CN109679998B - 一种定点突变MSTN并同时定点整合PPARγ的载体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体及重组细胞，载体包括Cas9切割表达载体和打靶载体。本发明将Cas9切割表达载体和打靶载体共同转染宿主细胞，构建重组细胞株，可以作为生产转基因克隆胚胎的核移植供体细胞，抑制MSTN的功能发挥，同时实现PPARγ在骨骼肌细胞中特异性表达，进而为快速、高效研制优质转基因肉牛新品种提供支撑。

Description

一种定点突变MSTN并同时定点整合PPARγ的载体
技术领域
本发明涉及转基因克隆动物技术领域，更具体的说是涉及一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体及重组细胞。
背景技术
肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)也叫生长分化因子(GDF8)，作为肌肉生长发育和分化的负向调控因子，可通过抑制正向调控因子--生肌决定因子(MoyD)的转录活性来抑制成肌细胞的增殖和分化。成熟态的MSTN以剂量敏感的方式抑制体外培养的C2C12生肌细胞DNA和蛋白质合成，并可抑制C2C12生肌细胞的有丝分裂从G1期向S期转化和从G2期向M期转化，以及诱导C2C12生肌细胞的自噬作用，因此抑制了C2C12生肌细胞的增殖；MSTN还通过抑制MyoD等关键生肌分化因子的功能和表达，及激活Erk1/2级联途径抑制成肌细胞分化为肌管。MSTN基因敲除后能促进骨骼肌质量的显著增加，而且不会导致致命缺陷。牛、狗、鼠等动物都有MSTN基因变异失活而出现“双倍肌肉”的情况。如比利时蓝牛MSTN基因外显子3上缺失了11bp，缺失造成第14个密码子变成了终止密码子，导致合成的MSTN无活性；皮埃蒙特牛的双肌表型就是由于p.C313Y突变破坏了半肌氨酸结构，破坏了其三维结构的稳定和功能，从而导致其骨骼肌与普通牛相比出现成倍增加。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma,PPARγ)在转录水平通过影响脂肪酸及其衍生物的功能而促进脂肪细胞的增殖和分化。活化的PPARγ不仅能够促进脂肪细胞分化，增加脂肪细胞数量，而且可调控脂肪组织中相关基因的表达，例如C/EBP、脂肪酸结合蛋白(αP2)，脂蛋白脂肪酶(LPL)和脂肪酸转位酶(CD-36/FAT)达到调控脂肪代谢目的，这些基因参与脂肪生成、转运、储存、氧化等过程。PPARγ在核受体调控脂肪细胞分化和诱导脂肪形成的进程中起到支配性的作用，PPARγ处于脂肪细胞分化转录调控网络的中心位置，在脂肪细胞分化早期阶段起到不可或缺的作用。重要的是所有转录调控因子必须在PPARγ存在的情况下才能起始脂肪细胞分化过程。总之，在复杂的生理代谢调控系统中，PPARγ是一个调节脂肪形成和能量代谢的主要因子。
CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated)系统是细菌和古菌的适应性免疫防御机制，用以抵抗外源病毒或者质粒的二次入侵。CRISPR/Cas9技术应用于基因条件性敲除、敲入、替换等基因编辑、基因转录调控、特定基因组序列定位等科研领域。其用于基因编辑的基本原理是：第一步，sgRNA指导Cas9对靶DNA序列的识别和切割过程，形成DNA双链断裂切口(double-strand break，DSBs)或DNA单链断裂切口(single-strand break，SSNs)；第二步，细胞的自我修复过程，即通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(homology-directedrepair，HR)两种途径，NHEJ造成开放阅读框的位点缺失或插入，从而导致移码突变，完成对生物体DNA序列进行删除、添加、替换的编辑工作，效率较高；HDR修复过程需要同源模板用来重组断裂的DNA序列，达到条件性基因敲除、敲进、替换、点突变等工作，效率低但保真性高。
转基因动物在家畜品种改良方面具有巨大的应用潜力。在实际生产中，转基因技术可以改善动物肉质，提高增长率、饲料利用率，改善乳质及其成分，改良繁殖性能等。因此，提供一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体及重组细胞，应用现代分子设计和育种技术改善牛肌肉和脂肪生长，提高我国地方肉牛品种的产肉能力和肉品质，选育具有我国自主知识产权的高品质中国地方黄牛品种，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体及重组细胞，在鲁西黄牛2号染色体MSTN基因3’UTR区由5’同源臂引入一个G到A的碱基突变同时定点整合PPARγ基因构建牛胎儿成纤维细胞株，以该细胞株作为核供体细胞，为研制高品质转基因肉牛育种材料提供支撑。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体，包括Cas9切割表达载体和打靶载体；
所述Cas9切割表达载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框，sgRNA靶位点在牛基因组2号染色体MSTN基因的3’UTR区；
所述打靶载体上克隆有重组基因MRF-PPARγ-PloyA，并克隆有sgRNA靶位点的上游同源序列作为其5’同源臂，和下游同源序列作为其3’同源臂，其中5’同源臂引入g+6354G-A单碱基突变；可以使MSTN蛋白功能丧失。
所述重组基因MRF-PPARγ-PloyA在PPARγ基因CDS区的上游连接牛骨骼肌特异性启动子MRF，在下游连接PloyA。
进一步，所述Cas9切割表达载体上克隆有sgRNA靶点，其核苷酸序列如下：
pSpCas9-Sg27F：5’-CACCgGTCAGTCTCATTAAGTGCTC-3’；SEQ ID NO.7；
pSpCas9-Sg27R：5’-AAACGAGCACTTAATGAGACTGACC-3’；SEQ ID NO.8。
进一步，所述MRF-PPARγ-PloyA重组基因中，MRF的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，PPARγ基因CDS区的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，PloyA的核苷酸序列如SEQ IDNO.34所示。
进一步，所述打靶载体同源臂包括分别位于重组基因MRF-PPARγ-PloyA上游、下游的5’同源臂和3’同源臂，所述重组基因MRF-PPARγ-PloyA与3’同源臂之间还设有一对同向的Loxp，Loxp之间设有筛选表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA。
