CN110283847A - 一种同时定点整合fad3和fabp4基因的载体及重组细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体及重组细胞，利用电穿孔的方法将靶向Rosa26基因的Cas9切割载体和打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，实现将FAD3和FABP4基因同时定点插入到鲁西黄牛胎儿成纤维细胞基因组中；通过Junction PCR筛选和验证获得了打靶阳性克隆细胞；以本发明定点插入外源基因的阳性细胞为供核细胞移入去核的牛成熟卵母细胞中，获得转基因克隆胚胎，进一步将克隆胚胎移植到受体牛体内，可获得所期望的转基因牛。本发明为快速、高效研制优质转基因肉牛育种新材料提供了供核细胞和技术方法。

Description

一种同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体及重组细胞
技术领域
本发明涉及转基因克隆动物技术领域，更具体的说是涉及一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体及重组细胞。
背景技术
脂肪酸脱氢酶(Fatty Acid Desaturase，FAD)是催化饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸链上特定的位置形成双键的酶类，它是多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)合成途径的关键酶。其中FAD3基因是植物中的一种多不饱和脂肪酸去饱和酶基因，属于ω-3型多不饱和脂肪酸脱氢酶，该酶以ω-6多不饱和脂肪酸为优先底物，使其脱氧转化为ω-3多不饱和脂肪酸。ω-3多不饱和脂肪酸是组成人体必需的物质，对健康非常重要，ω-6与ω-3PUFA比值过高可导致心血管疾病、癌症、炎症以及自身免疫反应等疾病，并且对于新生儿及幼儿的大脑、中枢神经和免疫系统的发育起重要作用。总之，FAD3基因是一种能有效将自身ω-6PUFAs转化为ω-3PUFAs的多不饱和脂肪酸去饱和酶基因，其可以作为改善脂肪酸比例的理想酶基因。
脂肪酸结合蛋白4(adipose fatty acid-binding protein，FABP4)，又可称为A-FABP，是组织特异性脂肪酸结合蛋白家族FABPs(fatty acid binding proteins)的重要成员之一，参与脂类代谢和脂肪沉积的调控，并在长链脂肪酸的摄取、转运以及能量代谢和炎症反应中起着重要的调控作用。其占细胞总蛋白量约为6％，主要在脂肪组织中表达量较高，因此是成熟脂肪细胞中重要的胞质蛋白之一。已有研究表明，FABP4与脂质代谢紊乱、糖尿病和肥胖相关。在脂肪细胞分化过程中，FABP4 mRNA表达水平显著升高，并且会受到脂肪酸、PPARγ激动剂及胰岛素的调控。在脂肪酸沉积和降解过程中，FABP4表达水平的提高可促进脂肪的沉积和脂解效率降低。FABP4作为一种脂质蛋白伴侣，对长链脂肪酸具有高亲和力，说明FABP4可优先结合长链脂肪酸，促进长链脂肪酸的吸收和降解。因此，FABP4影响脂肪酸的摄取、转运、酯化和β-氧化，调节体内能量平衡和脂质信号转导，也是影响牛肉嫩度和增加肌内脂肪含量的候选基因。
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated nuclease 9)系统是一种后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入。CRISPR/Cas9系统可以实现DNA片段的删除、反转、重复、插入和易位等基因编辑，也可用于功能基因筛选、转录调控、表观遗传调控和标记成像等科研领域。其基因编辑的大致原理为：首先，sgRNA引导Cas9蛋白靶向DNA序列，对其进行识别并且切割，从而形成DNA双链断裂切口(double-strand break，DSB)；然后，细胞的自我修复过程启动，即通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(homology-directed repair，HDR)两种途径，对DSB进行修复。由于NHEJ修复会造成开放阅读框的位点缺失或插入，从而导致移码突变，完成对生物体DNA序列进行删除、添加、替换的编辑工作，效率较高；HDR修复过程需要同源模板用来重组断裂的DNA序列，达到条件性基因敲除、敲进、替换、点突变等工作，效率低但保真性高。
由于传统畜禽育种工作繁重、时间冗长，分子育种的出现改变了这一状况，而转基因技术在家畜品种改良方面具有巨大的应用潜力。在实际生产中，转基因技术可以用于改善动物肉质，改善乳质及其成分，提高抗病能力，改良繁殖性能等。鲁西黄牛作为我国优良的地方品种，产肉性能良好，但肌间脂肪含量较低。因此，提供一种同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体及重组细胞，应用现代分子设计和育种技术改善牛肌间脂肪成分、提高肌间脂肪的沉积，提高我国地方肉牛品种的肉品质，选育具有我国自主知识产权的高品质中国地方黄牛品种，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体以及重组细胞。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体，包括Cas9切割载体和打靶载体；
所述Cas9切割载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框，sgRNA靶点在牛基因组22号染色体Rosa26基因上；
所述打靶载体包括用于同源重组的重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA，以及作为同源左臂的sgRNA靶点上游序列和同源右臂的sgRNA靶点的下游序列；所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA依次包括牛骨骼肌特异性启动子MRF、由P2A相连的FAD3基因CDS区和FABP4基因CDS区以及PolyA。
进一步，所述Cas9切割载体为pSpCas9-sgRNA，通过在pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体上连接sgRNA靶点序列构建而成。
进一步，所述sgRNA靶点的核苷酸序列如下：
pSpCas9-Sg21F：5’-CACCGTACCTGTTACATACAGTACC-3’；SEQ ID NO.13；
pSpCas9-Sg21R：5’-AAACGGTACTGTATGTAACAGGTAC-3’；SEQ ID NO.14。
进一步，所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA中，MRF的核苷酸序列如SEQ IDNO.35所示，FAD3基因CDS区(参考GenBank：DQ116425.1)的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，FABP4基因CDS区(参考GenBank：NM_174314.2)的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，PloyA的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。
