CN114231533A

CN114231533A - 一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法

Info

Publication number: CN114231533A
Application number: CN202210168461.4A
Authority: CN
Inventors: 秦川; 卢天宇; 邓守龙; 杨博超; 于佳楠; 王若琳; 徐亚新
Original assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Current assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Priority date: 2022-02-24
Filing date: 2022-02-24
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2042-02-24
Also published as: CN114231533B

Abstract

本发明公开了一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法，本发明通过定点基因重组的方式，将人源补体调节蛋白基因插入到猪ROSA26基因位点，从而构建得到组成型表达人补体调节蛋白的小型猪，构建得到的小型猪不仅避免了外源随机插入造成的遗传背景不清晰和后代繁育过程中因为染色体的分离而造成的表达量不稳定，而且为今后异种移植和免疫相关疾病的研究提供了重要动物资源，具有重要的临床应用价值。

Description

一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地，本发明涉及一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法。

背景技术

对于器官功能衰竭的患者，可以通过人工机械装置、干细胞器官再生或器官移植来挽救生命。但是人工机械装置的精密度不高，无法比拟器官的优良性能，胚胎干细胞定向诱导发育为器官的研究，尚未获得突破，所以目前器官移植仍然是治疗器官衰竭病人的优良手段。随着医疗技术的发展，器官移植成为了治疗终末期器官衰竭的有效方法，在临床上得到了广泛应用，但是供体器官短缺的问题也逐渐凸显了出来。据美国器官获取和移植网2018年5月公布的数据显示，器官供求比率不到5%，器官短缺正成为限制器官移植广泛开展的主要障碍。近年来，随着我国糖尿病、慢性肾病、心血管疾病以及肝炎等疾病患者的大幅增长，使得发展成为终末期肝、肾、心等器官衰竭的患者正在逐渐增加，对器官移植需求的压力也将越来越大。器官短缺已成为一个全球性问题，而异种器官移植是目前公认的解决人类器官供体严重不足的有效途径。

异种器官移植是指通过手术的方法将一个物种的器官或组织移植到另一个物种体内，代替原来器官或组织继续发挥功能。目前，异种器官移植研究主要是以猪为供体来源的。相比于其他动物，猪作为异种器官移植的供体有许多优势：猪的生理学、解剖学结构、代谢过程都与人类相似；猪来源广、产仔多、繁殖周期短、生长周期长；猪的器官易获取、无需等待；猪的遗传背景研究清楚，便于进行基因修饰。猪虽然是异种器官移植的优良供体，但从猪到灵长类的异种器官移植中，会发生免疫排斥反应，这也是异种器官移植研究中亟待解决的重要难题之一。敲除α-1,3半乳糖苷转移酶基因（α-1,3-galactosyltransferaseknockout，GTKO）供体猪的制备，虽然在一定程度上解决了异种器官移植超急性免疫排斥反应，但补体介导的排斥反应，仍是机体排斥外源移植物的主要方式之一。高效表达人补体调节蛋白（Human complement regulatory protein，hCRP）基因hCD46、hCD55、hCD59等，能有效地降低异种器官移植的免疫排斥反应。因此，得到高效、稳定、表达不同组合的人补体蛋白的基因编辑猪模型，是进行异种移植和其他免疫相关疾病研究重大而急迫的需求，但是如何制备得到该系列基因编辑猪仍是本领域亟待解决的重要问题之一。

发明内容

鉴于此，为了克服目前本领域存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法，本发明通过定点基因重组的方式，将hCRP基因插入到猪ROSA26基因位点，从而获得的转人源补体调节蛋白基因定点修饰的小型猪，该小型猪可以组成型表达人补体调节蛋白。本发明为今后在猪Rosa26点进行有效编辑提供了有效的gRNA位点，所获得的表达人源补体调节蛋白的动物避免了外源随机插入造成的遗传背景不清晰和后代繁育过程中因为染色体的分离而造成的表达量不稳定，为今后异种移植和免疫相关疾病的研究提供了重要动物资源，具有重要的临床应用价值。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种用于有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA。

进一步，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明的第二方面提供了一种靶向猪Rosa26基因内含子1的CRISPR/Cas9系统表达载体。