进一步，所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.35所示。
进一步，所述Cas9切割表达载体为pSpCas9-sgRNA，通过在pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体上连接sgRNA靶点序列构建；
所述打靶载体为pLR-MRF-PPARγ-PloyA-SE，通过将重组基因MRF-PPARγ-PloyA插入到打靶骨架T-VectorpMD19的第一个Loxp的上游，在5’同源臂引入g+6354G-A单碱基突变，将5’同源臂连接在MRF-PPARγ-PloyA的上游，将3’同源臂连接在第二个Loxp的下游构建。
进一步，一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的重组细胞，通过Cas9切割表达载体和打靶载体共同转染宿主细胞，将目的基因PPARγ定点插入到宿主细胞的2号染色体MSTN基因3’UTR区，并在MSTN基因3’UTR区引入g+6354G-A单碱基突变。
进一步，所述宿主细胞为鲁西黄牛胎儿成纤维细胞。
进一步，所述重组细胞是通过将Cas9切割表达载体和打靶载体共同转染到宿主细胞构建的；所述Cas9切割表达载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA，sgRNA靶点位于MSTN基因3’UTR序列；所述打靶载体包括用于通过同源重组定点整合至MSTN基因的3’UTR区的重组基因MRF-PPARγ-PloyA，以及作为同源臂的sgRNA靶点上游和下游同源序列，其中，sgRNA靶点上游同源序列引入有使MSTN蛋白功能丧失的g+6354G-A点突变；所述重组基因MRF-PPARγ-PloyA包括依次排列的骨骼肌特异性启动子MRF、PPARγ基因CDS区和PolyA。
进一步，所述共同转染是将Cas9切割表达载体和打靶载体共同电转到宿主细胞中；电转染参数如下：电压为510V；脉冲时间为2ms；电击次数2次。
进一步，一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体构建的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体及重组细胞，通过CRISPR/Cas9进行介导定点打靶，在牛骨骼肌细胞中特异性表达PPARγ基因的同时通过5’同源臂引入单碱基突变，引起bta-mir-1/206的靶向结合，使MSTN丧失生物活性，实现对两个基因同时编辑的目标，进而提高转基因效率，缩短肉牛育种时间；
本发明构建的CRISPR/Cas9切割载体，其靶点位于牛基因组2号染色体MSTN基因3’UTR区；在CRISPR/Cas9识别、切割后产生DNA双链断裂，启动同源重组末端修复机制，同时引入同源臂打靶载体，实现目的DNA序列的定点整合，提高目的基因定点插入的精度和效率；
本发明构建的骨骼肌特异性打靶载体，目的基因PPARγ是由骨骼肌特异性启动子MRF启动子启动转录，可以使得目的基因PPARγ在且仅在牛的骨骼肌细胞中正常转录和表达，从而可以提高转基因动物的安全性；
本发明构建的打靶载体在筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA两侧引入一对同向的Loxp序列，既可以提高阳性克隆细胞的筛选效率，又能在阳性克隆细胞获得后去除筛选标记，从而提高体细胞核移植的克隆效率。
本发明通过在MSTN基因3’UTR区引入g+6354G-A单碱基突变并定点整合PPARγ基因构建重组细胞株，可以作为生产转基因克隆胚胎的核移植供体细胞，抑制MSTN的功能发挥，同时实现PPARγ在骨骼肌细胞中特异性表达，进而为快速、高效研制优质转基因肉牛新品种提供支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明鲁西黄牛MSTN基因打靶位置示意图；
图2附图为本发明sgRNA靶点对应的潜在脱靶位点统计图；
图3附图为本发明PX458的载体图谱；
图4附图为本发明利用Surveyor nuclease assay对7个Cas9蛋白切割位点的切割活性检测图；
其中，NC表示以PX458空载体作为对照；
图5附图为本发明定点整合PPARγ基因和MSTN基因点突变的打靶载体的结构示意图；
图6附图为本发明5’arm片段；
图7附图为本发明MRF启动子片段；
图8附图为本发明PPARγ的CDS片段；
图9附图为本发明PolyA片段；
图10附图为本发明LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP(SE)片段；
图11附图为本发明3’arm片段；
图12附图为本发明定点整合PPARγ基因和MSTN基因点突变打靶载体的打靶策略；
图13附图为本发明Cas9切割表达载体和打靶载体pLR-MRF-PPARγ-PloyA-SE共转染BFFs细胞示意图；
其中，A表示明场下BFF细胞示意图，B表示暗场下BFF细胞示意图；
图14附图为本发明转染打靶载体的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞经嘌呤霉素筛选出来的阳性单克隆细胞图；
其中，A表示明场下单克隆细胞示意图，B表示暗场下单克隆细胞示意图；
图15附图为本发明选取部分生长状态良好的单克隆进行5’-junction PCR鉴定电泳结果图；
其中NC表示转入PX458空载体的单克隆；
图16附图为本发明5’-junction PCR鉴定为阳性的单克隆，进行3’-junction PCR鉴定电泳结果图；
图17附图为本发明Sanger测序确定外源基因PPARγ精准插入及MSTN基因3’UTR g+6354G-A单碱基突变的示意图；
图18附图为本发明利用基因打靶的阳性克隆细胞制备的转基因克隆胚胎；
其中，A表示明场下转基因克隆胚囊胚生长状态，B表示暗场下转基因克隆胚囊胚生长状态。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
Gibco胎牛血清、DMEM/F-12细胞培养基、Opti-MEM细胞培养基、
Figure BDA0001941792430000051
