KR20170002152A

KR20170002152A - 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20170002152A
Application number: KR1020150092205A
Authority: KR
Inventors: 김현일; 최기명; 심주현; 고나영; 엄희종; 김지호; 이정웅
Original assignee: 주식회사 옵티팜
Priority date: 2015-06-29
Filing date: 2015-06-29
Publication date: 2017-01-06
Also published as: KR101763196B1

Abstract

본 발명은 α1,3-GT(Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 유전자가 넉아웃되고, 인간 CD39 유전자가 넉인된, 형질전환 복제돼지에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 이종장기이식에서 발생하는 면역거부반응을 극복할 수 있어, 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여동물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 {Transgenic cloned piglets for xenotransplantation and producing method thereof}

본 발명은 α1,3-GT(Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 유전자가 넉아웃되고, 인간 CD39 유전자가 넉인된, 형질전환 복제돼지에 관한 것이다.

이종 이식(Xenotransplantation)은 인간의 장기를 대체할 수 있는 여러 가지 방법 중 하나로, 최근까지 이종 이식은 장기 이식 분야를 중심으로 발전하였다. 이종 장기나 세포의 공급원으로, 이종 장기이식이 처음 시도되던 1963년경에는 바분 원숭이(Baboons)와 같은 영장류가 많이 이용되었다. 특히, 이종 이식의 아버지라 불리는 Reemtsma는 침팬지의 신장을 신부전 환아에게 이식하여 최장 9개월의 생존을 유지하였으며 (Reemtsma K, et al. Ann Surg 1964; 160:384-410), 1984년에는 Bailey가 선천성 심장질환이 있는 Baby Fae에게 바분 원숭이의 심장을 이식하여 20일간 생존을 유지한 바 있다 (Bailey LL, et al. JAMA 1985; 254:3321-9). 그러나 영장류는 멸종 위기 종일뿐만 아니라 번식이 어렵고, 이종 장기 공급원으로 활용하기에는 사회적 거부감이 높으며, 높은 감염의 위험성이 있다. 이에 영장류 이외의 동물 중에서 장기의 크기가 사람과 매우 유사하고, 임신 기간이 127일로 짧아서 번식이 용이하며, 한꺼번에 많은 수의 새끼(6 내지 12 마리)를 낳을 수 있는 장점을 가진 돼지가 이종장기 공급원으로 선정되어 많은 연구가 진행되었으나, 돼지의 장기를 인체에 이식할 경우, 동종이식보다 훨씬 심각한 이종이식 거부반응(xenograft rejection)이 일어나는 문제점이 존재하였다.

한편, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제는 돼지의 장기를 사람으로 이식할 시에 초급성 면역거부반응(hyperacute rejection)을 일으키는 유전자이다. 영장류 이외의 모든 동물 세포의 표면에 존재하는 갈락토즈라는 항원에 대한 항체가 인체 내에 자연적으로 존재하기 때문에 항체-항원반응이 일어나고 이로 인해 초급성 면역거부반응이 유발되는데 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제가 갈락토즈를 합성한다. 따라서 상기 유전자의 기능을 억제한 형질전환 돼지에 대한 연구가 이루어졌으며, 2002년 유전자 타겟팅 방법을 통해 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제가 제거된 복제돼지가 세계 최초로 생산되었다(Yifan Dai et al,. Nat Biotechnology, 20; 251-255, 2002). 곧이어 2003년에는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자 두 좌위가 모두 제거된 동형접합 복제돼지가 생산되어 이종장기이식 모델로서 이종장기이식연구에 현실적으로 접근할 수 있는 발판이 마련되었다(Carol J. Phelps, Science, 299; 411-414, 2003). 이후 2005년에 동형접합적으로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제가 제거된 복제돼지의 장기를 원숭이에게 이식한 결과, 초급성 면역거부반응 없이 이식 후 2-6개월까지 생존함을 확인하였다(Kenji et al., Nature medicine, 11(1);29-31, 2005).