进一步，所述表达载体由本发明第一方面所述的sgRNA和骨架载体px330构成。

在本发明的具体实施例中，所述表达载体的具体构建过程如下：选择px330作为骨架载体，所述px330为能够携带CRISPR/Cas9的pX330载体，使用限制性内切酶BbsI对px330进行酶切，37℃水浴4 h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收、纯化。为了将本发明第一方面所述的sgRNA连接进入px330，需要在gRNA序列补上BbsI酶切位点的粘性末端。将带有BbsI酶切位点粘性末端的gRNA以及互补序列以引物形式合成。合成的核苷酸进行退火。退火程序为：97℃，7 min；自然冷却至室温。回收纯化后的px330的线性骨架与退火双链gRNA序列连接，16℃，3 h。连接产物转化Top 10感受态细胞，37℃培养箱培养，待其长出单克隆菌落后，挑取测序正确的阳性单克隆菌落，将其加入15 mL的氨苄抗性LB培养基中，37℃，220 rpm培养12 h构建得到靶向猪Rosa26基因内含子1的CRISPR/Cas9系统表达载体px330-pRosa26-gRNA。

本发明的第三方面提供了一种表达人源补体调节蛋白同源重组供体载体。

进一步，所述同源重组供体载体包含5’端同源臂（5’HA）、EF1α启动子、人源补体调节蛋白基因（hCRP）、CMV启动子转录表达的新霉素抗性基因（PKG-Neo）、3’端同源臂（3’HA）和/或2A短肽；

所述人源补体调节蛋白基因包括hCD46、hCD55和/或hCD59；

所述2A短肽依次串联hCD46、hCD55和/或hCD59；

所述2A短肽包括T2A短肽和/或p2A短肽。

进一步，所述同源重组供体载体包括表达hCD46的同源重组供体载体、同时表达hCD55和hCD59的同源重组供体载体、同时表达hCD46、hCD55和hCD59的同源重组供体载体；

所述表达hCD46的同源重组供体载体由5’HA、EF1α、hCD46、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；

所述同时表达hCD55和hCD59的同源重组供体载体由5’HA、EF1α、hCD55、p2A、hCD59、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；

所述同时表达hCD46、hCD55和hCD59的同源重组供体载体由5’HA、EF1α、hCD46、T2A、hCD55、p2A、hCD59、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；

所述5’HA的序列如SEQ ID NO:8所示；

所述EF1α的序列如SEQ ID NO:9所示；

所述hCD46的序列如SEQ ID NO:10所示；

所述T2A的序列如SEQ ID NO:11所示；

所述hCD55的序列如SEQ ID NO:12所示；

所述p2A的序列如SEQ ID NO:13所示；

所述hCD59的序列如SEQ ID NO:14所示；

所述PKG-Neo的序列如SEQ ID NO:15所示；

所述3’HA的序列如SEQ ID NO:16所示。

本发明的第四方面提供了一种用于在Rosa26位点定点敲入人源补体调节基因的CRISPR/Cas9系统。

进一步，所述CRISPR/Cas9系统包含本发明第二方面所述的表达载体、本发明第三方面所述的同源重组供体载体。

本发明的第五方面提供了一种表达人源补体调节蛋白小型猪的构建方法。

进一步，所述方法包括如下步骤：

(1) 构建靶向猪Rosa26基因内含子1的CRISPR/Cas9系统表达载体px330-pRosa26-gRNA；

(2) 构建表达人源补体调节蛋白同源重组供体载体pGSI-Rosa26-hCRP-KI；

(3) 将步骤(1)中所述的表达载体px330-pRosa26-gRNA与步骤(2)中所述的同源重组供体载体pGSI-Rosa26-hCRP-KI共转染小型猪胎儿成纤维细胞；

(4) 将经转染筛选获得的精确插入外源基因的阳性单克隆细胞作为核供体进行体细胞核移植，培育得到重组胚胎，将重组胚胎移植入代孕母猪，妊娠后产仔获得表达人源补体调节蛋白的小型猪。

步骤(1)中所述表达载体px330-pRosa26-gRNA的构建包括如下步骤：

1) 使用限制性内切酶BbsI酶切CRISPR/Cas9载体px330，得到线性化表达载体px330；

2) 将本发明第一方面所述的sgRNA与酶切后的线性化表达载体px330连接，得到靶向猪Rosa26基因内含子1的CRISPR/Cas9系统表达载体px330-pRosa26-gRNA；