3000Transfection Reagent购自Thermo fisher thermofisher公司；嘌呤霉素、胰蛋白酶购自Sigma公司；凝胶回收试剂盒、细胞培养皿、细胞培养板购自Corning公司；限制性内切酶购自NEB公司；PrimeSTAR HS DNA聚合酶、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶、反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、T-VectorpMD19、SolutionI DNA连接酶购自Takara公司；SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生物工程股份有限公司；无内毒素质粒小提试剂盒购自Omega公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、DH5a感受态细胞购自天根生化科技有限公司；G1.5、G2.5胚胎培养液购自Vitrolife公司；Surveyor nuclease assay试剂盒购自Transgenomic公司；电转染仪(ECM2001)购自美国BTX公司。
实施例1CRISPR/Cas9切割表达载体的构建
1)打靶位点设计及切割表达载体构建
为了实现PPARγ基因在牛的骨骼肌细胞中特异性转录和表达，同时在MSTN基因(GenBank：AF019761.1)3’UTR区引入g+6354G-A点突变，创造bta-mir-1/206靶位点，导致MSTN蛋白表达降低。利用牛骨骼肌特异性启动子MRF实现PPARγ基因(GenBank:NM_181024.2)在牛骨骼肌中特异性表达，定点插入到牛MSTN基因的3’UTR区，借助5’同源臂引入牛MSTN基因的3’UTR区g+6354G-A的单碱基突变，因此，选择MSTN的3’UTR区(chr2:6219940-6220590)共计650bp为打靶区，具体参见图1。
利用在线软件http://chopchop.cbu.uib.no/search.php、CCTop-CRISPR/Cas9target online predictor、http://www.rgenome.net/cas-designer综合预测到32条sgRNA。将筛选到的32个潜在打靶位点全部输入到打靶位点在线评估工具Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)，分别以错配数≤5和错配数≤3作为约束条件，统计每一个sgRNA靶点在牛基因组内对应的潜在脱靶位点的个数。对所有的sgRNA靶点序列及其对应的脱靶位点统计结果进行分析。选取潜在脱靶位点较低的7条gRNA分别以种质区为12、8、5且错配≤3、≤5为条件进行分析，结果见图2。
本发明所选取的一元表达载体pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体(见图3)既包括pSpCas9蛋白表达所需的完整元件序列，也包括稳定转录sgRNA所需的hU6启动子。用BbsI酶切pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体(Addgene)，得线性化的载体，将表1所述合成寡聚核苷酸序列完全退火后，分别连接至线性化的载体。即可实现7个CRISPR/Cas9切割表达载体构建。编号分别为pSpCas9-sg11、pSpCas9-sg19、pSpCas9-sg22、pSpCas9-sg27、pSpCas9-sg29、pSpCas9-sg30、pSpCas9-sg32。
表1 sgRNA克隆引物序列
Figure BDA0001941792430000061
Figure BDA0001941792430000071
注：其中下划线部分标识的序列为各打靶位点对应向导序列。
2)Cas9切割表达载体切割活性检测
将7种Cas9切割表达载体分别转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，以PX458空载体(指pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458))作为对照(NC)，转染72小时后消化细胞并提取基因组；以提取的细胞基因组为模板，PCR扩增一段包含sgRNA靶点的DNA序列并进行Surveyor错配核酸酶检测；其中PCR扩增打靶区域为663bp，退火温度为55℃，所用引物序列如下：
Surveyor-detect-F:5’-GATTTCTGGTTTCCACTTTATTAT-3’；SEQ ID NO.15；
Surveyor-detect-R:5’-CTCCAGCCTTGGCAGTGTTA-3’；SEQ ID NO.16。
具体操作参照Surveyornuclease assay试剂盒说明书，酶切产物进行电泳检测，检测结果见图4。
结果表明，在27号打靶位点处Cas9核酸酶切割活性较高，本发明选择27号打靶位点和Cas9核酸酶进行后续试验。
实施例2定点整合PPARγ基因和MSTN基因点突变打靶载体pLR-MRF-PPARγ-PloyA-SE的构建
定点整合PPARγ基因和MSTN基因点突变打靶载体包含5’arm、3’arm、PPARγ基因CDS区、LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP筛选标记，其中PPARγ基因CDS区上游与骨骼肌特异性启动子MRF连接，下游与筛选标记第一个LoxP序列由PloyA隔开，见图5。
各元件引物序列如下：
Figure BDA0001941792430000072
Figure BDA0001941792430000081
其中，下划线部分的碱基为酶切位点；方框内的碱基为上游同源臂引入的点突变。
将培养的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞(2016年1月，陕西省西安市采集)消化后收集并提取基因组，以提取的基因组为模板，分别用以下两对引物5’arm-19T-F1/5’arm-19T-R1、5’arm-19T-F2/5’arm-19T-R2进行PCR扩增，得到5’arm-A、5’arm-B两条片段，以5’arm-A和5’arm-B为模板，用引物5’arm-19T-F1/5’arm-19T-R2进行融合PCR反应，得到5’arm片段，序列如SEQ ID NO.31所示，大小为1183 bp，见图6，此步骤是将MSTN基因g+6354G-A点突变引入5’arm中。
以内蒙古大学提供的骨骼肌特异性启动子表达质粒为模板，用引物MRF-19T-F/MRF-19T-R扩增MRF启动子片段，序列如SEQ ID NO.32所示，大小为1015bp，见图7。
将分离的鲁西黄牛脂肪组织(2016年1月，陕西省西安市采集)研磨后，加入Trizol裂解并提取总RNA。对提取的总RNA进行反转录后得到cDNA。以获得的cDNA为模板，用PPARγ-19T-F/PPARγ-19T-R引物进行PCR扩增，得到PPARγ的CDS片段，序列如SEQ ID NO.33所示，大小为1518bp，见图8。