进一步，所述打靶载体同源臂包括分别位于重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA上游、下游的5’同源臂和3’同源臂，所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA与3’同源臂之间还设有一对同向的Loxp，该对Loxp之间设有筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA；所述筛选基因表达框包括依次排列的EF1α启动子、EGFP基因、P2A、嘌呤霉素抗性基因Puro和PolyA。
进一步，所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
进一步，所述打靶载体为pLR-MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA-SE，是通过依次将sgRNA靶点上游5’同源臂、重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA、筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA(SE)以及sgRNA靶点下游3’同源臂插入到打靶骨架载体T-VectorpMD19构建而成的。
进一步，一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的重组细胞，通过Cas9切割载体和打靶载体共同转染宿主细胞，将目的基因FAD3和FABP4定点插入到宿主细胞的22号染色体Rosa26基因中。电转染参数设置为：电压510V、脉冲时间2ms、电击次数2次。
进一步，所述宿主细胞为鲁西黄牛胎儿成纤维细胞。
进一步，一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体和重组细胞，本发明所构建的Cas9切割载体，其靶位点位于牛22号染色体Rosa26基因座内；在切割载体识别靶位点后，对靶位点进行切割，使DNA形成双链断裂，启动同源重组修复机制，实现目的基因的定点整合。
本发明构建的打靶载体在筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA两侧引入一对同向的Loxp序列，既可以提高阳性克隆细胞的筛选效率，又能在阳性克隆细胞获得后去除筛选标记，从而提高体细胞核移植的克隆效率。
本发明同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体，可以通过CRISPR/Cas9系统进行定点打靶，将两个基因同时引入宿主细胞，实现对两个基因定点整合的同时，提高转基因效率，缩短肉用家畜的育种周期。
本发明通过在Rosa26基因座内同时定点整合FAD3基因和FABP4基因构建重组细胞株，并以重组细胞株为供核细胞进行核移植，在胚胎水平验证了这两个基因同时整合进胚胎基因组；本发明获得的细胞株可以作为生产转基因克隆胚胎的核移植供体细胞，实现在鲁西黄牛骨骼肌细胞中同时表达FAD3和FABP4两种基因，进而为快速、高效研制优质转基因肉用家畜新品种奠定基础条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明鲁西黄牛Rosa26基因打靶位置示意图；
图2附图为本发明sgRNA靶点对应的潜在脱靶位点统计图；
图3附图为本发明PX458的载体图谱；
图4附图为本发明利用T7E1assay对8个Cas9蛋白切割位点的切割活性检测图；
其中，M为marker，WT为野生型细胞，Con为未插入sgRNA的PX458空载体转染的牛胎儿成纤维细胞；
图5附图为本发明定点整合FAD3基因和FABP4基因打靶载体的结构示意图；
图6附图为本发明5’arm扩增结果；
图7附图为本发明3’arm扩增结果；
图8附图为本发明MRF扩增结果；
图9附图为本发明FAD3-P2A扩增结果；
图10附图为本发明P2A-FABP4扩增结果；
图11附图为本发明FAD3-P2A-FABP4扩增结果；
图12附图为本发明PolyA扩增结果；
图13附图为本发明LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP(Selectableelement，SE)扩增结果；
图14附图为本发明定点整合FAD3基因和FABP4基因打靶载体打靶策略示意图；
图15附图为本发明Cas9切割载体和打靶载体pLR-MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA-SE共转染牛胎儿成纤维细胞的示意图；其中，A为40倍物镜下明场细胞生长图片，B为40倍物镜下暗场细胞生长图片；
图16附图为本发明经嘌呤霉素筛选获得的单克隆细胞株示意图；
其中，A为40倍物镜下明场单克隆细胞生长图片，B为40倍物镜下暗场单克隆细胞生长图片；
图17附图为本发明部分生长状态良好的单克隆细胞进行5’-junction PCR鉴定电泳结果图；
图18附图为本发明5’-junction PCR鉴定为阳性的单克隆细胞，进行3’-junctionPCR鉴定电泳结果图；
图19附图为本发明Sanger测序确定FAD3基因和FABP4基因的精准插入的示意图；
图20附图为本发明利用阳性克隆细胞经体细胞核移植技术生产的转基因克隆胚胎；
其中，A为明场克隆胚胎图片，B为暗场克隆胚胎图片。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
PrimeSTAR HS DNA Polymerase、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、T-Vector pMD19、DNALigation Kit Ver.2.1购自Takara公司；限制性内切酶购自NEB公司；凝胶回收试剂盒购自Genstar公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生物工程股份有限公司；去内毒素质粒小提试剂盒购自Omega公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、DH5α感受态细胞购自天根生化科技有限公司；Trypsin、Puromycin购自Sigma公司；Gibco胎牛血清、DMEM/F-12细胞培养基、Opti-MEM细胞培养基、3000Transfection Reagent购自Thermo fisher thermofisher公司；细胞培养皿、细胞培养板购自Corning公司；G1.5、G2.5胚胎培养液购自Vitrolife公司。
本发明首先需要构建靶向牛Rosa26基因的Cas9切割载体pSpCas9-sgRNA和定点整合FAD3和FABP4基因的打靶载体pLR-MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA-SE，再利用电转化方法将Cas9真核表达载体pSpCas9-sgRNA和打靶载体pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE共同转染到鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中，再经嘌呤霉素筛选获得克隆细胞株，利用JunctionPCR筛选和验证克隆细胞株，从而得到精确插入外源基因的阳性克隆细胞，最后将阳性克隆细胞作为供核细胞移入去核的牛卵母细胞中，获得转基因克隆胚胎。
