CN107619837A - 利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中MSR1启动子可以使Ipr1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终获得成活的Ipr1定点插入转基因克隆牛。

Description

利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成 纤维细胞的方法
技术领域
本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及转基因克隆牛的核供体细胞的构建，特别涉及一种利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1基因定点插入获取打靶的牛胎儿成纤维细胞的方法。
背景技术
结核病是一种由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)在人与牛之间传播引起的世界性人畜共患病，对畜牧业生产安全、畜产品安全乃至人类健康造成了严重威胁。
Ipr1(intracellular pathogen resistance 1,细胞内病原体抵抗因子1)基因是目前已发现的介导结核分枝杆菌天然免疫的一个基因，该基因能够限制结核分枝杆菌在巨噬细胞内的繁殖，并且能调节巨噬细胞的死亡方式(Behar,2011)。Ipr1基因的发现为预防牛结核病的流行和传播提供了一种新思路。研究发现牛Ipr1基因上的SNP可能与牛副结核的易感性相关。如果牛自身表达的Ipr1基因也具有抗结核的功能，那么从转基因动物的生物安全性角度考虑，转牛自身的Ipr1基因会是更好地选择。
2013年2月，国际著名期刊《Cell》报道了加州大学旧金山分校的研究人员所发现的一种精确沉默基因的方法，称之为CRISPR/Cas9介导的打靶技术。该技术表现出许多优越性，例如可以同时沉默任意数量的基因、具有优良的靶向性、构建简单且成本低等。该技术自发明以来，迅速被广大中外研究人员应用于人类细胞以及小鼠等模式动物研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。
应用转基因技术实现家畜的品种改良具有巨大的应用潜力。通过转基因技术增强家畜对于结核杆菌的抗性，对于未来的牛结核病的预防和治疗具有重大意义。然而，目前CRISPR/Cas9技术介导的基因插入在转基因家畜中的应用非常有限。此外，如何在保证外源基因插入效率的同时，减弱该系统多变的脱靶效应至今依然亟待解决。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，可以采用Cas9与Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体获取Ipr1基因在牛25号染色体F-A位点(即牛FSCN1基因和ACTB基因间区域内特定序列片段)定点整合的牛胎儿成纤维细胞，以该细胞作为核供体细胞，为研制抗结核病的转基因牛提供坚实的基础。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体(简称pIpr1-eGFP-P2A-Puro)，该打靶载体包括目的基因Ipr1以及用于将Ipr1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列。
所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游577-977bp和下游616-1016bp；打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。
所述目的基因Ipr1是由巨噬细胞清道夫受体1启动子启动转录。
所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。
所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。
一种插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体，将目的基因Ipr1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的25号染色体FSCN1和ACTB基因间。
所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞，以兼顾细胞数量与活性。
所述共转染操作采用电穿孔法。
所述CRISPR/Cas9表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。
所述插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞可作为生产转基因克隆牛的核移植操作供体细胞使用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro，并通过基因打靶技术使Ipr1基因定点整合到牛25号染色体F-A位点。该位点附近基因簇为持家基因，在不同组织中均处于活跃表达状态。将Ipr1插入该区域，可以避免其因异染色质化修饰而丧失活性。
2.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro，可通过CRISPR/Cas9来介导其整合到F-A位点。CRISPR/Cas9可以减少打靶过程中非同源末端重组修复(NHEJ)在基因组范围内引入额外的突变(indels)，从而减少细胞毒性，提高转基因动物的安全性。
3.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro，其目的基因Ipr1由巨噬细胞清道夫受体1启动子启动转录。从而使目的基因Ipr1在且仅在专门性的吞噬细胞中正常转录和表达，提高转基因动物生产的安全性。