以pTP-hTERT质粒(黄惠,胡广东,康健,等.一种通用型piggyBac转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证.生物工程学报,2014,30(8):1182-1192.)为模板，用PolyA-19T-F/PolyA-19T-R引物进行PCR扩增，得到PolyA片段，序列如SEQ ID NO.34所示，大小为245bp，见图9。
以pTP-hTERT质粒为模板，用SE-19T-F/SE-19T-R引物进行PCR扩增，得到LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP(Selectable element，SE)片段，大小为3130bp，见图10。
以鲁西黄牛基因组为模板，用引物3’arm-19T-F/3’arm-19T-R扩增3’arm片段，序列如SEQ ID NO.35所示，片段大小为797bp，见图11。
以PPARγ的CDS区和PolyA为模板，用引物PPARγ-19T-F/PolyA-19T-R进行融合PCR反应，得到PPARγ-PolyA，大小为1763bp。
以T-VectorpMD19为骨架，将扩增得到的3’arm片段进行T-A克隆连接至骨架载体，得到p3’arm-19T载体，同时按顺序引入了EcoR I-Sal I-HindⅢ-Spe I-Cla I-Not I六个酶切位点。并依次将SE片段、PPARγ-PolyA片段、MRF片段、5’arm片段经双酶切、胶回收、连接载体构建流程，连入骨架载体中。将最后连接完整的打靶质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
定点整合PPARγ基因和MSTN基因点突变打靶载体的打靶策略见图12。
实施例3Cas9切割表达载体和定点整合PPARγ基因和MSTN基因点突变打靶载体共转染鲁西黄牛牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞
本发明利用电穿孔的方法将靶向MSTN基因的Cas9切割表达载体和打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，实现对鲁西黄牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶，获得MSTN基因g+6354G-A点突变和MSTN位点定点敲入PPARγ基因CDS区的牛胎儿成纤维细胞。
1)牛胎儿成纤维细胞培养
从液氮罐中取出冻存的原代鲁西黄牛胎儿成纤维细胞于37℃解冻，离心；弃废液，加1ml含10％FBS的DMEM重悬，接种至60mm细胞培养皿，置于CO2培养箱中37℃条件下培养。待细胞融合时，胰酶消化，并按1:3的比例进行传代培养。选取第3至5代的细胞生长至90％汇合后，作为后续转染实验的宿主细胞。
2)阳性克隆细胞的筛选
采用电穿孔法，将Cas9切割表达载体pSpCas9-sgRNA和打靶载体pLR-MRF-PPARγ-PloyA-SE电转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞(BFFs)。
首先配电转液，称取KCl 0.8946g，K2HPO40.1742g，CaCl2·2H2O 0.0022g，以及MgCl2·6H2O 0.1016g，加入超纯水溶解后定容至100mL，调节pH值至7.4，0.22μm滤膜过滤除菌后，置于4℃保存。
当细胞生长至90％融合度时，胰酶消化并收集细胞，用无血清的Opti-MEM细胞培养液洗涤2次。用800μL电转液重悬细胞，将pSpCas9-sgRNA和pLR-MRF-PPARγ-PloyA-SE各10μg加入细胞悬液并混合均匀，然后转移至电转杯中，静置10min。将电转杯置于电转仪中，进行电击反应，具体电转染参数：电压：510V；脉冲时间：2ms；电击次数2次。电击完成后，静置15min，将细胞悬液重悬置于60mm细胞培养皿中培养，待细胞贴壁后更换新鲜细胞培养液。
转染24h后，在荧光显微镜下观察细胞的生长情况，结果如图13所示。胰酶消化并收集细胞，将细胞均匀接种到3个100mm细胞培养皿中。待细胞贴壁后，向细胞培养液中加入终浓度为1.5μg/mL的嘌呤霉素进行药物筛选，每隔3d进行一次换液。筛选9d后，未整合打靶载体的细胞全部死亡，整合打靶载体的细胞形成单克隆细胞团，并在显微镜下可见绿色荧光表达，如图14所示。待单克隆细胞生长至团块直径3mm以上，挑取单克隆接种于48孔板中继续培养，进行后续的阳性克隆鉴定。
3)Junction PCR鉴定基因打靶的阳性克隆细胞
取部分扩大培养的单克隆细胞，离心，弃上清后加入20μl裂解液，充分重悬后，65℃水浴30min，95℃水浴15min，完成细胞裂解。取5μl细胞裂解物为模板，用PrimeSTAR GXLDNA Polymerase进行JunctionPCR扩增，JunctionPCR鉴定引物序列如下：
5’junction-F：5’-ATAGGCTGAATGGCTGATG-3’；SEQ ID NO.36；
5’junction-R：5’-CCAGGCTCATCTAAATACTAAG-3’；SEQ ID NO.37；
3’junction-F：5’-GATCATAATCAGCCATACCAC-3’；SEQ ID NO.38；
3’junction-R：5’-TTTCAACAGACCCAACAGG-3’；SEQ ID NO.39。
其中，5’-junction的上游引物位于5’同源臂外侧基因组序列，下游引物位于MRF启动子序列，如果PCR出现1899bp条带则判为阳性，如图15所示，并进入3’-junction鉴定。3’-junction的上游引物位于SE筛选标记序列，下游引物位于3’同源臂外侧基因组序列，如果PCR出现1524bp条带则判为阳性，如图16所示。只有同时通过了5’-junction PCR和3’-junction PCR鉴定的克隆才能继续扩大培养。
对上述5’-junctionPCR和3’-junction PCR产物进行凝胶回收，得到的产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过测序结果确定打靶载体在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞基因组的精准插入，如图17所示。
实施例4以鉴定正确的单克隆细胞为核移植供体细胞构建转基因克隆胚胎
1)卵母细胞的收集和体外成熟
从西安市屠宰场采集牛卵巢，放置于装有无菌生理盐水的保温瓶中，温度维持在20～25℃，4h内运回实验室。
用一次性注射器抽取3～8mm直径卵泡的卵泡液，在体视显微镜下用捡卵针挑出形态完整、胞质均一的卵丘卵母细胞复合体进行体外培养。在卵母细胞培养平皿中培养20h后，用0.2％的透明质酸酶去除卵丘细胞，以排放出第一极体作为判断卵母细胞成熟的标志，挑选成熟卵母细胞进行后续体细胞核移植试验。
2)转基因克隆胚胎的构建
