KR102058015B1 - 돼지 ggta1 유전자가 결손되고, 인간 cd55 및 cd39 유전자가 발현되는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 - Google Patents

돼지 ggta1 유전자가 결손되고, 인간 cd55 및 cd39 유전자가 발현되는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환 복제돼지에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돼지 GGTA1 유전자가 결손되고, 인간 CD55와 CD39 유전자가 발현되는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이종장기이식용 형질전환돼지는 유전자가위인 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 돼지 GGTA1 유전자가 결손되고, 인간 CD55 및 CD39가 발현됨으로써 이종장기이식에서 발생하는 면역거부반응을 극복할 수 있는바, 이를 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

돼지 GGTA1 유전자가 결손되고, 인간 CD55 및 CD39 유전자가 발현되는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법{Transgenic cloned piglets defecting porcine GGTA1 gene, and expressing human CD39 and CD55 gene for xenotransplantation, and producing method thereof}
본 발명은 형질전환 복제돼지에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 돼지 GGTA1 유전자가 결손되고, 인간 CD55와 CD39 유전자가 발현되는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지에 관한 것이다.
전 세계적으로 장기이식 대기환자는 해마다 증가하고 있는 반면, 이식용 장기의 공급은 턱없이 부족한 실정이다. 우리나라의 경우 장기이식대기 환자 중 장기이식을 받은 환자는 약 10%이다. 이에, 이종 간의 장기이식(xenotransplantation)은 이식용 장기 공급 부족의 새로운 해결책으로 대두되고 있다. 개코원숭이(Baboon) 및 침팬지와 같은 영장류는 다른 종 보다 사람과 유전적, 생리학적으로 유사하지만 인수공통전염병의 위험이 높고 윤리적 이슈 등으로 인해 이종장기이식의 모델로써 적합하지 않다. 이종 간의 장기이식에 있어서, 돼지는 생리학적, 해부학적, 유전적으로 사람과 매우 유사하며 짧은 임신기간과 산자수가 많다는 이점이 있다. 돼지의 장기를 사람으로 이식했을 때 일어나는 초급성 면역거부반응은 항체-항원 매개성으로 장기이식 후 수 초 내에 발생되어 이식된 장기의 괴사를 일으키는 거부반응이다. 이러한 초급성 면역 거부반응의 주 원인은 돼지 세포 표면에 발현되는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제(Alpha-1,3-galactosyltransferase, GGTA1) 단백질이다. 초급성 면역 거부반응을 제어하기 위해 GGTA1이 결손된 형질전환 복제돼지가 2002년도에 전 세계 최초로 생산되었고(Yifan Dai et al., Nat Biotechnology, 20; 251-255, 2002), 그 후 GGTA1의 결손을 기반하여 이종장기이식을 위한 다양한 형질전환 복제돼지가 개발 되었다. GGTA1의 결손으로 초급성 면역거부반응이 제어되어 돼지 대 인간이 아닌 영장류(pig-to-non human primate)간의 장기이식의 생존율을 높일 수 있었지만 여전히 항체-항원 매개성 면역거부반응과 혈액응고 등의 현상으로 이식 후 피이식 개체의 생존기간은 최대 150일 내외였다. 항체-항원 매개성 면역 거부반응은 항체-항원의 결합 후 보체가 활성화되면서 이식된 장기조직을 손상시킨다. 상기 항체-항원 매개성 면역 거부반응은 보체 조절인자의 발현과, 응고 경로(coagulation pathway) 또는 혈소판 응집반응을 억제할 수 있는 유전자의 발현을 통해 조절할 수 있다. 최근 GGTA1 기반에 보체 조절 인자 및 혈액응고억제 유전자가 발현되는 돼지의 심장을 원숭이에게 이식하여 500일 이상 생존함으로써 이종장기이식의 가능성을 높이는 계기가 되었다(Keith A. Horvath, MD, et al., J Thorac Cardiovasc Surg 2014;148:1106-14).
이에 본 발명자들은 이종장기이식으로 인한 면역 거부반응을 억제하기 위하여, 돼지 GGTA1 유전자가 결손되고, 인간 CD55 및 CD39 유전자가 발현되는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 sgRNA(small guide RNA)를 포함하는 돼지 GGTA1 유전자 넉아웃용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 돼지 GGTA1 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부 서열을 포함하는 레프트 암(left arm) 및 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4 또는 인트론 4의 일부 서열을 포함하는 라이트 암(right arm)을 포함하는 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 돼지 GGTA1 넉아웃용 재조합 벡터 및 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터가 도입된 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계 및 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법 및 상기 방법에 의해 생산된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 sgRNA(small guide RNA)를 포함하는 돼지 GGTA1 유전자 넉아웃용 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 돼지 GGTA1 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부 서열을 포함하는 레프트 암(left arm) 및 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4 또는 인트론 4의 일부 서열을 포함하는 라이트 암(right arm)을 포함하는 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 돼지 GGTA1 넉아웃용 재조합 벡터 및 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터가 도입된 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계 및 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법 및 상기 방법에 의해 생산된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지를 제공한다.
본 발명에 따른 이종장기이식용 형질전환돼지는 유전자가위인 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 돼지 GGTA1 유전자가 결손되고, 인간 CD55 및 CD39가 발현됨으로써 이종장기이식에서 발생하는 면역거부반응을 극복할 수 있는바, 이를 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 돼지 GGTA1 유전자의 액손 4번의 염기서열, CRISPR/Cas9 타겟 서열 및 프라이머 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 돼지 GGTA1 유전자를 넉아웃시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 돼지 GGTA1 유전자 타겟 벡터의 시퀀싱 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 돼지 GGTA1 유전자를 넉아웃시키고, 인간 CD55 및 CD39 유전자를 넉인시키기 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 5는 돼지 GGTA1 유전자를 넉아웃 및 인간 CD55, CD39 유전자를 넉인시킨 후, 유세포 분석기를 이용하여 CD39가 발현되는 형질전환 세포 분리 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 형질전환 후보 세포주에서 타겟팅 유전자 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 형질전환 세포주 GT4-15의 GGTA1 CRISPR/Cas9 타겟 사이트의 염기서열을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 형질전환 세포주 제작 효율을 나타낸 도이다.