实施例1CRISPR/Cas9切割载体的构建
1)打靶靶点的设计及筛选
为了实现牛骨骼肌细胞中特异性转录和表达FAD3和FABP4基因，将FAD3和FABP4基因定点插入到牛Rosa26基因第一内含子中，FAD3基因和FABP4基因由P2A相连，借助牛骨骼肌特异性启动子MRF实现FAD3和FABP4基因的特异性表达。因此，选择牛Rosa26基因共计363bp为打靶区域(图1)。
利用靶点在线设计网站ZiFIT(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)设计sgRNA，结果给出共30个打靶位点，其中正义链17条，反义链13条。随后将预测给出的30条sgRNA在脱靶分析网站Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)进行脱靶分析，分别以错配数≤5和错配数≤3作为约束条件，统计每一个sgRNA靶点在牛基因组内对应的潜在脱靶位点的个数。由于理想的sgRNA靶点所对应的潜在脱靶位点应该尽可能的减少Cas9蛋白在基因组其它位置发生切割的可能性，故本发明采用“种子区内不包含错配”这种最容易发生脱靶的条件来对所有的脱靶位点进行分类。结合上述要求，以种子区为12、8、5且错配≤3、≤5为条件进一步对预测的sgRNA进行分析，筛选包含尽可能少的脱靶位点的sgRNA靶点(图2)。综合上述要求进行筛选，从全部30条sgRNA靶点中得到8条sgRNA进行后续的Cas9切割载体(pSpCas9-sgRNA)构建工作及进一步的切割效率检测。
本发明所选取的一元化表达载体pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体(见图3)既包括pSpCas9蛋白表达所需的完整元件序列，也包括稳定转录sgRNA所需的hU6启动子。用BbsI酶切pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体(Addgene)，得线性化的载体，将表1所述合成寡聚核苷酸序列完全退火后，分别连接至线性化的载体。即可实现8个CRISPR/Cas9切割表达载体构建。编号分别为pSpCas9-sg3、pSpCas9-sg5、pSpCas9-sg9、pSpCas9-sg12、pSpCas9-sg17、pSpCas9-sg19、pSpCas9-sg21、pSpCas9-sg25。
表1 sgRNA克隆引物序列
2)Cas9切割载体切割活性检测
将8种Cas9切割载体分别转染至鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，以PX458空载体(指pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458))作为对照(Con)，转染72小时后消化细胞并提取基因组；以提取的细胞基因组为模板，PCR扩增一段包含sgRNA靶点的DNA序列并进行T7E1酶切检测。所用扩增引物序列如下：
T7EI-F：5’-GCTCCTACCATAATGCCTTCAG-3’；SEQ ID NO.17；
T7EI-R：5’-TCTGCCTTTTGAATGTAGTTGTCAC-3’；SEQ ID NO.18。
具体操作参照Surveyornuclease assay试剂盒说明书，酶切产物进行电泳检测，检测结果见图4。
结果表明，Cas9切割载体对sgRNA21这个靶位点具有一定的切割效率，在21号打靶位点处Cas9核酸酶切割活性较高，因此本发明选择sgRNA21这个打靶位点进行后续试验。
实施例2定点整合FAD3基因和FABP4基因的打靶载体pLR-MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA-SE的构建
1)打靶载体各元件的克隆
定点整合FAD3基因和FABP4基因的打靶载体包含5’arm、3’arm、LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP筛选标记、FAD3基因的CDS区和FABP4基因的CDS区，其中FAD3和FABP4基因的CDS区之间由P2A相连，目的基因下游和筛选标记第一个LoxP由PolyA隔开，见图5。
各元件所用引物如下：
5’arm-F1：TTGGCGCGCCGATTCTTATTGTAACGCCTGTCC；SEQ ID NO.19；
5’arm-R1：ACGCGTCGACTACCTGGTAGTTAATTCTATTTCATTGTC；SEQ ID NO.20；
MRF-F1：ACGCGTCGACCCATATTTGGGTGTGCC；SEQ ID NO.21；
MRF-R1：CCGGAATTCTTCTCTTCCTTGGCCTC；SEQ ID NO.22；
FAD3-F1：ATTTGGCGCGCCACGCGTCGACCCGGAATTCCAGGACCAAACTATGAGC；SEQ IDNO.23；
FAD3-R1：GTCTCCTGCTTGCTTTAACAGAGAGAAGTTCGTGGCTCCGGATCCGAGCCAAATATCATCAGC；SEQ ID NO.24；
FABP4-F1：GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCTGAAAGCTCACAAAATGTGTG；SEQ ID NO.25；
FABP4-R1：CCCAAGCTTCCATCGATCGGACTAGTCGGGGTACCATTTGCGGCCGCTATCCCTTGGCTTATGCTC；SEQ ID NO.26；
PolyA-F1：ATTTGCGGCCGCACCGGATCTAGATAACTGATCAT；SEQ ID NO.27；
PolyA-R1：CGGGGTACCTAAGATACATTGATGAGTTTGGAC；SEQ ID NO.28；
SE-F1：GAGCACTAGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGCGTTATCCCCTG；SEQID NO.29；
SE-R1：TACCATCGATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGCTTACAATTTACGCCTTAAG；SEQ ID NO.30；
3’arm-F1：CCATCGATGTCTCACATCAAACCTATTTTGCAG；SEQ ID NO.31；
3’arm-R1：CCCAAGCTTTGTGAAAACAGTGAATCAAAAGGAG；SEQ ID NO.32；
其中，下划线部分的碱基为酶切位点；斜体并加粗部分的碱基为P2A。
将培养的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞(2016年1月，陕西省西安市采集)消化后收集并提取基因组，以其为模板，用引物5’arm-F1/5’arm-R1、3’arm-F1/3’arm-R1进行PCR扩增，得到5’arm(SEQ ID NO.33)和3’arm(SEQ ID NO.34)，大小分别为1070bp(图6)和1067bp(图7)。
以内蒙古大学提供的骨骼肌特异性启动子表达质粒为模板，用引物MRF-F1/MRF-R1扩增MRF启动子片段，大小为1015bp(SEQ ID NO.35)，见图8。
以内蒙古大学提供的FAD3表达质粒为模板，用引物FAD3-F1/FAD3-R1扩增FAD3基因，得到1246bp的条带，见图9；其中FAD3的CDS条带大小为1201bp(SEQ ID NO.36)。