步骤(2)中所述同源重组供体载体pGSI-Rosa26-hCRP-KI包括表达hCD46的pGSI-Rosa26-hCD46-KI、同时表达hCD55和hCD59的pGSI-Rosa26-hCD55-59-KI、同时表达hCD46、hCD55和hCD59的pGSI-Rosa26-hCD46-55-59-KI；

所述表达hCD46的pGSI-Rosa26-hCD46-KI由5’HA、EF1α、hCD46、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；

所述同时表达hCD55和hCD59的pGSI-Rosa26-hCD55-59-KI由5’HA、EF1α、hCD55、p2A、hCD59、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；

所述同时表达hCD46、hCD55和hCD59的pGSI-Rosa26-hCD46-55-59-KI由5’HA、EF1α、hCD46、T2A、hCD55、p2A、hCD59、PKG-Neo、3’HA依次克隆在pGSI骨架载体得到；

所述5’HA的序列如SEQ ID NO:8所示；

所述EF1α的序列如SEQ ID NO:9所示；

所述hCD46的序列如SEQ ID NO:10所示；

所述T2A的序列如SEQ ID NO:11所示；

所述hCD55的序列如SEQ ID NO:12所示；

所述p2A的序列如SEQ ID NO:13所示；

所述hCD59的序列如SEQ ID NO:14所示；

所述PKG-Neo的序列如SEQ ID NO:15所示；

所述3’HA的序列如SEQ ID NO:16所示；

步骤(3)中所述的表达载体px330-pRosa26-gRNA的用量为4 µg，所述的同源重组供体载体pGSI-Rosa26-hCRP-KI的用量为6 µg，所述的小型猪为巴马小型猪。

本发明的第六方面提供了一种表达人源补体调节蛋白的小型猪。

进一步，所述表达人源补体调节蛋白的小型猪为采用本发明第五方面所述的方法构建得到。

本发明的第七方面提供了一种源自本发明第六方面所述的表达人源补体调节蛋白的小型猪的生物材料。

进一步，所述生物材料包括器官或组织；

所述器官包括心脏、脾脏、肺、肾脏、肝脏；

所述组织包括上皮组织、结缔组织、肌组织或神经组织。

进一步，所述上皮组织包括感觉上皮、腺上皮、被覆上皮中的至少一种；

优选地，所述被覆上皮包括复层上皮或单层上皮；

更优选地，所述复层上皮包括复层扁平（鳞状）上皮、移行上皮；

更优选地，所述单层上皮包括单层扁平（鳞状）上皮、里、单层柱状上皮（有的有纤毛）、假复层柱状上皮（有的有纤毛）。

进一步，所述结缔组织包括血液、骨组织、软骨组织、固有结缔组织；

优选地，所述固有结缔组织包括脂肪组织、网状组织、致密结缔组织或疏松结缔组织。

进一步，所述肌组织包括平滑肌、心肌或骨骼肌。

进一步，所述神经组织包括周围神经系统或中枢神经系统。

进一步，本发明中所述的源自本发明第六方面所述的表达人源补体调节蛋白的小型猪的器官包括但不限于心脏、脾脏、肺、肾脏、肝脏，所述器官包括骨骼系统、肌肉系统、消化系统、韧带系统、呼吸系统、泌尿系统、内分泌腺、循环系统、神经系统、感觉器官、皮肤系统中的至少一种。

本发明的第八方面提供了如下任一方面的应用：

(1) 本发明第一方面所述的sgRNA在特异识别和靶向编辑猪ROSA26基因中的应用；

(2) 本发明第一方面所述的sgRNA在制备ROSA26基因定点整合转基因猪中的应用；

(3) 本发明第一方面所述的sgRNA在制备表达人源补体调节蛋白的小型猪中的应用；

(4) 本发明第二方面所述的表达载体在制备表达人源补体调节蛋白的小型猪中的应用；

(5) 本发明第三方面所述的同源重组供体载体在制备表达人源补体调节蛋白的小型猪中的应用；

(6) 本发明第四方面所述的CRISPR/Cas9系统在制备表达人源补体调节蛋白的小型猪中的应用；

(7) 本发明第六方面所述的表达人源补体调节蛋白的小型猪在异种器官移植中的应用；

(8) 本发明第六方面所述的表达人源补体调节蛋白的小型猪在作为异种器官移植供体猪中的应用；

(9) 本发明第七方面所述的生物材料在制备异种器官移植材料中的应用；

(10) 本发明第六方面所述的表达人源补体调节蛋白的小型猪在神经退行性疾病研究中的应用；

优选地，所述表达人源补体调节蛋白的小型猪包括表达hCD46、hCD55和/或hCD59的小型猪；

更优选地，所述表达人源补体调节蛋白的小型猪包括表达hCD46的小型猪、表达hCD55和hCD59的小型猪、表达hCD46、hCD55和hCD59的小型猪。

为了更好地理解本发明，对本发明中涉及到的术语进行如下解释：

本文中使用的术语“供体”，是指包括任何非人动物，其可以充当用于异种移植的供体器官、组织或细胞的来源。供体可以处于任何发育阶段，包括但不限于胎儿、新生儿、幼体和成体。

