CN108949824A

CN108949824A - 基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法

Info

Publication number: CN108949824A
Application number: CN201810813577.2A
Authority: CN
Inventors: 张涌; 袁梦珂; 韩静; 吴腾; 高元鹏; 韦永可
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2017-09-20
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2018-12-07
Also published as: CN107619837A

Abstract

本发明公开了一种利用Cas9切割核酸酶基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法分别将HMEJ策略的供体载体与HR策略的供体载体和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中MSR1启动子可以使Ipr1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。HMEJ策略获得阳性克隆细胞的效率高于传统的HR策略。以HMEJ策略获得的转基因阳性克隆细胞为核供体，获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终获得成活的Ipr1定点插入转基因克隆牛。

Description

基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆牛的核供体细胞的构建，特别涉及一种利用Cas9切割核酸酶基于HMEJ的方法介导Ipr1基因定点插入获取打靶的牛胎儿成纤维细胞的方法。

背景技术

牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染所引起的一种人畜共患病，牛结核病与人结核病可以相互传染，蔓延很快。牛患结核病后严重消瘦，产奶量下降，人感染则消瘦无力、呼吸困难致死。结核病既制约着畜牧业的发展，又威胁着人类健康。

Ipr1(intracellular pathogen resistance 1，细胞内病原体抵抗因子1)基因是介导结核分枝杆菌天然免疫的一个基因，该基因能够调节巨噬细胞的死亡方式和限制结核分枝杆菌在巨噬细胞内的繁殖(Behar，2011)。Ipr1基因在巨噬细胞中特异性表达，结核分枝杆菌感染或干扰素处理增强其表达(Pan et al.2005)。Ipr1基因的发现为预防牛结核病的流行和传播提供了一种新思路。

随着动物生物技术的发展，CRISPR/Cas9系统在任意物种的任一基因组位置上插入DNA片段，成为科研工作者们研究基因功能、生产转基因动物，发展新的基因治疗疗法治疗遗传性疾病的强力工具。

应用转基因技术实现家畜的品种改良具有巨大的应用潜力。通过转基因技术增强家畜对于结核杆菌的抗性，对于未来的牛结核病的预防和治疗具有重大意义。但是，提高CRISPR/Cas9介导的精确基因编辑或HDR介导的基因敲入(knock-in，KI)的效率，特别是对于转基因家畜育种而言仍然是一个重大的挑战。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用Cas9切割核酸酶基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，可以采用Cas9与Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体获取Ipr1基因在牛28号染色体M-S位点(即牛MAT1A基因和SFTPA1基因间区域内特定序列片段)定点整合的牛胎儿成纤维细胞，以该细胞作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体(简称pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ)，该供体载体包括目的基因Ipr1以及用于将Ipr1基因通过HMEJ方法介导的重组定点插入牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间的元件序列。

所述元件序列包括用于打靶位点同源介导的重组的同源臂序列和其两侧的打靶位点序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛28号染色体上打靶位点的上游792bp和下游790bp；打靶位点位于牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。

所述目的基因Ipr1是由巨噬细胞清道夫受体1启动子启动转录。

所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。

所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。

一种检测潜在打靶位点切割效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：以293T细胞为宿主细胞，通过共转染针对打靶位点的SSA报告载体和CRISPR/Cas9表达载体，基于SSA修复途径将存在重复序列的萤火虫荧光素酶基因恢复成完整表达框，通过不同打靶位点对应的萤火虫萤光素酶表达量确定打靶位点的切割效率。

一种插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体，基于HMEJ的方法将目的基因Ipr1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间。

所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，以兼顾细胞数量与活性。

所述共转染操作采用电穿孔法。

所述CRISPR/Cas9表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。

所述插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞可作为生产转基因克隆牛的核移植操作供体细胞使用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ，并通过基因打靶技术使Ipr1基因定点整合到牛28号染色体M-S位点。该位点附近基因簇SFTPD，MBL1和SFTPA1均属于胶原样凝集素家族的成员，且在巨噬细胞表面存在受体，可以识别结合并介导结核杆菌进入巨噬细胞，促进巨噬细胞的吞噬和杀伤能力。将Ipr1插入到该区域，使其有可能协同作用于巨噬细胞，进一步提高巨噬细胞抗结核感染的能力。另外，该位点附近基因簇的功能对于巨噬细胞非常重要，因此可以确定该段染色质在在巨噬细胞中处于活化状态。将Ipr1插入该区域，可以避免其因异染色质化修饰而丧失活性。

2.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ，可通过CRISPR/Cas9来介导其整合到M-S位点。HMEJ策略可以减少打靶过程中非同源末端连接(NHEJ)在基因组范围内引入额外的突变(indels)，从而减少细胞毒性，提高转基因动物的安全性，并且与传统HR策略相比，HMEJ策略可以大幅度提高外源基因精准整合的效率。

3.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ，其目的基因Ipr1由巨噬细胞清道夫受体1启动子启动转录。从而使目的基因Ipr1在且仅在专门性的吞噬细胞中正常转录和表达，提高转基因动物生产的安全性。

4.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ，该供体载体内包含有筛选标记基因PURO，方便药物筛选获取阳性克隆细胞；包含有筛选标记基因eGFP，方便在荧光显微镜下直接确定外源基因的插入。同时筛选标记两侧的同向LoxP可与cre酶共同作用，去除阳性克隆细胞中的筛选标记。