본 발명자들은 이종이식 거부반응을 극복하고 이식 초기의 급격한 이종장기 손상을 방지하여 안정적인 이식 기능을 유지할 수 있는, 형질전환 복제돼지를 개발하기 위해 노력한 결과, 이종장기 이식 시에 발생할 수 있는 단계별 면역거부반응을 억제할 수 있도록 혈전증 억제 유전자인 인간 CD39 유전자를 α1,3-GT 유전자에 적중시킴으로써 인간 CD39 유전자를 과발현할 수 있는 넉인 벡터를 제작하였으며, 이를 이용하여 제조한 형질전환 복제돼지에서 면역거부반응이 현저하게 억제됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 인간 유래 CD39 유전자가 돼지 유래 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중된 것을 포함하는 넉인(knock in) 벡터, 상기 벡터로 타겟팅된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 CD39 유전자가 돼지 유래 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중된 것을 포함하는, 넉인(knock in) 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 넉인 벡터를 체세포에 형질전환시킨 형질전환 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 핵 이식하여 제조된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 활성이 억제되고, 인간 CD39 유전자가 과발현되어 이종장기이식에서 발생하는 면역거부반응을 극복할 수 있는바, 이를 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 GTKO/hCD39-KI 벡터의 벡터맵을 나타낸 모식도이다.
도 2는 형질전환 세포주(G103 및 G107)에서 레프트 암 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 형질전환 세포주(G103 및 G107)에서 라이트 암 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 형질전환 세포주(G103 및 G107)에서 long PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)에서 레프트 암 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다(SM: 사이즈 마커, Donor: 핵 이식에 이용된 공여 세포, WT: 야생형 돼지 섬유아세포, SG: 대리모).
도 6은 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)에서 라이트 암 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다(SM: 사이즈 마커, Donor: 핵 이식에 이용된 공여 세포, WT: 야생형 돼지 섬유아세포, SG: 대리모).
도 7은 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)에서 long PCR 분석 결과를 나타낸 도이다(SM: 사이즈 마커, Donor: 핵 이식에 이용된 공여 세포, WT: 야생형 돼지 섬유아세포, SG: 대리모).
도 8은 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)에서 full PCR 분석 결과를 나타낸 도이다 (SM: 사이즈 마커, Donor: 핵 이식에 이용된 공여 세포, WT: 야생형 돼지 섬유아세포, SG: 대리모).
도 9는 형질전환 세포주(G103 및 G107)에서 GalT의 발현을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 형질전환 세포주(G103 및 G107)에서 hCD39의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)에서 GalT의 발현을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)에서 hCD39의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)에서 hCD39의 발현을 웨스턴 블랏을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)의 세포 표면에서 GalT의 하향 조절을 FACS를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)의 세포 표면에서 hCD39의 발현을 FACS를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 형질전환 복제돼지(P1 및 P2)로부터 수득한 섬유아세포에서 인간 혈청 처리 시간에 따른 세포 생존률을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 인간 유래 CD39 유전자가 돼지 유래 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase, α1,3-GT) 유전자에 적중된, 넉인(knock in) 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어 '넉인(Knock-in, 적중)'은 다른 종 또는 원래부터 해당 생명체에 존재하지 않았던 외래의 염기서열을 해당 생명체의 게놈 또는 해당 생명체로부터 유래한 DNA 염기서열에 유전자 재조합 기술을 이용하여 삽입하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 넉인 벡터는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부를 포함하는 레프트 암(left arm)으로 이루어진 제1영역, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 엑손 4의 일부를 포함하는 라이트 암(right arm)으로 이루어진 제2영역 및 인간 유래 CD39 유전자 발현 카세트를 포함한다.

돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자는 α-Gal의 생합성을 담당하는 것으로, 8개의 인트론과 9개의 엑손으로 구성되어 있으며, 그 중 엑손 4는 내재성 ATG 번역 개시 코돈을 포함하고, α1,3-GT 효소의 트랜스멤브레인 도메인을 코딩한다. 본 발명자들은 상기 엑손 4의 오픈 리딩 프레임을 교란할 수 있도록 제1영역과 제2영역을 구성하는 동시에 제1영역과 제2영역 사이에 CD39 유전자 발현 카세트가 위치하게 함으로써 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 전사 프로모터를 이용하여 CD39 유전자가 발현되는 넉인(knock-in) 시스템을 구축하였다.