4.本发明构建了一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro，该打靶载体内包含有筛选标记基因PURO，方便药物筛选获取阳性克隆细胞；包含有筛选标记基因eGFP，方便在荧光显微镜下直接确定外源基因的插入。同时筛选标记两侧的同向LoxP可与cre酶共同作用，去除阳性克隆细胞中的筛选标记。
5.本发明获取的插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞，经PCR鉴定，证实目的基因为定点整合到牛胎儿成纤维细胞基因组F-A位点。
6.以插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞作为核移植供体细胞，可以通过SCNT获得转基因克隆牛，为获得对结核病具有更强抗性的新品种转基因牛打下坚实的基础。
附图说明
图1是慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV的图谱。
图2是Ipr1过表达抑制结核分枝杆菌增殖的折线图。
图3是将打靶位点对应的向导序列克隆至Cas9表达载体的原理图。
图4是Cas9真核表达载体的图谱。
图5是利用Surveyor nuclease assay对Cas9切割活性检测结果的柱状图。
图6是打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro的图谱。
图7是原代培养(A)及传代培养(B)中的用于基因打靶的牛胎儿成纤维细胞。
图8是转染打靶载体的牛胎儿成纤维细胞经嘌呤霉素筛选出来的单克隆细胞图。
图9是选取一些具有代表性的单克隆细胞的junction PCR鉴定结果图。
图10是阳性克隆核型分析图。
图11是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆胚胎。
图12是利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆牛。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述是对本发明的解释，而不是限定。
通过体外攻菌实验证明了插入小鼠Ipr1基因可以限制牛结核分枝杆菌的增殖后，本发明首先构建了含有Ipr1基因的巨噬细胞特异性表达的打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro，然后通过电穿孔的方法将打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和SouthernBlotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该打靶的阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞中，获得转基因克隆胚胎。最后通过将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，获得转基因克隆牛。
具体所涉及的试剂和材料如下：胎牛血清、嘌呤霉素、DMEM、DMEM/F12、RPMI 1640、Opti-MEM培养基购自美国Invitrogen公司，EDTA和Trypsin购自美国Sigma公司，细胞培养板和培养皿购自美国Corning公司，质粒提取试剂盒和细胞基因组提取试剂盒均购自美国Omega公司，Mutation Detection试剂盒购自Transgenomic公司，反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、PrimeSTAR DNA聚合酶和Solution I DNA连接酶购自Takara公司，转染试剂HD DNA Transfection Reagent购自FuGENE公司，电转染仪(ECM2001)购自美国BTX公司，限制性内切酶购自NEB公司，感受态细胞DH5α和JM110均购自上海TIANGEN公司，红细胞裂解液购自碧云天公司，慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV和包装载体pMD2.和psPax2购自美国SBI system biosciences公司，293T细胞购自中国科学院细胞库，RAW264.7细胞系购自ATCC细胞库。
1、Ipr1基因的功能验证
1.1构建稳定表达Ipr1的慢病毒载体
根据小鼠Ipr1序列(GenBank登陆号：NM_175397.4)，设计引物如下：
Ipr1-EcoRI-F:5′-TCAGAATTCGAACCCCTTAACTAATCCAG-3′
Ipr1-BamHI-R:5′-CTAGGATCCGCTGGGACACTCAGAGGCTC-3′
采集适量小鼠外周血(2016年3月，成都达硕实验动物有限公司)，添加枸缘酸钠抗凝血剂(CPD)。离心富集血细胞后弃上清，加入足量的红细胞裂解液，轻柔重悬细胞充分裂解。800-1000r离心5-8分钟，弃去上层红色清液，并使用TRIZOL法对于下层沉淀提取总RNA。按照TakaRa公司反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit说明书进行标准的反转录操作后，以反转录所得的小鼠cDNA模板进行PCR反应。
50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，Ipr1-EcoRI-F(10μmol/L)：1μL，Ipr1-BamHI-R(10μmol/L)：1μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL，小鼠cDNA模板3μL，加超纯水至50μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，32个PCR循环；72℃再延伸5min；PCR胶回收产物经EcoRI和BamHI双酶切，经Solution I连接至pEGFP-C1载体(Clontech)，暂命名为pIpr1-C1。
