CN110177878B - 转基因动物和生物生产方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了包含锚定DNA序列的遗传修饰的非人哺乳动物，所述锚定DNA序列插入泌乳蛋白基因的内源基因座处，其中所述锚定DNA序列包含位点特异性重组酶识别位点。还提供了包含转基因的遗传修饰的非人哺乳动物，所述转基因插入泌乳蛋白基因的内源基因座处，其中所述转基因编码分泌性蛋白并且与所述泌乳蛋白基因的内源启动子可操作地连接，并且其中所述转基因侧接一对位点特异性重组酶重组后位点。所提供的遗传修饰的非人哺乳动物可用于从其所产生的乳中产生分泌性的重组蛋白，所述分泌性的重组蛋白由所述转基因编码。

Description

转基因动物和生物生产方法
对相关申请的引用
本申请要求2016年12月29日提交的美国临时专利申请62/439,896的优先权。其全部内容在此参考并入。
基金信息
本发明是在国立卫生研究院授予的基金号GM110822的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
发明领域
本发明主要涉及遗传修饰的非人哺乳动物。更具体地，本发明涉及遗传修饰的非人哺乳动物，其包含编码可经由乳汁(milk)分泌的蛋白质的基因，以及产生这种非人哺乳动物的方法。
背景技术
生物生产是生产基于生物制剂的治疗性药物，例如基于蛋白质的治疗剂如抗体和疫苗，其非常复杂以至于它们必须在生命系统中制得。已经采用了多种方法进行生物生产，包括微生物、动物细胞或植物细胞的培养，和从天然来源如血液和牛奶中纯化。通过转基因技术的组合，可以产生将靶蛋白分泌到乳中的转基因动物，然后从乳汁中纯化出靶蛋白(参见，例如，Gordon等人的美国专利7,045,676和7,939,317)。从乳汁中进行的生物生产的优势包括将单位成本降低5-50倍(使用动物乳时每种蛋白质每克为2-20美元，而使用细胞培养系统则为100美元)、技术要求低(同一个动物可以连续生产乳汁，而细胞培养需要不断地监测和取样)、复杂蛋白质的生产(动物自然携带生产复杂蛋白质所需的细胞机制，而这些复杂蛋白质即使有可能在细胞培养物中得到复制，那也是非常困难的)以及容易从乳汁中纯化出蛋白质(蛋白质能有效地从乳汁中通过，平均产率为53％，纯度为99％)。生物生产的市场近年来发展迅速。在欧盟和美国，被批准的转基因动物生物生产的实例包括在转基因山羊的乳汁中表达的Atryn(抗凝血酶，由LBF生产)(2006年在欧洲批准，2009年在美国批准)和在转基因兔的乳汁中表达的Ruconest(C1抑制剂，由Pharming Group生产)(2010年在欧洲批准，2016年在美国批准)。鉴于对治疗性蛋白质需求的增加以及市场占有率的竞争，需要改进生物生产的技术。
发明概述
在一个方面，本公开提供了遗传修饰的非人哺乳动物，其包含插入泌乳蛋白基因的内源基因座处的锚定DNA序列，其中所述锚序列包含第一位点特异性重组酶识别位点。在某些实施方案中，所述锚定DNA序列还包含第二位点特异性重组酶识别位点。在某些实施方案中，所述第一重组酶识别位点与所述第二重组酶识别位点相同。在某些实施方案中，所述第一重组酶识别位点不同于所述第二重组酶识别位点。在某些实施方案中，所述第一位点特异性重组酶识别位点或所述第二位点特异性重组酶识别位点被选自下组的位点特异性重组酶识别：Cre、Flp、λ整合酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶、Sin解离酶、Gin转化酶、Hin转化酶、Tn5044解离酶、IS607转座酶、Bxb1整合酶、wBeta整合酶、BL3整合酶、phiR4整合酶、A118整合酶、TG1整合酶、MR11整合酶、phi370整合酶、SPBc整合酶、TP901-1整合酶、phiRV整合酶、FC1整合酶、K38整合酶、phiBT1整合酶和phiC31整合酶。在某些实施方案中，所述第一或所述第二位点特异性重组酶识别位点为attP。在某些实施方案中，所述第一或所述第二位点特异性重组酶识别位点为attB。在某些实施方案中，所述第一位点特异性重组酶识别位点是phiC31-attP并且所述第二位点特异性重组酶识别位点是Bxb1-attP，或反之亦然。
在某些实施方案中，所述泌乳蛋白基因选自下组：αS1-酪蛋白(CSN1)、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白(CSN2)、κ-酪蛋白、乳清酸基因和α-乳清蛋白。在某些实施方案中，所述泌乳蛋白基因为β-酪蛋白。在某些实施方案中，所述锚定DNA序列插入β-酪蛋白内源基因座的内含子1中。
在某些实施方案中，所述锚定DNA序列还包含报告基因，所述报告基因与所述泌乳蛋白基因的内源启动子可操作地连接。在某些实施方案中，所述报告基因侧接所述第一和所述第二位点特异性重组酶识别位点。
在某些实施方案中，所述非人哺乳动物是啮齿动物，例如大鼠或小鼠，或兔形目动物，例如兔子、野兔或鼠兔。
在另一个方面，本公开提供了遗传修饰的非人哺乳动物。在某些实施方案中，所述遗传修饰的非人哺乳动物包含插入泌乳蛋白基因的内源基因座的转基因，其中所述转基因编码与信号肽融合的蛋白并且与所述泌乳蛋白基因的内源启动子可操作地连接，并且其中所述转基因侧接第一位点特异性重组酶重组后位点和第二位点特异性重组酶重组后位点。
在某些实施方案中，所述第一位点特异性重组酶重组后的位点是attR。在某些实施方案中，所述第二位点特异性重组酶重组后的位点是attL。在某些实施方案中，所述attR由attP×attB产生，并且所述attL由attB×attP产生。在某些实施方案中，所述attL由attP×attB产生，并且所述attR由attB×attP产生。
在某些实施方案中，所述转基因在其5'末端包含信号肽编码序列。在某些实施方案中，所述转基因在其3'末端包含polyA序列。在某些实施方案中，所述转基因在其3'末端不包含polyA序列。