상기 레프트 암과 라이트 암은 상동 재조합이 일어나는 두 개의 영역을 의미한다.

상기 제1영역은 2 내기 4 kb의 크기일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 제2영역은 3 내기 5 kb의 크기일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

상기 제1영역 및 제2영역의 크기가 상기 특정 범위보다 작을 경우에는 상동 재조합이 잘 일어나지 않고, 상기 특정 범위보다 클 경우에는 벡터의 크기가 불필요하게 커져 불안정하게 되거나 형질전환이 원하는 대로 잘 이루어지지 않을 수 있다.

상기 인간 유래 CD39 유전자 발현 카세트는 인간 유래 CD39 유전자 외에 프로모터 및 선별 마커 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 '카세트'는 유전자 재조합 기술을 이용하여 삽입하기를 원하는 외래의 염기서열을 자유롭게 삽입할 수 있는 벡터 상의 특정 영역을 의미하며, PCR 등을 통해 증폭된 외래의 유전자를 재조합 할 수 있다.

본 발명에서 용어 "프로모터"는 목적 유전자의 과발현을 유도하기 위한 것으로, 상기 프로모터에는 전사에 필요한 기본인자(Basal element) 뿐만 아니라, 발현의 촉진 및 조절에 사용될 수 있는 인핸서(enhancer)가 더 포함될 수 있다.

본 발명에서 용어 "선별 마커(selection marker)"는 넉인 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택 가능 표현형을 부여하는 마커들을 포함하는 개념이며, 양성 선별마커와 음성 선별마커를 포함한다.

상기 "양성 선별 마커"는 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 당해 특정 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 양성 선택을 가능하게 하는 마커를 의미하는 것으로, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycin phosphotransferase), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase), 퓨로마이신(puromycin), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase), 구아닌 포스퍼트랜스퍼라제(guanine phosphotransferae), 제오신(zeocin) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 양성 선별마커 유전자는 프로모터 트랩 방식에 의해, 즉, 프로모터 없이 내생적 항원 결정기 합성 유전자의 개시 코돈을 이용하여 번역될 수 있도록 넉인될 수 있고, 아니면, 통상적으로 사용되는 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터와 같은 항상성 프로모터에 의해 작동가능하도록 연결될 수 있다.

상기 "음성 선별 마커"는 무작위적 삽입(random insertion)이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 음성 선택을 가능하게 하는 마커 유전자로서, 당해 유전자를 발현하는 세포만을 선별적으로 사멸시킴으로써, 무작위적 삽입에 의한 형질도입을 방지하는 역할을 수행하며, 예를 들어, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나아제(Herpers simplex virus-thymidine kinase), 히포산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제(Hypoxanthine phosphoribosyltransferase), 시토신 디아미나아제(Cytosine deaminase), 디프테리아 톡신-A(Diphtheria toxin-A) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 인간 유래 CD39 유전자 발현 카세트는 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 돼지 α1,3-GT 유전자좌(locus)에 인간 CD39 유전자를 삽입한 GTKO/hCD39-KI 벡터를 제조하였으며, 이의 벡터맵을 도 1에 나타내었다.

상기 체세포는 섬유아세포인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 상기 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있고, 예를 들어 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, '형질감염(transfection)'이라고 부르기도 하는데, 본 발명에서는 동일한 의미로 사용된다.

본 발명의 넉인 벡터가 숙주 세포 내로 형질전환되면, 숙주 세포 게놈상의 내생적(endogeneous) α1,3-GT 유전자와 타겟팅 넉인 벡터 사이에 상동 재조합이 일어나면서, 염기 서열이 교체된다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포주를 핵 이식하여 제조된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 상기 형질전환 세포주를 제조하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식한 후 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및(c) 상기 단계 (b)의 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 생산하는 단계;를 포함하는 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 '핵 이식'은 핵이 없는 세포에 다른 세포의 핵 DNA를 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말하며, 당 분야에서 공지된 방법을 제한없이 사용하는 것이 가능하다.

본 발명에서 용어 '핵 이식란'은 공여핵원세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.