将pIpr1-C1和慢病毒载体pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV(如图1所示)进行EcoR I和BamH I双酶切处理，通过Solution I连接后，测序后保存阳性重组载体，即完成稳定表达Ipr1的慢病毒载体pCDH-MSCV-Ipr1-T2A-Puro的构建。
1.2细胞转染及稳定细胞株的筛选
DMEM培养液培养293T细胞，待细胞密度(汇合度)达到约60％～80％时，准备细胞转染。质粒pCDH-MCS-T2A-Puro-MSCV以及重组质粒pCDH-MSCV-Ipr1-T2A-Puro与包装质粒分别共转染293T细胞，48h后离心10min，将上述包含慢病毒的培养液，加入到10mm培养皿中汇合度约60～80％的RAW264.7细胞系中继续培养。转导8h后更换为含10％FBS的RPMI 1640培养液；转导48h后，更换培养液为含有5μg/mL嘌呤霉素和10％FBS的RPMI 1640培养液，进行阳性细胞筛选并每隔3d更换一次新的相同成分培养液。药物筛选8d后，经过胰酶轻度消化，挑取多个状态良好的单克隆细胞，混匀后接种至24孔板中。待细胞铺满整个培养皿后，继续传代培养直至长满整个60mm皿，得到稳定整合Ipr1过表达RAW264.7细胞。
1.3Ipr1基因的功能验证
以稳定整合Ipr1过表达RAW264.7细胞为实验组，转染空载体的RAW264.7细胞为对照组(Control)，向培养液中加入1×106单位的结核分枝杆菌(AF 2212/97)悬液进行体外攻菌实验操作，放回培养箱中继续培养。
在攻菌操作后4h、24h、48h、72h、96h和120h时间点收集细胞，进行后续菌落形成单位计数(Colony-Forming Units，CFU)分析。结果表明，稳定整合Ipr1过表达RAW264.7细胞的过表达可以减少RAW264.7巨噬细胞样细胞系的荷菌数(图2，96h:Control 323％±20％vs.Ipr1 134％±23％,P＝0.0017)。这证明了插入小鼠Ipr1基因可以限制牛结核分枝杆菌的增殖，并提示了通过插入小鼠Ipr1基因获取抗结核的转基因牛新品种的可能性。
前期实验证明5个牛Ipr1基因的可变剪接体无法起到限制结核杆菌的生长和增殖的作用，相反小鼠Ipr1基因则可以显著地抑制结核杆菌的生长和增殖。因此最终选用小鼠Ipr1作为生产转基因牛的候选基因。
2、CRISPR/Cas9真核表达载体的构建
2.1打靶位点设计及载体构建
选择牛基因组25号染色体上FSCN1(fascin actin-bundling protein 1，FSCN1)基因和ACTB(beta-actin，ACTB)基因间区域设计打靶位点(以下或也称为F-A打靶位点)，该基因间区域全长为560bp，(左起为5`端)：
Bos Taurus chromosome 25Btau_4.6.1Chr25.position 40,631,870-40,632,429
将上述序列输入打靶位点在线筛选工具ZiFiT(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)，随后将总计80个潜在打靶位点全部输入打靶位点在线评估工具Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)中，输出初步的筛选结果。本发明从全部的80个潜在打靶位点中挑选出最理想的14个位点进行后续的CRISPR/Cas9真核表达载体构建工作及进一步的切割效率检测。
如图3所示，本发明所选取的一元表达载体既包含hspCas9蛋白表达所需的完整元件序列，也包含稳定转录sgRNA所需的hU6启动子。该载体在经过限制性内切酶Bbs I酶切处理后，可形成将打靶位点对应的向导序列克隆至该载体所需的接头结构。利用表1所述合成的寡聚核苷酸序列，通过简单的退火与连接反应即可实现CRISPR/Cas9真核表达载体构建。
表1.sgRNA克隆引物序列(5'-3')
表1中下划线部分标识的序列为各打靶位点对应向导序列
将上述核酸序列送至上海生工生物公司合成，构建如下反应体系：2μL Top Guideoligo(100μM)；2μL Bottom Guide oligo(100μM)；加16μL ddH2O至20μL总体积。混匀并短暂离心后，置于PCR仪中进行如下程序：37℃5分钟；95℃10分钟；之后每分钟梯度降温5℃直至4℃。完成退火后，取出样品并置于冰上待用。
构建Cas9表达载体质粒酶切反应体系如下：10μL pSpCas9(BB)-2A-GFP(2μg，addgene，参见图4)；2μL 10×NEBuffer 2.1；1μL Bbs I；加7μL ddH2O至20μL总体积。混匀并短暂离心后，37℃水浴过夜。回收酶切后载体，并与上述退火后样品构建如下连接体系：1μL退火后双链oligo；2μL pSpCas9(BB)-2A-GFP；5μL 2×Solution I；加2μL ddH2O至10μL总体积。混匀并短暂离心后16℃水浴连接1h。连接产物(靶位点插入位置位于hU6启动子与sgRNA接头序列scaffold间)按标准程序转化入感受态细胞DH5α中，涂布于固体LB培养基(100mg/mL氨苄青霉素)上37℃培养过夜。挑取数个单克隆扩大培养后送往华大科技测序，选取阳性克隆保存菌种备用。
2.2切割活性检测
当60mm培养皿内牛胎儿成纤维细胞(BFFs)培养至汇合度约60％时，分别取各组Cas9表达载体质粒10μg；FuGENE HD转染试剂20μL；补加Opti-MEM至总体积250μL。充分混匀后室温静置孵育15min，将转染混合物加入到各对应培养皿中，轻柔混匀后放回培养箱中继续培养。转染72h后，收集细胞并使用Omega公司全基因组提取试剂盒提取基因组并进行后续Surveyor错配核酸酶检测。操作按照说明书中标准程序进行，其中PCR扩增打靶区域(1037bp)所用引物序列如下，退火温度60℃：
Surveyor-detect-F：5′-GACTCCTGTAACCTCTGTCCCTG-3′
Surveyor-detect-R：5′-TCAGCAGTTGCGGTTCG-3′