在某些实施方案中，所述转基因编码选自下组的治疗性蛋白：抗原结合蛋白、抗体、疫苗、融合蛋白、酶和辅酶。在某些实施方案中，所述转基因是人FVII，或人FX，或人血管性血友病因子(Von Willebrand因子)，或人FVIII模拟物，或LL37，或阿达木单抗(修美乐Humira)。在某些实施方案中，所述转基因编码溶酶体蛋白，例如具有甘露糖-6磷酸(M6P)修饰的α-葡糖苷酶。在某些实施方案中，所述转基因可以编码多种多肽。编码所述多种多肽的序列可以是多顺反子的，其通过2A或IRES序列进行连接。
本文还提供了用于制备遗传修饰的非人哺乳动物的方法。在某些实施方案中，所述方法包括将锚定DNA序列插入胚胎中泌乳蛋白基因的内源基因座中，其中所述锚定DNA序列包含第一位点特异性重组酶识别位点；将所述胚胎转移至同一物种的雌性哺乳动物；并允许所述胚胎发育成动物。
在某些实施方案中，所述插入步骤包括向所述胚胎中引入基因编辑酶，所述基因编辑酶选自下组：ZFN、TALEN和CRISPR/Cas。在某些实施方案中，所述基因编辑酶是CRISPR/Cas并且所述插入步骤还包括向所述胚胎中引入针对所述内源基因座的靶序列而设计的sgRNA。在一个实施例中，所述sgRNA靶向以下序列：
GGATATCATGTTAGAGTGCCTGG(SEQ ID NO:1)。
在某些实施方案中，所述插入步骤包括用同源定向修复(HDR)增强子处理所述胚胎。在某些实施方案中，所述同源定向修复(HDR)增强子是RS-1。在某些实施方案中，用约7.5μM的RS-1对胚胎处理约20小时。
本文还提供了用于制备遗传修饰的非人哺乳动物的方法。在某些实施方案中，所述方法包括从非人哺乳动物获得胚胎，其中所述胚胎包含插入泌乳蛋白基因的内源基因座处的锚定DNA序列，其中所述锚定DNA序列包含由位点特异性重组酶识别的第一位点特异性重组酶识别位点；向所述胚胎中引入构建体和位点特异性重组酶，所述构建体包含编码蛋白质或肽的转基因和由所述位点特异性重组酶识别的第二位点特异性重组酶识别位点，其中所述位点特异性重组酶介导所述第一和所述第二位点特异性重组酶识别位点之间的重组，从而将所述转基因插入所述泌乳蛋白基因的内源基因座，其中所述转基因与所述泌乳蛋白基因的启动子可操作地连接；将携带所述转基因的所述胚胎转移到同一物种的雌性宿主哺乳动物中；以及允许所述胚胎发育成动物。
在某些实施方案中，非人哺乳动物能够产生由转基因编码的蛋白质并在乳汁中分泌所述蛋白质。
本文还提供了制备分泌性蛋白质的方法。在某些实施方案中，所述方法包括在本文提供的遗传修饰的非人哺乳动物、通过本文提供的方法产生的遗传修饰的非人哺乳动物、或所述非人哺乳动物的遗传修饰后代中诱导泌乳，其中所述后代的基因组包含所述基因修饰；从所述收集的乳中收集所述分泌性蛋白质。
附图简述
图1显示了兔CSN2(β-酪蛋白)基因(未按比例)的基因座的示意图，所述基因座由9个外显子(E1-E9)组成，第一个编码外显子是E2。还示出了CSN2(β-酪蛋白)基因中用于CRISPR/Cas9介导的基因靶向的sgRNA靶向序列。
图2示出了CRISPR/Cas9靶向β-酪蛋白基因的工作机制
图3示出了转基因动物生物生产的体外验证和体内生产过程的方案。
图4示出了基因靶向策略和用于对敲除和敲入事件进行基因分型的引物。引物组LF1/RR1用于确认敲除事件，以及用于体外检测假定的敲入事件。引物组LF1/LR1和RF1/RR1用于确认起始动物(founders)及其后代动物中的准确敲入事件。
图5示出了基因靶向性构建体，其具有位于锚定基因(例如，tdTomato)和整合酶识别位点phiC31 attP和Bxb1 attP侧翼的酪蛋白基因序列5'和3'臂。下栏显示了在内源兔β-酪蛋白基因座处敲入后的转基因。
图6示出了HDR增强子处理过的兔胚胎中Cas9或TALEN介导的HR效率的提升。SCR7、RS-1或RAD51 mRNA在改善兔Rosa26样基因座(RLL)处Cas9介导的HR效率上的效果。
图7示出了产药兔的乳汁中重组蛋白的高产率。在起始兔中，作为报告表达盒的重组tdTomato由内源β-酪蛋白启动子驱动。繁殖起始兔，产生杂合的MRP1.0-DSR雌性兔。并测定了该动物的乳汁中tdTomato的浓度。测得tdTomato的浓度为6.3g/L。纯合的MRP1.0-DSR雌性中tdTomato的浓度达到了12.5g/L。
图8示出了整合酶介导的LL37敲入胚胎的产生。
发明详述
我们已经开发出了几种用于生物生产的遗传修饰的非人哺乳动物。在一个方面，所述哺乳动物包含插入泌乳蛋白基因的内源基因座处的锚定DNA序列，其中所述锚定DNA序列包含位点特异性重组酶识别位点。所述哺乳动物可用作基因工程的起始动物，以将靶转基因引入所述泌乳蛋白基因的内源基因座。因此，在另一个方面，所述哺乳动物包含插入泌乳蛋白基因的内源基因座处的转基因，其中所述转基因编码分泌性蛋白并与所述泌乳蛋白基因的内源启动子可操作地连接，并且其中所述转基因侧接一对位点特异性重组酶重组后位点。所提供的遗传修饰的非人哺乳动物可用于从其产生的乳汁中产生分泌性的重组蛋白，所述分泌性的重组蛋白由所述转基因编码。以下讨论了本公开的这些方面和其他方面。
定义
应当理解，前面的一般性描述和以下的详细描述都只是示例性和说明性的，并不是对要求保护的本发明的限制。在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”的使用不是限制性的。此外，除非另有特别说明，否则诸如“元件”或“组件”的术语包括包含一个单元的元件和组件，以及包含一个以上子单元的元件和组件。另外，术语“部分”的使用可包括部分的部分或整个部分。
本文所用的术语“锚定基因”或“锚定DNA序列”是指这样的核苷酸序列：当被插入到动物基因组中时，其可用于促进目的转基因的插入。在某些实施方案中，锚定基因包含位点特异性重组酶识别位点。在某些实施方案中，锚定基因还可以包含报告基因。在某些实施方案中，可以通过同源重组将所述锚定基因引入所述基因组。