本文中使用的术语“基因编辑”，是指使用基因编辑工具插入、置换或自基因组中去除DNA的基因工程类型。基因编辑工具的示例包括但不限于锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）以及成簇规律间隔短回文重复系统（CRISPR）。其中，ZFNs是一个经过人工修饰的核酸酶，它通过将一个锌指DNA结合结构域与核酸酶的一个DNA切割结构域融合而产生，通过设计锌指结构域就可以实现对目的基因的特定DNA序列的靶向切割，这也使得锌指核酸酶能够定位于复杂基因组内的独特的靶向序，通过利用内源DNA修复机制，锌指核酸酶可用于精确修饰高等生物的基因组；TALEN是经过基因工程改造后的可以切割特定DNA序列的限制酶，TALEN是通过将一个TAL效应子DNA结合结构域与核酸酶的一个DNA切割结构域融合而获得的，TALENs可以被设计成与几乎任何所需的DNA序列结合，因此当与核酸酶结合时，DNA可以在特定位置进行切割；CRISPR-Cas是原核生物免疫系统，赋予原核生物对如存在于质粒和噬菌体中的外来遗传物质的抗性，是一种获得性免疫系统，携带间隔序列的RNA有助于Cas（CRISPR相关）蛋白识别并切割外源致病DNA，其它RNA指导的Cas蛋白切割外源RNA。

本文中使用的术语“基因敲入”，是指是使用不同DNA序列置换染色体基因座中编码的遗传信息而产生的遗传修饰，即利用基因同源重组，将外源有功能基因（基因组原先不存在、或已失活的基因），转入细胞与基因组中的同源序列进行同源重组，插入到基因组中，在细胞内获得表达的技术。

本文中使用的术语“人源化”，是指这样的核酸或蛋白质，即，其结构（即核苷酸或氨基酸序列）包含与在非人动物中天然存在的特定基因或蛋白质的结构基本或相同对应的部分，还包含不同于在相关特定非人基因或蛋白质中存在的而与相应的人基因或蛋白质中存在的相当结构较近似地对应的部分。在一些实施方案中，“人源化”基因是编码基本上具有人多肽的氨基酸序列的多肽的基因（例如，人蛋白质或其特征性部分）。

本文中使用的术语“转染”，同“转化”或“转导”，是指外源性核酸被转移或引入宿主细胞的过程。“转染”或“转化”或“转导”细胞是被使用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括受试者原代细胞及其子代。

本文中使用的术语“体细胞核移植”，是指含有转基因的动物细胞例如猪细胞可以用作供体细胞，以提供核用于核转移到去核卵母细胞内，以产生克隆的转基因动物。

本文中使用的术语“载体”，是指能够将多核苷酸转移至宿主细胞的部分。载体包括但不限于单链、双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离端、无游离端（例如环状）的核酸分子；包含DNA、RNA或二者的核酸分子；本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，是指环状双链DNA环，其中可以通过例如标准分子克隆技术插入另外的DNA片段。另一种类型的载体是病毒载体，其中载体中存在病毒衍生的DNA或RNA序列用于包装进病毒（例如，逆转录病毒、复制缺陷逆转录病毒、腺病毒、复制缺陷腺病毒以及腺病毒相关病毒）。病毒载体还包含由病毒携带的用于转染至宿主细胞中的多核苷酸。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其他载体（例如非附加型哺乳动物载体）当引入宿主细胞时被整合至宿主细胞基因组中，由此与宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够指导其操作性连接的基因的表达。本文中这样的载体被称为“表达载体”。重组DNA技术中具有实用性的常用表达载体通常为质粒形式。重组表达载体可以包含适于宿主细胞中核酸表达的形式的本发明的核酸。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