5.本发明获取的插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞，经PCR鉴定，证实目的基因为定点整合到牛胎儿成纤维细胞基因组M-S位点。

6.以插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞，可以通过SCNT获得转基因克隆牛，为获得对结核病具有更强抗性的新品种转基因牛打下坚实的基础。

附图说明

图1是将打靶位点对应的向导序列克隆至Cas9表达载体的原理图。

图2是利用SSA报告系统对潜在打靶位点切割活性检测的原理图。

图3是SSA报告系统载体的图谱。

图4是利用SSA报告系统对潜在打靶位点切割活性检测结果的柱状图。

图5是供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ的图谱。

图6是供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HR的图谱。

图7是原代培养中的用于基因打靶的牛胎儿成纤维细胞。

图8是转染供体载体的牛胎儿成纤维细胞经嘌呤霉素筛选出来的单克隆细胞图。

图9是选取一些具有代表性的单克隆细胞的3'-junction PCR鉴定结果图

图10是选取一些具有代表性的单克隆细胞的5'-junction PCR鉴定结果图。

图11是利用HMEJ策略和HR策略获得阳性克隆结果的柱状图。

图12是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆胚胎。

图13是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆牛。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述是对本发明的解释，而不是限定。

本发明通过SSA报告系统对潜在打靶位点的切割活性进行检测，构建了含有Ipr1基因的巨噬细胞特异性表达的供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HR和pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ，然后通过电穿孔的方法将供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HR和pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该打靶的阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞中，获得转基因克隆胚胎。最后通过将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，获得转基因克隆牛。

具体所涉及的试剂和材料如下：胎牛血清、嘌呤霉素、DMEM、DMEM/F12、Opti-MEM培养基购自美国Invitrogen公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，细胞培养板和培养皿购自美国Corning公司，质粒提取试剂盒和细胞基因组提取试剂盒均购自美国Omega公司，双荧光报告系统分析试剂盒TransDetect Double-Luciferase Reporter Assay Kit购自北京全式金公司公司，反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit、PrimeSTAR DNA聚合酶和Solution I DNA连接酶购自Takara公司，转染试剂HD DNA Transfection Reagent购自FuGENE公司，电转染仪(ECM2001)购自美国BTX公司，限制性内切酶购自NEB公司，感受态细胞DH5α和JM110均购自上海TIANGEN公司，红细胞裂解液购自碧云天公司，293T细胞购自中国科学院细胞库。

1、CRISPR/Cas9真核表达载体的构建

1.1打靶位点设计及载体构建

选择牛基因组28号染色体上MAT1A(methionine adenosyltransferase 1A，MAT1A)基因和SFTPA1(surfactant protein A1，SFTPA1)基因间的一段序列设计打靶位点(以下或也称为M-S打靶位点)，选择序列长度为4048bp，序列如下(参见SEQ.ID.NO.1，左起为5`端)：

chromosome:UMD3.1:28:35859365:35863817

将上述序列输入打靶位点在线筛选工具ZiFiT(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)，随后将总计132个潜在打靶位点全部输入打靶位点在线评估工具Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)中，输出初步的筛选结果。本发明从全部的132个潜在打靶位点中挑选出最理想的5个位点进行后续的CRISPR/Cas9真核表达载体构建工作及进一步的切割活性检测。

如图1所示，本发明所选取的一元表达载体既包含hspCas9蛋白表达所需的完整元件序列，也包含稳定转录sgRNA所需的hU6启动子。该载体在经过限制性内切酶Bbs I酶切处理后，可形成将打靶位点对应的向导序列克隆至该载体所需的接头结构。利用表1所述合成的寡聚核苷酸序列，通过简单的退火与连接反应即可实现CRISPR/Cas9真核表达载体构建。

表1.sgRNA克隆引物序列(5'-3')

表1中下划线部分标识的序列为各打靶位点对应向导序列

将上述核酸序列送至上海生工生物公司合成，构建如下反应体系：2μL Top Guideoligo(100μM)；2μL Bottom Guide oligo(100μM)；加16μL ddH₂O至20μL总体积。混匀并短暂离心后，置于PCR仪中进行如下程序：37℃5分钟；95℃10分钟；之后每分钟梯度降温5℃直至4℃。完成退火后，取出样品并置于冰上待用。

构建Cas9表达载体质粒酶切反应体系如下：10μL pSpCas9(BB)-2A-Puro(2μg，addgene)；2μL 10×Cutsmart；1μL Bbs I；加7μL ddH₂O至20μL总体积。混匀并短暂离心后，37℃水浴过夜。回收酶切后载体，并与上述退火后样品构建如下连接体系：1μL退火后双链oligo；2μL pSpCas9(BB)-2A-Puro；5μL 2×Solution I；加2μL ddH₂O至10μL总体积。混匀并短暂离心后16℃水浴连接1h。连接产物(靶位点插入位置位于hU6启动子与sgRNA接头序列scaffold间)按标准程序转化入感受态细胞DH5α中，涂布于固体LB培养基(100mg/mL氨苄青霉素)上37℃培养过夜。挑取数个单克隆扩大培养后送往上海生工生物公司测序，选取阳性克隆保存菌种备用，并命名为：Cas9-sg1～5。