在将核酸序列插入细胞的语境中，术语“引入”表示“转染”、或“转化”、或“转导”，并且包括涉及将核酸序列掺入真核或原核细胞中，其中所述核酸序列可以瞬时存在于细胞中或者可以被掺入到细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子。可以使用本领域已知的任何方法将本公开所述载体引入细胞中。可以采用各种转化动物细胞的技术，包括例如：显微注射、逆转录病毒介导的基因转移、电穿孔、转染等(参见，例如，Keown et al.,Methods in Enzymology 1990,185:527-537)。在一个实施方案中，通过病毒将所述载体引入所述细胞。
本文所用的术语“非人哺乳动物”是指在任何发育阶段的除人以外的哺乳动物。在某些实施方案中，所述非人哺乳动物是啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪。在一些实施方案中，所述非人哺乳动物可以是转基因哺乳动物、基因改造的哺乳动物和/或克隆。在某些实施方案中，所述非人哺乳动物能高度有效地诱导泌乳动物(包括泌乳的家畜动物)乳腺复旧(involution)和停止产奶的过程。
术语“可操作地连接”是指元件的排列，其中将如此描述的组件配置为能够执行它们的通常功能。因此，与多肽可操作地连接的给定信号肽指导所述多肽从细胞分泌。对于启动子来说，与编码序列可操作地连接的启动子将指导所述编码序列的表达。所述启动子或其他控制元件不需要与所述编码序列邻接，只要它们起到指导其表达的作用即可。例如，插入的已转录但未翻译的序列可以存在于所述启动子序列和所述编码序列之间，并且所述启动子序列仍然可以被认为与所述编码序列“可操作地连接”。
本文所用的“启动子”是引导核酸转录的核酸控制序列的阵列。启动子包括转录起始位点附近的必需核酸序列，例如，在聚合酶II型启动子情况下的TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子或阻遏子元件，其可以位于距转录起始位点数千碱基对的位置。
术语“重组”是指在两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。“同源重组(HR)”是指例如在修复细胞中的双链断裂期间发生的特定形式的交换。重组利用核苷酸序列的同源性，例如使用“供体”分子来模板修复“靶”分子(即经历了双链断裂的分子)，并且由于它导致遗传信息从所述供体转移到所述靶标，因此被不同地称为“非交叉性的基因转换”或“短链基因转换”。
“泌乳蛋白基因”或“乳蛋白基因”是指编码酪蛋白(参见美国专利号5,304,489)、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白和乳清酸性蛋白的基因。在某些实施方案中，优选所述酪蛋白基因，例如，αS1-酪蛋白(CSN1)、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白(CSN2)或κ-酪蛋白。来自乳蛋白基因的转录启动子用于在乳腺中获得目的蛋白的表达。在某些实施方案中，所述锚定基因与乳蛋白基因的启动子可操作地连接，所述乳蛋白基因的启动子在所述乳蛋白基因的内源基因座处，或在基因组中除所述内源基因座之外的不同位点处，例如安全港基因座(如Hipp11(H11)基因座、ROSA26基因座、Rosa26样基因座(LLC)、HPRT、AAVS1或多重抗生素抗性(mar)基因座)。
本文所用的“可选择标志物”是指这样的基因：其在细胞中的表达使得所述细胞在特定培养条件下富集或消耗。可选择标志物可以是外来基因或非天然表达的细胞基因，或者是在靶细胞群中天然表达但处于不适当的表达水平的基因。
本文所用的“位点特异性重组酶”是指这样的酶家族：其介导由所述酶识别的特定DNA序列之间的位点特异性重组。位点特异性重组酶的例子包括，但不限于，Cre重组酶、Flp重组酶、λ整合酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶、Sin解离酶、Gin转化酶、Hin转化酶、Tn5044解离酶、Tn3转座酶、睡美人转座酶、IS607转座酶、Bxb1整合酶、wBeta整合酶、BL3整合酶、phiR4整合酶、A118整合酶、TG1整合酶、MR11整合酶、phi370整合酶、SPBc整合酶、SV1整合酶、TP901-1整合酶、phiRV整合酶、FC1整合酶、K38整合酶、phiBT1整合酶和phiC31整合酶。
在某些实施方案中，所述位点特异性重组酶是单向重组酶。本文所用的“单向重组酶”是指在重组发生后识别位点被破坏的重组酶。换句话说，当所述重组酶介导重组后，由所述重组酶识别的序列变为不被所述重组酶识别的序列，并且所述重组酶的持续存在不能逆转先前的重组事件。
在某些实施方案中，所述整合酶/位点特异性重组酶的表达可以通过将所述整合酶/重组酶基因插入细胞基因组中来实现，例如将含有整合酶/位点特异性重组酶基因的载体(包括启动子和其他表达元件)引入所述宿主细胞，使得整合酶/重组酶可以在所述细胞中表达。或者，所述整合酶/位点特异性重组酶的表达可以通过向所述细胞中引入所述整合酶/重组酶蛋白、mRNA或含有所述整合酶/重组酶基因的质粒来实现。
本文所用的术语“载体”是指被引入宿主细胞从而产生转化的宿主细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起始子。载体还可以包括一种或多种治疗性基因和/或可选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，从而使所述细胞表达非该细胞原生的核酸和/或蛋白质。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞的材料，例如病毒颗粒、脂质体、纳米颗粒、蛋白质涂层等。
DNA构建体和载体