本发明首次公开了一种能够用于有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA，并且提供一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法，本发明通过定点基因重组的方式，将hCRP基因插入到猪ROSA26基因位点，从而获得的转人源补体调节蛋白基因定点修饰的小型猪，可以组成型表达人源补体调节蛋白。本发明所获得的表达人源补体调节蛋白的动物避免了外源随机插入造成的遗传背景不清晰和后代繁育过程中因为染色体的分离而造成的表达量不稳定，为今后异种移植提供了供体动物资源，具有重要的临床应用价值，同时也为开发适合不同细胞、组织、器官的异种移植供体猪的研究奠定了基础，对开发真正有效的适合各种细胞、组织、器官异种移植的供体猪具有重大的意义，促进了异种器官移植的研发进程。

附图说明

图1为猪ROSA26位点gRNA的切割效率在PEF中的检测结果图，其中，M：DL2000 DNAMarker，1：pRosa26-gRNA-1，2：pRosa26-gRNA-2，3：pRosa26-gRNA-3，4：pRosa26-gRNA-4，5：pRosa26-gRNA-5，6：pRosa26-gRNA-6，NC：阴性对照，仅转染px330质粒；

图2为pRosa26-4gRNA位点Sanger测序结果峰图，其中，灰色区域为pRosa26-4gRNA靶位点，箭头处为CRISPR/Cas9切割位点；

图3为表达人源补体调节蛋白hCRP（hCD46、hCD55和/或CD59）的同源重组打靶策略示意图，其中，A图：CRISPR/Cas9介导hCRP定点整合到pRosa26位点示意图，HA代表同源重组臂，E1和E2代表pRosa26位点外显子1和外显子2，B图：定点整合修饰后Rosa26位点基因型鉴定序列示意图；

图4为hCRP基因敲入单克隆细胞基因型鉴定结果图，其中，A图：hCD46基因敲入单克隆细胞系基因型鉴定结果，B图：hCD55-hCD59基因敲入单克隆细胞系基因型鉴定结果，C图：hCD46-hCD55-hCD59基因敲入单克隆细胞系基因型鉴定结果；

图5为hCD46基因敲入F0代克隆猪鉴定结果图，其中，A图：新生仔猪基因型鉴定结果图；B图：qPCR检测新生死亡仔猪各组织hCD46 mRNA转录本（n=3）结果图，C图：Westernblot检测新生死亡仔猪组织人源CD46蛋白表达结果图，D图：免疫组织化学检测新生死亡仔猪组织人源CD46蛋白表达结果图；

图6为hCD55-CD59基因敲入F0代克隆猪鉴定结果图，其中，A图：新生仔猪基因型鉴定结果图，B图：RT-PCR检测新生死亡仔猪组织hCD55-CD59 mRNA转录本结果图，C图：Western blot检测新生死亡仔猪组织人源CD55和CD59蛋白表达结果图，D图：免疫组织化学检测新生死亡仔猪组织人源CD55和CD59蛋白表达结果图；

图7为hCD46-CD55-CD59基因敲入F0代克隆猪鉴定结果图，其中，A图：新生仔猪基因型鉴定结果图，B图：新生死亡仔猪组织hCD46 mRNA转录本检测（n=2）检测结果图，C图：Western blot检测新生死亡仔猪组织人源或CD46、CD55和CD59蛋白表达结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 猪Rosa26位点CRISPR/Cas9 gRNA筛选以及同源重组供体载体构建

1、猪Rosa26位点CRISPR/Cas9表达载体的构建以及gRNA的筛选

猪Rosa26位点位于13号染色体上，根据Ensemble和UCSC数据库中的基因组序列信息，获Rosa26基因组序列信息。根据CRISPR/Cas9的作用机制，通过在线设计网站设计靶向猪Rosa26位点内含子1的gRNA候选位点共6个，6个引导RNA（Guide RNA，gRNA）的序列如表1所示。