1.2SSA报告载体的构建

如图2所示，本发明所选取的SSA报告系统载体包含萤火虫荧光素酶基因重复序列，该载体通过PCR和在经过限制性内切酶酶切处理后，可在重复序列间插入需检测的打靶位点序列。该载体转染细胞后，在有相应Cas9:sgRNA存在的情况下，产生双链断裂，通过SSA修复途径恢复完整萤火虫荧光素酶基因表达框。从而评估不同打靶位点的切割活性。

以pGL3-Control为模板，设计引物如下：

RvP3-f：5'-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3'

SSA-1-3-1-r：5'-CTCGAATTCC-[CCTCACGAATCCTTATGGAACAC]-CTCACATAGGACCTCTCACACACAG-3'

SSA-1-3-2-r：5'-CTCGAATTCC-[CCTATGGGAGAGCCGTGGGCTGT]-CTCACATAGGACCTCTCACACACAG-3'

SSA-1-3-3-r：5'-CTCGAATTCC-[CCTGACGATCCAGTGCATCCTTT]-CTCACATAGGACCTCTCACACACAG-3'

SSA-1-3-4-r：5'-CTCGAATTCC-[CCCTGACGATCCAGTGCATCCTT]-CTCACATAGGACCTCTCACACACAG-3'

SSA-1-3-5-r：5'-CTCGAATTCC-[TTCACTCTCGATGAAAAGGCCGA]-CTCACATAGGACCTCTCACACACAG-3'

50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，RvP3-f(10μmol/L)：1μL，SSA-1-3-1～5-r(10μmol/L)：1μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL，pGL3-Control质粒模板1μL，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min30s，34个PCR循环；72℃再延伸5min；回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T simple克隆载体(Takara)，转化入商品化DH5α大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海生工生物公司测序。测序正确的载体暂命名为SSA-1～5-19T。

将SSA-1～5-19T与pSSA-1-3载体(如图3所示)分别进行BglII和EcoRI双酶切处理，通过Solution I将SSA-1～5-19T连接至后者骨架载体上。将连接产物转化入DH5α感受态细胞中。重组质粒中含有重复的序列，直接测序鉴定十分困难，因此提取质粒后，利用引物LucRep-f和LucRep-r进行PCR扩增鉴定。引物如下：

LucRep-f：5'-CGAAGGTTGTGGATCTGGATACC-3'

LucRep-r：5'-TAGCTGATGTAGTCTCAGTGAGC-3'

50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，LucRep-f(10μmol/L)：1μL，LucRep-r(10μmol/L)：1μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL，重组质粒1μL，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸51s，34个PCR循环；72℃再延伸5min；回收PCR目的片段送上海生工生物公司测序，测序正确的载体命名为pSSA-sg1～5。

1.3切割活性检测

当24孔板内293T细胞培养至汇合度约60％时，分别取各组Cas9表达载体质粒；SSA报告载体；海肾萤光素酶报告载体pRL-SV40(如表2所示)；FuGENE HD转染试剂2.5μL；补加Opti-MEM至总体积100μL。充分混匀后室温静置孵育15min，将转染混合物加入到各对应培养皿中，轻柔混匀后放回培养箱中继续培养。转染48h后，使用双荧光报告系统分析试剂盒检测萤火虫荧光素酶报告基因和海肾荧光素酶报告基因活性。结果表明，在1号打靶位点处Cas9核酸酶切割活性最高，如图4所示。

表2.SSA各组细胞转染试验组合

1.4CRISPR/Cas9表达载体的构建

表3.sgRNA克隆引物序列(5'-3')

表3中下划线部分标识的序列为各打靶位点对应向导序列

构建Cas9表达载体质粒酶切反应体系如下：10μL pSpCas9(BB)-2A-GFP(2μg，addgene)；2μL 10×Cutsmart；1μL Bbs I；加7μL ddH₂O至20μL总体积。混匀并短暂离心后，37℃水浴过夜。回收酶切后载体，并与上述退火后样品构建如下连接体系：1μL退火后双链oligo；2μL pSpCas9(BB)-2A-Puro；5μL 2×Solution I；加2μL ddH₂O至10μL总体积。混匀并短暂离心后16℃水浴连接1h。连接产物(靶位点插入位置位于hU6启动子与sgRNA接头序列scaffold间)按标准程序转化入感受态细胞DH5α中，涂布于固体LB培养基(100mg/mL氨苄青霉素)上37℃培养过夜。挑取数个单克隆扩大培养后送往上海生工生物公司测序，选取阳性克隆保存菌种备用，并命名为：Cas9-GFP-1和Cas9-GFP-75。2、Ipr1巨噬细胞特异性供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ的构建