采用体细胞核移植技术将供体细胞转移到去除细胞核的成熟卵母细胞中。核移植具体为：显微操作液为含10％胎牛血清，5μg/mL细胞松弛素B的PBS，用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质，以10μg/ml Hoechst 33342染色10min，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞；完全去除第一极体及染色体的卵母细胞被用于核移植。
卵母细胞的注核与融合，具体过程如下：胰酶消化经筛选验证的阳性单克隆胎儿成纤维细胞用做供核细胞。用去核管将供体细胞注入去核成功的卵母细胞透明带下。核质复合体在电融合液中平衡3min，用微电极法进行融合，用与显微操作仪连接的微电极尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予电脉冲进行电融合。融合电压为28V，融合时间为10μm。融合后的重组体放入10％胎牛血清的M199中，38.5℃、5％CO2、饱合湿度下培养，2h后观察融合情况。
3)转基因克隆胚胎的激活及体外培养
融合的重组胚平衡2h后，用含5μmol/L离子霉素(Ionomycin，购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液(购自SIGMA公司，称取NaCl 0.6294g，KCl 0.0534g，KH2PO40.0162g，CaCl2·2H2O 0.0251g，MgCl2·6H2O 0.0100g，NaHCO3·0.2106g，丙酮酸钠0.0033g，乳酸钠28.24μL，必需氨基酸(50×)2mL，非必需氨基酸(100×)1mL，谷氨酰胺0.0146g，BSA 0.8g，加入90mL去离子水中，调pH值至7.3，定容至100mL)处理5min，然后在含2mmol/L二甲基氨基嘌呤(6-DMAP，购自SIGMA公司)的mSOFaa培养液内培养4h，清洗3次后转入矿物油覆盖并预先在CO2培养箱中平衡至少2h的mSOFaa中培养，培养密度为5μL每个重组胚，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养，第7天挑选正常发育的囊胚进行核移植，如图18所示。
鲁西黄牛作为我国优良的地方品种，产肉性能良好，前躯发育良好，但是后躯发育较差。因此运用本发明的基因分子设计和基因工程技术操作相结合，使得将PPARγ基因(CDS区)定点敲入牛MSTN基因的3’UTR区，并在骨骼肌特异性启动子MRF作用下，该基因在牛骨骼肌细胞中特异性转录和表达，同时由5’同源臂带入的g+6354G-A点突变导致MSTN蛋白功能丧失，即在抑制MSTN的功能发挥的同时，实现PPARγ在骨骼肌细胞中的表达，为获得优质肉用家畜品种提供了一种快速高效的育种策略和方法。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种定点突变MSTN并同时定点整合PPARγ的载体
<160> 39
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
caccgttgac cagaaccaat ttaac 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
aaacgttaaa ttggttctgg tcaac 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
caccgttgca gttggcaagg gtata 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aaactatacc cttgccaact gcaac 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
caccgcaagt tctactgaag ccaca 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
aaactgtggc ttcagtagaa cttgc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
caccggtcag tctcattaag tgctc 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
aaacgagcac ttaatgagac tgacc 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
caccgctgac acacttatct gagtt 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
aaacaactca gataagtgtg tcagc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
caccgtgaca cacttatctg agttt 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aaacaaactc agataagtgt gtcac 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
caccgacaca cttatctgag tttgg 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
aaacccaaac tcagataagt gtgtc 25
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
gatttctggt ttccacttta ttat 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
ctccagcctt ggcagtgtta 20
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
ccggaattct atgggcaatg gatgttc 27
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ggaatgttga gatttgaata c 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gtattcaaat ctcaacattc c 21
<210> 20
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
acgcgtcgac ctcgggaaaa gatgcagc 28