본 발명에서 용어 '탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.

본 발명에 따른 형질전환 복제돼지에서는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 활성이 억제되고, 인간 CD39가 과발현되는바, 이종장기이식에서 발생하는 면역거부반응을 극복할 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위 한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. α1,3- GT 유전자좌(locus)로의 삽입을 위한 인간 CD39 유전자 발현 카세트의 제조

항원 결정기 유전자인 돼지 α1,3-GT 유전자좌(locus)에 인간 CD39 유전자를 삽입함으로써 α1,3-GT를 넉아웃하고, hCD39를 넉인할 수 있는 GTKO/hCD39-KI 벡터를 제조하였다. 먼저, α-gal 엑손 4의 레프트 암(left arm)의 2.5kb, 라이트 암(right arm)의 4kb 부위 및 hCD39를 PCR을 통해 증폭하였다. 이때 사용된 구체적인 프라이머 서열은 다음과 같다.

레프트 암(left arm): 5'-GCGGCCGCAATTCATGATTATTATCCTCCAAGC-3' 및 5'- CTCGAGTATTTTCTCCTGGGAAAAGAAAAGG-3'

라이트 암(right arm): 5'-GTCGACCTGTCAATGCTGCTTGTCTCAACTG -3' 및 5'-GGCGCGCCTCTGCCTGCTCCATCTACAGCATAA-3'

hCD39: 5'-CTCGAGCATGGAAGATACAAAGGAGTCTAAC-3' 및 5'-TTAATTAAGATGGAACAAAAATTTAACGCGAAT-3'

PCR을 통해 증폭된 유전자를 각각 T 벡터(Promega Inc, USA)에 삽입한 후 제한효소를 이용하여 유전자의 삽입 여부를 확인하였다 (레프트 암은 Not I 및 Xho I, 라이트 암은 Asc I 및 Sal I, hCD39는 Xho I 및 Pac I을 제한효소로 이용함). 그 후, α-gal의 5′ 및 3′ DNA 단편을 각각 변형된 PGKneolox2DTA.2 (Addgene plasmid 13449) 벡터에 삽입하고, hCD39pA 유전자를 레프트 암 및 mPGKneo의 네오마이신 부위 사이에 삽입하였다.

이상의 과정을 통해 제조한 GTKO/hCD39-KI 벡터의 벡터맵 및 각 유전자의 위치를 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 돼지 1차 섬유아세포로의 형질주입

생후 2개월 된 미니 돼지(miniature pig)의 귀에서 섬유아세포를 분리하였다. 보다 구체적으로, 귀의 연골을 제거한 후, 귀 조직을 작은 조각으로 자르고 배양 접시에 옮긴 후, 귀에서 유래한 섬유아세포를 플레이트의 약 90 % 가득찬 정도(confluence)가 될 때까지 배양 배지에 유지하였다. 세포는 15 % 소태아혈청(Invitrogen, CA, USA), 1 % 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM 머캅토에탄올(Invitrogen) 및 1 % 항생제/항진균제(Invritrogen)를 포함하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)(Invitrogen) 배지에서 유지하였다. 형질주입을 위해 제조사의 방법에 따라 아멕사 베이직 뉴클레오펙션 키트(Amaxa Basic Nucleofector Kit)를 이용하여 수행하였다. 상기 세포에 Not I-절단된 GTKO/hCD39/neo 벡터를 뉴클레오펙션하고 48시간 후, 세포를 10 cm 디쉬에 접종하고, 400 μg/mL의 G418 (Invitrogen)의 존재 하에 배양하여, 항생제 저항성 클론을 선별하였다.