2.1目的基因的克隆

根据小鼠Ipr1序列(GenBank登陆号：NM_175397.4)，设计引物如下：

Ipr1-EcoRI-F:5′-TCAGAATTCGAACCCCTTAACTAATCCAG-3′

Ipr1-BamHI-R:5′-CTAGGATCCGCTGGGACACTCAGAGGCTC-3′

采集适量小鼠外周血(2016年5月，成都达硕实验动物有限公司)，添加枸缘酸钠抗凝血剂(CPD)。离心富集血细胞后弃上清，加入足量的红细胞裂解液，轻柔重悬细胞充分裂解。800-1000r离心5-8分钟，弃去上层红色清液，并使用TRIZOL法对于下层沉淀提取总RNA。按照TakaRa公司反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit说明书进行标准的反转录操作后，以反转录所得的小鼠cDNA模板进行PCR反应。

50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，Ipr1-EcoRI-F(10μmol/L)：1μL，Ipr1-BamHI-R(10μmol/L)：1μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL，小鼠cDNA模板3μL，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，32个PCR循环；72℃再延伸5min；PCR胶回收产物经EcoRI和BamHI双酶切，经Solution I连接至pEGFP-C1载体(Clontech)，暂命名为pIpr1-C1。

2.2MSR1启动子的克隆

MSR1启动子是牛内源的巨噬细胞特异性启动子。使用该启动子的目的在于引导Ipr1基因在巨噬细胞中特异性表达，不仅显著增强Ipr1基因抗结核的作用，同时对提高转基因动物的生物安全性有着重要的意义。

根据牛的MSR1(macrophage scavenger receptor 1，巨噬细胞清道夫受体1)序列(GenBank登陆号：NC_007328)，设计引物序列如下：

pMSR-BglII-F:5′-TGAAGATCTACCATCTCTTGATAGAAAGT-3′

pMSR-HindIII-R:5′-TACAAGCTTGACACACAAAAATACAGAG-3′

50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，pMSR-BglII-F(10μmol/L)：1μL，pMSR-HindIII-R(10μmol/L)：1μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL，荷斯坦奶牛基因组DNA模板2μL，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，32个PCR循环；72℃再延伸5min；PCR胶回收产物经BglII和HindIII双酶切，经Solution I连接至pIpr1-C1载体，暂命名为pMSR1-Ipr1。

2.3MSR1-Ipr1表达框的克隆

以pMSR1-Ipr1序列为模板，设计引物如下：

Ipr1-19T-F：5′-ATTTGCGGCCGCGAATTCGTCGACGGACCATCTCTTGATAGAAAG-3′

Ipr1-19T-R：5′-AAGCTTCCATGGATCGATGGGGCTAGCTACGCGTTAAGATACATT GAT-3′

50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，Ipr1-19T-F(10μmol/L)：1μL，Ipr1-19T-R(10μmol/L)：1μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL，pMSR1-Ipr1质粒模板1μL，加超纯水至50μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，32个PCR循环；72℃再延伸5min；回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T simple克隆载体(Takara)，转化入商品化DH5α大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海生工生物公司测序。测序正确的载体暂命名为pPromoter-Ipr1-polyA-19T。

2.4同源臂序列的克隆

设计引物分别扩增牛28号染色体上M-S打靶位点上游序列(792bp)作为HR策略左侧同源臂(Left arm，LA)和下游序列(790bp)作为HR策略右侧同源臂(Right arm，RA)，引物序列如下：

HR-LA-19T-F：5'-GCGGCCGCTGGAATGGCTAGAGTGGATA-3'

HR-LA-19T-R：5'-GTCGACCAAAGGGAATGCCTGATG-3'

HR-RA-19T-F：5'-GCGGCCGCAACATCGATGCATAATCCCTCACCCT-3'

HR-RA-19T-R：5'-AAGCTTGCTGAAGCGGAAACTC-3'

反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL primer F(10μM)；1μLprimer R(10μM)；1μL荷斯坦奶牛基因组DNA(200ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为58℃，延伸时间50s。回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T克隆载体(Takara)，转化入商品化JM110大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海生工生物公司测序，测序正确的即为LA阳性重组子和HR-RA阳性重组子。

设计引物扩增牛28号染色体上M-S打靶位点下游序列(790bp)并在上下游引物中添加打靶序列作为HMEJ策略RA，打靶序列如下：

5'-GTGGCGCTCGAGGTTCGATCCGG-3'

引物序列如下：

HMEJ-RA-19T-F：

5'-GTGGCGCTCGAGGTTCGATCCGGCGGCCGCTAAACCATCGATGCATAATCCCTCAC CCT-3'

HMEJ-RA-19T-R：

5'-GTGGCGCTCGAGGTTCGATCCGGAAGCTTGCTGAAGCGGAAACTC-3'

反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL primer F(10μM)；1μL primer R(10μM)；1μL荷斯坦奶牛基因组DNA(200ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为58℃，延伸时间50s。回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T克隆载体(Takara)，转化入商品化JM110大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海生工生物公司测序，测序正确的即为HMEJ-RA阳性重组子。

本发明中所用荷斯坦奶牛基因组DNA为下文中组织块贴壁法所得的牛胎儿成纤维细胞中所提取(2015年11月)，按照Thermo公司GeneJET Genomic DNA Purification Kit说明书进行标准的基因组提取操作。