核酸电泳结果经过软件image-J(http://imagej.net)灰度评估，计算得出切割效率fcut＝酶切后两条带灰度之和/该泳道三条带灰度总和。为了更好的反映出Cas9蛋白在该位点的实际打靶效果，进一步通过以下算法将切割效率折算为实际突变率indel％＝(1检测结果见图5。
结果表明，在45号打靶位点处Cas9核酸酶切割活性最高(20号活性也较高)。可选择45号(或20号)打靶位点和Cas9核酸酶进行后续的Ipr1插入实验，提高转基因动物生产的成功概率。
以下如未做另外说明，Cas9核酸酶表达载体均以表1中编号45所对应序列的带下划线部分作为向导序列。
3、Ipr1巨噬细胞特异性打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro的构建
3.1MSR1启动子的克隆
MSR1启动子是牛内源的巨噬细胞特异性启动子。使用该启动子的目的在于引导Ipr1基因在巨噬细胞中特异性表达，不仅显著增强Ipr1基因抗结核的作用，同时对提高转基因动物的生物安全性有着重要的意义。
根据牛的MSR1(macrophage scavenger receptor 1，巨噬细胞清道夫受体1)序列(GenBank登陆号：NC_007328)，设计引物序列如下：
pMSR-BglII-F:5′-TGAAGATCTACCATCTCTTGATAGAAAGT-3′
pMSR-HindIII-R:5′-TACAAGCTTGACACACAAAAATACAGAG-3′
50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，pMSR-BglII-F(10μmol/L)：1μL，pMSR-HindIII-R(10μmol/L)：1μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL，荷斯坦奶牛基因组DNA模板2μL，加超纯水至50μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，32个PCR循环；72℃再延伸5min；PCR胶回收产物经BglII和HindIII双酶切，经Solution I连接至pIpr1-C1载体，暂命名为pMSR1-Ipr1。
3.2MSR1-Ipr1表达框的克隆
以pMSR1-Ipr1序列为模板，设计引物如下：
Ipr1-19T-F：5′-ATTTGCGGCCGCGAATTCGTCGACGGACCATCTCTTGATAGAAAG-3′
Ipr1-19T-R：5′-AAGCTTCCATGGATCGATGGGGCTAGCTACGCGTTAAGATACATTGAT-3′
50μL的PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs(2.5mmol/L)：4μL，Ipr1-19T-F(10μmol/L)：1μL，Ipr1-19T-R(10μmol/L)：1μL，PrimeSTAR DNA聚合酶(5U/μL)：0.5μL，pMSR1-Ipr1质粒模板1μL，加超纯水至50μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸3min，32个PCR循环；72℃再延伸5min；回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T simple克隆载体(Takara)，转化入商品化DH5α大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海华大基因测序。测序正确的载体暂命名为pPromoter-Ipr1-polyA-19T。
3.3同源臂序列的克隆
设计引物分别扩增牛25号染色体上F-A打靶位点上游序列(777bp)作为左侧同源臂(Left arm，LA)和下游序列(816bp)作为右侧同源臂(Right arm,RA)，引物序列如下：
LA-19T-F：5'-GCGGCCGCGTCTGACCCGTGAGTGTT-3'
LA-19T-R：5'-GTCGACGCGGCTAGTTTGGGAGTG-3'
RA-19T-F：5'-GCGGCCGCAACATCGATACACCCTTTCTAGTGGTCC-3'
RA-19T-R：5'-AAGCTTTCCCGCTGATTGTTCTTC-3'
反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL primer F(10μM)；1μL primer R(10μM)；1μL荷斯坦奶牛基因组DNA(200ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为58℃，延伸时间50s。回收PCR目的片段并在其末端加A处理后，构建标准T-A克隆连接体系将其重组至pMD19T克隆载体(Takara)，转化入商品化JM110大肠杆菌中，并挑取数个单克隆扩大培养后送上海华大基因测序，测序正确的即为LA阳性重组子和RA阳性重组子。
本发明中所用荷斯坦奶牛基因组DNA为下文中组织块贴壁法所得的牛胎儿成纤维细胞中所提取(2015年10月)，按照Thermo公司GeneJET Genomic DNA Purification Kit说明书进行标准的基因组提取操作。
将LA阳性重组子与pPromoter-Ipr1-polyA-19T载体分别进行NotI和SalI双酶切处理，通过Solution I将左侧同源臂连接至后者骨架载体上。将连接产物转化入JM110感受态细胞中。NotI和SalI双酶切鉴定出阳性重组子后，提取质粒，然后将其与RA阳性重组子分别进行ClaI和NotI双酶切处理，通过Solution I将右侧同源臂连接至前者骨架载体上。将阳性重组载体暂命名为pLA-Promoter-Ipr1-polyA-RA-19T。
以本实验室已有载体为模板(DOI:10.13345/j.cjb.130529)，扩增筛选标记LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-LoxP。引物序列如下：