将分离的鲁西黄牛脂肪组织(2016年1月，陕西省西安市采集)研磨后，加入Trizol裂解并提取总RNA。对提取的总RNA进行反转录后得到cDNA。以获得的cDNA为模板，用FABP4-F1/FABP4-R1引物进行PCR扩增，得到480bp的条带，见图10；其中FABP4的CDS条带大小为423bp(SEQ ID NO.37)。
以FAD3的CDS和FABP4的CDS为模板，用引物FAD3-F1/FABP4-R1进行融合PCR反应，得到FAD3-P2A-FABP4条带，大小为1690bp，见图11；其中P2A大小为66bp(SEQ ID NO.38)。
以pTP-hTERT质粒(黄惠，胡广东，康健，等，一种通用型piggyBac转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证；生物工程学报，2014，30(8):1182-1192.)为模板，分别用PolyA-F1/PolyA-R1、SE-F1/SE-R1两对引物进行PCR扩增，得到PolyA和LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP(Selectable element，SE)条带，大小分别为245bp(SEQ IDNO.39)(图12)和3130bp(图13)。
以T-VectorpMD19为骨架，将扩增得到的FAD3-P2A-FABP4片段进行T-A克隆连接至骨架载体，得到pFAD3-P2A-FABP4-19T载体，随后按顺序依次将5’arm片段、MRF片段、PolyA片段、SE片段、3’arm片段经双酶切、胶回收、连接载体构建流程，连入骨架载体中。将最后连接完整的打靶质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。定点整合FAD3基因和FABP4基因打靶载体的打靶策略见图14。
2)Cas9切割载体和定点整合FAD3基因和FABP4基因打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞构建核移植供体细胞系
本发明利用电穿孔的方法将靶向Rosa26基因的Cas9切割载体和打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，实现对鲁西黄牛胎儿成纤维细胞的基因打靶，获得定点插入FAD3基因和FABP4基因的牛胎儿成纤维细胞。
(1)鲁西黄牛胎儿成纤维细胞的培养
将原代鲁西黄牛胎儿成纤维细胞从冻存的液氮罐中取出，于37℃解冻，简短离心，弃废液，加1ml含10％FBS的DMEM/F12重悬，接种至60mm细胞培养皿，置于CO2培养箱中37℃条件下培养。待细胞融合形成旋涡状时，用胰酶消化，并按1:3的比例进行传代培养。选取第3至5代的细胞生长至90％汇合后，作为后续转染实验的宿主细胞。
(2)阳性克隆细胞的筛选
本发明采用电穿孔法，将Cas9切割载体pSpCas9-sgRNA和打靶载体pLR-MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA-SE电转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞(BFFs)。
电转液的配制，称取KCl 0.8946g，K2HPO40.1742g，CaCl2·2H2O 0.0022g，以及MgCl2·6H2O 0.1016g，加入超纯水溶解后定容至100mL，调节pH值至7.4，0.22μm滤膜过滤除菌后，置于4℃保存。
电转染的具体方法：当细胞生长至90％融合度时，胰酶消化并收集细胞，用无血清的Opti-MEM细胞培养液洗涤2次。用800μL电转液重悬细胞，将pSpCas9-sgRNA和pLR-MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA-SE各10μg加入细胞悬液并混合均匀，然后转移至电转杯中，静置10min。将电转杯置于电转仪中，进行电击反应，具体电转染参数：电压：510V；脉冲时间：2ms；电击次数2次。电击完成后，静置15min，将细胞悬液重悬置于60mm细胞培养皿中培养，待细胞贴壁后更换新鲜细胞培养液。
转染24h后，在荧光显微镜下观察细胞的生长情况(见图15)。胰酶消化并收集细胞，将细胞均匀接种到3～4个100mm细胞培养皿中。待细胞贴壁后，向细胞培养液中加入终浓度为1.5μg/mL的嘌呤霉素进行药物筛选，每隔2d进行一次换液。筛选7d后，未整合打靶载体的细胞全部死亡，整合打靶载体的细胞形成单克隆细胞团，并在荧光显微镜下可见绿色荧光表达，如图16所示。待单克隆细胞生长至团块直径3mm以上，挑取单克隆接种于48孔板中继续培养，进行后续的阳性克隆鉴定。
(3)Junction PCR鉴定插入基因的定点整合
取部分扩大培养的单克隆细胞，离心，弃上清，用裂解法(加入20μl裂解液，重悬，65℃水浴30min，95℃水浴15min)提取细胞基因组。以单克隆细胞基因组为模板，用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase进行Junction PCR扩增，Junction PCR鉴定引物序列如下：
5’junction-F：5’-TGTTACCGCCTCTATGAAAT-3’；SEQ ID NO.40；
5’junction-R：5’-CCAGGCTCATCTAAATACTAAG-3’；SEQ ID NO.41；
3’junction-F：5’-CATCGGCAAGGTGTGGGT-3’；SEQ ID NO.42；
3’junction-R：5’-TGGCTGTGCTGGCTCTTAG-3’；SEQ ID NO.43；
其中，5’junction上游引物匹配同源5’arm上游基因组序列，下游引物匹配打靶载体MRF基因序列；3’junction上游引物匹配打靶载体Puro基因表达框，下游引物匹配同源3’arm下游基因组序列。5’junction PCR扩增结果为2059bp(图17)，3’junctionPCR扩增结果为2578bp(图18)，只有同时通过了5’junction PCR和3’junction PCR鉴定的单克隆细胞才会继续扩大培养。
对上述5’junctionPCR和3’junctionPCR产物进行凝胶回收，得到的产物进行T-A克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过测序结果确定打靶载体在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞基因组形成精准插入，结果如图19所示。
3)以鉴定正确的单克隆细胞为核移植供体细胞构建转基因克隆胚胎
(1)卵母细胞的收集和体外成熟
从西安市屠宰场采集牛卵巢，放置于装有无菌生理盐水的保温瓶中，温度维持在20～25℃，4h内运回实验室。
用一次性注射器抽取3～8mm直径卵泡的卵泡液，在体视显微镜下用捡卵针挑出形态完整、胞质均一的卵丘卵母细胞复合体进行体外培养。在卵母细胞培养平皿中培养20h后，用0.2％的透明质酸酶去除卵丘细胞，以排放出第一极体作为判断卵母细胞成熟的标志，挑选成熟卵母细胞进行后续体细胞核移植试验。
(2)转基因克隆胚胎的构建