将LA阳性重组子与pPromoter-Ipr1-polyA-19T载体分别进行NotI和SalI双酶切处理，通过Solution I将左侧同源臂连接至后者骨架载体上。将连接产物转化入JM110感受态细胞中。NotI和SalI双酶切鉴定出阳性重组子后，提取质粒，然后将其与HR-RA阳性重组子和HMEJ-RA阳性重组子分别进行ClaI和NotI双酶切处理，通过Solution I将右侧同源臂连接至前者骨架载体上。将阳性重组载体暂命名为pLA-Promoter-Ipr1-polyA-HR-RA-19T和pLA-Promoter-Ipr1-polyA-HMEJ-RA-19T。

2.5筛选标记的克隆与巨噬细胞特异性表达供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HR和pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ的构建

以本实验室已有载体为模板(DOI:10.13345/j.cjb.130529)，扩增筛选标记LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-LoxP。引物序列如下：

EEPP-19T-F：5'-GAGCACTAGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGCGTTATCCCCTGATTCTGT-3'

EEPP-19T-R：5'-TACCATCGATGGAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGCTTACAATTTACGCCTTAAG-3'

反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL EEPP-19T-F(10μM)；EEPP-19T-R(10μM)；1μL质粒模板(200ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为62℃，延伸时间3min。

将PCR产物与pLA-Promoter-Ipr1-polyA-HR-RA-19T和pLA-Promoter-Ipr1-polyA-HMEJ-RA-19T载体分别进行SpeI和ClaI双酶切处理，通过Solution I连接后，测序后保存阳性重组载体，即完成巨噬细胞特异性表达供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HR和pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ的构建，如图5、图6所示。图中所示载体包括以下顺次排列的元件：HR-LA或HMEJ-LA、MSR1启动子(pMSR1)，Ipr1开放阅读框(Ipr ORF)、SV40polyA、上游LoxP位点、EF1α启动子(EF1promoter)、荧光报告基因EGFP开放阅读框、P2A序列和抗性基因PURO(抗嘌呤霉素)开放阅读框(eGFP-P2A-Puro)、SV40polyA、下游LoxP位点以及HR-RA或HMEJ-RA。

3、巨噬细胞特异性表达供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HR和pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ与特异性Cas9切割核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞。

3.1牛胎儿成纤维细胞培养

本发明中所用牛胎儿成纤维细胞均为组织块贴壁法所得。将采集的牛胎儿(杨凌科元克隆股份有限公司，2015年10月)用含有青链霉素的PBS缓冲液清洗三次以上以避免细菌污染。在无菌工作台上用眼科剪及镊子剥离牛胎儿皮肤组织，并将其剪碎为约1mm³的组织块。小心的将组织块均匀贴附直径60mm培养皿中，并轻柔滴加少量DMEM/F12培养液润湿。将培养皿倒置CO²培养箱中38.5℃，5％CO²孵育4h后，加入5mL含有青链霉素及10％FBS的DMEM/F12培养液正置培养。约3-4天后可见组织块周围有成纤维细胞迁出，继续培养至细胞汇合度大于90％后弃去残余组织块，此时可选择冻存细胞或者传代培养，如图7所示。

传代培养与冻存：弃去细胞培养液，加入3mL PBS轻柔洗涤后弃液，加入1mL含0.25％胰酶的PBS消化细胞，38.5℃孵育3min后加入DMEM/F12培养液终止消化。轻柔吹打剥离贴壁细胞形成细胞悬液，离心弃去上清后选择加入DMEM/F12培养液重悬细胞，按照1:3～1:5的比例传代培养；或选择加入含10％DMSO的细胞冻存液，彻底重悬细胞并转入冻存管及程序冻存盒中，并最终转置液氮中冻存。细胞复苏：将冻存管从液氮中取出，37℃水浴迅速解冻。低速离心后弃去冻存液，加入1mL含10％FBS的DMEM/F12培养液彻底重悬细胞。转接至对应规格培养皿中，置于38.5℃，5％CO₂培养箱中培养。3.2阳性细胞克隆的筛选

本发明使用电穿孔法将供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HR和pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ分别与特异性Cas9切割核酸酶表达载体Cas9-GFP-1及Cas9-GFP-75共转染入牛胎儿成纤维细胞。电转液配方为KCl：120mM；CaCl₂：0.15mM；K₂HPO₄:10mM；MgCl₂:2.50mM。调节pH值至7.6后，与Opti-MEM培养液按照体积比3:1混匀。向500μL混合液中加入上述两种载体质粒各20μg，转移至离心弃去培养液的细胞团块中，轻轻吹打重悬细胞并混匀。将上述细胞悬液转移到新的BTX电转杯中静置5min，调节电转仪电压为510V，脉冲1ms电击3次后静置10min。将细胞悬液转移到90mm培养皿中，于38.5℃、5％的CO₂培养箱中继续培养。

转染24h后，向细胞培养液中加入终浓度为1μg/mL的嘌呤霉素进行药物筛选。筛选8d后，基因组中未整合供体载体的细胞全部死亡，而稳定整合供体载体的细胞逐渐形成单克隆细胞团，并在荧光显微镜下可见绿色荧光表达，单克隆细胞见图8。挑取单克隆细胞至48孔板继续培养并继续进行后续阳性克隆鉴定。