도 9는 형질전환 세포주 GT4-15에서 돼지 α-Gal과 인간 CD55 및 CD39의 발현을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 최종적으로 제작된 형질전환 세포주 GT4-15에서 돼지 α-Gal과 인간 CD55 및 CD39 웨스턴 블랏팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 GGTA1 유전자의 염기서열 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지에서 타겟팅 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지 섬유아세포에서 돼지 α-Gal과 인간 CD55 및 CD39 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지 섬유아세포에서 인간 CD55 및 CD39 웨스턴 블랏팅 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지 섬유아세포에서 사람혈청에 의한 세포독성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명을 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 PBMC에서 사람혈청에 의한 세포독성 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 sgRNA(small guide RNA)를 포함하는 돼지 GGTA1(Alpha1,3-Galactosyltransferase) 유전자 넉아웃용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, “GGTA1(Alpha1,3-Galactosyltransferase)” 유전자는 α-Gal의 생합성을 담당하는 것으로, 돼지의 경우 8개의 인트론 및 9개의 엑손으로 구성되어 있으며, 그 중 엑손 4는 내재성 ATG 번역 개시코돈을 포함하고, α-Gal 효소의 트렌스멤브레인 도메인을 코딩한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 돼지 GGTA1 유전자 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4번(GeneBank accession no. AH010595.2)를 인지하여, GGTA1 유전자를 넉아웃시킨다.
본 발명에 있어서, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 유전자 발현 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 sgRNA는 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA로서, 서열번호 1 내지 2로 표시되는 DNA로부터 전사될 수 있으며, 보다 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 sgRNA일 수 있다.
본 발명에 있어서, “CRISPR-Cas9”은 유전자 가위의 한 종류로, 유전자 제거를 위한 클로닝에 이용된다.
본 발명에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (transactivating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제(nickase)를 형성한다. Cas9 단백질을 암호화하는 유전자는 일반적으로 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)와 관련있으며, 40개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 존재한다. 대표적으로 세 종류의 CRISPR-Cas 시스템이 존재하며 그 중 Cas9 단백질을 수반하는 타입 Ⅱ CRISPR/Cas 시스템이 대표적이다.
본 발명에 있어서, “유전자 가위”는 유전체에서 원하는 부위의 DNA를 잘라내는 기술로, 유전체에서 특정 염기서열을 인식한 후 해당 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 유전자 교정(genome editing) 기술을 의미한다.
본 발명의 넉아웃용 재조합 벡터에는 DNA 결합과 관련된 gRNA(guide RNA)와 DNA 절단을 위한 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래 SpCas9이 포함되며, 상기 gRNA domain에는 DNA 내의 어떤 서열에도 결합할 수 있는 클로닝 부위가 있어 genomic DNA 중 원하는 특정서열에 결합할 수 있다. 특정부위에 결합한 gRNA의 유도 및 Cas9 단백질의 활성을 통해 DNA 절단을 유도한다.
본 발명의 돼지 GGTA1 유전자 넉아웃용 재조합 벡터는 바람직하게는 도 2에 개시된 벡터맵으로 표시될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 돼지 GGTA1 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부 서열을 포함하는 레프트 암(left arm) 및 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4 또는 인트론 4의 일부 서열을 포함하는 라이트 암(right arm)을 포함하는 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서는 돼지 GGTA1 유전자 엑손 4의 오픈 리딩 프레임을 교란하기 위하여 레프트 암과 라이트암을 구성하는 동시에, 레프트 암과 라이트 암의 사이에 인간 CD55 및 CD39 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 유전자가 위치하게 함으로써 돼지 GGTA1 유전자의 전사 프로모터를 이용하여 CD55 및 CD39 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상을 발현시키는 넉인 시스템을 구축하였다.
본 발명에 있어서, “레프트 암(left arm)” 및 “라이트 암(right arm)”은 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나는 영역을 의미한다.
본 발명에 있어서, “상동 재조합”은 상동성을 지닌 유전자 좌위에서 교환을 통하여 일어나는 유전자 재조합을 의미하며, 기능이 소실된 대립유전자를 지닌 형질전환 동물의 제조에 이용된다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 레프트 암은 돼지 GGTA1 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 레프트 암의 크기는 2 내지 6kb일 수 있으며, 더 바람직하게는 2967b이다. 이 때, 상기 레프트 암의 크기가 2kb 미만일 경우에는 상동 재조합이 잘 일어나지 않고, 6kb이상인 경우에는 벡터의 크기가 불필요하게 커져 불안정하게 되거나 형질전환이 원하는대로 잘 이루어지지 않을 수 있어 바람직하지 않다.
본 발명의 일 구체예에서, 레프트 암은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 라이트 암은 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4 또는 인트론 4의 일부 서열을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 라이트 암의 크기는 1.5 내지 5kb일 수 있으며, 더 바람직하게는 4084b이다. 이 때, 상기 라이트 암의 크기가 1,5kb를 넘지 않는 경우에는 상동 재조합이 일어날 확률이 매우 낮으며, 5kb를 넘을 경우에는 유전자 재조합이 어렵고, 불필요하게 커진 크기로 인해 벡터가 불안정해질 수 있어 바람직하지 않다.
본 발명의 일 구체예에서, 라이트 암은 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 인간 CD55 유전자; 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 인간 CD39 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 더 포함할 수 있으며, 상기 유전자의 전체 서열 또는 일부 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 인간 CD55 및 CD39 유전자는 벡터 내의 항생제 내성 유전자에 삽입되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “인간 CD55(GenBank accession no, NM001114752.2) 유전자”는 보체활성 억제 유전자이며, 보체활성화 단계 중 C3 컨버테이즈(convertase)의 불활화 작용을 한다.
본 발명에 있어서, “인간 CD39(GenBank accession no, NM001776.5) 유전자”는 혈소판 반응으로 인한 혈액응고반응 억제 유전자이며, 혈소판 활성화 억제 작용을 한다.
본 발명의 인간 세포 부착 인자 넉인용 유전자 재조합 벡터는 바람직하게는 도 4에 개시된 벡터맵으로 표시될 수 있다.
형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포 제조하기 위한 재조합 벡터는 전술한 바와 같이 돼지 GGTA1 유전자 넉아웃용 재조합 벡터 및 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터일 수 있으나, 목적 서열을 포함할 수 있는 한 이에 제한되지 않는다. 목적 서열을 포함하는 재조합 벡터의 예로는 (1) 하나의 벡터에 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 sgRNA, 돼지 GGTA1 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부 서열을 포함하는 레프트 암(left arm), 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4 또는 인트론 4의 일부 서열을 포함하는 라이트 암(right arm), 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 인간 CD55 유전자 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 인간 CD39 유전자가 모두 포함된 형태의 재조합 벡터일 수 있으며;
(2) 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 sgRNA, 돼지 GGTA1 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부 서열을 포함하는 레프트 암(left arm), 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4 또는 인트론 4의 일부 서열을 포함하는 라이트 암(right arm) 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 인간 CD55 유전자와 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 인간 CD39 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 유전자를 포함하는 다수의 벡터일 수 있다.
상기 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 제조하기 위한 재조합 벡터는 바람직하게는 도 2 및 도 4에 개시된 벡터맵으로 표시된 벡터의 조합일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 돼지 GGTA1 넉아웃용 재조합 벡터 및 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터가 도입된 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명에 있어서, "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, '형질감염(transfection)'이라고 부르기도 하는데, 본 발명에서는 동일한 의미로 사용된다.