EEPP-19T-F：5'-GAGCACTAGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGCGTTATCCCCTGATTCTGT-3'
EEPP-19T-R：5'-TACCATCGATGGAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGCTTACAATTTACGCCTTAAG-3'
反应体系如下：10μL 5×PS Buffer；4μL dNTPs(2.5mmol/L)；1μL EEPP-19T-F(10μM)；EEPP-19T-R(10μM)；1μL质粒模板(200ng/μL)；0.5μL PrimerStar DNA聚合酶(2.5U/μL)；加双蒸水至50μL。按照产品说明书标准三步法设置反应程序，其中退火温度为62℃，延伸时间3min。
将PCR产物进行SpeI和ClaI双酶切处理,pLA-Promoter-Ipr1-polyA-RA-19T载体进行NheI和ClaI双酶切处理，通过Solution I连接后，测序后保存阳性重组载体，即完成巨噬细胞特异性表达打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro的构建，如图6所示(即供体载体Cas9(45)Ipr 1Donor Vector)。图6中所示载体包括以下顺次排列的元件：LA、MSR1启动子(pMSR1)，Ipr1开放阅读框(Ipr ORF)、SV40polyA、上游LoxP位点、EF1α启动子(EF1promoter)、荧光报告基因EGFP开放阅读框、P2A序列和抗性基因PURO(抗嘌呤霉素)开放阅读框(eGFP-P2A-Puro)、SV40polyA、下游LoxP位点以及RA。
4、巨噬细胞特异性表达打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro与特异性Cas9切割核酸酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞。
4.1牛胎儿成纤维细胞培养
本发明中所用牛胎儿成纤维细胞均为组织块贴壁法所得。将采集的牛胎儿(杨凌科元克隆股份有限公司，2015年10月)用含有青链霉素的PBS缓冲液清洗三次以上以避免细菌污染。在无菌工作台上用眼科剪及镊子剥离牛胎儿皮肤组织，并将其剪碎为约1mm3的组织块。小心的将组织块均匀贴附直径60mm培养皿中，并轻柔滴加少量DMEM培养液润湿。将培养皿倒置CO2培养箱中37℃，5％CO2孵育4h后，加入5mL含有青链霉素及10％FBS的DMEM培养液正置培养。约3-4天后可见组织块周围有成纤维细胞迁出，继续培养至细胞汇合度大于90％后弃去残余组织块，此时可选择冻存细胞或者传代培养，如图7A所示。
传代培养与冻存：弃去细胞培养液，加入3mL PBS轻柔洗涤后弃液，加入1mL含0.25％胰酶的PBS消化细胞，37℃孵育3min后加入DMEM培养液终止消化。轻柔吹打剥离贴壁细胞形成细胞悬液，离心弃去上清后选择加入DMEM培养液重悬细胞，按照1:3～1:5的比例传代培养，如图7B所示；或选择加入含10％DMSO的细胞冻存液，彻底重悬细胞并转入冻存管及程序冻存盒中，并最终转置液氮中冻存。细胞复苏：将冻存管从液氮中取出，37℃水浴迅速解冻。低速离心后弃去冻存液，加入1mL含10％FBS的DMEM培养液彻底重悬细胞。转接至对应规格培养皿中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
4.2阳性细胞克隆的筛选
本发明使用电穿孔法将打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro与特异性Cas9切割核酸酶表达载体共转染入牛胎儿成纤维细胞。电转液配方为KCl：120mM；CaCl2：0.15mM；K2HPO4:10mM；MgCl2:2.50mM。调节pH值至7.6后，与Opti-MEM培养液按照体积比3:1混匀。向500μL混合液中加入上述两种载体质粒各20μg，转移至离心弃去培养液的细胞团块中，轻轻吹打重悬细胞并混匀。将上述细胞悬液转移到新的BTX电转杯中静置5min，调节电转仪电压为510V，脉冲1ms电击3次后静置10min。将细胞悬液转移到90mm培养皿中，于37°、5％的CO2培养箱中继续培养。
转染24h后，向细胞培养液中加入终浓度为2μg/mL的嘌呤霉素进行药物筛选。筛选8d后，基因组中未整合打靶载体的细胞全部死亡，而稳定整合打靶载体的细胞逐渐形成单克隆细胞团，并在荧光显微镜下可见绿色荧光表达，单克隆细胞见图8。挑取单克隆细胞至48孔板继续培养并继续进行后续阳性克隆鉴定。
4.3PCR鉴定基因打靶的阳性细胞克隆
取部分扩大培养的单克隆细胞，离心弃上清后加入20μL裂解液(10mM Tris-HCl,pH 8.5；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.5％NP-40；0.5％Tween-20；400g/mL proteinase K)，充分重悬后65℃水浴30min，95℃水浴15min完成细胞裂解。取5μL细胞裂解物作为模板，分别利用下述junctionPCR引物进行阳性克隆鉴定。
5'-junction：Lj F：5'-GCCCATCCCAACTCT-3'；
Lj R：5'-AAAGGATACCCACCAAGT-3'；
3'-junction：Rj F：5'-TCCCAACATACCCTTCT-3'；
Rj R：5'-CACCGATTTATCTATTTCC-3'。
其中，5'-junction上游引物匹配序列为5'端同源臂上游基因组序列，下游引物匹配序列为打靶载体上Ipr1基因启动子序列，产物大小1545bp；3'-junction上游引物匹配序列为打靶载体上puro基因序列，下游引物匹配序列为3'端同源臂下游基因组序列，产物大小应为1872bp。通过5'-junction PCR反应鉴定出的阳性克隆进一步通过3'-junction PCR进行鉴定。只有通过了两轮PCR鉴定的克隆才会在扩大培养后，进行后续实验。典型的利用junction PCR鉴定过程见图9。统计表明，使用上述方法进行Ipr1打靶插入的阳性率为18.75％，该比例对于转基因动物生产而言是足够高的。