表1 pRosa26 gRNA候选位点序列

选择px330作为骨架载体，所述px330为能够携带CRISPR/Cas9的pX330载体，使用限制性内切酶BbsI对px330进行酶切，37℃水浴4 h。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收、纯化。为了将sgRNA连接进入px330，需要在gRNA序列补上BbsI酶切位点的粘性末端。将带有BbsI酶切位点粘性末端的gRNA以及互补序列以引物形式合成。合成的核苷酸进行退火。退火程序为：97℃，7 min；自然冷却至室温。回收纯化后的px330的线性骨架与退火双链gRNA序列连接，16℃，3 h。连接产物转化Top 10感受态细胞，37℃培养箱培养，待其长出单克隆菌落后，挑取测序正确的阳性单克隆菌落，将其加入15 mL的氨苄抗性LB培养基中，37℃，220 rpm培养12 h。测序引物为U6 Forward-RNA：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG（SEQ IDNO:7），其位于pX330的载体骨架上。构建不同位点的CRISPR/Cas9系统表达载体px330-pRosa26-gRNA。

px330-pRosa26-gRNA去内毒素提取：参照QIAGEN公司的去内毒素提取说明书。将提取好的质粒测定浓度后分装冻存，用于后续猪胎儿成纤维细胞的转染。将达到约70%汇合的猪胎儿成纤维细胞，进行消化、离心，获得数量约2×10⁵-2×10⁶的猪胎儿成纤维细胞。将CRISPR/Cas9打靶载体px330-pRosa26-gRNA（6 µg），加入到Lonza转染试剂中，混匀，使用加入质粒的转染试剂重悬细胞，并将细胞悬液加入到电击杯中，T-016程序电击细胞。电击完成后，立即将细胞吸出，加3 mL含15%血清的DMEM到六孔板的一个孔中。37℃，5% CO₂培养箱培养48 h后，细胞达到90%汇合，将细胞消化下来，提取细胞的基因组，作为PCR扩增的模板。

在gRNA靶点的上、下游分别设计PCR扩增引物，PCR扩增包括gRNA靶点的上下游序列，将PCR产物纯化退火后，采用T7核酸内切酶I（T7E1）进行酶切，结果显示，T7EN1酶切结果表明gRNA-1没有效率，因此没有进一步进行切割效率的检测，而5条gRNA pRosa26-gRNA-2、pRosa26-gRNA-3、pRosa26-gRNA-4、pRosa26-gRNA-5、pRosa26-gRNA-6均有效率（见图1）。另外将PCR产物，连接pEASY-blunt-simple载体的连接产物，转化至Top10感受态细胞，37℃培养箱培养，待其长出单克隆菌落后，随机挑取一定数量的单克隆菌落进行测序。将各个单克隆菌落测序结果与野生型Rosa26位点的基因组序列进行比对，认定发生了碱基插入/缺失的单克隆为阳性单克隆菌落。不同CRISPR/Cas9打靶载体的切割效率=突变的单克隆菌落个数/测序的单克隆菌落总数。不同gRNA靶位点的切割效率（编辑效率）见表2，结果显示，pRosa26-gRNA-2、pRosa26-gRNA-3、pRosa26-gRNA-4、pRosa26-gRNA-5、pRosa26-gRNA-6的切割效率分别为42.1%、35%、66.7%、42.8%、6.4%，可见pRosa26-gRNA-4表现出较高的切割效率（66.7%），也即虽然根据一般意义上的原则可以设计出成百上千种靶向猪Rosa26位点内含子1的gRNA序列，但是并不是所有理论设计得到的gRNA序列都能满足基因打靶实验要求，基于所述理论设计得到的gRNA序列构建得到的动物模型的功能更是无法预期的；尽管gRNA的设计原理是已知的，但从众多的候选靶序列找到一个合适的靶序列，并且设计匹配的sgRNA不发生脱靶，并且具有较高的敲入效率并非依靠本领域常规技术手段能够获得的，而是需要发明人在构建过程中进行反复的、大量的实验验证，才能最终筛选得到能够用于在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪构建的gRNA序列。综合上述结果，本发明选取了切割效率最高的靶点pRosa26-gRNA-4作为用于制备定点插入猪Rosa26位点的gRNA，并将其应用于后续的实验中。

