KR101048426B1 - 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 위치에 ｄａｆ 유전자를 넉인한 체세포 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 상동 재조합 방법으로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 제거함과 동시에 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 위치에 DAF(decay accelerating factor) 유전자를 적중시킬 수 있는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포, 상기 세포로 핵이식된 수정란, 상기 벡터에 의해 넉 아웃된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제, 상동 재조합, 유전자 타겟팅 벡터, DAF
Description
본 발명은 상동 재조합 방법으로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 제거함과 동시에 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 위치에 DAF(decay accelerating factor) 유전자를 적중시킬 수 있는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터, 상기 벡터가 도입된 세포, 상기 세포로 핵이식된 수정란, 상기 벡터에 의해 넉 아웃된 형질전환 동물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
유전자의 넉 아웃(knock-out)은 유전자 타겟팅(gene targeting) 기술의 하나로서 생쥐에서 처음 위치 특이적으로 특정 유전자에 변이를 도입할 수 있는 기술로 보고되었다(Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. Cell, 51, 3, 503-512(1987)). 이러한 기술은 다양한 유전자 변이 생쥐의 생산에 이용되고 있으며(Fujino, T 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 1, 229-234(2003)), 이러한 기술은 가축의 양에서도 적용되고 있다(McCreath, K.J. 등, Nature, 405, 1066-1067(2000)). 넉 아웃은 선별마커를 이용하여 유전정보를 암호화하는 부분을 방해하거나 제거함으로써 이루어진다. 이는 특정한 변이(specific mutation)가 아닌 유전정보 손실(loss of a gene)의 효과를 연구하는데 이용될 수 있다.
특정한 변이를 만들기 위한 목적으로 넉 인(knock-in)이 고안되었는데 유전자의 넉 인은 의도된 특정 변이 DNA서열(mutated DNA sequence)이 다른 유전자 방해(disruption)없이 특정 내부서열에 대체되는 것이다. 이 기술로 변형 프리온 단백질을 발현하는 넉 인 마우스가 개발되어 전염성 프리온 질병에 대해 연구가 이루어지고 있으며(T. Kitamoto 등, BBRC, 294, 280-286(2002)), 헌팅턴 질병을 연구하기 위하여 헌팅턴 질환 관련 유전자를 넉 인한 마우스의 개발도 보고되었다(Lin. C.H 등, Hum. Mol. Genet, 10, 137-144(2001)).
한편, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자는 이종간 이식시 급속한 면역거부반응을 일으키는 원인 유전자로서, 이 유전자가 제거될 경우 생체거부반응이 제거된 이종간 장기 이식용 질환모델동물 개발이 가능하다. 2003년에 영국의 PPL사에서 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 동형접합적으로(homozygous) 제거된 체세포 복제에 성공함으로써 현 장기부족현상을 해결해 줄수 있는 장기 이식용 질환모델동물 생산을 위한 획기적인 진보를 가져왔다 (Carol J. Phelps, Science, 299;411-414, 2003). 이후, 좀 더 효율적으로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 제거할 수 있는 프로모터-트랩 (promoter trap)의 원리를 이용한 타겟팅법 등이 소개되었다 (Sharon Harrison et al., Cloning and stem cells, 6(4);327-331, 2004). 프로모터-트랩 (promoter-trap)을 이용한 유전자 타겟팅 벡터의 사용은 유전자가 도입되는 체세포에서 활발히 전사되는 유전자로 제한되는데, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자는 대부분의 돼지 유래 세포에서 활발하게 발현되기 때문에 이용가능하다.
2005년 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제가 제거된 복제 돼지 유래의 장기는 원숭이로 이식되었으며, 그 결과 급성 면역 거부반응 없이 이식 후 2-6 개월까지 생존이 지연됨을 보고하였다 (Kenji Kuwaki et al., Nature medicine, 11(1);29-31, 2005). 그러나 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 제거되었음에도 불구하고 다른 경로를 통하는 이종 항원에 의해 인체 보체 유전자들이 활성화 됨으로써 장기 이식시 심각한 거부반응이 초래될 수 있음이 보고되었다 (Tanemura M et al., Biochem Biophys Res Commun, 235;359-364, 1997 Komoda H et al., Xenotransplantation, 11;237-246, 2004). 그러한 장애를 극복하기 위해, 생체 내에서 면역작용에 관계하는 단백질들을 과다 발현하는 복제 돼지를 생산하고자 하는 시도가 있었지만, 여전히 외래 유전자의 정규장소 외의 발현은 배 발달에 장애를 야기하고 배아 발달 후기와 출생 후 초기에 대부분 발달하는 신경 시스템에 치명적이라는 문제점이 있다(Gao et al., Neurochem Res., 24(9);1181-1188, 1999).
한편, DAF((decay accelerating factor) 는 적혈구에서 보체 시스템 활성을 조절하는 단백질로 1969년에 발견된(E.M. Hoffmann, Immunochemistry, 6, 391- 403(1969)) 이후 마우스 DAF(A.P. Spicer 등, J. Immunol, 155, 3079-3091(1995), 랫트 DAF(S.J Hinchliffe 등, J. Immunol, 161, 5695-5703(1998))등 다양한 아이소폼(Isoform)이 발견되었다. DAF는 자가 면역 공격(autologous complement attack)에서 숙주세포를 보호하는 보체 억제 기능을 갖는 세포표면 조절 단백질이다. 보체와 접촉하는 심혈관세포나 혈액 뿐만 아니라 대부분의 혈관외부 세포에서도 폭 넓게 발현한다. 종양세포에서 DAF의 발현증가는 종양세포 표면에서 보체의 농도를 감소시켰으며 보체반응 분해도 감소였다고 보고된다(M. Yamakawa 등, Cancer, 73, 2808-2807(1994)). 그리고 세포 표면에서 DAF의 감소는 면역반응의 강도(intensity)를 증가시켰으며 보체조절 세포분해도 증가한다고 보고하고 있다(J.C. Mason 등, Arthritis Rheum, 44, 138-150(2001)).