在一个方面，本公开提供了DNA构建体或载体，例如，供体质粒或寡脱氧核糖核苷酸(ODN)，其包含锚定基因以便在动物基因组中进行基因整合。在某些实施方案中，所述锚定基因侧接泌乳蛋白基因序列(如β-酪蛋白(CSN2))的5'和3'同源臂。所述5'和3'同源臂可以，例如通过PCR从乳蛋白基因序列克隆得到，或基于插入位置通过DNA从头合成克隆得到。
在某些实施方案中，所述锚定基因包含单个位点特异性重组酶识别位点。在某些实施方案中，所述锚定基因包含两个位点特异性重组酶识别位点。所述两个位点特异性重组酶识别位点可以相同或不同。在某些实施方案中，所述锚定基因包含报告基因，所述报告基因侧接所述两个位点特异性重组酶识别位点，例如位于5'处的PhiC31 attP位点和3'处的Bxb attP位点以利于单向的转基因盒式交换。在某些实施方案中，所述重组位点选自由以下组成的组：野生型attB、野生型attP、其假性位点和其串联重复序列。
在某些实施方案中，所述锚定基因在所述第一attP位点之后还包含剪接受体(SA)信号以使所述报告基因经剪切而与乳蛋白mRNA的外显子1融合。这也会使所述内含子中的所述第一attP位点剪切出来并且不会在融合mRNA中。在某些实施方案中，所述报告基因在其5'处具有信号肽序列并且在其3'处具有polyA信号以产生由所述报告基因编码的分泌蛋白。在某些实施方案中，所述报告基因在其3'处不与polyA信号可操作地连接。
在某些实施方案中，所述载体还包含可选择标志物。本文所用的“可选择标志物”是指这样的基因：其在细胞中的表达可以使所述细胞在特定培养条件下富集或消耗。可选择标志物可以是外源基因或非天然表达的细胞基因，或者是在靶细胞群中天然表达但处于不适当表达水平的基因。
如果所述基因的表达可以使所述细胞在特定条件下富集，则所述可选择标志物是“阳性可选择标志物”。通常，阳性可选择标志物是编码抗生素抗性的基因，并且选择表达所述可选择标志物的细胞包括将抗生素引入培养物中。在使用中，所述抗生素的应用能选择性地杀死或消除不表达所述标志物的细胞，留下纯化或富集了表达所述抗生素抗性的细胞的细胞群。阳性可选择标志物的实例包括氨基糖苷磷酸转移酶(新霉素抗性基因)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(嘌呤霉素抗性基因)、潮霉素抗性基因和杀稻瘟素S脱氨酶(杀稻瘟素S抗性基因)。阳性可选择标志物的其他实例包括可用于通过细胞分选进行选择的基因，例如，荧光蛋白和细胞表面标志物。
相反，如果所述基因的表达可以使所述细胞在特定培养条件下耗尽，则所述可选择标志物是“阴性可选择标志物”。阴性可选择标志物的实例包括胸苷激酶基因。在使用中，更昔洛韦的应用能杀死具有胸苷激酶表达的细胞。阴性可选择标志物的其他实例包括DT毒素、细胞死亡基因如TRAIL、半胱天冬酶和BCL2家族基因。
初级转基因哺乳动物
在另一个方面，本公开提供了初级或亲本非人转基因哺乳动物，其在其种系中包含本文所述的锚定基因。在某些实施方案中，可通过将含有所述锚定基因的构建体引入多能细胞的基因组或非人哺乳动物胚胎中来产生所述非人转基因哺乳动物。在某些实施方案中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法将锚定基因引入动物。可以通过允许所引入的分子在其同源区域进行重组的任何方法将所需锚定基因的序列引入多能细胞，例如受精卵或胚胎干(ES)细胞。可以使用的技术包括，但不限于，磷酸钙/DNA共沉淀，将DNA显微注射到单细胞胚胎的原核或细胞质中，电穿孔，细菌原生质体与完整的细胞融合，转染，逆转录病毒感染，以及聚阳离子，(例如，聚凝胺，聚鸟氨酸等)，经由逆转录病毒介导将基因转移到种系中(Van der Putten et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:6148-6152(1985))，在胚胎干细胞中的基因靶向(Thompson et al.,Cell 56:313-321(1989))，胚胎电穿孔(Lo,Mol.Cell.Biol.3:1803-1814(1983))和精子介导的基因转移(Lavitrano et al.,Cell57:717-723(1989))。在某些实施方案中，所述DNA是单链或双链DNA，其为线性或环状(参见例如，美国专利号4,873,191；Geurts et al.,“Knockout Rats via EmbryoMicroinjection of Zinc-Finger Nucleases,”Science,第325卷,第433页(2009年7月24日)；Tesson et al.,“Knockout rats generated by embryo microinjection ofTALENs,”Nature Biotechnology,第29卷,第8期,第695-696页(2011年8月)；Hogan etal.,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory(1986)；Casas et al.(2004)Am J Pathol 165,1289-1300；Hogan et al.,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,second ed.,Cold SpringHarbor Laboratory(1994)；美国专利号5,602,299；5,175,384；6,066,778；4,873,191和6,037,521)。
标准的显微注射包括分离受精卵，使胚胎可视化，将DNA注射到原核或细胞质中，同时将所述卵保持在钝的固定移液管处(直径约50μm)，使用直径为约1.5μm的尖端移液管将基因修饰组分混合物注射进所述原核或细胞质中，所述混合物包括DNA、RNA、mRNA或蛋白质、或核糖核蛋白(RNP)、小分子、缓冲液等。