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
acgcgtcgac ccatatttgg gtgtgcctg 29
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
cccaagcctt tctcttcctt ggcctctg 28
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
cccaagccta tgggtgaaac tctgggagat g 31
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
ctaatacaag tccttgtaga tttcc 25
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
accggatcta gataactgat c 21
<210> 26
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
gagcactagt taagatacat tgatgagttt gg 32
<210> 27
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
gagcactagt ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgcgtt atcccctgat 60
tctgt 65
<210> 28
<211> 65
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
gagcactagt ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgcgtt atcccctgat 60
tctgt 65
<210> 29
<211> 103
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
ccggaattcc ggacgcgtcg acgtcggcca tagcggccgc ggaacccaag cttgggggac 60
tagtccaatt ccatcgatcc aacacttaat gagactgaca cac 103
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
aaggaaaaaa gcggccgcaa agcacatttg ccattc 36
<210> 31
<211> 1183
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
tatgggcaat ggatgttcta taaagaaaga aaactcattt tcctagaggt ctacattcaa 60
ttctgtagca tacttggaga agctgcattg aaaaggcagt caaaaagtat tcattttggt 120
caaaatttca aaattatagc ctgcctttgc aatactgcag cttttaggat gaaataatgg 180
aaatgactga ttctatcaat attgtataaa aagattttga aatagttgca tttatataat 240
atgtatacaa tattgttttg taaataaatg tctccttttt tatttacttt ggtatatttt 300
tacagtaagg acatttcaaa ttaagtatta aggcacaaag acatgtcatg taggacataa 360
aagcaaatgc ttatatttcg gagcaaatta gttgattaaa tagtggtctt aaaactccat 420
atgctaatgg ttagatggtt atattacaat cattttatat ttttttacat tattagcatt 480
cacttatgga ttcatgatgg ctgtataatg tgaatgtgaa atttcaatgg tttactgtca 540
ttgtattcaa atctcaacat tccattattt taatacttat aaatattaag cataccaaaa 600
tgatttaact ctattatctg aaatcagaat aataaactga tgatatctta caaattgtta 660
attttatttt ataatttgat aatgaatata tttctgcata tatttactac tattttgtaa 720
atcaggattt tgttaatcaa ataaattgta cttatgatta agtgaaatta tttcttacat 780
ccaatgtgta gaaacaattt aagttatatt aaagtgtttt cacctttttt gaaagacaac 840
agtttcatgt tataatgatt aactttagat ttctggtttc cactttatta taaaagttta 900
atgactgagc acaaaagttt ggtttagaaa ttttaggtct gctactctag tttctcatga 960
gtgaaattcc tgttaaattg gttctggtca agttgcttta aacatacaaa agcaaggact 1020
agttacatct gtttcatttc tctttatctt gacctgaaaa ctatttatat gttttcttag 1080
gttcaatttc caaatgcatt gcagttggca agggtatatg gtcctagagt tacaagttct 1140
actgaagcca cagggacaca gggaggctgc atcttttccc gag 1183
<210> 32
<211> 1015
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ccatatttgg gtgtgcctgg gggttataat taacccggac acgtggcgac ctcaccccac 60
caacacctgc ccccgcgtcc ccccagcccc agcacctcag gtctcccaga ggagatcgcg 120
agcaatgagc tctaaaaata aactcccttc ccggcatgat taagcaacta tttcttgaac 180
tggtagtgaa actttatgga atagtgtgtt tgtacagtgg tgactatttg tcacagtagg 240