본 발명자는 미니어쳐 돼지에서 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 유전자 타겟팅하고 그 위치에 DAF 유전자를 삽입(삽입체(insertion)하여 DAF(decay accelerating factor) 유전자가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 전사조절 영역을 이용하여 발현될 수 있는 체세포를 확보하였고, 이 체세포가 이종장기이식에서 발생하는 초급성 거부반응(hyperacute rejection)을 억제하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 보체 시스템 활성화 유전자인 DAF가 발현하여 보다 효율적으로 이종장기이식에 사용될 수 있는 미니어쳐 돼지 생산에 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 (1) 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역; (2) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 제1 영역; (3) DAF(decay accelerating factor) 를 코딩하는 유전자 영역; (4) 양성 선별마커 영역; 및 (5) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 2 내지 4 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하고, 상기 (1) 내지 (5)영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 유전자 타겟팅된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 타겟팅된 세포로 핵이식된 수정란을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터가 도입되어 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 동물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 이용하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 동물을 제조 하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역; (2) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 제1 영역; (3) DAF(decay accelerating factor) 를 코딩하는 유전자 영역; (4) 양성 선별마커 영역; 및 (5) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 2 내지 4 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하고, 상기 (1) 내지 (5)영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "유전자 타겟팅 벡터(gene targeting vector)"란 게놈의 특정 유전자 위치로 목적하는 유전자를 제거 또는 삽입할 수 있는 벡터를 말하며, 상동 재조합 (homologous recombination)이 일어나도록 타겟팅하고자 하는 특정 유전자에 상동 염기 서열을 포함한다. 본 발명의 유전자 타겟팅 벡터는, DAF 유전자의 핵산 서열이 게놈상의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 5'→3' 배열로 삽입되는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 타겟팅 벡터이다. 용어 "벡터"와 "벡터 카세트"는 동일한 의미로 사용되고 있으며, 원형(circular) 또는 선형(linear) 형태일 수 있다.
본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터는 핵 국재 화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역을 포함한다.
상기 핵 국재화 신호 영역은 벡터의 5' 말단 쪽에 포함됨을 특징으로 한다. 전사 인자의 핵 중으로의 유입은 다양한 외부 및 내부 자극뿐 아니라 발생 신호에 반응하여 일어나는 과정이다. 그러므로, 벡터 내에 삽입된 핵 국재화 신호는 벡터가 세포 내로 도입된 후, 본 발명의 벡터가 핵 내로 유입될 수 있도록 이동을 돕게 되는데, 이를 통해 핵 내에 존재하는 게놈 상의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 대한 타겟팅 효율을 높일 수 있다. 또한, 유전자 타겟팅 벡터를 세포에 도입시켜 세포 내 유전자를 타겟팅 할 때, 핵으로의 유입 효율을 높이기 위해 직접적인 전기천공법을 이용하게 되는데, 본 발명의 벡터는 핵 국재화 신호 영역을 포함하고 있어 세포 내에서 핵으로의 수송이 용이하므로, 통상적인 세포의 형질전환법인 리포좀 방법으로도 효율적으로 벡터를 도입시켜 유전자를 타겟팅시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 핵산 서열에 상동인 서열을 가지는 제1 영역과 제2 영역을 포함한다. 제1 영역은 레프트 암(left arm)에 해당하고, 제2 영역은 라이트 암(right arm)에 해당한다.
본 발명의 "제1 영역"은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 핵산 서열에 상동인, 2 내지 8 kb 길이의 핵산 서열, 바람직하게는 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 제1 영역의 길이는 유전자 타겟팅 효율을 결정하는 중요한 요소로, 더욱 바람직하게는 5.4kb의 길이를 가진다. 또한, 제1 영 역은 바람직하게 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 엑손 4의 업스트림의 NcoI 제한효소 인식 위치로부터 5.4kb를 포함한다.
본 발명의 "제2 영역" 은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 핵산 서열에 상동인 2 내지 8kb 길이의 핵산서열, 바람직하게는 2 내지 4 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 더욱 바람직하게는 2.5kb의 길이를 가진다. 이때, 제1 영역이 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 핵산 서열의 5'→3'배열에 있어 상부(upstream)에 해당하고 제2 영역이 하부(downstream)에 해당한다. 또한, 제2 영역은 바람직하게 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 엑손 4의 스타트 위치로부터 다운스트림의 2.5kb를 포함한다.
상기 벡터로 타겟팅되는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 소, 양, 염소, 돼지, 말, 토끼, 개, 원숭이 등의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자고, 보다 바람직하게는 돼지 또는 미니어쳐 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자다.
본 발명에서 용어 "상동(homologous)"이란 제1 영역 또는 제2 영역과 이에 해당하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 핵산 서열과의 동일성 정도를 나타내는 것으로, 적어도 90% 이상 동일하고, 바람직하게는 95% 이상 동일하다. 또한, 본 발명은 DAF 를 코딩하는 유전자 영역을 포함한다.