실시예 3. 인간 CD39 유전자를 발현하는 형질전환 돼지의 생산

3-1. 난모세포( oocyte )의 준비

미성숙 암돼지의 난소를 수득한 후, 35℃의 0.9 % NaCl 용액에 넣어 실험실로 운반하였다. COCs(Cumulus-oocyte complexes)는 10 mL 일회용 주사기에 고정된 18-게이지 바늘을 이용하여 2-6 mm 지름의 미성숙 난포(antral follicle)로부터 흡입되었다. 상기 COCs를 0.1 % 폴리비닐알코올, 3.05 mM D-글루코스, 0.91 mM 피루브산 나트륨, 0.57 mM cysteine, 0.5 μg/mL LH(L-5269, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), 0.5 μg/mL FSH(F-2293, Sigma-Aldrich Corp.), 10 ng/mL 표피생장인자(E-4127, Sigma-Aldrich Corp.), 75 μg/mL 페니실린 G 및 50 μg/mL 스트렙토마이신을 포함한 TCM 199(31100-035, Gibco Grand Island, NY, USA)로 3회 세척하였다. 약 50-60 COCs를 미네랄 오일로 덮인 4-웰 멀티디쉬(Nunc, Roskilde, Denmark)에 옮긴 후, 500 mL의 동일한 배지를 첨가하고, 5 %의 CO₂ 및 39℃의 조건에서 배양하였다.

3-2. 핵 이식

핵 이식(nuclear transfer)은 Park 등(Biol. Reprod. 2002; 66:1001-1005)의 방법을 약간 수정하여 수행하였다. 보다 구체적으로, 배양 42 내지 44시간 후에 0.1 % PVA 및 0.2 % 히알루로니다아제를 포함하는 TL-HEPES에서 4분 동안 강하게 볼텍싱하여 난구세포(cumulus cell)로부터 난모세포를 분리하였다. 0.3 % BSA (Sigma-Aldrich Corp., A-8022) 및 7.5 μg/mL 시토칼라신 B를 포함하는 TCM 199에서 미세 유리 피펫을 이용하여 제1 극체 및 인접 세포질을 흡입함으로써 난구세포-없는 난모세포에서 세포핵을 제거하였다. SCNT에 앞서 혈청 기아(serum starvation)를 위하여, 상기 실시예 2에서 제조한 공여 세포를 0.5 % FBS를 포함하는 DMEM에서 3일 동안 배양하였다. 단일 공여 세포를 난모세포 막과 접촉하는 난모세포의 위란강(perivitelline space)에 위치시켰다. 접종된 난모세포를 0.3 M 만니톨, 1.0 mM CaCl₂ _·H₂O, 0.1 mM MgCl₂ _·6H₂O 및 0.5 mM HEPES로 이루어진 배지에서 1 mm 간격으로 0.2 mm 직경의 두 백금 전극 사이에 배치하였다. 융합/활성화(Fusion/activation)는 30 μs (BTX, USA) 동안 1.1 kV/cm의 DC 펄스를 2회 연속적으로 가하여 유도하였다. 그 후, 20 내지 30개의 재구성된 배아(reconstructed embryos)를 미네랄 오일로 덮힌 4-웰 멀티디쉬에 옮기고, 500 mL의 0.4 % BSA를 보충한 NCSU(North Carolina State University)-23 배지를 첨가하였다. 배양 1 또는 2일 후, NT 배아를 승가 허용기(standing estrus)의 첫 날인 암돼지의 난관으로 외과적으로 이식하였다. 임신 상태는 초음파 스캐너(Mysono 201, Medison Co., LTD, Seoul, Korea)로 확인하였다.

실시예 4. 형질전환 세포주 및 형질전환 돼지의 스크리닝

4-1. 형질전환 세포주의 스크리닝

상기 실시예 2와 같은 방법을 통해 GTKO/hCD39-KI 벡터로 전기천공법이 수행된 생후 2년된 Yucatan 미니돼지로부터 PPF #1 세포주를 분리하고, 75개의 G418-저항성 콜로니를 레프트 암 및 라이트 암 PCR을 통해 분석하였다. 보다 구체적으로, Dneasy Blood & tissue kit (QIAGEN, Germany)를 이용하여 각 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 50 ng 게놈 DNA를 이용하여 하기 프라이머를 이용한 PCR을 각각 수행하였다. 레프트 암 PCR은 207F (5'-CCT CCTCTATCCTACCTCTAA AGC-3', 레프트 암 외부의 인트론 3에 위치) 및 213R (5'-CATCCAGCACAATCCCATACTTAA-3', hCD39 cDNA에 위치)을, 라이트 암 PCR은 7F (5'-AAGTGCCACCTAAGCTTGAAGTTCC-3', 네오마이신-저항성 유전자에 위치) 및 8R (5'-AAGCCAAACATAATCTTGCCCTCCC-3', 라이트 암 외부의 인트론 4에 위치)을 각각 프라이머로 이용하였다. 이후, 레프트 암 및 라이트 암 PCR-양성 콜로니 각각을 내생적 대립유전자(3.5 kb) 및 타겟 대립유전자(7 kb)의 증폭을 통한 long PCR로 더 분석하였다. long PCR은 207F (5'-CCT CCTCTATCCTACCTCTAA AGC-3', 레프트 암 외부의 인트론 3에 위치) 및 205R (5'- TTGGCTGATAACTAGGAGATTAGAGGAGAC-3', 라이트 암에 위치)을 프라이머로 이용하였다. 그 결과를 표 1, 및 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