处于不同发育阶段的胚胎细胞(例如胚胎干(ES)细胞)也可用于引入用于产生转基因动物的基因。根据胚胎细胞的发育阶段，使用不同的方法。然后，被转染的胚胎细胞可以在被引入囊胚期胚胎的囊胚腔后定殖于胚胎，并有助于产生嵌合动物的种系(详见：Jaenisch,Science 240:1468-1474(1988))。在某些实施方案中，还可以将Cas9 mRNA和靶向乳蛋白基因(例如，β-酪蛋白(CSN2))的sgRNA与转基因构建体一起转染到上述胚胎细胞中，以使所述转基因位点特异性地插入所述乳蛋白基因的内源基因座。根据重组位点(例如，β-酪蛋白基因的内含子1或外显子2)设计sgRNA的序列。本领域技术人员应理解，除了CRISPR/Cas系统外，可以使用能促进敲入过程的其他系统，例如ZFN和TALEN。在某些实施方案中，将同源定向修复(HDR)增强子(例如RS-1)加入胚胎细胞以提升核酸酶介导的基因靶向系统(例如，CRISPR/Cas或TALEN)的敲入效率。
在将被转染的胚胎细胞引入囊胚之前，可以对所述被转染的胚胎细胞进行各种选择步骤以富集已经整合了敲入基因的胚胎细胞的比例(前提是敲入的基因能提供这种选择手段)。在某些实施方案中，所述供体质粒/ODN含有阴性选择标志物，例如白喉毒素A(DTA)或HSV-TK，以减少所述锚定基因的DNA片段的非特异性随机插入。或者，可用PCR来筛选已经整合了所述敲入的胚胎细胞。
其他多能细胞包括哺乳动物受精卵或干细胞，所述干细胞包括胚胎干细胞、胎儿干细胞、诱导的多能干细胞和成体干细胞。干细胞是能够经历细胞分裂周期同时保持未分化状态并且能够分化成特化细胞类型的细胞。干细胞可以是全能干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、寡能干细胞和单能干细胞，其中任何一种都可以从体细胞诱导出来。干细胞还可包括癌症干细胞。
哺乳动物细胞可以是家畜的细胞，例如牛、绵羊、山羊或猪的细胞。哺乳动物细胞也可以是啮齿动物细胞，例如小鼠、大鼠、仓鼠的细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞可以是兔形目动物细胞，例如兔细胞。哺乳动物细胞也可以是非人灵长类动物细胞，例如猿猴、猴子、猿和原猴的细胞。
然后将携带转基因的胚胎转移到相同物种的雌性宿主哺乳动物中，以使所述胚胎发育成动物。筛选并评估所得动物以选择在其基因组中具有转基因的动物。在其基因组中携带转基因的转基因动物可以用作初级动物，用于进一步用目的基因进行基因替换。
可以对转基因动物进行繁殖、近交、远交或杂交以产生具有转基因的动物。此类繁殖策略的实例包括但不限于：使具有一个以上整合位点的转基因动物繁殖以建立分离的品系；使分离的品系之间繁殖从而产生复合转基因动物，所述复合转基因动物由于每个转基因的加和表达的影响而使所述转基因更高水平表达；对杂合的转基因小鼠进行杂交以产生针对给定整合位点为纯合的动物，从而既增加表达又消除通过DNA分析筛选动物的需要；对分离的纯合品系进行杂交以产生复合杂合或纯合的品系；将动物与具有不同的遗传品系背景的动物一起繁殖，以检测修饰等位基因对转基因表达的影响以及表达的效果。
可以对在不同位点具有转基因的转基因动物进行杂交，以产生具有不同转基因的品系。例如，在β-酪蛋白的内源基因座上携带转基因的转基因动物可以与在αS1-酪蛋白(CSN1)的内源基因座上携带转基因的转基因动物一起繁殖，使得可以产生在β-酪蛋白和αS1-酪蛋白的内源基因座上都携带转基因的后代。
基因替换和产药哺乳动物
在又一个方面，本公开提供了用于生物生产目的的产药非人转基因哺乳动物，其在其种系中包含插入内源泌乳蛋白基因的靶转基因。在某些实施方案中，通过用所述靶转基因替换初级哺乳动物种系中的所述锚定基因来产生产药性转基因哺乳动物。在某些实施方案中，可以用目的转基因替换插入泌乳蛋白基因的内源基因座处的所述锚定基因，使得所述目的基因可以与所述泌乳蛋白基因的启动子可操作地连接。为了将所述目的转基因整合到所述锚定位点处，将靶向性的构建体引入细胞，例如初级动物的胚胎。当所述锚定基因包含一个或两个attP(或attB)位点时，所述靶向性构建体含有依序侧接一个或两个attB(或attP)位点的目的转基因。
在某些实施方案中，将位点特异性重组酶(例如丝氨酸整合酶)以质粒载体或mRNA或蛋白质的形式引入所述细胞中。所述丝氨酸整合酶介导attP和attB位点之间的重组。有一种可能性，所述重组发生在一个attP和一个attB位点之间。在这种情况下，将所述转基因插入一个锚定位点处。在第二种可能性中，所述重组发生在两对attP和attB位点之间，导致在所述两个attP(或attB)位点之间的序列与所述目的基因交换。在第三种可能性中，在两对attP和attB位点之间的重组导致所述两个attP(或attB)位点之间的序列与所述靶构建体的主干交换。
在某些实施方案中，所述靶向性构建体含有侧接两个不同attB(或attP)位点的所述目的转基因，每个位点由不同的位点特异性重组酶识别，并且所述锚定基因依序包含两个不同的attP(或attB)位点。将所述两种位点特异性重组酶引入所述细胞中，以介导重组。每个位点特异性重组酶介导一对attP和attB之间的重组。结果，通过重组，所述锚定基因以定向的方式被所述目的转基因替换，消除了所述靶向性构建体的主干插入所述靶基因座的可能性。
在所述泌乳蛋白基因的内源基因座处进行基因置换后，将胚胎转移到相同物种的受体雌性动物中以发育成动物。
在某些实施方案中，整合酶整合后的位点是由两个相应的整合酶特异性位点的重组产生的序列。例如，整合酶整合后的位点为attL或attR。attL和attR位点是attP和attB位点重组的结果。