본 발명에서 용어 "DAF(decay accelerating factor)" 란 적혈구에서 보체 시스템 활성을 조절하는 단백질을 말한다. 이종이식시 보체 활성화 단백질들의 연쇄적인 반응에 의해 활성화된 보체는 숙주세포의 막에 결합하여 급성면역거부반응을 유도함으로써 이종이식의 결정적인 장애로 작용하는데, 인간 보체 조절 단백질 DAF는 보체반응경로에서 C2와 C4b의 결합을 방해함으로서 보체의 활성화를 억제한다.
본 발명자는 미니어쳐 돼지에서 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 유전자 타겟팅하고 그 위치에 DAF 유전자를 삽입[삽입체(insertion)]하여 DAF(decay accelerating factor) 유전자가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 전사조절 영역을 이용하여 발현될 수 있는 체세포를 확보하였고, 이 체세포가 이종장기이식에서 발생하는 초급성 거부반응(hyperacute rejection)을 억제하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 보체 시스템 활성화 유전자인 DAF가 발현하여 보다 효율적으로 이종장기이식에 사용될 수 있는 미니어쳐 돼지 생산에 이용될 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 벡터는 양성 선별마커 영역을 포함한다. 본 발명에서 용어 "선별마커(selection marker)"란 세포로 유전자 타겟팅 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있고, 양성 선별마커와 음성 선별마커가 있다.
용어 "양성 선별마커"란 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선택 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 양성 선택을 가능하게 하는 마커로, 네오마이신 (Neomycin: Neo), 하이그로마이신 (hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (guanine phosphosribosyltransferase: Gpt) 등이 있으며, 바람직하게는 네오 마이신 마커이지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명의 양성 선별마커는 제1 영역과 제2 영역 사이에 위치하는 것이 바람직하며, 제1 영역의 3' 말단에 연결되고, 제2 영역 상부(5') 쪽에 위치할 수 있다. 이러한 위치에 삽입됨으로써, 본 발명의 벡터가 세포 내로 타겟팅되어 상동재조합을 일으켜, 숙주 세포 게놈 상의 타겟 유전자와 재조합되었을 때, 게놈 내로의 삽입이 용이해지며, 이들의 발현을 통해 유전자 타겟팅 여부의 식별이 가능해지게 된다.
또한, 본 발명의 선별마커는 선별마커 유전자를 전사시키기 위한 별도의 프로모터를 상기 벡터 내에 포함할 수 있다. 본 발명의 선별마커 전사를 위해 사용할 수 있는 프로모터로는 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터, 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 양성 선별마커를 전사시키기 위한 프로모터는 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터를 양성 선별마커의 상부(upstream)에 연결되도록 벡터에 삽입시키는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터는 3' 말단 쪽에 polyA 서열을 추가로 포함할 수 있다. polyA 서열은 전사 종료 및 초기 RNA 전사체의 폴리아데닐화를 모두 지시하는 DNA 서열을 의미한다. polyA 테일 (tail)이 없는 전사체는 불안정하고 신속하게 분해되기 때문에 재조합 전사체의 효율적인 폴리아데닐화가 바람직하다.
또한, 본 발명의 벡터는 음성 선별마커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "음성 선별마커"란 무작위적 삽입 (random 삽입체(insertion)이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 음성 선택을 가능하게 하는 마커로, 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제 (Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼자제 (hypoxanthine phosphoribosyl transferase: Hprt), 싸이토신 디아미네즈 (cytosine deaminase) 및 디프테리아 톡신 (Diphtheria toxin) 등이 있으며 바람직하게는 디프테리아 톡신이지만, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 음성 선별마커는 제1 영역의 5' 말단 쪽 또는 제2 영역의 3' 말단 쪽에 위치할 수 있으나, 바람직하게는 제2 영역의 3'말단 쪽이며, 본 발명의 벡터 상에서 제2 영역의 3'말단에 연결되어 벡터의 3'말단 쪽에 위치하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 타겟팅 벡터가 숙주 세포 내로 타겟팅되면, 숙주 세포 게놈 상의 내생적(endogeneous) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자와 타겟팅 벡터 사이에 상동 재조합이 일어나면서, 염기 서열이 교체된다. 벡터 상의 DAF 유전자 및 양성 선별마커 유전자는 내생적 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 프로모터에 의해 발현되는데, 이러한 점에서 본 타겟팅 벡터는 프로모터-트랩(promoter trap)의 원리를 이용한 프로모터 트랩 벡터라 할 수 있다. 세포 내에서 전사되어 기능하는 유전자(발현유전자)를 망라적으로 포착(트랩)하는 방법으로는 프로모터 트랩 이외에도 인핸서 트랩, 엑손 트랩 등이 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls), 미니어쳐 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 상동 영역, 양성 선별마커 및 음성 선별마커를 이용하여 벡터를 구축하였다. 본 발명에서는 시미안 바이러스 40 (Simian virus 40) 게놈에 포함되어 있는 72bp 반복 부위 인핸서 서열(tandem repeat enhancer sequence)인 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls)를 맨 앞에 위치시키며 다음에 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 엑손4의 업스트림 NcoI 제한 효소 위치로부터 NcoI 위치까지 앞쪽 5.4kb를 5'부분의 상동영역(제1 영역)으로 연결하고, DAF 유전자를 연결하여 5' 부분을 완성하였다. 또한, SV40 PolyA 시그널의 3' 부분에 PGK(phosphoglycerine kinase) 프로모터에 의하여 발현 할 수 있는 양성 선별마커인 neor 유전자를 연결하고 그 다음에 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 상동영역으로 엑손4의 스타트부터 NcoI 제한 효소 위치까지 뒤쪽 2.5kb (제2 영역)를 연결 한 후 pMCDT-A(A+T/pau)벡터에 연결하여 3' 부분을 완성하였다. 최종적으로 완성한 5‘부분 단편을 3’부분의 pMCDT-A(A+T/pau)벡터부분에 삽입함으로써 최종 벡터인 pMCDT-A GT DAF벡터 구축을 완성한다. 이렇게 구축된 본 발명의 벡터는 5' 말단부터 핵 국재화 신호 영역, 미니어쳐 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 상동인 제1 영역, DAF 유전자 영역, poly A 영역, 양성 선별마커 영역, 미니어쳐 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 상동인 제2 영역, 및 음성 선별마커 영역의 순서로 구성된다. 이러한 벡터는 세포에 도입시 NotI 제한효소로 선형화시켜 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 벡터는 핵 국재화 신호 영역을 포함하지 않은 벡터나 핵 국재화 신호 영역을 3'말단 쪽에 포함한 벡터에 비해 유전자 타겟팅 효율이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 4).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 벡터로 유전자 타겟팅된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 벡터로 타겟팅 될 수 있는 세포는 동물, 바람직하게는 돼지 또는 미니어쳐 돼지 유래의 체세포이다. 세포를 분리하거나 활성화할 수 있는 유용한 조직에는 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 골수, 귀, 피부, 뼈, 쓸개 조직, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 세포 타입은 섬유아 세포, 상피 세포, 신경 세포, 배아 세포, 간 세포, 및 여포 세포 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는 섬유 아세포 또는 귀 조직 세포이다.