항생제 저항성 클론의 수	분석 클론의 수 (%)	레프트 암 PCR 양성 클론의 수 (%)	라이트 암 PCR 양성 클론의 수 (%)	long PCR로 최종 선별한 클론의 수 (%)
75	39 (52)	11 (14.6)	5 (6.6)	2 (2.6)

도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 레프트 암 및 라이트 암 PCR 결과, G103 및 G107의 두 개의 형질전환 세포주에서 4.0 kb 및 2.5 kb의 표적 밴드가 각각 나타남을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, long PCR을 통해 G103 및 G107 형질전환 세포주가 이형접합적 타겟팅되었음을 검증하였다.

상기 과정을 통해 선별된 G103 및 G107 형질전환 세포주를 상기 실시예 3에서의 핵 이식의 공여세포로 이용하였다.

4-2. 형질전환 돼지의 스크리닝

상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 돼지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 레프트 암 PCR, 라이트 암 PCR 및 long PCR을 수행하여 타겟 클론을 분석하였다. 대조군으로는 야생형 돼지의 섬유아세포(WT) 및 대리모(SG)를 이용하였다. 그 결과를 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

도 5 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 레프트 암, 라이트 암 및 long PCR 결과, 두 마리의 새끼돼지(P1, P2)가 성공적으로 형질전환된 것을 확인하였다.

다음으로, 동일한 형질전환 새끼돼지를 대상으로 상동성 부위의 외부에 위치한 프라이머를 이용하여 Full PCR을 수행하였다. 프라이머는 207F (5'-CCT CCTCTATCCTACCTCTAA AGC-3', 레프트 암 외부의 인트론 3에 위치) 및 8R (5'-AAGCCAAACATAATCTTGCCCTCCC-3', 라이트 암 외부의 인트론 4에 위치)을 이용하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 표적 밴드(10.5kb) 및 내생적 밴드(7.5kb)의 증폭을 통해 형질전환 새끼돼지의 GalT 유전자좌에 표적 벡터가 정상적으로 삽입되었음을 확인하였다.

실시예 5. 형질전환 세포주 및 형질전환 돼지의 검증

5-1. 형질전환 세포주에서 α1,3- GT 및 hCD39 유전자 발현 분석

상기 실시예 4를 통해 선별한 형질전환 세포주(G103 및 G107)에서 이형적 넉아웃에 의해 α1,3-GT의 하향 조절이 나타나는지를 확인하기 위하여, 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 보다 구체적으로, easy-spinTM total RNA extraction kit(Intron, Korea)를 이용하여 형질전환 세포에서 전체 RNA를 분리하고, iScriptTM cDNA synthesis kit(Biorad, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 iQTM SYBR green supermix(Biorad, CA, USA)를 이용하여 증폭하였다. 실시간 RT-PCR에 이용된 프라이머 서열은 다음과 같으며, GAPDH의 발현량을 이용하여 정량화하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

GalT 발현 확인: 5'-CCAGATGGAAGGCTCCAGTG-3' 및 5'-AACGCAGAGGACCCAGCTCTA-3'

GAPDH: 5'-TCGGAGTGAACGGATTTG-3' 및 5'-CCTGGAAGATGGTGATGG-3'

도 9에 나타낸 바와 같이, G103 및 G107 형질전환 세포주는 대조군(WT)에 비해 약 절반 이하의 GalT 발현을 보임을 확인하였다.