4.4阳性克隆核型分析
在核移植前，取少量阳性克隆细胞进行核型分析。当多数转基因细胞处于对数生长期时，向培养液中加入终浓度为0.4μg/mL的秋水仙素并继续培养5h。胰酶消化并富集细胞于15mL离心管中，1000rpm离心5min后弃去上清，加入10mL细胞低渗液(0.075M KCl)并轻柔的彻底重悬细胞。37℃水浴30min后，加入1.5mL预冷的甲醇和0.5mL预冷的乙酸混匀进行细胞预固定。1000rpm离心10min后弃去上清，重新加入10mL上述固定液并轻柔重悬细胞，室温孵育20min进行固定。重复上述离心与固定步骤2-3次后，离心弃去上清，并加入100μL预冷的固定液轻柔吹打重悬细胞。将冷冻处理过的载玻片30℃倾斜放置，并以一定高度进行滴片，自然风干后，将玻片浸入10％吉姆萨染液中10min进行染色，洗去浮色后使用油镜进行镜检观察。典型的核型分析结果如图10所示，显示染色体数量、结构完整、形态良好。
5、以上述基因组定点整合了目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞为核供体细胞，构建转基因克隆牛
5.1卵母细胞的成熟培养
本发明所用卵巢均为无菌条件下采自西安市屠宰场(2016年10月)，在37℃无菌生理盐水内运输至实验室。抽取3～8mm直径的卵泡并收集卵丘卵母细胞复合体，在体视显微镜下挑选合适的卵母细胞用于成熟培养。成熟培养液为加入10％FBS和10ng/mL的表皮生长因子的TCM199(Gibico)。在38.5摄氏度，5％CO2条件下培养20h后，用0.2％的透明质酸酶去除卵丘细胞，并挑选成熟的卵母细胞用于核移植实验。
5.2转基因克隆胚的构建
本发明采取采用体细胞核移植(SCNT)技术将供体细胞转移到去除细胞核的成熟卵母细胞中去。核移植时以含10％FBS，5μg/mL细胞松弛素B的PBS作为显微操作液，用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质。以10μg/mL Hoechst33342染色10min后，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。
以生长至接触抑制状态3d后的Ipr1精准插入的阳性转基因荷斯坦牛胎儿成纤维细胞为供核细胞。用去核管将供体细胞注入去核成功的卵母细胞透明带下。使用电融合液将核质复合体平衡3min，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，并给予28V、10μm电脉冲进行电融合。将融合后的重组体置于含有10％FBS的M199中，38.5℃、5％CO2培养2h后观察融合情况。
5.3转基因克隆胚的激活及体外培养
融合的重组胚在含10％FBS的M199中平衡2h后，用含5μmol/L离子霉素(购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液(购自SIGMA公司)处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培养液内培养4h，清洗3次后转入矿物油覆盖并预先在CO2培养箱中平衡至少2h的mSOFaa中培养，培养密度为5μL每个重组胚，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养，在第7天检查囊胚发育情况。正常发育至囊胚的转基因克隆胚如图11所示。
5.4转基因克隆牛的制备
将发育良好的囊胚移植到发情的荷斯坦受体牛的子宫角(每头受体牛移植2-3枚囊胚)。60天后，用B超对移植后未返情的受体牛做怀孕检查。此后每月检查一次，观察妊娠维持情况。10个月后，成功产下成活的基因打靶的转基因克隆牛(图12)。F-A打靶位点定点整合Ipr1基因的转基因克隆牛的制备成功，为预防牛结核打下了坚实的基础。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 利用Cas9切割核酸酶介导Ipr1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法
<160> 47
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
tcagaattcg aaccccttaa ctaatccag 29
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
ctaggatccg ctgggacact cagaggctc 29
<210> 3
<211> 560
<212> DNA
<213> Bos taurus
<400> 3
aagaaccttg cccttgtcca ggaatccagg ggggcttcct ggaagaggtg atatgtacac 60
caaaccctaa aggagaagca gaacttaaag aagcagaaag gatgcgtgtg gggagcagag 120
tccattacag accgagagaa caggaagggc agaggccctg aggcagattt ggtgttctaa 180
ggattagaag gcagagtgtc tgggaacaca gagtaaggct ggaggggcaa gggggtgagg 240
ttagccacac tcccaaacta gccgcggtct ccacaactat gtgcagtgtc gacgtgcagc 300
tccttgaatt gccactcaca ggttcccagc acccagatcg acgtacaggc ctagggttcc 360
agaagcttcc atcacaccct ttctagtggt cctccacata gggcaccttt gtcctgtctt 420