상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하기 위한 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran) 및 양이온 리포좀(cationic liposome)법 등을 이용할 수 있으며, 이로 제한되지 않는다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입하는 것이 바람직하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 타겟팅된 세포로 핵이식된 수정란에 관한 것이다.
본 발명에서, "핵이식 (nuclear transfer)"이란 세포의 핵을 이미 핵을 제거한 난자에 넣어 이식시키는 것을 의미하며, 이런 핵이식된 수정란을 착상시켜서 태어난 개체는 핵공여 세포의 유전적 물질이 핵수여 세포질로 그대로 전달되었기 때문에 유전적으로 완전히 동일한 복제 개체이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 벡터가 도입되어 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 동물에 관한 것이다.
본 발명에서 유전자 "넉아웃(knock-out)"이라 함은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미하며, 유전자 넉인(knock-in)"이란 특정 외래 유전자가 발현될 수 있도록 숙주의 게놈상에 도입되는 것을 의 미한다. 본 발명의 타겟팅 벡터가 도입된 체세포를 이용하여 동물의 수정란에 핵이식시키고, 핵이식된 수정란을 착상시켜 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 개체를 생산해낼 수 있다. 이러한 개체는 세포의 유전적 물질이 핵수여 세포질로 그대로 전달되었기 때문에 유전적으로 완전히 동일한 복제 개체라고 할 수 있다.
본 발명의 벡터를 도입시켜 넉 아웃시킬 수 있는 동물은 바람직하게는 돼지, 더욱 바람직하게는 미니어쳐 돼지이며, 본 발명의 벡터를 통해 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 형질전환 돼지는 급성 면역반응을 일으키지 않아 이종장기이식에 효과적으로 이용될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법에 관한 것으로, 바람직하게는 (1)제1항의 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 구축하는 단계; (2)돼지로부터 체세포를 분리 및 배양하는 단계; (3)구축된 단계(1)의 벡터를 상기 단계(2)에서 분리한 체세포에 도입하여 상동재조합을 유도하는 단계; 및 (4)상동재조합에 의해 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 선별하는 단계를 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법을 단계별로 설명한다.
먼저, 단계 (1)은 본 발명의 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 구축하는 단계로서, 상기에서 설명한 바와 같이, 5' 말단부터 핵 국재화 신호 영역, 미니어쳐 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 상동인 제1 영역, DAF 유전자 영역, poly A 영역, 양성 선별마커 영역, 미니어쳐 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 상동인 제2 영역, 및 음성 선별마커 영역을 가지며, 상기 영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되도록 구축할 수 있다. 이렇게 구축된 본 발명의 타겟팅 벡터는 세포 내의 내재적 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 타겟팅되어 이들 유전자를 파괴시킴과 동시에 DAF 유전자를 삽입시킬 수 있다.
단계 (2)는 돼지로부터 체세포를 분리 및 배양하는 단계로서, 단계 (1)의 타겟팅 벡터를 도입시키기 위한 돼지의 체세포를 분리하고, 배양시켜 체세포를 생산하는 단계이다. 상기 돼지의 체세포는 미니어쳐 돼지 귀 조직에서 분리하는 것이 바람직한데, 귀 조직은 분만 10일령의 귀 조직을 사용하고 이들 조직을 1 내지 3mm 정도로 절단하여 배양할 수 있다. 본 발명에서는 귀 조직을 돼지로부터 절단한 후 무균적으로 소독하고 겉 피부 조직과 연골 조직을 제거한 다음에 세로와 가로가 각각 2mm 되도록 메스로 절단하여 조직을 배양하였다.
이들의 조직 배양시에는 귀 조직이 배양액 안으로 완전히 잠기지 않도록하여 배양하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 체세포 분리 및 배양을 위한 배지는 고농도의 글루코오스 및 FBS가 포함된 배지를 이용하여 귀 조직으로부터 체세포를 분리하고, FBS, 비필수 아미노산 및 항생제를 포함한 배지에서 계대 배양하는 것을 통해 체세포를 생산할 수 있으며, 바람직하게는 돼지의 귀 조직을 고농도의 글루코오스 및 15% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지에 배양하여 체세포를 분리하고, 20% FBS, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨, 베타-머르캅토에탄올이 포함된 DMEM 배지에서 계대 배양할 수 있다.