다음으로, 동일한 세포주에서 RT-PCR을 통해 CD39 유전자 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, G103 및 G107 형질전환 세포주에서 외인성 hCD39 유전자가 현저하게 높은 수준으로 발현되며, 대조군에서는 이러한 발현이 관찰되지 않음을 확인하였다.

5-2. 형질전환 돼지에서 α1,3- GT 및 hCD39 유전자 발현 분석

상기 실시예 4를 통해 선별한 새끼돼지(P1 및 P2)에서 상기 실시예 5-1과 동일한 방법으로 GalT 및 CD39 유전자 발현을 분석하였다. mRNA는 새끼 돼지의 귀 피부 섬유아세포로부터 수득하였다. 그 결과를 도 11 및 도 12에 나타내었다.

도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 형질전환 새끼돼지(P1 및 P2)의 섬유아세포에서 GalT 발현이 현저하게 감소하고, hCD39의 발현이 높게 나타남을 확인하였다.

상기 결과를 단백질 수준에서 확인하기 위하여, 종래 공지된 방법에 따라 웨스턴 블랏을 수행하였다. 보다 구체적으로, 돼지 섬유아세포로부터 단백질을 분리한 후, 20 ㎍의 단백질을 8 % 소듐 도데실설파이트 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하고, 이를 PVDF 막(Polyvinylidene fluoride membranes)(Invitrogene) 상에 트랜스퍼하였다. 상기 막을 블로킹 버퍼(1 xTBS, 0.1 % 트윈 20 및 5 % 탈지분유)로 1시간 동안 실온에서 블로킹한 후, 마우스 단일클론 항-CD39 항체(BioLegend, CA, USA)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 상기 막을 세척 버퍼(1 x TBS 및 0.1 % Tween20)로 3회 세척한 후, HRP(horseradish peroxidase)-결합 염소 항-마우스 IgG(Santa Cruz, CA, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하고, 다시 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 최종적으로 ECL 화학 발광 키트(ECL chemiluminescence kit)를 이용하여 단백질 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 형질전환 새끼돼지(P1 및 P2)의 섬유아세포에서 hCD39의 단백질 발현이 나타나며, 대조군에서는 이러한 발현이 관찰되지 않음을 확인하였다.

5-3. FACS 분석

세포 표면 단백질 발현을 검출하기 위하여, 유세포 분석을 수행하였다. 먼저 형질전환 새끼 돼지의 섬유아세포를 HBSS(Hank's balanced salt solution)로 세척한 뒤 트립신화(trypsinized)하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 그 후, 상기 세포를 100 μL PBS로 재 현탁한 후, 10 μL의 FITC(fluorescein isothiocyanate)-결합 항-CD39(Abcam, MA, USA)와 함께 1시간 동안 얼음에서 배양하였다. 1 μL의 Alexa Fluor 488-결합 항-이소렉틴 GS ib4(Life technology, NY, USA)를 상기 세포에 첨가하고, 다시 1시간 동안 얼음에서 배양하였다. 이를 유세포 분석기(BD FACSvantage SE, Germany)로 분석하였다. 그 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.

도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 형질전환 새끼돼지(P1 및 P2)에서 GalT가 하향 조절되고, hCD39가 세포 표면에서 발현됨을 확인하였다.

5-4. 인간 보체 혈청-매개 세포독성 분석

상기 실시예 4를 통해 선별한 새끼돼지(P1 및 P2)로부터 수득한 섬유아세포 및 야생형 섬유아세포를 이용하여 보체 매개 면역 거부반응의 억제를 확인하였다. 먼저, 웰 당 1x10⁴ 섬유아세포를 96 웰 플레이트에 심은 후, 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 50%의 인간 혈청(Innovative research, MI, USA)으로 채워진 표준 배양 배지에서 30, 60, 90, 120, 180 및 240 분간 배양하였다. 그 후, 10 μL의 CCK-8 용액(Dojindo, Japan)을 첨가하고, 3시간 더 배양하였다. 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 450 nm 파장에서의 흡광도를 분석하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 야생형 섬유아세포의 생존률이 56 %에서 45.7 %로 감소한 데 반해, 형질전환 새끼돼지 P1의 생존률은 72.3 %에서 62 %, P2의 생존률은 69.5 %에서 58.2 %로 나타남을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 본 발명의 형질전환 돼지는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 활성이 억제되고, 인간 CD39 유전자가 과발현되며, 이에 의해 인간 보체에 대한 세포 독성이 현저하게 억제되고, 이종장기이식에서 발생하는 면역거부반응을 극복할 수 있음을 확인하였다.