ctgcacatag attggctccc tgtctttaaa ctccacgaaa acaggatcag agagaatccg 480
ttcttgtgtg tgaagtggga gctcactgtg gtttgcattt gcatttcacg gatgacccgt 540
gatgtcgagt ctcttcttat 560
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
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caccgaacct gtgagtggca attca 25
<210> 5
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<212> DNA
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caccgatgtg gaggaccact agaaa 25
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<400> 7
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<400> 8
caccgcagat cgacgtacag gccta 25
<210> 9
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caccgcagca cccagatcga cgtac 25
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caccgcagga caaaggtgcc ctatg 25
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caccgccaca ctcccaaact agccg 25
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aaaccggcta gtttgggagt gtggc 25
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caccgcctag gcctgtacgt cgatc 25
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aaacgatcga cgtacaggcc taggc 25
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caccgcctgt cttctgcaca tagat 25
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aaacatctat gtgcagaaga caggc 25
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caccgctagg cctgtacgtc gatct 25
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caccgctgta cgtcgatctg ggtgc 25
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aaacgcaccc agatcgacgt acagc 25
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caccggacaa aggtgcccta tgtgg 25
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aaacccacat agggcacctt tgtcc 25
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aaacaaacta gccgcggtct ccacc 25
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caccgtgtac gtcgatctgg gtgct 25
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aaacagcacc cagatcgacg tacac 25
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<213> 人工合成()
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aaacaactag ccgcggtctc cacac 25
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<213> 人工合成()
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tgaagatcta ccatctcttg atagaaagt 29
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<212> DNA
<213> 人工合成()
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tacaagcttg acacacaaaa atacagag 28
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<212> DNA
<213> 人工合成()
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atttgcggcc gcgaattcgt cgacggacca tctcttgata gaaag 45