단계 (3)은 구축된 단계(1)의 벡터를 상기 단계(2)에서 분리한 체세포에 도입하여 상동재조합을 유도하는 단계로서, 본 발명의 타겟팅 벡터를 단계(2)에서 생산한 돼지의 체세포에 도입시켜 상동재조합을 유도하여 돼지의 체세포 게놈 상의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 파괴시키는 단계이다.
본 발명의 벡터를 돼지의 체세포에 도입시키는 방법은 상기에서 설명한 바와 같이 핵산을 세포 내로 도입하는 공지의 방법, 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran) 및 양이온 리포좀(cationic liposome) 등을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 전기천공법이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 통상적인 유전자 타겟팅 벡터의 경우 유전자의 크기가 큰 편이라서 주로 전기천공법을 이용하여 체세포 내로 도입하지만, 본 발명의 벡터는 핵 국재화 신호 영역을 포함하고 있어, 핵 내로의 유입이 용이하므로 양이온 리포좀 법을 이용하더라도 효율적으로 세포 내 도입이 가능할 수 있다.
단계 (4)는 상동재조합에 의해 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 선별하는 단계로서, 단계 (3)의 상동재조합에 의해 돼지 체세포의 게놈 상에 존재하는 내재적 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 파괴된 돼지의 체세포를 선별해내는 단계이다.
상기 체세포 선별은 벡터 내에 삽입되어 있던 선별마커 유전자를 이용할 수 있는데, 특히, 벡터 상에 존재하던 양성 선별마커가 돼지 체세포 게놈 상으로 도입되어 발현되면, 이들 양성 선별마커 발현을 인식할 수 있는 처리제를 이용하여 타겟팅 여부를 식별할 수 있게 된다. 본 발명의 선별마커로는 바람직하게는 네오마이신 마커를 이용할 수 있으며, 선별을 위한 처리제로는 항생제, G418을 이용할 수 있다. 선별을 위해 사용하는 G418의 농도는 200 내지 400㎍/㎖ 가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 300 ㎍/㎖이다.
또한, 유전자 타겟팅 벡터가 도입된 클론 체세포의 선별에 이용할 수 있는 배양은 15% 내지 20% FBS을 포함하는 DMEM을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 20% FBS를 포함한다. 왜냐하면, 선별 시 세포의 증식을 촉진시키는 것이 보다 빠르게 세포를 선별할 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게는 20%의 FBS(fetal bovine serum, FBS), 비필수 아미노산, 피루브산나트륨, 베타-머르캅토에탄올이 포함된 DMEM 배지를 이용할 수 있다. 또한, 상기 단계(3)을 통해 상동재조합을 유도한 돼지 체세포를 G418 선별 배지에서 11 내지 12일간 배양한 후, 선별하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 벡터가 제대로 체세포 내의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 타겟팅되었는지를 분석하기 위해 PCR 및 서던 블롯(Southern blot)을 이용할 수 있다.
상기 PCR 분석은 1차 및 2차 PCR을 통해 효율적으로 타겟팅된 세포를 분석해낼 수 있는데 먼저, 1차적인 PCR은 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 3' 상동영역(제2 영역) 바깥 쪽에 있는 프라이머와 neor 유전자 상에 있는 프라이머를 이용함으로써, 벡터가 세포 내로 유입이 되었는지를 분석한다. 유전자 타겟팅은 상동염색체 중 한 곳에서 일어나므로 유전자 타겟팅이 일어난 상동염색체와 그렇지 않은 상동염색체가 세포에 존재하게 되므로 이들을 동시에 PCR 분석함으로써, 이들의 차이를 통해 타겟팅 여부를 좀더 정확하게 분석할 수 있게 된다. 이를 위해 1차 PCR에 의해 선별된 세포를 대상으로 2차 PCR을 수행할 수 있다. 2차 PCR을 위한 프라이머는 neo 유전자 앞쪽 프라이머와 3' 상동영역 밖에 있는 프라이머를 이용하면 서로 2.9kb의 크기 차이를 보이는 유전자 영역을 증폭할 수 있다.
상기 유전자 타겟팅된 체세포 제조방법에 의해 본 발명의 벡터로 유전자 타겟팅된 돼지 체세포주를 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 대한민국 대전 유성구 과학로 111번지 한국생명공학연구원)에 2009 년 5월 21일자로 기탁번호 제KCTC11517BP호로 기탁하였다.
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또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 벡터를 이용하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 동물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 바람직하게는 (1)상기의 방법에 의하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 수득하는 단계; (2)돼지 난자의 핵을 제거하고 상기 유전자 타겟팅된 세포를 도입하여 체세포 핵이식된 수정란을 제조하는 단계; 및 (3)상기 수정란을 착상시키는 단계를 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 돼지를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 벡터는 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자로의 타겟팅이 최적화된 벡터이므로, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃된 돼지 제조에 이용될 수 있으며, 상기 벡터로 타겟팅된 체세포를 돼지의 수정란에 핵 이식시키고, 이렇게 핵 이식된 수정란을 착상시켜 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 동물 돼지를 생산해낼 수 있다.
난자의 핵, 즉 유전 물질을 제거하기 위해서는 물리적인 방법, 화학적인 방법 및 사이토칼라신(Cytochalasin) B를 사용한 원심분리법 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 유리 마이크로피펫 (glass micropipette)을 사용하는 물리적인 핵 제거 방법을 사용할 수 있다.