상기 체세포는 바람직하게는 섬유아세포이며, 보다 바람직하게는 돼지의 섬유아세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 형질전환을 위한 재조합 벡터는 각각의 유전자를 포함하고 있는 재조합 벡터가 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 형질전환 세포는 바람직하게는 2017년 10월 02일에 한국세포주연구재단(한국세포주은행)에 기탁한 수탁번호 KCLRF-BP-00411의 세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계 및 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법 및 상기 방법에 의해 생산된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지를 제공한다.
본 발명에 있어서, “핵 이식”은 핵이 없는 세포에 다른 세포의 핵 DNA를 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말하며, 당 분야에서 공지된 방법을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, “핵 이식란”은 공여핵원세포가 도입 또는 융합된 난자를 의미한다.
본 발명에 있어서, “탈핵 난자”는 난자의 핵이 제거된 것을 의미한다.
본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 유전자 가위인 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 GGTA1 유전자가 제거되고, GGTA1의 유전자위에서 인간 CD55, CD39 유전자를 발현하게 됨으로써, 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성 제거 및 인간 CD46, CD39 유전자가 발현되어 이종장기이식에서 발생하는 초급성 및 보체에 의한 면역거부반응과 혈액응고에 의한 면역 거부반응을 극복할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 이종간의 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해o-i석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. GGTA1 유전자를 제거하기 위한 재조합 벡터의 제조
돼지 GGTA1 유전자를 넉아웃시키기 위하여, 타겟 부위를 GGTA1 유전자의 엑손 4번으로 선택하였다. 돼지 GGTA1 엑손 4의 염기서열(GeneBank accession no. AH010595.2)을 분석하여 guide RNA가 결합할 수 있는 엑손의 염기서열 부위를 결정하였고, 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다. 구체적으로, 도 1에 표시한 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4의 염기서열 중 선별한 2개의 sgRNA(small guide RNA) 염기서열을 각각 포함하도록 제작된 두 프라이머를 혼성화한 후, 그 산물을 Cas9 벡터에 삽입하였다. sgRNA 서열을 표 1에 나타내었으며, 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 서열 도입 유무를 확인하였다(솔젠트). 도 2는 서열번호 1의 sgRNA를 포함하는 플라스미드 벡터의 벡터맵을 일례로 나타낸 것이다.
서열번호 sgRNA 염기서열(5’->3’) PAM 염기서열
1 aatgaatgtc aaaggaagag tgg
2 ggagaaaat aatgaatgtca agg
다음으로, 각 sgRNA 위치에 따른 타겟팅 효율을 검증하기 위하여 2개의 sgRNA를 각각 포함하도록 제작된 재조합 벡터 2종을 돼지 섬유아세포주에 전기천공법 키트(amaxa)를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환을 실시하고 48시간 후 Dneasy blood & tissue kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 각각의 형질전환 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 게놈 DNA 50ng 및 프라이머(463F : 5'-CACCTGCAAATACATACTTCATGGT-3', 464R : 5'-AAACACCATGAAGTATGTATTTGCA-3')를 이용하여 PCR 산물을 수득하였다. PCR 산물을 이용하여 타겟 부위에 발생한 돌연변이(mutation)를 시퀀싱 분석을 통해서 확인하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 서열번호 1의 sgRNA를 포함하는 1번 재조합 벡터가 표적 유전자 부위인 GGTA1 유전자의 변이를 유도하는 것을 확인하였으며, 이후 실험에서는 1번 재조합 벡터를 이용하였다.
실시예 2. CD39, CD55 유전자를 넉인하기 위한 재조합 벡터의 제조
돼지 GGTA1 유전자위에 CD39, CD55 유전자가 넉인된 돼지를 생산하기 위하여, 타겟 부위를 GGTA1 유전자의 엑손 4번으로 선택하였다. 엑손 4번을 타겟팅하기 위하여, 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4의 염기서열(GenBank accession no. AH010595.2)을 분석하여, 돼지 GGTA1 유전자의 인트론 3의 일부 서열과 엑손 4의 일부서열을 포함하며 크기가 2.5kb인 레프트 암(Left arm)과 엑손 4의 일부 서열과 인트론 4의 일부서열을 포함하며 크기가 4kb인 라이트 암(right arm)의 서열을 결정하였다. 레프트 암 및 라이트 암은 각각 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시된다.
구체적으로, 돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4의 레프트 암의 2967b 및 라이트 암의 4084b와, 인간 CD55 및 CD39 유전자를 PCR을 통해 증폭하였다. 이 때, PCR에 사용한 프라이머의 염기서열은 표 2에 나타내었다.
프라이머 염기서열(5’-3’)
레프트 암 F: GCGGC CGCAA TTCAT GATTA TTATC CTCCA AGC
R: CTCGA GTATT TTCTC CTGGG AAAAG AAAAG G
라이트 암 F: GTCGA CCTGT CAATG CTGCT TGTCT CAACT G
R: GGCGC GCCTC TGCCT GCTCC ATCTA CAGCA TAA
CD55 F: CTCGA GCATG CATCT AGAGC CATGA CCGTC
R: CTCGA GATTA TCATC GTGTT TTTCA AAGGA A
CD39 F: CTCCA GCATGGAAGA TAAA AGGAG TCTAA C
R: TTAAT TAAGA TGGAA CAAAA ATTTA ACGCG AAT
상기 증폭된 유전자를 T 벡터(Promega, USA)에 삽입하여 클로닝 하였고, 레프트 암 및 라이트 암의 단편 각각을 변형된 PGKneolox2DTA.2(Addgene plasmid 13449) 벡터에 삽입하였다. 또한 상기 벡터에 인간 CD55 및 CD39 유전자를 레프트 암과 PGKneolox2DTA.2 벡터 내의 네오마이신(neomycin) 내성 유전자 사이에 삽입하여, CD39(서열번호 6), CD55 유전자(서열번호 5)를 넉인하기 위한 재조합 벡터 GTKO/CD55/CD39 KI를 제작하였다. 상기 재조합 벡터의 벡터맵은 도 4에 나타내었다.
실시예 3. 돼지 GGTA1 유전자가 제거되고, 인간 CD55 및 CD39 유전자가 도입된 세포주의 구축
3-1. 돼지 GGTA1 유전자가 제거되고, 인간 CD55 및 CD39 유전자가 도입된 형질전환 세포주의 제작
상기 실시예 1에서 효율이 검증된 1번 재조합 벡터(sgRNA 5’-AATGAATGTCAAAGGAAGAG-3’) 및 실시예 2로 제작된 재조합 넉인 벡터를 돼지 섬유아세포주에 전기천공법 키트(Amaxa)를 이용하여 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 유세포 분류기(FACS)를 이용하여 CD39 유전자를 발현하는 세포를 1차적으로 선별하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 형질전환된 세포 중 CD39 유전자를 발현하는 세포는 전체 세포의 0.1 내지 0.2% 임을 알 수 있다.