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<213> 人工合成()
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aagcttccat ggatcgatgg ggctagctac gcgttaagat acattgat 48
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gcggccgcgt ctgacccgtg agtgtt 26
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<213> 人工合成()
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<213> 人工合成()
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gcggccgcaa catcgataca ccctttctag tggtcc 36
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<400> 41
aagctttccc gctgattgtt cttc 24
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<212> DNA
<213> 人工合成()
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gagcactagt ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgcgtt atcccctgat 60
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<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 43
taccatcgat ggaacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcgctta caatttacgc 60
cttaag 66
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<400> 44
gcccatccca actct 15
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<212> DNA
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aaaggatacc caccaagt 18
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<400> 46
tcccaacata cccttct 17
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 47
caccgattta tctatttcc 19

Claims (10)

1.一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：该打靶载体包括目的基因Ipr1以及用于将Ipr1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列。
2.根据权利要求1所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游577-977bp和下游616-1016bp；打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。
3.根据权利要求1所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述目的基因Ipr1是由巨噬细胞清道夫受体1启动子启动转录。
4.根据权利要求1所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，这两个筛选标记基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。
5.根据权利要求4所述一种Ipr1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：所述元件序列还包括位于两个筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列。
6.一种插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：以牛胎儿成纤维细胞为宿主细胞，通过共转染打靶载体pIpr1-eGFP-P2A-Puro和针对打靶位点的CRISPR/Cas9表达载体，将目的基因Ipr1定点整合到牛胎儿成纤维细胞的25号染色体FSCN1和ACTB基因间。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述宿主细胞为传代2～3代的荷斯坦奶牛胎儿成纤维细胞。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述共转染操作采用电穿孔法。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9表达载体包含有与打靶位点相对应的向导序列，打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间如SEQ.ID.NO.1所示的序列内。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述插入目的基因Ipr1的牛胎儿成纤维细胞可作为生产转基因克隆牛的核移植操作供体细胞使用。
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