进行体细胞核移植时，以含10％胎牛血清、5μg/mL细胞松弛素B的PBS作为显微操作液，孵育卵母细胞15min后，在显微操作仪上固定卵母细胞，并用内径为20μm的去核针在显微操作仪上吸取第一极体及相邻胞质完成去核操作。利用Hoechst 33342染色液(10μg/mL)孵育10min后，分拣出彻底去除细胞核与第一极体的卵母细胞用于后续核移植。
以生长至接触抑制状态3天的FAD3和FABP4精确插入的阳性单克隆细胞为供核细胞，用去核针将供核细胞注入上述备用的卵母细胞透明带下。使用电融合液将核质复合体孵育5min，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，并给予30V、间隔10μs的20μm电脉冲两次进行电融合。将融合后的重组体置于含10％胎牛血清预热的M199缓冲液中，并在38.5℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养2h后观察融合情况。
(3)转基因克隆胚胎的激活及体外培养
融合重组胚平衡2h后，挑选出充分融合的重构胚，先置于5μM的离子霉素中处理4min，再转移至mSOFaa(购自SIGMA公司，称取NaCl 0.6294g，KCl 0.0534g，KH2PO40.0162g，CaCl2·2H2O 0.0251g，MgCl2·6H2O 0.0100g，NaHCO30.2106g，丙酮酸钠0.0033g，乳酸钠28.24μL，必需氨基酸(50×)2mL，非必需氨基酸(100×)1mL，谷氨酰胺0.0146g，BSA 0.8g，加入90mL去离子水中，调pH值至7.3，定容至100mL)中洗涤5min，然后转移至2mM的二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)中处理3～5h，最后用mSOFaa洗涤干净后转移至胚胎培养液G1.5中培养。待第3天，将用矿物油覆盖的胚胎培养液G2.5在培养箱中平衡2h，然后将克隆胚胎转移至胚胎培养液G2.5中继续培养，培养密度为每个胚胎/5μL。第7天，在显微镜下观察克隆囊胚的发育情况(见图20)，同时可以观察到含有绿色荧光蛋白的胚胎，表明所构建的载体将目的基因FAD3和FABP4整合到鲁西黄牛胎儿成纤维细胞以及核移植克隆胚胎基因组中，挑选发育良好的克隆囊胚进行后续胚胎移植，可以获得转FAD3和FABP4基因的克隆牛。
鲁西黄牛作为我国优良的地方品种，产肉性能良好，前躯发育良好，但是后躯发育较差。因此运用本发明的基因分子设计和基因工程技术操作相结合，使得将FAD3和FABP4两个基因(CDS区)定点敲入牛Rosa26基因内，并在骨骼肌特异性启动子MRF作用下，使两个基因在牛骨骼肌细胞中实现特异性转录和表达，为获得优质肉用家畜品种提供了一种快速高效的胚胎育种策略和方法。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体及重组细胞
<160> 43
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caccgaagac atcttgtcct agtgg 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aaacccacta ggacaagatg tcttc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
caccgaatta actaccaggt atgcc 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aaacggcata cctggtagtt aattc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
caccgatcaa acctattttg cagtc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aaacgactgc aaaataggtt tgatc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
caccgcatac agtacctggc atacc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aaacggtatg ccaggtactg tatgc 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
caccggagaa gacatcttgt cctag 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
aaacctagga caagatgtct tctcc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
caccggggtg tttctttcca ccact 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aaacagtggt ggaaagaaac acccc 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
caccgtacct gttacataca gtacc 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
aaacggtact gtatgtaaca ggtac 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
caccgtgcca ggtactgtat gtaac 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
aaacgttaca tacagtacct ggcac 25
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gctcctacca taatgccttc ag 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
tctgcctttt gaatgtagtt gtcac 25
<210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ttggcgcgcc gattcttatt gtaacgcctg tcc 33
<210> 20
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
acgcgtcgac tacctggtag ttaattctat ttcattgtc 39
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
acgcgtcgac ccatatttgg gtgtgcc 27
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
ccggaattct tctcttcctt ggcctc 26
<210> 23
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
atttggcgcg ccacgcgtcg acccggaatt ccaggaccaa actatgagc 49
<210> 24
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
