组子的转化：所制备的pcDNA3.1-CDXA连接产物加入到感受态大肠杆菌DH5α中，在PCR仪中42℃90s热激反应，反应结束后将菌液中的菌体复苏；复苏后的菌体进行液体扩大培养，然后将扩大培养的菌体测序；
F.质粒的提取：测序正确的菌液进行质粒提取；具体操作步骤参照Omega公司去内毒素质粒提试剂盒；
2).鸡小肠上皮细胞体外分离培养及鉴定：取15日龄鸡胚，无菌操作取出小肠，去除肠系膜分离小肠并清洗干净小肠组织块；采用嗜热菌蛋白酶HEPES消化液进行酶消化组织块，使其形成细胞悬液，采用相差贴壁法培养鸡小肠上皮细胞，培养好鸡小肠上皮细胞接种于细胞培养板，至于40℃7%CO2培养箱内培养；将培养好的鸡小肠上皮细胞采用倒置相差显微镜进行形态学鉴定，通过免疫组化进行细胞鉴定；
3).运用阳离子脂质体介导法将真核表达载体转染至鸡小肠上皮细胞；
4).转染后收集鸡小肠上皮细胞并获得cDNA：首先收集转染后的鸡小肠上皮细胞，用37℃水浴30min预热好的PBS缓冲液反复冲洗的收集好的转染后的鸡小肠上皮细胞，然后提取细胞RNA，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性和稳定性，然后将RNA反转录为cDNA；
5).设计引物，在NCBI中，查找鸡转录调控因子CDXA与GLUT2基因序列信息，按照查到的基因序列应用Primer3.0进行在线引物设计，引物设计见表2，
表2引物
6).样品cDNA中目的基因表达量测定：用绝对荧光定量PCR测定pcDNA3.1-CDXA转染试验中空白对照组、阴性对照组和质粒转染组目的基因的表达量；
7).数据统计分析：应用SAS8.1统计软件中的Duncans方法对数据进行多重比较，分析CDXA基因的过表达对GLUT2基因的表达的影响。
3.根据权利要求2所述的一种转录因子CDXA调控鸡肠道内糖转运蛋白GLUT2表达的方法，其特征在于：所构建的真核表达载体pcDNA3.1-CDXA全长6411bp，CDXA插入位点为917～1894bp。
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