3.3PCR鉴定基因打靶的阳性细胞克隆

取部分扩大培养的单克隆细胞，离心弃上清后加入20μL裂解液(10mM Tris-HCl，pH 8.5；50mM KCl；1.5mM MgCl₂；0.5％NP-40；0.5％Tween-20；400g/mL proteinase K)，充分重悬后65℃水浴30min，95℃水浴15min完成细胞裂解。取5μL细胞裂解物作为模板，分别利用下述junction PCR引物进行阳性克隆鉴定。

5'-junction：Lj F：5'-TGGACTGTAGCCCGTCTG-3'；

Lj R：5'-CGGCAGCACCGATTT-3'；

3'-junction：Rj F：5'-CTCGGCTTCACCGTCAC-3'；

Rj R：5'-CCGGGAGAAATACCAATAACC-3'。

其中，5'-junction上游引物匹配序列为5'端同源臂上游基因组序列，下游引物匹配序列为供体载体上Ipr1基因启动子序列，产物大小1730bp；3'-junction上游引物匹配序列为供体载体上puro基因序列，下游引物匹配序列为3'端同源臂下游基因组序列，产物大小应为1761bp。通过3'-junction PCR反应鉴定出的阳性克隆，结果如图9所示；进一步通过5'-junction PCR进行鉴定，结果如图10所示。只有通过了两轮PCR鉴定的克隆才会在扩大培养后，进行后续实验。

如图11所示(P＝0.00519，unpaired Student’s t-test)，相同实验条件下，基于HMEJ的方法得到的阳性单克隆数远多于HR策略，两者差异性显著。

4、以上述基因组定点整合了目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞为核供体细胞，构建转基因克隆牛

4.1卵母细胞的成熟培养

本发明所用卵巢均为无菌条件下采自西安市屠宰场(2017年5月)，在37℃无菌生理盐水内运输至实验室。抽取3～8mm直径的卵泡并收集卵丘卵母细胞复合体，在体视显微镜下挑选合适的卵母细胞用于成熟培养。成熟培养液为加入10％FBS，10ng/mL的表皮生长因子的TCM199(Gibico)，10ng/mL的bFGF，1μg/mL的Estradiol-17βStock egl，0.075IU/mL的HMG和2.2mg/mL的sodium pyruvate。在38.5摄氏度，5％CO₂条件下培养20h后，用0.2％的透明质酸酶去除卵丘细胞，并挑选成熟的卵母细胞用于核移植实验。4.2转基因克隆胚的构建

本发明采取采用体细胞核移植(SCNT)技术将供体细胞转移到去除细胞核的成熟卵母细胞中去。核移植时以含10％FBS，5μg/mL细胞松弛素B的PBS作为显微操作液，用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质。以10μg/mL Hoechst33342染色10min后，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。

以生长至接触抑制状态3d后的Ipr1精准插入的阳性转基因荷斯坦牛胎儿成纤维细胞为供核细胞。用去核管将供体细胞注入去核成功的卵母细胞透明带下。使用电融合液将核质复合体平衡3min，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，并给予28V、10μm电脉冲进行电融合。将融合后的重组体置于含有10％FBS的M199中，38.5℃、5％CO₂培养1h后观察融合情况。

4.3转基因克隆胚的激活及体外培养

融合的重组胚在含10％FBS的M199中平衡1h后，用含5μmol/L离子霉素(购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养4h，清洗3次后转入矿物油覆盖并预先在CO₂培养箱中平衡至少2h的mSOFaa中培养，培养密度为500μL每40个重组胚，在38.5℃、5％CO₂、5％O₂饱和湿度下培养，在第6-7天检查囊胚发育情况。正常发育至囊胚的转基因克隆胚如图12箭头指示所示。

4.4转基因克隆牛的制备

将发育良好的囊胚移植到发情的荷斯坦受体牛的子宫角(每头受体牛移植1-2枚囊胚)。60天后，用B超对移植后未返情的受体牛做怀孕检查。此后每月检查一次，观察妊娠维持情况。10个月后，成功产下成活的基因打靶的转基因克隆牛(图13)。M-S打靶位点定点整合Ipr1基因的转基因克隆牛的制备成功，为预防牛结核打下了坚实的基础。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 基于HMEJ的方法介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4048