세포 선별 후 단일콜로니 배양 및 분석을 통하여 넉인 벡터가 타겟팅 된 형질전환 세포주를 제조하였다. 구체적으로, Dneasy Blood & tissue kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 각각의 형질전환 세포 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출 후 프라이머 207F(5’-CCTCCTCTATCCTACCTCTAAAGC-3’) 및 521R(5’- TTTGTACGTTATTACAGTATCCTCG-3’)를 이용한 레프트 암 PCR과, 프라이머 7F(5’-AAGTGCCACCTAAGCTTGAAGTTCC-3’) 및 8R(5’-AAGCCAAACATAATCTTGCCCTCCC-3’)를 이용한 라이트 암 PCR, 그리고 프라이머 207F(5’- CCTCCTCTATCCTACCTCTAAAGC-3’) 및 205R(5’-TTGGCTGATAACTAGGAGATTAGAGGAGAC-3’)를 이용한 Long PCR을 이용하여 타겟팅 여부를 확인 하였다. PCR을 통한 타겟팅 여부를 확인한 결과는 도 6에 나타내었다.
또한, CD55 및 CD39 유전자의 넉인이 확인 된 3개의 콜로니에서 한 쌍의 GGTA1 염색체 중 넉인된 염색체를 제외하고 나머지 한쪽의 염색체의 CRISPR/Cas9 표적부위 염기서열 확인하였다. 상기 CRISPR/Cas9 표적부위 염기서열 확인은 463F 및 464R 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였고 수득된 PCR 산물을 솔젠트사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 결과는 도 7에 나타내었다.
도 6 및 7에 나타낸 바와 같이, 형질전환 세포주에서 타겟팅 벡터가 표적부위에 넉인된 것을 알 수 있다. 또한 GGTA1 한쪽 염색체는 넉인되었고, 나머지 한쪽 염색체는 CRISPR/Cas9 작용으로 인한 유전자 변이로 GGTA1 유전자의 넉아웃된 것을 확인 하였다. 상기 실험을 통해 확립한 3개의 콜로니 중 세포 형태 및 증식속도 등을 고려하여 핵이식에 사용할 콜로니 1개를 선별하여 GT4-15로 명명하였고, 한국세포주은행에 2017년 10월 13일 자로 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00411을 부여받았다.
3-2. 돼지 GGTA1 유전자가 넉아웃되고 , 인간 CD55 및 CD39 유전자가 넉인된 형질전환 세포주 GT4-15의 제작 효율
종래기술(K. Choi et al., 2016)의 상동재조합(homologous recombination) 원리를 이용한 유전자 넉인 시스템은 그 효율이 매우 낮고, 주로 한 쌍의 염색체 중 한쪽에만 타겟팅 되기 때문에 이형접합(heterozygous)의 형태로 유전자가 넉아웃된다. 따라서 본 발명에서는 종래기술과 같이 넉인 벡터를 사용하는 동시에 같은 위치를 타겟으로 하는 CRISPR/Cas9 시스템을 함께 이용함으로써, 넉인 벡터의 타겟팅 효율이 증가됨과 동시에 양쪽 유전자가 모두 변이가 일어나 넉아웃이 된 형질전환 세포주를 제작 하였다. 이에, 본 발명과 종래기술의 형질전환 세포주 제작 효율을 비교하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 것과 같이, 본 발명의 형질전환 세포주 제작 효율이 넉인 벡터를 이용하여 타겟팅 된 형질전환 세포주를 제작하는 종래기술보다 현저하게 높은 것을 확인하였다.
3-3. 돼지 GGTA1 유전자가 넉아웃되고 , 인간 CD55 및 CD39 유전자가 넉인된 형질전환 세포주 GT4-15의 유전자 발현 검증
상기 실시예 3-1에서 제작된 돼지 GGTA1 유전자가 넉아웃되고, 인간 CD55 및 CD39 유전자가 넉인된 형질전환 세포주 GT4-15의 유세포 분석을 수행하였다. 먼저 형질전환 세포주 GT4-15를 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척한 뒤 트립신화(trypsinized)하여 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 그 후, 상기 세포를 100μl PBS로 재현탁한 후, α-gal 발현 확인을 위하여 1μl의 FITC 결합 isolectin-IB4(Invitrogen, USA)를 첨가하여 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. CD55, CD39 유전자 발현 확인을 위해 PBS로 현탁한 세포에 1μl의 anti-CD55(santacruz, USA)와 anti-CD39(Santacruz, USA) 를 각각 상기 세포에 첨가하고, 2시간 동안 상온에서 배양하였다. 이를 1x PBS로 3회 세척한 후, 100μl PBS로 재현탁한 후, 1μl 의 FITC 결합 Goat anti-chicken을 첨가하고, 1시간 동안 4℃에서 배양하였다. 항체 반응 후 각각의 세포를 3회 세척한 후, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하여 유세포 분석기(BD FACSvantage SE, Germany)로 분석하였다. 상기 유세포 분석 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 것과 같이 FACS 분석을 통하여 세포 표면에서 α-Gal 유전자 발현이 억제되고 CD55, CD39 유전자가 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다.
다음으로, 웨스턴 블랏팅 분석을 이용하여 형질전환 세포주에서 CD55, CD39 단백질발현을 확인하였다. 보다 구체적으로 세포에서 추출한 20 ㎍의 단백질을 10% 소듐 도데실설파이트 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하고 PVDF 막 상에 트랜스퍼 하였다. 상기 PVDF 막을 블로킹 버퍼(1x PBS, 2% 트윈 20, 5% 스킴 밀크)로 1시간 동안 실온에서 블로킹한 후 막을 anti-CD55(Santacruz, USA), Anti-CD39(Santacruz, USA), Anti-β-actin(Santacruz, USA)과 함께 4℃에서 밤새 배양하고, 다시 세척 버퍼(1x PBS, 2% 트윈 20)로 3회 세척하였다. 그 뒤 PVDF 막을 각각 HRP 결합 anti-mouse(Santa cruz, U.S.)로 상온에서 1시간 동안 배양하고 세척 버퍼로 3회 세척하였다. ECL 화학 발광 키트 (ECL chemiluminescence kit)를 이용하여 단백질 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군(WT)과 다르게 형질전환 세포주 GT4-15에서 CD55 및 CD39 단백질이 발현됨을 확인하였다.