gtctcctgct tgctttaaca gagagaagtt cgtggctccg gatccgagcc aaatatcatc 60
agc 63
<210> 25
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca ggagacgtgg aagaaaaccc cggtcctgaa 60
agctcacaaa atgtgtg 77
<210> 26
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
cccaagcttc catcgatcgg actagtcggg gtaccatttg cggccgctat cccttggctt 60
atgctc 66
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
atttgcggcc gcaccggatc tagataactg atcat 35
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
cggggtacct aagatacatt gatgagtttg gac 33
<210> 29
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
gagcactagt ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgcgtt atcccctg 58
<210> 30
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
taccatcgat ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcgctta caatttacgc 60
cttaag 66
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
ccatcgatgt ctcacatcaa acctattttg cag 33
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
cccaagcttt gtgaaaacag tgaatcaaaa ggag 34
<210> 33
<211> 1070
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
gattcttatt gtaacgcctg tccagctttc aagagtcttc tccaacatca cagttctgga 60
ctgcaaggag atccaaccag tcaatcctga agaaaatcag tcctgaatat tcattggaag 120
gactgatgct gaagctgaaa ctccaatact ttgaccacct gatgcgaaga accgactcgt 180
tggaaaagac cctgatgctg ggaaagattg aaggcaggag gagaagggga cgacagagga 240
tgagatggtt ggatggtatc accgactcaa cggacagggg tttgagtagg cactgggagt 300
aggtgacgga cagggaagcc atgggtttgc aaagagtctg acaccactga gcaagtgaac 360
tgaactgaac tgtccagctc tacttcccca ttcctgcccc tcaaaacaca gagcaacaga 420
atccttggca accctcttgg gagtaagcaa ctctgtactc ccagccactg ttgctgggtc 480
tgagtaaaca catgaccgaa actgtcaatc agattctctc ttcttctaac cattgggaac 540
aaagagctag aaaccctggt tatttaaaat tggaaacata aatttagatg agggggagcc 600
acttatagag ataagtagag ccaagagccc atgggctccc aggggagata aaagtgactg 660
tctaggtttc tggtggtttt ctctaagacc aggatcctac ttttcttaag acatggcttt 720
cagtttttct gtgggttccc caagacatct cagtattttg ctattaattc ccactcccac 780
acaatcatca cttttttaaa tcttaaacta gcttatttag gtttctaaca gttgcaccca 840
taataattct ctatattcct ggctcctacc ataatgcctt cagtagataa taaatgtttg 900
ttaaatgaat gatgactagg agctcttcct taatcaaatg ggcccagttt tcctactgtt 960
gtcattgaat tgacaggttc caattgtgtt gaactaggat tccaaggatg agcaggggaa 1020
aagaggaagc aaagattgga ggacaatgaa atagaattaa ctaccaggta 1070
<210> 34
<211> 1067
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
gtctcacatc aaacctattt tgcagtctgg caaacagaaa cctagagaag acatcttgtc 60
ctagtggtgg aaagaaacac ccaaagggaa acaggcaaag aagaaagaaa gccgttttgt 120
tctttgaaaa ctagaaaatt ccaggatgat tcctgggttt ctgtgagtat agaattttaa 180
catataagta aaagctctcc gtgttcattt atacattata cacatttatc aaatctctgc 240
tatccatctg cttcactgca cagaaatgaa acagaacaaa atgtgttcta tttctcaaca 300
tggaatatat cctttctaaa cagaaatgtg acaactacat tcaaaaggca gatgaaaact 360
atcattctca ttttaaatca agaaaattga gatattaatt atgtgatctt ttcagaatct 420
caaggaatca acattggata caaagaaaga gatctttaac attttatcct gttctttatc 480
tactagattc taacacagta cctcacaaaa gattttgaag ggaaaattca aagcaaagtg 540
tcccttgaaa ctacaaggct aactcattgt cctacctgag catcccatag gcaagagtag 600
atctaagagt tgtgggtcca aaatgtgtga tatttcttcg gtggagactc tcctctgtca 660
acgcaatgcc cacaacaact tcattatcat ggatgttcaa aagaacctac aaacaaaata 720