상기 유전자 타겟팅된 체세포를 핵이 제거된 난자 내로 도입시키는 방법은 세포막융합법, 세포질내 미세주입법 등을 이용할 수 있는데, 세포막융합법은 간단하며 대규모 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질내 미세주입법은 핵과 난자내 물질들과의 접촉을 극대화시킨다는 장점이 있다.
체세포와 핵이 제거된 난자와의 융합은 전기자극을 통하여 세포막의 점도를 변화시켜 융합시키는 방법을 통하여 재조합할 수 있으며, 이때, 미세전류ㆍ전압을 자유롭게 조정할 수 있는 전기융합기를 이용할 수 있다.
핵이식된 수정란은 활성화시켜 이식 가능한 단계까지 발생시킨 후 대리모로 착상시키는 것이 바람직하다. 여기서 복제 수정란의 활성화는 수정란이 분열할 수 있도록 성숙과정에서 일시적으로 정지되어진 세포주기를 다시 가동시키는 것을 의미한다. 복제수정란 활성화를 위하여서는 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키나제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시키는 것이 바람직하며, 이를 위해 복제 수정란 내 칼슘이온을 증가시키기 위해 세포막 투과도를 변형시키거나, 세포 외로부터 칼슘유입을 급격히 증가시키거나, 이노마이신(ionomycin) 및 6-DMAP 등의 화학적 물질을 이용하여 세포주기 정지요소의 활성을 직접적으로 저해시키는 방법 등을 이용할 수 있다.
이러한 방법을 통해 생산된 돼지는 세포 내재적인 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 결손됨과 동시에 보체 시스템 활성화 유전자인 DAF 유전자가 삽입되어 있기 때문에, 이종간 장기이식시 급성 면역반응이 저해되어 보다 효율적으로 이종장기이식에 사용될 수 있는 미니어쳐 돼지 생산에 이용될 수 있다.
본 발명에서 개발된 넉 인 체세포는 이종장기이식에서 발생하는 초급성 거부반응(hyperacute rejection)을 억제하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 보체 시스템 활성화 유전자인 DAF가 발현하여 보다 효율적으로 이종장기이식에 사용될 수 있는 미니어쳐 돼지 생산에 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 개발된 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자를 유전자 타겟팅하여 DAF 유전자를 넉 인한 체세포는 장기이식용 미니어쳐 돼지를 복제하는데 공여 체세포로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기위하여 제공된는 것일 뿐, 실시 예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
미니어쳐
돼지 알파 1,3-
갈락토실트랜스퍼라아제
유전자
타겟팅
벡터 구축
넉 인 벡터는 미니어쳐 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 엑손 4를 기준으로 업스트림 5.4kb의 5, 영역을 레프트 암(left arm)으로 이용하였으며 엑손 4를 포함하는 2.5kb의 3‘영역을 라이트 암(right arm)으로 이용하여 구축하였다. 넉 인 벡터의 5’ 암(arm)부분의 구축을 위해 엑손 4의 업스트림 5.4kb의 5' 부분에는 SalI 제한효소 인식부위를, 3' 부분에는 NcoI 인식부위를 넣어 PCR 증폭하고 T-easy 벡터에 서브클로닝(subcloning) 하였다. 이렇게 증폭된 넉 인 벡터의 5' 암(arm)부분은 SalI-NcoI 제한 효소 처리에 의하여 약 5.4kb의 삽입체(insert)를 제조하였고 nls 서열은 NotI-XhoI 제한효소 처리하여 삽입체(insert)로 준비하여 T-easy/NcoⅠ-NotⅠ 벡터를 이용하여 3 단편 연결(fragment ligation)을 실시하였 다. 이렇게 제조된 nls 서열 및 5' 암(arm) 부분 단편은 시퀀싱을 통해 정상적인지 확인한 후 뒷부분에 사람 DAF 유전자를 삽입하였다. nls 서열 및 5' 암(arm) 부분은 NotI-NcoI 제한효소 처리하여 삽입체(insert)를 제조하였고 h-DAF는 BspHⅠ-SalⅠ제한효소 처리하여 삽입체(insert)를 제조하였다. 제조된 삽입체(insert) 는 T-easy/NotI-SalI vector를 이용 3 단편 연결(fragment ligation)을 실시하였다. 이렇게 하여 nls 서열, 5' 암(arm) 부분, 및 h-DAF를 포함하는 플라스미드를 제조하였다.
넉 인 벡터의 3' 암(arm) 부분의 구축을 위해 엑손 4부터 3' NcoI을 포함하는 2.5kb 부분의 5' 부분에는 ATG를 Smal 으로 치환하고 3' 부분에는 NcoI을 XhoI으로 치환할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR증폭하여 pMCDT-A 벡터에 서브클로닝 하였다. pGK-neo는 BamHⅠ으로 절단 한 후 접착(sticky) 말단을 블런팅(blunting)시켜주고 SmaI 링커를 연결하였다. EcoRI-SmaI 제한효소 처리하여 삽입체(insert) 제조한 후 pBSK-/EcoRI-SmaI 벡터를 이용하여 연결하였다. 이렇게 만들어진 pGK-neo가 포함된 플라스미드를 SalI-EcoRI으로 절단하여 벡터로 이용하고 서브클로닝된 SV40 PolyA를 SalI-EcoRI제한효소 절단한 후 삽입체(insert)로 제조 후 연결 하여 SV40 PolyA+pGK-neo가 연결된 플라스미드를 제조하였다. SV40 PolyA, pGK-neo 및 pMCDT-A/3'arm부분을 연결하기 위하여 SV40 PolyA+pGK-neo를 SalI-SmaI 제한효소 절단하여 삽입체(insert)를 제조하고 pMCDT-A/3'arm부분을 SalI-SmaI 제한효소 절단하여 제조한 벡터에 연결하였다. 이렇게 하여 pMCDT-A/SV40 PolyA, pGK-neo, 및 3' 암(arm)부분 이 연결된 플라스미드를 얻었다.