在某些实施方案中，所述被替换的基因编码非天然多肽。在某些实施方案中，所述被替换的基因编码通常不分泌到乳汁中的重组蛋白。在某些实施方案中，所述被替换的基因编码治疗性蛋白，所述治疗性蛋白选自由以下组成的组：抗原结合蛋白、抗体、疫苗、融合蛋白、酶、辅酶、多顺反子和由2A或IRES序列连接的多个肽，或其同源物。所述治疗性蛋白的实例包括，但不限于，选自下组的蛋白质：LL37、α-1抗胰蛋白酶、血管抑制素、抗溶血因子、抗体、抗体片段、脱脂蛋白、载脂蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、gro-a、gro-b、gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎性蛋白-1α、单核细胞炎性蛋白-1β、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、T64262、CD40、CD40配体、c-kit配体、胶原、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、上皮中性粒细胞激活肽-78、MIP-16、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮中性粒细胞激活肽、红细胞生成素(EPO)、去角质毒素、凝血因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、血管性血友病因子(Von Willebrand因子)、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤连蛋白、四螺旋束蛋白、G-CSF、glp-1、GM-CSF、葡萄糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、grf、hedgehog蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(hGF)、水蛭素(hirudin)、人生长激素(hGH)、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、IGF-I、IGF-II、干扰素(IFN)、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、白细胞介素(IL)、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、神经秩蛋白(neurturin)、中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因产物、副肌萎缩素、甲状旁腺激素、PD-ECSF、PDGF、肽激素、多效营养因子、蛋白A、蛋白质G、pth、热原外毒素A、热原外毒素B、热原外毒素C、pyy、松弛素、肾素、SCF、小生物合成蛋白、可溶性补体受体1、可溶性I-CAM 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超级抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、类固醇激素受体、超氧化物歧化酶、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织型纤溶酶原激活物、肿瘤生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕激素受体、睾酮受体、醛固酮受体、LDL受体，以及皮质酮、溶酶体蛋白如可溶性酸水解酶(例如，糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、磷酸酶和硫酸酯酶)和如T.Braulke and J.S.Bonifacino,"Sorting of lysosomal proteins"Biochimica et Biophysica Acta,第1793卷,第4期,605–614页(2009年4月)中详细描述的溶酶体膜蛋白。
在获得携带有与乳腺中泌乳蛋白基因的内源启动子可操作地连接的转基因的遗传修饰的哺乳动物后，对雌性转基因哺乳动物或其具有修饰的基因组的后代进行泌乳诱导。经遗传修饰的哺乳动物可以在乳中产生分泌的重组蛋白，所述重组蛋白可以从所述乳中收集和纯化。
实施例
以下实施例被包括了进来以说明优选的实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了发明人发现的在实施方案的实践中能很好地起作用的技术，因此可被认为是构成针对其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多改变并仍然获得相同或相似的结果。
实施例1：用于CRISPR/Cas的sgRNA的设计
设计有效的sgRNA用于靶向兔CSN2(即β-酪蛋白)基因。兔CSN2(rbCSN2)基因位于第15号染色体上，由9个外显子组成。第一个编码外显子是外显子2。基因的组织如图1所示。
为了保留CSN2的内源性控制元件，从而实现转基因的高表达水平的目的，我们设计了靶向内含子1序列的sgRNA。有义链上的选自内含子1的特定序列如SEQ ID NO:2所示。
我们接下来将所选择的序列运用到在线CRISPR设计站点(crispr.mit.edu)。基于其预测的活性和安全性特征，选择了四种可能的向导序列。
实施例2：对sgRNA的体外验证
我们接下来进行了体外实验以验证设计的sgRNA的有效性。通过Surveyor测定测试了可能的向导序列的活性，并且最终基于其活性和安全性特征选择了3号gRNA(图2)。
整个过程和决策点示于图3中。将3号gRNA用于体内生产转基因动物。
表1.靶向兔β-酪蛋白的sgRNA
所有的动物饲养、护理和使用程序均经过了密歇根大学动物使用和护理大学委员会(UCUCA)的审查和批准。如前所述，从超排卵胚胎供体雌兔中收获了胚胎。在授精后19-21小时使用显微操纵器在配备有微分干涉差(DIC)装置的倒置显微镜下对胚胎进行了显微注射。使用含有100ng/μl Cas9 mRNA和6ng/μl sgRNA的混合物进行细胞质显微注射。对注射后的胚胎进行洗涤并在体外培养3-4天直至它们达到囊胚期。