실시예 4. 돼지 GGTA1 유전자가 넉아웃되고 , 인간 CD55 및 CD39 유전자가 넉인된 형질전환 돼지의 생산
4-1. 난모세포( oocyte )의 준비
미성숙 암퇘지의 난소를 수득한 후, 35℃의 0.9 % NaCl 용액에 넣어 실험실로 운반하였다. COCs(Cumulus-oocyte complexes)는 10mL 일회용 주사기에 고정된 18-게이지 바늘을 이용하여 2 내지 6 mm 지름의 미성숙 난포(antral follicle)로부터 흡입되었다. COCs를 0.1% 폴리비닐알코올, 3.05mM D-글루코스, 0.91mM 피루브산 나트륨, 0.57mM cysteine, 0.5μg/mL LH (L-5269, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), 0.5μg/mL FSH (F-2293, Sigma-Aldrich Corp.), 10ng/mL 표피생장인자(E-4127, Sigma-Aldrich Corp.), 75μg/mL 페니실린 G 및 50μg/mL 스트렙토마이신을 포함한 TCM 199 (31100-035, Gibco Grand Island, NY, USA)로 3회 세척하였다. 약 50 내지 60 COCs를 미네랄 오일로 덮힌 4-웰 멀티디쉬 (Nunc, Roskilde, Denmark)에 옮긴 후, 500μl의 동일한 배지를 첨가하고, 5%의 CO2및 39℃의 조건에서 배양하여 준비하였다.
4-2. 핵 이식
핵 이식(nuclear transfer)은 Park 등 (Biol. Reprod. 66:1001-1005, 2002)의 방법을 약간 수정하여 수행하였다. 구체적으로, 배양 시작 42 내지 44시간 후에, 0.1% PVA 및 0.2% 히알루로니다아제를 포함하는 TL-HEPES에서 4분 동안 강하게 볼텍싱하여 난구세포(cumulus cell)로부터 난모세포를 분리하였다. 0.3% BSA (Sigma-Aldrich Corp., A-8022) 및 7.5μg/mL 시토칼라신 B를 포함하는 TCM 199에서 미세 유리 피펫을 이용하여 제1 극체 및 인접 세포질을 흡입함으로써 난모세포의 세포핵을 제거하였다. SCNT에 앞서 혈청 기아(serum starvation)를 위하여, 상기 실시예 2에서 제조한 공여 세포(형질전환 세포주 G4-15)를 0.5% FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 3일 동안 배양하였다. 단일 공여 세포를 난모세포 막과 접촉하는 난모세포의 위란강(perivitelline space)에 위치시켰다. 접종된 난모세포를 0.3M 만니톨, 1.0mM CaCl2 ·H2O, 0.1mM MgCl2 ·6H2O 및 0.5mM HEPES로 이루어진 배지에서 1mm 간격의 0.2mm 직경의 두 백금 전극 사이에 배치하였다. 융합/활성화(Fusion/activation)는 30μs (BTX, USA)동안 1.1kV/cm의 DC 펄스를 2회 연속적으로 가하여 유도하였다. 그 후, 20 내지 30개의 재구성된 배아(reconstructed embryos)를 미네랄 오일이 덮힌 4-웰 멀티디쉬에 옮기고, 500mL의 0.4% BSA를 보충한 NCSU(North Carolina State University)-23 배지를 첨가하였다. 배양 1 또는 2일 후, NT 배아를 승가 허용기(standing estrus)의 첫 날인 암퇘지의 난관으로 외과적으로 이식하였다. 임신 상태는 초음파 스캐너(Mysono 201, Medison Co., LTD, Seoul, Korea)로 확인하였다.
실시예 5. GGTA1 유전자가 제거되고 CD55, CD39 유전자가 넉인된 형질전환 돼지의 검증
5-1. 염기서열 분석 및 타겟팅 PCR 분석
상기 실시예 4에서 제조된 형질전환 돼지를 확인하기 위하여, 산자의 섬유아세포를 수득한 후, genomic DNA를 추출하여 463F 및 464R 프라이머로 GGTA1 유전자의 타겟 부위를 증폭 시켰고, PCR 산물의 염기서열을 분석하였다(솔젠트). 상기 PCR 산물의 염기서열 분석 결과는 도 11에 나타내었다. 또한 넉인 유무를 확인하기 위하여 7F 및 8R 프라이머와 207F 및 521R 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 11 내지 도 12에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 4에서 제조된 형질전환 돼지의 섬유아세포에서 표적 유전자 부위인 GGTA1 유전자가 잘 제거되었으며, CD55 및 CD39 넉인 벡터가 GGTA1 유전자위에 도입되어 있음을 확인하였다.
5- 2.웨스턴블랏 분석 및 유세포 분석
상기 실시예 4에서 제조한 형질전환 돼지를 단백질 수준에서 확인하기 위하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 형질전환 돼지에서 분리된 섬유아세포에서 단백질을 분리하여 실시예 3-3의 나타낸 방법으로 각 유전자에 대한 단백질 발현 분석 및 유세포 분석을 수행하였으며, 그 결과를 각각 도 14 및 15에 나타내었다.
도 14 및 15에 나타낸 바와 같이, 형질전환 돼지는 α-Gal 발현이 억제되고 인간 CD55 및 CD39 유전자가 단백질 수준에서 현저하게 발현되는 것을 확인하였다.
5-3. 사람혈청에 의한 세포독성 기능평가
상기 실시예 4에서 제조된 형질전환 돼지의 기능평가를 위하여 사람 혈청에 의한 세포독성 분석을 하였다. 형질전환 돼지의 섬유아세포에 사람보체혈청을 처리한 후 세포 생존율을 측정하였다. 구체적으로, 실험 24시간 전 섬유아세포 약 10000개를 96 웰 배양 접시에서 배양하였다. 배양 24시간 후 사람보체혈청(Innovative, USA)을 100% 농도로 1, 1.5, 2, 4시간 동안 처리하였다. 모든 웰의 사람보체 혈청을 제거 한 후 100μl의 배양배지 및 10μl의 CCK-8(Dojindo, Japan)를 첨가하여 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
또한 형질전환 돼지로부터 분리된 PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell)의 사람혈청에 의한 세포독성 분석을 하였다. 형질전환 돼지의 혈액 5ml를 EDTA가 처리된 튜브에 보관하였고, 이를 PBS 5ml에 희석하였다. 희석된 혈액을 ficoll paque plus(GE healthcare, UK) 용액을 이용하여 PBMC를 분리하였다. 분리된 PBMC를 96 웰 배양 접시에서 배양한 후 사람보체혈청을 6.25, 12.5, 25%의 농도로 3시간동안 처리하였다. 상기 PBMC는 섬유아세포와 동일한 방법으로 세포생존율을 측정 하였다. PBMC의 세포생존율을 분석한 결과는 도 16에 나타내었다.
도 15 및 16에 나타낸 바와 같이, 모든 처리군에서 일반돼지(WT)보다 GGTA1 유전자만 결손된 돼지(GTKO)에서 생존율이 높았다. 특히, 돼지 GGTA1 유전자가 넉아웃되고, 인간 CD55 및 CD39 유전자가 넉인된 본 발명의 형질전환 복제돼지는 GTKO 돼지보다도 사람보체혈청에 의한 생존율이 현저히 높은 것을 확인하였다.