최종적으로 T-easy/NotI-SalI (nls 서열, 5'arm 부분, 및 h-DAF)와 pMCDT-A/SalI-XhoI (SV40 PolyA, pGK-neo, 및 3'arm 부분)을 연결하기 위하여 T-easy/NotI-SalI (nls 서열, 5'arm 부분, h-DAF)을 NotI-SalI 제한효소 절단하여 삽입체(insert)를 준비하였고 pMCDT-A/SalI-XhoI (SV40 PolyA, pGK-neo, 3' arm 부분)을 NotI-SalI 제한효소 절단하여 벡터로 이용하여 두 단편을 연결하였다. 이렇게 하여 최종적으로 pMCDT-A GT DAF 벡터인 pMCDT-A/NotI-SalI (nls 서열, 5'arm 부분, h-DAF+SV40 PolyA, pGK-neo, 및 3'arm 부분) 이 완성되었다. 이와 같은 벡터는 NotI의 절단에 의하여 직선화한 후 세포로의 유전자 도입에 이용하였다 (도 1, 도 2 및 도 3).
<
실시예
2>
미니어쳐
돼지 체세포에
knock
-
in
벡터의 도입
돼지 체세포에 Knock-in 벡터의 도입은 전기천공법(electroporation) 을 이용하였다. 전기천공법은 배양한 세포를 트립신(Trypsin) 처리에 의하여 회수한 후 세포 수가 5× 106 cell/0.4㎖ F10 배양액이 되도록 현탁한 다음 0.1ml F10 배양액에 녹인 10㎍의 직선화 유전자 타겟팅 벡터을 혼합하여 4mm gap cuvette에 세포벡터 혼합액을 넣었다. 이 큐벳을 BTX Electro-cell manipulator(ECM 2001)에 장착한 다음 450V, 4 pulses, 1 ms 조건에서 전기 충격을 실시하였다. 전기 충격 후 큐벳을 얼음 위에 10분간 방치 한 다음 10㎖ 배양액으로 옮겨 잘 현탁한 다음 48 웰 플레이트로 웰 옮겨 배양하였다. 넉-인(Knock-in) 벡터를 세포에 도입한 다음 48시간 후 300㎍/㎖의 G418로 12일간 선별하였다. 특히 본 선별 과정 중에는 20% FBS, 1mM 피 루브산나트륨, 1×비필수 아미노산, 1×베타-머르캅토에탄올, 100Unit/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 배지로 이용하였다. 선별된 콜로니는 트립신 처리에 의하여 24 웰로 계대 배양하였으며 3 내지 4일 후 세포가 컨플루언트(confluent) 하면 12 웰로 계대 배양하였으며 동일한 방법에 의하여 6 웰, 60mm 디쉬, 100mm 디쉬 순으로 계대 배양하여 동결보존하였다
<
실시예
3>
Knock
-
in
벡터가 도입된 클론 체세포의 선별과 배양
전기천공법(electroporation)을 이용하여 넉 인벡터를 세포에 도입한 다음 정확한 위치에 벡터가 삽입된 클론 체세포를 선별하기 위해서는 선별 마커에 대응하는 적절한 농도의 항생물질을 사용하여야 한다. 본 실시예에서는 유전자 타겟팅 벡터를 세포에 도입한 다음 48 웰에 1250개의 세포를 접종한 다음 300㎍/ml의 G418로 12일간 선별하였다. 특히 본 선별 과정 중에는 20% FBS, 1mM 피루브산나트륨, 1×비필수 아미노산, 1×베타-머르캅토에탄올, 100Unit/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 배지로 이용하였다. 선별 12일째에 정상적인 형태를 보이는 클론 체세포은 트립신 처리하여 세포를 24-웰 플레이트로 계대 하였다. 이렇게 계대된 체세포는 3-4일 후에 90% 컨플루언트(confluent) 하면 12-웰 플레이트로 계대하였다. 그리고 3-4일 간격으로 6-웰, 60mm 배양 디쉬, 100mm 배양 디쉬로 계대 배양하여 동결보존하거나 실험에 이용하였다.
<
실시예
4>
미니어쳐
돼지 알파 1,3-
갈락토실트랜스퍼라아제
유전자위치에
DAF
유전자가
gene
targeting
된 돼지 체세포의 분석
양성 선별마커 와 음성 선별마커를 통해 선별된 클론 체세포는 24 웰 플레이트에서 12 웰 플레이트로 계대할 때 1차 PCR로 유전자 타겟팅 되었는지 확인하였으며 100mm 배양 디쉬로 계대 배양한 다음 게놈 DNA을 분리하여 2차 PCR로 분석하였다. 도 4에는 넉 인 벡터를 도입하여 넉 인된 체세포를 확인한 효율에 대해서 정리한 표로서 최종 7개의 콜로니에서 넉 인되었음을 확인하였다.