将囊胚期的胚胎单独裂解并提取了基因组DNA。为了获得更好的PCR反应，使用Mini Kit(Qiagen，Germantown，MD)按照制造商的方案并稍作修改复制了全基因组。纯化了使用LF1/RR1引物组的PCR产物并测序以检测靠近sgRNA靶序列的插入缺失(indel)突变(图4)。在色谱曲线上，在靶向位点上的峰或接近靶向位点的峰表示插入缺失(indel)事件。使用了Mutation Surveyor(Softgenetics，State College，PA)分析测序结果。
表2.对sgRNA的体外验证
我们用靶向β-酪蛋白(rbCSN2)的3号sgRNA对总共102个原核期胚胎进行了显微注射(参见表2)。令人满意的是，经过PCR和测序的所有囊胚(n＝56)中有63％在被靶向的切割位点处或附近含有插入或缺失；36％(n＝12)含有双等位基因突变。这些结果证实3号sgRNA能有效地靶向rbCSN2。
由于αs1-酪蛋白(rbCSN1)代表了用于通过乳腺产生生物治疗剂的另一个潜在的敲入基因座，因此我们设计了靶向rbCSN1的sgRNA。实现了59％插入缺失(indel)和23％双等位基因突变率，再次证实了该sgRNA的高效率。
表3.靶向兔αs1-酪蛋白的sgRNA
实施例3：供体DNA的构建
本研究的目的是使现有的动物产药过程现代化。特别地，我们提出了产生这样的初级转基因兔：(i)通过利用内源性主要乳蛋白(例如β-酪蛋白，αs1-酪蛋白)表达元件，其可以产生>10g/L水平的药物蛋白质；(ii)利用预先放置的整合酶序列，可以以“盒交换方式”有效地(>40％)将其转化成表达另一种药物蛋白质产物。
针对这些特征，我们设计了供体DNA载体，如图5所示。所述转基因(即tdTomato)直接侧接PhiC31和Bxb1整合酶序列(例如，phiC31-attP和bxb1-attP)，继而侧接rbCSN2序列的同源臂。
所述转基因在β-酪蛋白启动子下表达。基于gRNA3的位置，通过对兔基因组DNA进行PCR克隆1.5kb的5'臂和3'臂。5'和3'臂之间的插入DNA片段包括以下组分：
i.位于5'处的PhC31 attP位点和3'处的Bxb1 attP位点，用于促进单向转基因替换。
ii.在第一个attP位点之后的剪接受体(SA)信号，用于使所述转基因经剪接与mRNA中的外显子1融合。这也会使所述第一个attP位点位于内含子中而不会在所述mRNA中。
iii.td-tomato报告基因，其在其5'处具有信号肽序列并且在其3'处具有polyA信号，用于产生分泌的td-tomato蛋白。
供体质粒还含有DTA可选择标志物，用于减少反式DNA片段的非特异性随机插入。
实施例4：兔胚胎中核酸酶介导的敲入效率的改善
实现所提出的目标的主要技术挑战是在兔中较低的敲入效率，即使使用CRISPR/Cas9也是如此。Cas9/TALEN/ZFN在靶位点裂解DNA后，两种主要的DNA修复机制为非同源末端连接(NHEJ)和同源定向修复(HDR)，其中NHEJ会导致以不可预测的插入缺失(indel)为特征的敲除(KO)而当共同引入供体模板载体时HDR倾向于敲入事件。为了测试抑制NHEJ或增强HDR是否会提升核酸酶介导的基因靶向系统中敲入事件的机会，我们进行了实验来检测有效的NHEJ抑制剂SCR7(Srivastava M et al.,Cell(2012)151(7):1474-87)和HDR增强剂RS-1，即，3-[(苄基氨基)磺酰基]-4-溴-N-(4-溴苯基)苯甲酰胺(Jayathilaka K et al.,Proc Natl Acad Sci USA(2008)105(41):15848-53)在提高兔胚胎中Cas9或TALEN介导的HDR效率方面的效应。
我们首先在兔基因组中ROSA26样基因座(RLL)处测试了SCR7和RS-1对Cas9介导的HDR的效应(图6)。将供体模板DNA与Cas9 mRNA和针对RLL基因座的sgRNA共同显微注射。注射后，在一系列浓度的SCR7(0μM(对照),20μM,40μM和80μM)或RS-1(0μM(对照),7.5μM和15μM)中将胚胎处理20小时。在这些条件下用SCR7处理胚胎对总的敲入效率没有显著影响(对照组为7.1％，治疗组为7.7-9.4％)。令人惊讶的是，用7.5μM的RS-1处理胚胎导致了26.1％(46个中有12个)的敲入率，显著高于对照(4.8％)和15μM时(5.4％)的敲入率。有趣的是，显微注射RAD51 mRNA能模拟RS-1的有益效应，从而进一步证实RAD51是RS-1改善核酸酶介导的HDR效率的靶标。
实施例5：对β-酪蛋白基因座的体外敲入效率
在确认了sgRNA的体外功效(实施例2)以及提高了敲入效率(实施例4)后，我们评估了产生td-Tomato敲入胚胎的效率。使用含有100ng/μl供体DNA、100ng/μl Cas9mRNA和6ng/μl sgRNA的混合物进行细胞质显微注射。随后将胚胎培养至囊胚期，提取基因组DNA，并使用图4中所描述的引物组对其进行PCR。将针对两个引物组(LF1/LR1和RF1/RR1)都含有期望的条带大小的阳性胚胎认为是推定的敲入胚胎。
与实施例4中呈现的数据一致的是，施加7.5μM的RS-1显著地提升了敲入率(从8.3％提升至28.9％)(P<0.05)(参见表4)。
表4.兔胚胎中的敲入率。
被注射的胚胎 囊胚(％) 测序的 推定的敲入 ％敲入
对照 60 24 24 2 8.3
RS-1 135 69 69 20 28.9
实施例6：胚胎转移结果
在按照实施例5的描述体外验证了敲入率后，进行了胚胎转移步骤，其目的是产生敲入的起始(founder)兔。
在显微注射后，在RS-1处理下将胚胎培养过夜(20小时)，然后通过外科手术将其转移到已同步的接受者母体的输卵管中。将大约15到20个胚胎转移到一个接受者母体上。结果总结在下表5中。简而言之，我们将45个胚胎转移到了3个受体中。所述三个受体中有两个怀孕且总共产生了9个幼体。在这些幼体中，发现有两个具有转基因的敲入。