agacagaata aaatagcttt aagagagttc aagttatact tattactaag attttaaaat 780
ttgaggctta attaatttgt tactttatta ctgaggtatc ccttgcatac agtaaaatgc 840
acaaatctta agtatgtagt gcagtgaatt tttgcatgta catgctgtgt aaccaccacc 900
cagaaaaagt ttttcttgcc ctctaagtca gtgcccatcc cagattgtca ttaatctgac 960
cactatcatg ataaattatt ttttcttgag cttcatataa aggaaatcat ttaggtatat 1020
actattttag aattatttta ttctcctttt gattcactgt tttcaca 1067
<210> 35
<211> 1015
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
ccatatttgg gtgtgcctgg gggttataat taacccggac acgtggcgac ctcaccccac 60
caacacctgc ccccgcgtcc ccccagcccc agcacctcag gtctcccaga ggagatcgcg 120
agcaatgagc tctaaaaata aactcccttc ccggcatgat taagcaacta tttcttgaac 180
tggtagtgaa actttatgga atagtgtgtt tgtacagtgg tgactatttg tcacagtagg 240
ctctgacacc ggcattcaag caccaaccaa attgggcaat atgtcataag gagccagttg 300
gggggcagta acaaaatcct tggataacca ttctatacca gagacatctg cttatctttg 360
cagacagtaa ctccaggcat ctctgtaatc tcgatattgt aaatatcata attcatctga 420
aagtcatgta taaccttgga aggactgtaa tggttttatc acaggaatag catctttttg 480
agaggcagga gagagaaaag acctgaacca ctctgcaaat attaaacaag ctattttgga 540
gcaatggcta ttgcctttga aatctttcat catgggtcta tacttagtat ttagatgagc 600
ctgggggagg ggaacagtgc agtgttaatc cccagttgtt ttgaacttgt cctgtaagca 660
ggttagcctc taaagtgtcc caaattgaag tgttcgatgc tttgtttaaa tttaggagtc 720
catatatttt gttttaacct gtcctgcata taggttgtca catcattcta aaggtgacac 780
ttctcagttt tctttcaaac tagatgttct agagagcact gggtgtaatc acattgagag 840
actgatgctc catgacagct aaaagttgga ttgagtttca ggagctacta tatataaagc 900
tggggcgact tatgtcaccg cactaattaa atgccatctg ggtaaccacc cagaaccttc 960
tgggtttttg agcccatcac cctgttcaga ccaagtcaga ggccaaggaa gagaa 1015
<210> 36
<211> 1201
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
caggaccaaa ctatgagccc tccaaactca atgagtccca ccaccaacgg caatggtgtg 60
gctatgaatg gggcgaagaa gcagctcgat ttcgacccga gtgctgcccc ccctttcaag 120
attgcagaca tccgtgctgc aattccgccg cattgctggg tgaagaaccc ctggaggtcg 180
ctcagctacg tcctgagaga cctccttgtc atcctcagct tcgccgttgc ggcggcaaag 240
ctggacagct ggactttctg gcctctttac tgggttgctc aaggaaccat gttctgggca 300
gtctttgttc ttggacatga ttgtggccat gggagcttct cagacatctg gttgttgaac 360
aatgtgatgg gacatatact ccattcctca atcctcgtac cttaccatgg atggagaatt 420
agccacaaga cccatcacca gaatcacggc aatgtggaga aagatgaatc ctgggttcct 480
ctaccggaga aagtgtacaa gagcttggat accagcacta agttcatgag gttcaccatt 540
cctctcccaa tgtttgctta tcctatctac ttgtggacga gaagtccggg gaagaaaggg 600
tcgcatttca acccatacag cgacctattc gcaccaaacg agagggcagc ggtcttgatt 660
tcaacattgt gctggacagc catggcctta ctcctctgct actcatcgtt catatacggc 720
ttcgctccgg tcctcaaaat ctacggcgta ccttatctga tattcgtggc atggctcgac 780
atggtgacct accttcatca ccacgggtac gagcagaagc tgccgtggta cagaggcaaa 840
gaatggagct acctacgtgg agggctgacg accgttgatc gagattacgg ggtcatcaac 900
aacatccacc atgacattgg cacccatgtc attcaccatc tcttccctca aatgccacac 960
tatcaccttg tggaagcgac tcaggcagcg aagcacgtgc tggggaagta ctacagagag 1020
ccgaagaaat cagggccttt cccattccac ttgtttgggt acttggtaag gagcctgggc 1080
gaggatcact acgttagcga cacaggcgac gtcgttttct atcagtctga cccacatatt 1140
cccaagttcc gtaccagcag tgccaccacc aagtccaaat ccagctgatg atatttggct 1200
c 1201
<210> 37
<211> 423
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
gaaagctcac aaaatgtgtg atgcatttgt aggtacctgg aaacttgtct ccagtgaaaa 60