ctctgacacc ggcattcaag caccaaccaa attgggcaat atgtcataag gagccagttg 300
gggggcagta acaaaatcct tggataacca ttctatacca gagacatctg cttatctttg 360
cagacagtaa ctccaggcat ctctgtaatc tcgatattgt aaatatcata attcatctga 420
aagtcatgta taaccttgga aggactgtaa tggttttatc acaggaatag catctttttg 480
agaggcagga gagagaaaag acctgaacca ctctgcaaat attaaacaag ctattttgga 540
gcaatggcta ttgcctttga aatctttcat catgggtcta tacttagtat ttagatgagc 600
ctgggggagg ggaacagtgc agtgttaatc cccagttgtt ttgaacttgt cctgtaagca 660
ggttagcctc taaagtgtcc caaattgaag tgttcgatgc tttgtttaaa tttaggagtc 720
catatatttt gttttaacct gtcctgcata taggttgtca catcattcta aaggtgacac 780
ttctcagttt tctttcaaac tagatgttct agagagcact gggtgtaatc acattgagag 840
actgatgctc catgacagct aaaagttgga ttgagtttca ggagctacta tatataaagc 900
tggggcgact tatgtcaccg cactaattaa atgccatctg ggtaaccacc cagaaccttc 960
tgggtttttg agcccatcac cctgttcaga ccaagtcaga ggccaaggaa gagaa 1015
<210> 33
<211> 1518
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
atgggtgaaa ctctgggaga tgctcttatt gacccagaga gtgagccctt cgctgtcaca 60
gtgtctgcaa ggacctcaca agaaattacc atggttgaca cagagatgcc gttttggccc 120
accaactttg ggatcagctc cgtggacctt tctatgatgg atgaccactc ccatgccttt 180
gacatcaagc ccttcaccac cgttgacttc tccagcattt ccactccgca ctatgaggac 240
attccgttcc caagagctga cccgatggtt gcagattata agtatgacct gaagctccaa 300
gagtaccaaa gtgcaatcaa agtggagcct gtatccccac cttattattc tgaaaagact 360
cagctgtaca gtaagcctca tgaagagcct tccaactccc tcatggccat tgaatgccgg 420
gtctgtgggg ataaagcgtc agggttccac tatggagttc atgcttgtga aggatgcaag 480
ggtttcttcc ggaggacaat cagattgaaa cttatttacg ataggtgtga tcttaactgt 540
cggatccaca agaaaagtag aaataaatgt cagtactgtc ggtttcagaa gtgccttgct 600
gtggggatgt ctcataatgc catcaggttt gggcgcatgc cacaggccga gaaggagaag 660
ctgttagcgg agatctccag cgatatcgac caactgaacc cagagtctgc tgacctccgg 720
gccctggcaa agcatttgta tgactcgtac ataaagtcct tcccgctgac caaagcaaag 780
gcgagggcga tcttgacggg aaagacgaca gacaaatcac cgtttgttat ctatgacatg 840
aactccttaa tgatgggaga agataaaatc aagttcaagc acatcagtcc cctgcaggag 900
cccagcaaag aggtggccat ccgcatcttc caggggtgtc agtttcgctc cgtggaagcc 960
gtgcaggaga tcacagagta cgccaagaat atccccggct ttgtgaacct tgacttgaac 1020
gaccaagtaa ctctcctaaa atacggcgtg cacgagatca tttacacgat gctggcctcc 1080
ttgatgaata aggatggggt cctcatatcc gagggccaag gattcatgac aagggagttt 1140
ctaaagagcc tgcgaaagcc ctttggtgac tttatggagc ccaagttcga gtttgctgtg 1200
aagttcaacg cactggaatt agatgacagc gacttagcaa tatttatagc tgtcattatt 1260
ctcagtggag accgcccagg tttgctgaac gtgaagccca ttgaggacat acaagacaat 1320
ctgctgcaag ccttggagct gcagctcaag ctgaaccacc ccgagtcctc ccagctcttt 1380
gccaagctgc tccagaaaat gacagacctc agacagattg tgacagaaca cgtgcagctg 1440
ttgcaagtaa taaagaaaac agagacggac atgagtctcc acccactcct acaggaaatc 1500
tacaaggact tgtattag 1518
<210> 34
<211> 245
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
accggatcta gataactgat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 60
ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 120
gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 180
acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 240
tctta 245
<210> 38
<211> 797
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
cacttaatga gactgacaca cttatctgag tttgggggaa tacattttca aattgaactg 60
agaaataatt aggaagtgcc tagaatcctt acgtgcaaca ctatttatac atgtttttga 120
agtgagctct cttctccact cctggccagt ttaataactt agctctaaag aagtgactat 180
gtttaattag cagtgactaa ttctctctgg tgttctgagt cttaaataaa taatttataa 240
gtatgataaa tacaatttta aactatatta cagcaattta cactcataca aacaaaatgt 300
actacttctt ctaattgtga taatatttaa cactgccaag gctggagcta tatgtgagtt 360
gctcctgggg gggtgcgggg gcaggaagga gccaactgtg gggacgggct aaggccactt 420
tttggttgca catatcagaa cctactttta tctgggccat gagtatacat gacctaaaag 480
tcggggtcag caggtgcatc cacgcacctt aggctctgga gtacaaataa ctggggccct 540
tgacctctac agtgagaaat gtgaggaagt atccctctca gtttccaagg gcccagtcac 600
aggactcctc agtcttcata ctcagcctca cccatgggtc cccaggatca catcaccaat 660
ctctccattt ggtagtcctt ttcaaaaccc ataagaccat gaaagaaagc atcaggacca 720
atttcttctg tgacaagacc taggcattcc cccccccccc tattttgcca aagtcatagg 780
aatggcaaat gtgcttt 797
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
ataggctgaa tggctgatg 19
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
ccaggctcat ctaaatacta ag 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
gatcataatc agccatacca c 21
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
tttcaacaga cccaacagg 19

Claims (3)

1.一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的载体，其特征在于，包括Cas9切割表达载体和打靶载体；
所述Cas9切割表达载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框，sgRNA靶位点在牛基因组2号染色体MSTN基因的3’UTR区；
所述打靶载体上克隆有重组基因MRF-PPARγ-PloyA，并克隆有sgRNA靶位点的上游同源序列作为其5’同源臂，和下游同源序列作为其3’同源臂，其中5’同源臂引入g+6354G-A单碱基突变；
所述重组基因MRF-PPARγ-PloyA在PPARγ基因CDS区的上游连接牛骨骼肌特异性启动子MRF，在下游连接PloyA；
所述Cas9切割表达载体上克隆有sgRNA靶点，其核苷酸序列如下：
pSpCas9-Sg27 F：5’-CACCgGTCAGTCTCATTAAGTGCTC-3’；SEQ ID NO.7；
pSpCas9-Sg27 R：5’-AAACGAGCACTTAATGAGACTGACC-3’；SEQ ID NO.8；
所述MRF-PPARγ-PloyA重组基因中，MRF的核苷酸序列如SEQ ID NO.32所示，PPARγ基因CDS区的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示，PloyA的核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示；
所述打靶载体同源臂包括分别位于重组基因MRF-PPARγ-PloyA上游、下游的5’同源臂和3’同源臂，所述重组基因MRF-PPARγ-PloyA与3’同源臂之间还设有一对同向的Loxp，Loxp之间设有筛选表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA；
所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.31所示，3’同源臂的核苷酸序列如SEQ IDNO.35所示；
所述Cas9切割表达载体为pSpCas9-sgRNA，通过在pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体上连接sgRNA靶点序列构建；
所述打靶载体为pLR-MRF-PPARγ-PloyA-SE，通过将重组基因MRF-PPARγ-PloyA插入到打靶骨架T-Vector pMD19的第一个Loxp的上游，在5’同源臂引入g+6354G-A单碱基突变，将5’同源臂连接在MRF-PPARγ-PloyA的上游，将3’同源臂连接在第二个Loxp的下游构建；
所述元件连接顺序参见说明书附图12。
2.一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的重组细胞，其特征在于，利用权利要求1所述的Cas9切割表达载体和打靶载体共同转染宿主细胞；所述宿主细胞为鲁西黄牛胎儿成纤维细胞。
3.根据权利要求2所述的一种通过miRNA靶向定点突变MSTN基因并同时定点整合PPARγ基因的重组细胞，其特征在于，所述共同转染是将Cas9切割表达载体和打靶载体共同电转到鲁西黄牛胎儿成纤维细胞中；电转染参数如下：电压为510V；脉冲时间为2ms；电击次数2次。
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