<110> Optipharm.CO.,LTD <120> Transgenic cloned piglets for xenotransplantation and producing method thereof <130> 1-10 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1844 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human CD39 <400> 1 catggaagat acaaaggagt ctaacgtgaa gacattttgc tccaagaata tcctagccat 60 ccttggcttc tcctctatca tagctgtgat agctttgctt gctgtggggt tgacccagaa 120 caaagcattg ccagaaaacg ttaagtatgg gattgtgctg gatgcgggtt cttctcacac 180 aagtttatac atctataagt ggccagcaga aaaggagaat gacacaggcg tggtgcatca 240 agtagaagaa tgcagggtta aaggtcctgg aatctcaaaa tttgttcaga aagtaaatga 300 aataggcatt tacctgactg attgcatgga aagagctagg gaagtgattc caaggtccca 360 gcaccaagag acacccgttt acctgggagc cacggcaggc atgcggttgc tcaggatgga 420 aagtgaagag ttggcagaca gggttctgga tgtggtggag aggagcctca gcaactaccc 480 ctttgacttc cagggtgcca ggatcattac tggccaagag gaaggtgcct atggctggat 540 tactatcaac tatctgctgg gcaaattcag tcagaaaaca aggtggttca gcatagtccc 600 atatgaaacc aataatcagg aaacctttgg agctttggac cttgggggag cctctacaca 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gctttgcata cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacccta 3480 actgacacac attccacagc tggttctttc cgcctcagga ctcttccttt ttcaatatta 3540 ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 3600 aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccaccta agcttgaagt 3660 tcctatactt tctagagaat aggaacttcg cgctataact tcgtataatg tatgctatac 3720 gaagttat 3728

Claims

서열번호 1로 표시되는 인간 유래 CD39 유전자가 돼지 유래 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(α-1,3-galactosyltransferase) 유전자에 적중된 것을 포함하는, 넉인(knock in) 벡터.
제1항에 있어서, 상기 넉인 벡터는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부를 포함하는 레프트 암(left arm)으로 이루어진 제1영역, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 엑손 4의 일부를 포함하는 라이트 암(right arm)으로 이루어진 제2영역 및 인간 유래 CD39 발현 카세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 넉인 벡터.
제2항에 있어서, 상기 인간 유래 CD39 발현 카세트는 선별 마커 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 넉인 벡터.
제3항에 있어서, 상기 선별 마커 유전자는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neomycin phosphotransferase), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hygromycin phosphotransferase), 퓨로마이신(puromycin), 히스티디놀 디하이드로게나제(histidinol dehydrogenase), 구아닌 포스퍼트랜스퍼라제(guanine phosphotransferae), 및 제오신(zeocin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 넉인 벡터.
제2항에 있어서, 상기 제1영역은 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 넉인 벡터.
제2항에 있어서, 상기 제2영역은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 넉인 벡터.
제2항에 있어서, 상기 인간 유래 CD39 발현 카세트는 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 넉인 벡터.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 넉인 벡터는 하기 벡터맵으로 표시되는 것을 특징으로 하는, 넉인 벡터.
제1항의 넉인 벡터를 체세포에 형질전환시켜 제조한 형질전환 세포주.
제9항에 있어서, 상기 체세포는 돼지의 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포주.
제9항의 형질전환 세포주를 핵 이식하여 제조된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지.
(a) 제9항의 형질전환 세포주를 제조하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 형질전환 세포주를 탈핵된 난자에 이식한 후 융합시켜 핵 이식란을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)의 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 생산하는 단계;를 포함하는 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 생산방법.