表2 不同CRISPR/Cas9 gRNA位点的切割效率

2、表达人源补体调节蛋白同源重组供体载体的构建

为了进行精确插入，构建了同源重组载体，该载体包含有：一个EF1α启动子驱动表达人源hCRP基因（hCD46、hCD55和/或hCD59），一个CMV启动子转录表达的新霉素（Neo）抗性基因，在拟插入外源基因的两侧分别采用pRosa26-gRNA-4位点上下游为1982 bp和2052 bp的序列作为同源重组的5’端和3’端同源臂。以上序列由中美泰和公司合成，克隆在pGSI骨架载体，最终分别获得3种pGSI-Rosa26-hCRP-KI（5’HA：EF1α：hCD46：T2A：hCD55：p2A：hCD59：PKG-Neo：3’HA）同源重组载体，分别为pGSI-Rosa26-hCD46-KI、pGSI-Rosa26-hCD55-59-KI、pGSI-Rosa26-hCD46-55-59-KI（见图3）。其中，为了同时表达多个hCRP基因采用2A短肽（T2A短肽、p2A短肽）串联依次表达hCD46、hCD55和/或hCD59。通过Sanger测序，确定同源重组供体载体序列的正确性，进行后续基因定点敲入。其中，5’HA的序列如SEQ ID NO:8所示，EF1α的序列如SEQ ID NO:9所示，hCD46的序列如SEQ ID NO:10所示，T2A的序列如SEQID NO:11所示，hCD55的序列如SEQ ID NO:12所示，p2A的序列如SEQ ID NO:13所示，hCD59的序列如SEQ ID NO:14所示，PKG-Neo的序列如SEQ ID NO:15所示，3’HA的序列如SEQ IDNO:16所示。

实施例2 猪胎儿成纤维细胞的转染和中靶细胞单克隆的筛选

1、猪胎儿成纤维细胞的建系

将妊娠35天的巴马小型猪麻醉，从其子宫内无菌取出胎儿，用含双抗的PBS清洗胎儿后，置于超净工作台中，用眼科剪去除胎儿的头部、四肢、内脏及软骨组织，用PBS冲洗干净；在细胞培养皿内加入适量的FBS，保持组织不至于过分干燥，用眼科剪将剩余组织尽量剪碎。每个胎儿样品加入8-10 mL胶原酶溶液，37℃消化4 h，期间拿出摇晃几次。

将消化后的组织块加入10 mL含有15% FBS的DMEM终止消化，1000 rpm，离心5 min弃掉上清，转移到2-3个T75细胞培养瓶中，37℃，5% CO₂培养箱中培养；培养3天左右，观察到组织块周围有大量细胞爬出，待细胞生长至约90%汇合度时，对细胞进行消化并冻存备用。

2、定点插入单克隆细胞的筛选

将达到70%汇合的猪胎儿成纤维细胞，进行消化、离心，获得数量约2×10⁵-2×10⁶的猪胎儿成纤维细胞。

CRISPR/Cas9打靶载体pX330-pRosa26-gRNA-4与pGSI-hCRP-KI同源重组载体按照摩尔比1:1加入Lonza转染试剂中，混匀。其中，pRosa26-4gRNA位点Sanger测序结果峰图见图2，灰色区域为pRosa26-4gRNA的靶位点，箭头处为CRISPR/Cas9切割位点。使用加入质粒的转染试剂重悬细胞，并将细胞悬液加入到电击杯中，T-016程序电击细胞。电击完成后，立即将细胞吸出，加3 mL含15%血清的DMEM到六孔板的一个孔中。37℃，5% CO₂培养箱培养24h后，将细胞消化下来，以每盘4000个细胞的密度稀释至30个10 cm细胞培养皿中。24-48 h后，待10 cm皿中的细胞贴壁、且状态良好，加入700-1000 µg/mL的G418，每隔一天补加一次G418，加药量根据细胞状态及汇合度灵活掌控，但最高浓度不能超过1000 µg/mL。G418筛选7-14天后，可见优质细胞单克隆。

细胞单克隆的挑取及扩大培养。在显微镜下，挑选状态良好的单克隆。弃掉10 cm培养皿中的培养基，PBS清洗一次，将克隆环蘸取凡士林，用克隆环将细胞单克隆圈住，加入10-30 µL 0.25%的胰蛋白酶，37℃消化2 min。在显微镜下观察，细胞变圆、游离，加入含15%FBS的DMEM终止消化，将细胞吸出加入24孔板中。48-72 h后，24孔板中细胞汇合至80-90%时，将细胞传至6孔板中。待6孔板中细胞达到80%-90%汇合时，对大部分细胞冻存，少部分细胞提取基因组用于单克隆细胞基因型的鉴定。

实施例3 定点敲入hCRP阳性细胞单克隆的鉴定

由于Cas9的切割造成双链断裂，在同源重组载体的介导下，HDR的修复方式会进行基因组精确地插入，因此需要以打靶细胞单克隆的基因组为模板，分别对外源基因进行PCR扩增，并对同源重组5’和3’接头区域进行测序，检测基因编辑情况。