종합적으로, 본 발명에 따른 방법을 통해 제조한 GGTA1 유전자가 제거되고 GGTA1의 유전자위에서 인간 CD55, CD39 유전자를 발현하는 형질전환 돼지는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성 제거 및 인간 CD46, CD39 유전자가 발현되어 이종장기이식에서 발생하는 초급성 및 보체에 의한 면역거부반응과 혈액응고에 의한 면역 거부반응을 극복할 수 있음을 확인하였다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
한국세포주은행 KCLRF-BP-00411 20171013
<110> Optipharm.CO.,LTD <120> Transgenic cloned piglets defecting porcine GGTA1 gene, and expressing human CD39 and CD55 gene for xenotransplantation, and producing method thereof <130> 1-74P <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> small guide RNA 1 <400> 1 aatgaatgtc aaaggaagag 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> small guide RNA 2 <400> 2 ggagaaaata atgaatgtca 20 <210> 3 <211> 2967 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> left arm <400> 3 aattcatgat tattatcctc caagcctgtt cctcctccag cccatctgag aaaatactac 60 aacccccctg cttaagcaga aatcttgggt cttccttgtc tcatctctga taacaaaatt 120 accaaccacg tcctatcaat tctctctcca aagtatatat atatatattt ttttttaatt 180 ttttcccgct gtacagcatg gggatcaagt tattcttaca tgtatatttt ccccccaccc 240 tttgttccgt tgcaatatga gtatctagac atagttctca atgctactca gcaggatctc 300 cttgtaaatc taagttgtat ctgataaccc caagctcccg atccctccca ctccctccct 360 ctcctgtcgg gcagccacaa gtctattctc caagtccatg attttctttt ctgtggagat 420 ggtcatttgt gctggatatt agattccagt tataagtgat atcatatggt atttgtcaaa 480 gtatatattt tatttttctt tgtctttttg tcttttgtct tttttttttt tgttgttgtt 540 gttgttgttg ttgttgctat tacttgggcc gctcccgcgg catatggagg ttcccaggct 600 aggagttgaa tcggagctgt agccaccggc ctacgccaga gccacagcaa cgcgggatcc 660 gagccgcgtc tgcaacctac accacagctc acggcaacgc tggatcctta acccactgag 720 caagggcagg gaccgaaccc gcaacctcat ggttcctagt cggattcgtt aaccactgcg 780 ccacgacggg aactcccaaa gtatattttg aatcaagcca ccctttgagc caggccacct 840 cctctttatg gtcatgagaa cggtctgccc ttgtcctttt ctccattctc cacactcagc 900 acccagatgg gtctctctag gtgaagttgg atcaggggat tctccagctt tagatgcttt 960 ttgggattcc ccaccctact ttccatacct ttccaggttc tgactgcctc tgcccccctt 1020 ctgactgcct agcaccagcc actcaagggg gacagtgtca gtcactattt ttttcttgtc 1080 caggtttttt gcttttgttt ttttcaaaca cgagcagctc tttctcttgt ctgcctggta 1140 tagatgctgt ttccaaaata ttctcatccc ttctcacggc ccttgtcatc ctttcccatc 1200 ctatcttcat cccttgggaa gctctaaagt catctcccca aattgaaggg tgactaaaga 1260 gtttcccaga aggaaaaact gagtttccaa ctactacact gacttgcaag aaatgtttgt 1320 gtcttcatta aatgaaaaag aaaaaactgt aacaagatat gagaaaatac agaaaggaaa 1380 taataagact agaaaagtca aatatatagt gaaggtgttg catcaaacac ttaaataaac 1440 tagtacagat gttaaaagac taaattatat agttgaagga tagctgtgaa gatgtaaact 1500 atgacatcta aaacacaaaa tgttggcgtt cccgtcacgg cacagtggaa acgaatccga 1560 ctaggaacca tgaggttgca ggttcaattc ctgcccttgc tcagtgggtt aaggatccgg 1620 tgttgccgtg agctgtggtg taggtagcca atgaggcttg gatcccgcgt tgctgtggct 1680 ctggtgtagg ccggtggcta cagctccgat tcgaccccta gcctgggaac ctccatatgc 1740 cgcgggagcg gccctaaaaa gacaaataga cctaaaaaga aaaaaatcac aagacccaca 1800 aaatgttgcg aatcagtcct ctactagtat tatgtaattg tgcaagtttt ccttttatgt 1860 ctgttaatat ttgcgttcta gatgtaggtg ctctgatatc gtgtgcatat atgttaacca 1920 atgttatgtc ttcctctggt attgatccct ttgttattat gtaatgccct actttatctt 1980 ttgttacatt ctttgtttat gagtattgct gatatgtggc tagctgccac acttttcttg 2040 tcctttccat ttgaaataaa tatctttcta tctccaccca aattaaagta ctccgcaacc 2100 tgttattcca cccagcatcc cttccctctt caactacaat ttcatgcagc gatcaagaaa 2160 tacgaatgta ccgactgttt gccacttgtg tgggtgcatt ggggaaaagc tgggtgggaa 2220 gtggcagagc ctagattata aaggaccagg gtgagagttc ccattgtggc tcagctgaaa 2280 tgaatctgac tagcatccat gaggacgaag gtttgatccc tggcctcaat cagtgggtta 2340 aggatctggc gttgctgtcc gtgagttgtg gtgtagttcg cagacaaggc gtggacttag 2400 tgtggctgtg gctgtggcat aggctagtgg ctacagctct gattcgaccc ctagcctggg 2460 aatctctata tgctgtgagt gtggccctaa aatttaaatg aaattaaata aaggaccagg 2520 gtatattttt ctttgaggat aaggtacata gtcagtatat cagggacagt agacctagga 2580 aacggatgct tcctctagtc tgtgatgcga ggtggggcat ctgagttggg ggcggctgga 2640 gcccttaggg accattaact aaacccgtca ctctcccaca tctcggtgga ccttgggatc 2700 agtcaggatg cttccccttt gagcctcaaa atggccttag tatccttccc aacccagacg 2760 gccctgtcag ttcattgact tggctaattt gccagtgtag gcctatgcaa attaaggtag 2820 aacgcactcc ttagcgctcg ttgactattc atcaactttt ccttttagaa aagatattgg 2880 tataagcact tcttaaaaaa ccatattcca ctctgggtgt atttaatcta attttccctt 2940 ctccttttct tttcccagga gaaaata 2967 <210> 4 <211> 4084 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> right arm <400> 4 ctgtcaatgc tgcttgtctc aactgtaatg gttgtgtttt gggaatacat caacaggtaa 60 ttatgaaaca tgatgaaatg atgttgatga aagtctcctc taatctccta gttatcagcc 120 aagtcaccag cttgcattaa aagtaggatt cactgacacc gtaaagaaag cattccagag 180 agttgccgtt gtggctcagg ggcagcaaac ccaattagga tccaagagga ggtgggtttg 240 atccctggcc ttgctctttg gcttaaggat ccggcattgc cgtgacctgt ggtgtaggtt 300 gcagatgcag ctcggatctg gcattgctgt ggctgtggcg taggctggtg gcttcagctc 360 cagtttgacc cctagcctgg gaacttccat