表5.含有锚定转基因的起始兔的产生
如表6所示，繁殖敲入幼体以产生具有纯合敲入的后代。
表6.初级兔的种系传播和群体建立
世代 出生的幼体数 杂合的敲入幼体数 纯合的敲入幼体数
F1 8 2 0
F2 7 23 3
实施例7.在初级转基因动物中生产重组蛋白
然后我们测量了初级兔的乳中重组的tdTomato(作为报告分子)的产量。在初级兔中，重组的tdTomato表达盒由内源性β-酪蛋白启动子驱动。在我们培育了雌性杂合的MRP1.0-DSR兔后，我们能够确定该动物的乳中tdTomato的浓度。与来自WT雌性的乳汁不同，通过肉眼观察到从MRP1.0-DSR雌性收集的乳汁呈鲜红色。我们计算得出tdTomato的浓度为6.3g/L。之后，我们测得纯合的MRP1.0-DSR雌性中tdTomato的浓度为12.5g/L。
实施例8.整合酶介导的敲入胚胎的产生
我们接下来使用了初级兔来产生具有靶转基因的敲入胚胎。图8示出了整合酶介导的LL37敲入的方案。如图8所示，为了产生具有靶转基因(如LL37)的敲入胚胎，将供体构建体导入到初级兔的胚胎中，所述供体构建体包含侧接重组酶识别位点(PhiC31-attB和Bxb1-attB)的靶转基因。还向所述胚胎中引入了整合酶，例如PhiC31和Bxb1，其介导所述重组酶识别位点之间的重组。结果，tdTomato基因被所述靶转基因取代，产生了新的产药兔。
整合酶介导的敲入胚胎产生的结果示于表7和8中。
表7.整合酶介导的LL37敲入胚胎的产生
胚胎基因型 注射的胚胎 测序的胚胎 LL37敲入的胚胎(％)
初级兔(杂合) 9 9 1(11)
WT 12 11 0(0)
表8.整合酶介导的rhRVIIa敲入胚胎的产生
胚胎基因型 注射的胚胎 测序的胚胎 FVIIa敲入的胚胎(％)
初级兔(杂合) 17 16 3(18)
WT 14 14 0(0)

Claims (13)

1.一种制备遗传修饰的兔的方法，包括
通过向兔胚胎中引入CRISPR/Cas蛋白和sgRNA将锚定DNA序列插入所述兔胚胎中内源β-酪蛋白基因的内含子1中，其中所述锚定DNA序列包含第一位点特异性重组酶识别位点，所述sgRNA靶向以下序列：
GGATATCATGTTAGAGTGCCTGG；
将所述兔胚胎转移到雌兔中；和
允许所述兔胚胎发育成携带有所述锚定DNA序列的兔。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入步骤包括用同源定向修复(HDR)增强子RS-1处理所述兔胚胎。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一位点特异性重组酶识别位点被位点特异性重组酶识别，所述位点特异性重组酶选自由以下组成的组：
Cre、Flp、λ整合酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶的、Sin解离酶、Gin转化酶、Hin转化酶、Tn5044解离酶、IS607转座酶、Bxb1、wBeta、BL3、phiR4、A118、TG1、MR11、phi370、SPBc、TP901-1、phiRV、FC1、K38、phiBT1和phiC31。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述锚定DNA序列还包含报告基因，所述报告基因与所述β-酪蛋白基因的内源启动子可操作地连接。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述锚定DNA序列还包含第二位点特异性重组酶识别位点，其中所述报告基因侧接所述第一位点特异性重组酶识别位点和所述第二位点特异性重组酶识别位点。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述第一位点特异性重组酶识别位点为phiC31-attP，且所述第二位点特异性重组酶识别位点为Bxb1-attP，或反之亦然。
7.根据权利要求1所述的方法，进一步包括
获得源自携带有所述锚定DNA序列的兔或其后代的胚胎，其中所述胚胎包含插入到内源β-酪蛋白基因的内含子1中的所述锚定DNA序列；
将以下物质引入所述胚胎中
构建体，其包含编码分泌性蛋白的转基因和由所述位点特异性重组酶识别的第二位点特异性重组酶识别位点，和
所述位点特异性重组酶，
其中所述位点特异性重组酶介导所述第一位点特异性重组酶识别位点和所述第二位点特异性重组酶识别位点之间的重组，从而将所述转基因插入所述内源β-酪蛋白内源基因的内含子1中，其中所述转基因与β-酪蛋白基因的启动子可操作地连接；
将携带有所述转基因的胚胎转移到雌性兔中；和
允许所述胚胎发育成携带有所述转基因的兔。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述转基因在其5'末端包含信号肽编码序列。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述转基因在其3'末端包含polyA序列。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述转基因编码治疗性蛋白，所述治疗性蛋白选自由以下组成的组：抗原结合蛋白、疫苗、融合蛋白、酶、辅酶、凝血因子和溶酶体蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗原结合蛋白是抗体。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述转基因是人FVII或LL37。
13.根据权利要求7所述的方法，进一步包括
从携带有所述转基因的兔或其后代中收集乳汁；和
从收集的所述乳汁中收集所述分泌性蛋白。
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