ctttgatgat tacatgaaag aagtgggcgt gggctttgct accaggaaag tggctggcat 120
ggccaaaccc actttgatca tcagtttgaa tgggggtgtg gtcaccatta aatcagaaag 180
cacctttaaa aatactgaga tttccttcaa attgggccag gaatttgatg aaatcactcc 240
agatgacagg aaagtcaaga gcatcgtaaa cttagatgaa ggtgctctgg tacaagtaca 300
aaactgggat ggaaaatcaa ccaccataaa gagaaaactc atggatgata agatggtgct 360
ggaatgtgtc atgaatggtg tcactgccac cagagtttat gagagagcat aagccaaggg 420
ata 423
<210> 38
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
ggatccggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagacgtgga agaaaacccc 60
ggtcct 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
accggatcta gataactgat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 60
ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 120
gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 180
acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 240
tctta 245
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<212> DNA
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tgttaccgcc tctatgaaat 20
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ccaggctcat ctaaatacta ag 22
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<213> Artificial Sequence
<400> 42
catcggcaag gtgtgggt 18
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
tggctgtgct ggctcttag 19

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体，其特征在于，包括Cas9切割载体和打靶载体；
所述Cas9切割载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框，sgRNA靶点在牛基因组22号染色体Rosa26基因上；
所述打靶载体包括用于同源重组的重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA，以及作为同源左臂的sgRNA靶点上游序列和同源右臂的sgRNA靶点的下游序列；所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA依次包括牛骨骼肌特异性启动子MRF、由P2A相连的FAD3基因CDS区和FABP4基因CDS区以及PolyA。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述Cas9切割载体为pSpCas9-sgRNA，通过在pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体上连接sgRNA靶点序列构建而成。
3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述sgRNA靶点的核苷酸序列如下：
pSpCas9-Sg21 F：5’-CACCGTACCTGTTACATACAGTACC-3’；SEQ ID NO.13；
pSpCas9-Sg21 R：5’-AAACGGTACTGTATGTAACAGGTAC-3’；SEQ ID NO.14。
4.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA中，MRF的核苷酸序列如SEQID NO.35所示，FAD3基因CDS区的核苷酸序列如SEQ ID NO.36所示，FABP4基因CDS区的核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示，PloyA的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示。
5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述打靶载体同源臂包括分别位于重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA上游、下游的5’同源臂和3’同源臂，所述重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA与3’同源臂之间还设有一对同向的Loxp，该对Loxp之间设有筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA。
6.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
7.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体，其特征在于，所述打靶载体是通过依次将sgRNA靶点上游5’同源臂、重组基因MRF-FAD3-P2A-FABP4-PolyA、筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA以及sgRNA靶点下游3’同源臂插入到打靶骨架载体T-VectorpMD19构建而成的。
8.一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的重组细胞，其特征在于，通过Cas9切割载体和打靶载体共同转染宿主细胞，将目的基因FAD3和FABP4定点插入到宿主细胞的22号染色体Rosa26基因中。
9.根据权利要求8所述的一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的重组细胞，其特征在于，所述宿主细胞为鲁西黄牛胎儿成纤维细胞。
10.一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3和FABP4基因的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
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