atcccacact tgcggcccta aaaagcaaag 420 aaagaaagaa aatattctac ccttcctgta tccctgagcc cttaaatacc gtctttaaag 480 tcattagatc ttcaagtacc ttccagctaa ttaattatct tccttcctgc catgttgcca 540 ttgtcctgat ttttatacct ctgcagttct gggtaggcta gagccagaaa taataaggtc 600 atgttaagac caagatataa tattaaatta tttatatgac cagatatgga agttaccttg 660 agaactttca gacaggaatt ccatgagaaa tacaccctga tttttgcaat cctaaaatat 720 ttgcagagtt taaaggaaca actcaagttg ttgacttttg ctgcaaaaca cactgagtcg 780 ctggtgattc atttgtgcct ggctaaactt ttgggtgttt tgtctttttt ttttaactct 840 ggaaagcaaa atgaattaaa catttctgag ttttcaaatt catcagtgga ttcaccccaa 900 atatttgacg ctgcttcttt gcttttggaa actacgatgc cttggagatt ccagctggag 960 acgcttctga cagaaagaaa tgtctgcaag cagctaccaa aatgcatgat ggctttgact 1020 taagaggtat tgataccgct tggactttct ttcaaaaagg ccaccttaca acttggcctg 1080 aaggcattcc cgtggtggtg cagcggaaaa tgaatctgac taggaacccc gaggttgtgg 1140 gttcaatccc tggccttgct cagtggctta aggatcgggt gttgaagtaa gctgtggtgt 1200 agattgcaga cgcagcttgg atctggtgtt gctgtggctt tggtgtaggc cggcagctac 1260 agctccactt ggacccctag tctgggaacc tccatatgcc acaggtgtgg ccctaaaagg 1320 aaaaaagaca acaaacaaac aaaaaaccaa aaaacaactt ggcctggaga gctatgtcat 1380 caccattgat attttgatgg gtagtgtttt agtagcccct caagttcagg atgatggcct 1440 ggattaacgt tagaatgtct cttaaattct aagacttgat gagccagcag gaccattttg 1500 gccacttaga aaggaactgc atcttcaggt ccatcagtag aaggaggatt ctctagggag 1560 ttctctctta gctcagcggg ttcaagaatt cagtcttgtc cctacagcag ctcaggtgac 1620 tgctatggct tggctttgat ccctggccca ggaatttctg catgctgcag gtgcagccaa 1680 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaggagg aggtggattc cctagaataa gaagctgtca 1740 ttcctttgga tgcttcatag atctaaccac ttctggaaca gttattccct ctcattctga 1800 agaactcatt ttaagaaaaa caagacgagc tagagagtga acaaatgtct acaaaccaac 1860 cttttcgaat tgaggaaact gtggtacttc ctctgaagaa aagatgacag cgttggatgc 1920 agagaccctg gggctccctt aggtacttga ggactgagga gatattctca gtggaggctg 1980 gagctaggct gcctggggtt ggtcctgtgc caccacttcc ctcctctgtg actttgggca 2040 agtttcccta tctttaaaaa tggggatgat agtagtacct gcttcatagg gttgttggat 2100 aaaataagtt gtgaataaag cactaagggc aacgtactta gtaagcgctg gctgccatca 2160 ccaccaccac tatcaccatc tgtccggagg gcagcatagg acaggagatt ttggcaaata 2220 gaaggaagag ttctaggagt tcccgttgtg gtgcagggga aatgaatcca actaggaact 2280 aggagatttc gggttcaatc ccgcgcctcg ctcagtgggt taaggatcca gtgttgccat 2340 gagctgtggt gtagattgca gacatggcta ggatctggag ttgctatggc tgtggtgtaa 2400 gctggcagct gtagctcgga ttctacccct agcctgggaa tttccgtatg ccacaggttt 2460 ggccctacaa agaaaaaaga aaaagaaaaa gaaaaaattc taggggctga aagaatctaa 2520 cagaagagca agttccccat ggggttcctg acctgagttg agatgcttgt gtaggcaacc 2580 ttcaagctct gaactcttga ttgttttgaa ttgcagccag agttatactt ccatattttg 2640 ggtacttcac aaaattaaaa cacagaagcc aaaggcccag aagtgcatat tggtgctggc 2700 ctcccataaa gagggttgtt ttgcagtgct gggcacactc tctcttcaca gtaactggag 2760 cagattctgg ctgctcttca gggccgtagt ctggcaccca gactgcagcc acatcattct 2820 tcaatgtgag gaatctattt gaacatctgc aaggggttta aaaggcagga gattctttgc 2880 caccttgtga attggtctga ggtgagctga gggcactaac cttagacagg tgggtagcac 2940 tgtagctaaa gaggattaca ggagttcctg ttgtggctta gtggtaacaa atccaactag 3000 tatccatgag gattcaggtt cgatccctgg cctcgctcag tgggtcaggt atccggtgtt 3060 gctgtggctg tggtgtaggc tggcagcttc agctctgatt tgacccctag cctgggaact 3120 tccatgtgct gtaggtaagg cccttgaaaa aaaaaaaaaa agagatttac aaaataactc 3180 catcaaacac atacagctgt ttaagaatgt catccaggac agcatttggt taaaggctag 3240 atgaaaaaaa aaaaaaaatc ttagaatttt atttatttat tttttctttt tagggccaga 3300 cctgtggcct atggaaatgc ctgggctagg ggtggaatca gagctgccta caccacagcc 3360 atagccacgc cagatccaag ccccgtctgt gacctacacc acagctcatg gcaaacactg 3420 gatccttaat ccactgagtg aggccaggaa ttgaacccac attctcatgg atgctagttg 3480 ggttcttaag ccactgagcc acaagcttag aattttagag gtggaagaaa ctttaagagc 3540 tataataaag taatgatggt gatggtgatt ttgatgttag cggctactag ttattgagtg 3600 tttgcttgtg ccaggaactc cactgttcat tccctcctgt ttttaaaaca gccctggaag 3660 gtcagtgtta gtccacattt ctagatgagg aatactgagt ttccacaata ttaaatgtga 3720 acgttcaagg tcacattttt aggaagattt aggtccaggg ctgtctgact tgggtaacct 3780 gggtaaccct tcctttagtc aaggtttcca ttgttcaggc gatggacaag taggtgaaat 3840 gccttaacag tgaacttatg tctaacttct aattagaact cagatcttct gattcatcat 3900 ctggggctcc ttctggagct ggttgttcat gccaaatgct gcgaggggta cagtgtgcgc 3960 caaggagaat ccctaccctc aaggggttat gctgtagatg gagcaggcag aggtaccagc 4020 ttttgttccc tttagtgagg gttaatttcg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt 4080 cctg 4084 <210> 5 <211> 1864 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 catgcatcta gagccatgac cgtcgcgcgg ccgagcgtgc ccgcggcgct gcccctcctc 60 ggggagctgc cccggctgct gctgctggtg ctgttgtgcc tgccggccgt gtggggtgac 120 tgtggccttc ccccagatgt acctaatgcc cagccagctt tggaaggccg tacaagtttt 180 cccgaggata ctgtaataac gtacaaatgt gaagaaagct ttgtgaaaat tcctggcgag 240 aaggactcag tgatctgcct taagggcagt caatggtcag atattgaaga gttctgcaat 300 cgagctgcga