G418에 내성을 가지는 콜로니(colony)를 선별한 다음 24 웰에서 12 웰로 계대 배양할 때 1/5의 세포를 취하여 1차 PCR을 수행하였다. 1/5의 세포 현탁액을 10000rpm, 4℃, 10분 원심을 한 후 상층을 버리고 3차 멸균수 40ul를 넣어 볼텍스 한 후 10분동안 100℃ 처리하였다. 100℃처리후 Proteinase K(10mg/ml) 1ul를 첨가하여 55℃에서 130분간 처리 한 다음 다시 10분동안 100℃ 처리하였다. PCR에는 세포추출액중 20ul를 이용하였다. PCR에 사용된 프라이머는 센스프라이머(neo3-1 : TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT)와 안티 센스 프라이머(GT control XbaI AS : TCCTCATCTAGAAATGTGGACTAACACTGA) 이며 PCR 조건은 94℃ 2분 변성후 94℃ 30초, 66℃ 30초, 72℃ 3분30초 33회 반복을 하고 마지막 72℃ 10분 반응하였다. PCR 산물의 확인은 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 약 3.7kb의 밴드를 확인하였다. 2차 PCR은 게놈 DNA을 분리한 후 100ng의 게놈 DNA을 이용하여 위와 동일하게 실시하였다(도 5).
도 1은 본 발명에 따른 미니어쳐 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자에 DAF 유전자를 넉 인하기 위한 벡터의 개략도이다.
도 2은 본 발명에서 제작된 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 pMCDT-A GT DAF 벡터 모식도이다.
도 3은 벡터내의 제한효소 인식부위를 이용하여 제한효소 절단한 사진이다.
도 4은 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 pMCDT-A GT DAF벡터를 미니어쳐 돼지 체세포에 도입된 효율을 정리한 표이다.
도 5은 본 발명에서 개발된 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자의 pMCDT-A GT DAF 벡터를 미니어쳐 돼지 체세포에 도입하고 넉 인된 미니어쳐 돼지 체세포를 PCR 분석한 사진이다.
Claims (15)
- (1) 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, nls) 영역; (2) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 4 내지 6 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 제1 영역; (3) DAF(decay accelerating factor) 를 코딩하는 유전자 영역; (4) 양성 선별마커 영역; 및 (5) 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 핵산 서열에 상동인 2 내지 4 kb 길이의 핵산 서열을 갖는 제2 영역을 포함하고, 상기 (1) 내지 (5)영역들이 5'말단에서부터 순서대로 구성되는 것을 특징으로 하는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제는 돼지 또는 미니어쳐 돼지 유래임을 특징으로 하는 벡터.
- 제1항에 있어서, 제1 영역이 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 엑손 4의 업스트림의 NcoI 제한효소 인식 위치로부터 5.4kb를 포함하는 것인 벡터.
- 제1항에 있어서, 제2 영역이 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 엑손 4 의 스타트 위치로부터 다운스트림의 2.5kb를 포함하는 것인 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 양성 선별마커가 네오마이신 (Neomycin: Neo), 하이그로마이신 (hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase gene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (guanine phosphosribosyltransferase: Gpt)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제1항에 있어서, 음성 선별마커를 추가로 포함하는 벡터.
- 제6항에 있어서, 상기 음성 선별마커가 디프테리아 톡신 (Diphtheria toxin), 헤르페스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제 (Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk), 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제 (hypoxanthine phosphoribosyl transferase: Hprt) 및 사이토신 디아미네즈 (cytosine deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 폴리 A(poly A) 서열을 추가로 포함하는 벡터.
- 제1항에 있어서, 상기 벡터는 도 2의 개열지도를 가지는 벡터.
- 제1항의 벡터로 유전자 타겟팅된 세포.
- 제10항에 있어서, 기탁번호 KCTC11517BP인 세포.
- 제10항의 세포로 핵이식된 수정란.
- 제1항의 벡터가 도입되어 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 동물.
- (1) 제1항의 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터를 구축하는 단계; (2) 돼지로부터 체세포를 분리 및 배양하는 단계; (3) 구축된 단계(1)의 벡터를 상기 단계(2)에서 분리한 체세포에 도입하여 상동재조합을 유도하는 단계; 및 (4) 상동재조합에 의해 돼지 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 선별하는 단계를 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 제조하는 방법.
- (1) 제14항의 방법에 의하여 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 타겟팅된 돼지의 체세포를 수득하는 단계; (2) 돼지 난자의 핵을 제거하고 상기 유전자 타겟팅된 세포를 도입하여 체세포 핵이식된 수정란을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 수정란을 착상시키는 단계를 포함하는, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 넉 아웃됨과 동시에 DAF 유전자가 넉 인된 형질전환 돼지를 제조하는 방법.
Priority Applications (1)
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Publications (2)
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| KR101435635B1 (ko) * | 2012-09-27 | 2014-08-29 | 전남대학교산학협력단 | 넉인 벡터 및 이를 이용한 장기이식용 형질전환 동물의 제조방법 |
Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| US20030203427A1 (en) | 1999-10-22 | 2003-10-30 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Alpha1-3 galactosyltransferase gene and promoter |
| KR20090056922A (ko) * | 2007-11-30 | 2009-06-03 | 한국생명공학연구원 | 이종 장기 이식용 미니 복제돼지 생산을 위한 유전자 조작된 세포주 및 그의 생산방법 |
| KR20100013227A (ko) * | 2008-07-30 | 2010-02-09 | 한국생명공학연구원 | 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 타겟팅 벡터 및그의 용도 |
-
2009
- 2009-05-27 KR KR1020090046628A patent/KR101048426B1/ko active IP Right Grant
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