<212> DNA

<213> Bos taurus

<400> 1

atgtagaaac tcaccttgtc caaatgtatt tttgaactag ctatatttgt ttttagttta 60

aagaattgtt tttacgtaag tctttttttt tttttcttct catattgcat ctccgtagta 120

ttataaacaa agttatggat agtatttggc aggtagtggt ttttaaaatg attcccatta 180

tattttaatc tctagaaaat gtaacgagtt aaatttaagt tgatgatgta attcactatt 240

tcttaactat tatctgggaa aagttcaacc accaaagaca ttagacatat cacaacactg 300

tttctctgtc gaggcttctg tgtggctggg cagtaaagag aacagcggag gttatgccat 360

ggcatcaggg gctcctggtg gtctgtctgg gcctggcagg gctgctgccc tctggtcacc 420

agggctggac tgagttcagt tacttagggc tgcacacggt gcatgcaggt tgggattctc 480

acctgtccag ggcttctggg ccagggaggc cttcggcctt ttcatcgaga gtgaagagcc 540

atccctgatg gcaccgctgg ctgtgcacct gctgaaggcc taggagcagc ctgagccaag 600

atctggagca gcagcctttg gactggaggc tggggcatga gttgctgtgc ccagtagtct 660

agctgatcca ggatcaaaca tgctcggggt ggatgtggat tctaggcaaa tagcaaggct 720

ggagcttctg gctgatacag caagcagtcc tgggacctga ggcttagata aggtctacct 780

tgcagagtga ctgtccaaga ggagtccatc cagagcttaa gccaaggctg tgggcaaagg 840

atgcactgga tcgtcaggga aattttgccc aagattctgt cagatcagat gggaagaagt 900

tcaaacctga ctctagaacc tgcagactgt gctacttctg gtaagttatg gagcctcact 960

gagcctcggt tcctctatta tttaagggag taaagatggg ccctgtgaag gatatggtgg 1020

atgtaaagaa acctaacagg tgctcaggag tggacactgg ttcacatccg cttctccagg 1080

gcacagcatt gagccagcct ctgtggaaac agggatggaa cgtccaaggg tgaagactct 1140

atcaggctag gtcaggggga aagaagatcc tcatggtaga gccaggagag tgagaggatt 1200

aagtcaggac ttatcaagat ccctgatata aaacttccct ggtggctcag aggttagtcc 1260

gtctgcctgc aatgtgggaa acctgggttc gatccctggg tcaggaagat tccgctggag 1320

aaggaaatgg caacccactc cagtaatctt gcctggagaa tcccatggac ggaggagcct 1380

ggtgggctac agtccacggg gtctcaaaga gtcggacact gagcgaattc actttcactt 1440

tcgtgaaggt ggcatgacta aacagggaga gtgtgatggt gtgacgtttg ttttcagatc 1500

ggctcatttg actgcaattt ttcctgcagc caccagaggg cagagctgac ccatatattt 1560

cctatgggag agccgtgggc tgtatgttgt caccctgatt atttaactta tatgcagagt 1620

acatcatgag aaacgcagga ctggatgaag cacaagctgg aatcaagatt tccgggagaa 1680

ataccaataa cctcagatat gcacgtaaca ccacacttat ggcagaaagt gaagaactga 1740

agagcttctt gataaaagtg aaagagaaga gtgaaaaagt tggcttaaaa ctcaacattc 1800

agaaaactaa gattatggca tctggtccca tcacttcatg gcaaatagat ggagaaacag 1860

tggaaacagt gacagacttt attttggggg gctccaaaat cactgcaaat tgtgactgca 1920

gccatgaaat taaaagacac atactccttg gaagaaaagt tatgaccaac ctagacagaa 1980

tattaaaaag caaagacatt actttgccaa caaagtccat ctagtcaaag ctatggtttt 2040

tccaatagtc atgtatggat atgagagttg gaccataaag aaagctgagc actgaagaat 2100

tgatgctttt aatctgtggt gttggagaag tctcttgaga gtcccttgga ctgcaaggag 2160

atccaaccag tccatcctaa aggagatcag tcctgaatat tcattggaag gactgatgct 2220

gaagcggaaa ctccaatact ttggccacct gatgggaaga gctgactcat ttgaaaagac 2280

cctgatgctg ggaaagattg aaggcaggag gagaagggga cgacagagga tgagatggtt 2340

ggatggcatc actgtctcga tggacatgag ttttagtaag ctccgggagt tgatggtgga 2400

cagggaagtc tggctgtagt ccagggggtc gcaaagagtt ggacacgact gagcgtctga 2460

actgaactga gctgtgggct ccctgttgtg aattctattg gaaatgatga gccttaggct 2520

ggagaagact cttgagagtc ccatggactg caaggagatc caaccagtcc attctaaagg 2580

agatcagtcc tgggtgttct ttggaaggaa tgatgctaaa gctgaaactc cagtactttg 2640

gccacctcat gcgaagagtt gactcattgg aaaagactct gatgctggga gggattgggg 2700

gcaggaggag aaggggacga cagaggatga gatggctgga tggcatcact gactcaatgg 2760

acgtgagtct gagtgaactc cgggagttgg tgatggacag ggaggcctgg cgtgctacaa 2820

ttcatggggt cgcaaagagt cagacacgac tgaacgactg aactgaactg aactgaactg 2880

aaggctcagg ggttaccttc cgcctctgta ggtacagaag ccattcacag accctgagaa 2940

gtcagaaccc ttttcttaac attccatctc tagagcaagc gcttttcccc agggtgaggg 3000

attatgcacg tgagagactg acccttaggt tcctcacgaa tccttatgga acacacatac 3060

catccaactt tcgcgtctgc tcttcagtgc actttagaag gcaaagggaa tgcctgatga 3120

aggacactga aggccctgcc ccaggcacca tcatccccca ccctgcagca agcccggcct 3180

caggggcaca gctgggaacc agggcttcct gagtaagggt ctctccaggg ttgtgagact 3240

caggcacaag caggagggtt tgcggcactg tgtcctacca ccccctgacc tttcattgtg 3300

tgcaccagcc tgggtttccc tcccgccttg ggcccctctg ttcctctcat gtgtgtctcc 3360

caatccagcc aactctcctc ggttctctgg ggctgtggag caacgctctg ctggccactc 3420

ggtttcctct acacccatgg tgtggcttgc atccttgtgg gactctgttc ccttccctgg 3480

ttcgtgttta tccgagacac ttatcctcag cctgctctta cgcacttctt gggtgcaggc 3540

tctttctcct cctccctatt ggtctttggg ccaactggga tctcatgaag aatctttgtt 3600

tgtcccatgg atgtctgtag agctgtgggc atacagagcc atggcagagg gcacagcccc 3660

aggacaggac tgctggttgc cgagacaagg cttttttatg gaagcagaca tagctggtgg 3720

ccagtagccc tgcaggggtc acctgccata gttgaattcc tgaaggccct gcttctctga 3780

atgtccctgc agacctggct cctggtcttg ggcatgtggg ggccatggcc agtgtgtgcc 3840

ctctggtctt gagtcggggc ttagccatgt agctatccac tctagccatt ccagtattct 3900

tgcctggaga ttcccatgga cagaggagcc agacgggcta cagtccatgg ggtcgcaaaa 3960

gagtctgaca cgactgagcg actaatagaa atgctttcac tttcatgtcg cttaagggga 4020

gtcccagctc tggcaaggat gggctgtg 4048

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

caccggtgtt ccataaggat tcgtg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aaaccacgaa tccttatgga acacc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