ggtgccaaca aggctaaatt ctgcatccct caaacagcct tatatcactc 360 agaattattt tccagtcggt actgttgtgg aatatgagtg ccgtccaggt tacagaagag 420 aaccttctct atcaccaaaa ctaacttgcc ttcagaattt aaaatggtcc acagcagtcg 480 aattttgtaa aaagaaatca tgccctaatc cgggagaaat acgaaatggt cagattgatg 540 taccaggtgg catattattt ggtgcaacca tctccttctc atgtaacaca gggtacaaat 600 tatttggctc gacttctagt ttttgtctta tttcaggcag ctctgtccag tggagtgacc 660 cgttgccaga gtgcagagaa atttattgtc cagcaccacc acaaattgac aatggaataa 720 ttcaagggga acgtgaccat tatggatata gacagtctgt aacgtatgca tgtaataaag 780 gattcaccat gattggagag cactctattt attgtactgt gaataatgat gaaggagagt 840 ggagtggccc accacctgaa tgcagaggaa aatctctaac ttccaagtcc caccaacagt 900 tcagaaacct accacagtaa atgttccaac tacagaagtc tcaccaactt ctcagaaaac 960 caccacaaaa accaccacac caaatgctca agcaacacgg agtacacctg tttccaggac 1020 aaccaagcat tttcatgaaa caaccccaaa taaaggaagt ggaaccactt caggtactac 1080 ccgtcttcta tctggttctc gtcctgtcac ccaggctggt atgcggtggt gtgatcgtag 1140 ctcactgcag tctcgaactc ctgggttcaa gcgatccttc cacttcagcc tcccaagtag 1200 ctggtactac agggcacacg tgtttcacgt tgacaggttt gcttgggacg ctagtaacca 1260 tgggcttgct gacttaggaa ttcgcccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg 1320 aagccgcttg gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc 1380 gtcttttggc aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag 1440 gggtctttcc cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt 1500 tcctctggaa gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa 1560 ccccccacct ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc 1620 aaaggcggca caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg 1680 gctcacctca agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat 1740 gggatctgat ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa 1800 cgtctaggcc ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatct 1860 cgag 1864 <210> 6 <211> 1534 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 catggaagat acaaaggagt ctaacgtgaa gacattttgc tccaagaata tcctagccat 60 ccttggcttc tcctctatca tagctgtgat agctttgctt gctgtggggt tgacccagaa 120 caaagcattg ccagaaaacg ttaagtatgg gattgtgctg gatgcgggtt cttctcacac 180 aagtttatac atctataagt ggccagcaga aaaggagaat gacacaggcg tggtgcatca 240 agtagaagaa tgcagggtta aaggtcctgg aatctcaaaa tttgttcaga aagtaaatga 300 aataggcatt tacctgactg attgcatgga aagagctagg gaagtgattc caaggtccca 360 gcaccaagag acacccgttt acctgggagc cacggcaggc atgcggttgc tcaggatgga 420 aagtgaagag ttggcagaca gggttctgga tgtggtggag aggagcctca gcaactaccc 480 ctttgacttc cagggtgcca ggatcattac tggccaagag gaaggtgcct atggctggat 540 tactatcaac tatctgctgg gcaaattcag tcagaaaaca aggtggttca gcatagtccc 600 atatgaaacc aataatcagg aaacctttgg agctttggac cttgggggag cctctacaca 660 agtcactttt gtaccccaaa accagactat cgagtcccca gataatgctc tgcaatttcg 720 cctctatggc aaggactaca atgtctacac acatagcttc ttgtgctatg ggaaggatca 780 ggcactctgg cagaaactgg ccaaggacat tcaggttgca agtaatgaaa ttctcaggga 840 cccatgcttt catcctggat ataagaaggt agtgaacgta agtgaccttt acaagacccc 900 ctgcaccaag agatttgaga tgactcttcc attccagcag tttgaaatcc agggtattgg 960 aaactatcaa caatgccatc aaagcatcct ggagctcttc aacaccagtt actgccctta 1020 ctcccagtgt gccttcaatg ggattttctt gccaccactc cagggggatt ttggggcatt 1080 ttcagctttt tactttgtga tgaagttttt aaacttgaca tcagagaaag tctctcagga 1140 aaaggtgact gagatgatga aaaagttctg tgctcagcct tgggaggaga taaaaacatc 1200 ttacgctgga gtaaaggaga agtacctgag tgaatactgc ttttctggta cctacattct 1260 ctccctcctt ctgcaaggct atcatttcac agctgattcc tgggagcaca tccatttcat 1320 tggcaagatc cagggcagcg acgccggctg gactttgggc tacatgctga acctgaccaa 1380 catgatccca gctgagcaac cattgtccac acctctctcc cactccacct atgtcttcct 1440 catggttcta ttctccctgg tccttttcac agtggccatc ataggcttgc ttatctttca 1500 caagccttca tatttctgga aagatatggt atag 1534

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. (a) 서열번호 1 또는 2의 염기서열로 표시되는 sgRNA(small guide RNA)를 포함하는, 돼지 GGTA1(Alpha1,3-Galactosyltransferase) 유전자 넉아웃용 재조합 벡터; 및
    (b) 돼지 GGTA1 유전자의 인트론 3 또는 엑손 4의 일부 서열을 포함하고, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 레프트 암(left arm) 및
    돼지 GGTA1 유전자의 엑손 4 또는 인트론 4의 일부 서열을 포함하고, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 라이트 암(right arm)을 포함하고,
    서열번호 5의 염기서열로 표시되는 인간 CD55 유전자 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 인간 CD39 유전자가 삽입된 인간 세포 부착 분자 넉인용 재조합 벡터;가 도입된, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 제조용 형질전환 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 형질전환 세포는 수탁번호 KCLRF-BP-00411인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항의 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및
    상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법.
  12. 제11항의 방법으로 생산한 이종장기이식용 형질전환 복제돼지.
KR1020180075908A 2018-06-29 2018-06-29 돼지 ggta1 유전자가 결손되고, 인간 cd55 및 cd39 유전자가 발현되는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 KR102058015B1 (ko)

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