caccgacagc ccacggctct cccat 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aaacatggga gagccgtggg ctgtc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

caccgaaagg atgcactgga tcgtc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

aaacgacgat ccagtgcatc ctttc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

caccgaagga tgcactggat cgtca 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aaactgacga tccagtgcat ccttc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

caccgactct cgatgaaaag gccga 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aaactcggcc ttttcatcga gagtc 25

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ctagcaaaat aggctgtccc 20

<210> 13

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctcgaattcc cctcacgaat ccttatggaa cacctcacat aggacctctc acacacag 58

<210> 14

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

ctcgaattcc cctatgggag agccgtgggc tgtctcacat aggacctctc acacacag 58

<210> 15

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

ctcgaattcc cctgacgatc cagtgcatcc tttctcacat aggacctctc acacacag 58

<210> 16

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

ctcgaattcc ccctgacgat ccagtgcatc cttctcacat aggacctctc acacacag 58

<210> 17

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

ctcgaattcc ttcactctcg atgaaaaggc cgactcacat aggacctctc acacacag 58

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

cgaaggttgt ggatctggat acc 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

tagctgatgt agtctcagtg agc 23

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

caccggtgtt ccataaggat tcgtg 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

aaaccacgaa tccttatgga acacc 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

caccggtggc gctcgaggtt cgatc 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

aaacgatcga acctcgagcg ccacc 25

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

tcagaattcg aaccccttaa ctaatccag 29

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

ctaggatccg ctgggacact cagaggctc 29

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

tgaagatcta ccatctcttg atagaaagt 29

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

tacaagcttg acacacaaaa atacagag 28

<210> 28

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

atttgcggcc gcgaattcgt cgacggacca tctcttgata gaaag 45

<210> 29

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

aagcttccat ggatcgatgg ggctagctac gcgttaagat acattgat 48

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

gcggccgctg gaatggctag agtggata 28

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

gtcgaccaaa gggaatgcct gatg 24

<210> 32

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

gcggccgcaa catcgatgca taatccctca ccct 34

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

aagcttgctg aagcggaaac tc 22

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

gtggcgctcg aggttcgatc cgg 23

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

gtggcgctcg aggttcgatc cggcggccgc taaaccatcg atgcataatc cctcaccct 59

<210> 36

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

gtggcgctcg aggttcgatc cggaagcttg ctgaagcgga aactc 45

<210> 37

<211> 65

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

gagcactagt ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgcgtt atcccctgat 60

tctgt 65

<210> 38

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

taccatcgat ggaacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcgctta caatttacgc 60

cttaag 66

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

tggactgtag cccgtctg 18

<210> 40

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

cggcagcacc gattt 15

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

ctcggcttca ccgtcac 17

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

ccgggagaaa taccaataac c 21

Claims

1.一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体，其特征在于，该供体载体包括目的基因Ipr1以及用于将Ipr1基因通过HMEJ方法介导的重组定点插入牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间的元件序列。

2.根据权利要求1所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体，其特征在于，所述元件序列包括用于打靶位点同源介导的重组的同源臂序列，同源臂以牛cDNA为模板扩增，扩增产物分别为牛28号染色体上打靶位点的上游792bp和下游790bp；打靶位点位于牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。

3.根据权利要求1所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体，其特征在于，所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。

4.根据权利要求4所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达供体载体，其特征在于，所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。

5.一种检测潜在打靶位点切割效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：以293T细胞为宿主细胞，通过共转染针对打靶位点的SSA报告载体和CRISPR/Cas9表达载体，基于SSA修复途径将存在重复序列的萤火虫荧光素酶基因恢复成完整表达框，通过不同打靶位点对应的萤火虫萤光素酶表达量确定打靶位点的切割效率。

6.一种插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染供体载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro-HMEJ和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体，基于HMEJ的方法将目的基因Ipr1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述共转染操作采用电穿孔法。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛28号染色体MAT1A和SFTPA1基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述基于HMEJ的方法插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞可作为生产转基因克隆牛的核移植操作供体细胞使用。