将px330-Rosa26-4gRNA（4 µg）分别与相应的同源重组打靶pGSI-Rosa26-hCRP（6µg）载体DNA，电转猪的胎儿成纤维细胞。通过稀释细胞后加入嘌呤霉素抗性药物，10-15天后挑选单克隆细胞系。对获得的每个单克隆来源的细胞基因型进行检测，PCR扩增引物见表3。分别提取27、20和21个细胞单克隆的基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳显示，分别有21、5和4个细胞系，在5’接头、内部序列和3’接头区域PCR鉴定都为阳性（图4A-4C），表明以上克隆在pROSA26位点发生了基因插入，整合效率依次为77.78%、17.24%和19.01%。

表3 基因编辑后的单克隆细胞和仔猪基因型鉴定引物

实施例4 基因编辑猪的制备

1、体细胞核移植以及胚胎回植

以实施例3中获得的阳性猪胎儿成纤维细胞为核移植供体细胞。培养胎儿成纤维细胞至100%汇合1-2天，去除培养皿内培养基，加入PBS洗涤1次，然后用0.25%胰蛋白酶消化约2 min，待细胞变圆后立即后用含血清的细胞培养液终止消化，1000 rpm离心5 min，弃上清，用操作液重悬离心沉淀的细胞，冰浴放置备用。

以体外成熟的减数分裂期的卵母细胞为核移植受体卵质。从母猪卵巢中采集卵丘卵母细胞复合体，经过体外成熟并用透明质酸酶脱去卵丘细胞，而后在体式显微镜下挑选排出第一极体、形态正常、胞质均匀的成熟卵母细胞备用。

在显微操作仪下，将卵母细胞的细胞核去除后移入编辑后的体细胞。经过电融合，诱导细胞与卵子融合并同时激活卵母细胞。构建成重组胚胎，融合胚放入覆盖有矿物油的四孔板培养，培养条件为38.5℃，5% CO₂，湿度为100%。体外发育至1-4细胞期后观察卵裂情况及发育状态，并用于胚胎移植。

挑选形态正常、发育优良的克隆胚胎用手术法移植入胚胎同期的母猪内。移植步骤为舒泰常规麻醉，将母猪保定在手术架上面，尽量避开血管，在腹中线处切口，露出卵巢，输卵管及子宫，使用胚胎移植管吸取胚胎，然后沿输卵管伞部进入将克隆胚胎释放到输卵管壶腹部。胚胎移植后给代孕母猪注射青链霉素，30天后进行B超检测妊娠情况，直至生产前。

2、hCD46-KI小型猪模型鉴定

以hCD46-19#和20#细胞作为供体细胞，通过自然分娩获得小型猪。采集新生猪耳缘组织，提取基因组为模板进行扩增，鉴定引物同表3。PCR结果显示，新生仔猪均在Rosa26位点发生了定点插入（见图5A）。

新生较弱的仔猪安乐死后，采集仔猪各组织约100 mg，提取总RNA。以WT猪作为对照，对F0代克隆猪采用qPCR进行检测或CD46的表达。结果显示，克隆仔猪各组织中hCD46mRNA的表达（见图5B）。

死亡仔猪各组织约100mg提取总蛋白，对各组织中hCD46、蛋白表达通过WesternBolt进行检测。选用人源293T细胞作为阳性对照。Western blot实验中，蛋白上样量为50 µg。由结果可知，在基因编辑猪的各组织中均检测到人源CD55和CD59蛋白的表达，而野生型PEF中没有检测到人源蛋白的表达（见图5C）。同样的，免疫组化结果显示克隆猪中均检测到人源CD46的表达（见图5D）。

3、hCD55-CD59-KI小型猪模型鉴定

以hCD55-CD59-21#细胞作为供体细胞，通过自然分娩获得小型猪。采集新生猪耳缘组织，提取基因组为模板进行扩增，鉴定引物同表3。PCR结果显示，新生仔猪均在Rosa26位点发生了定点插入（见图6A）。

新生较弱的仔猪安乐死后，采集仔猪各组织约100 mg，提取总RNA。以WT猪作为对照，对F0代克隆猪表达的mRNA转录本采用反转录PCR进行转录本检测。结果显示，克隆仔猪各组织中均有hCD55-hCD59转录本mRNA（见图6B）。

死亡仔猪各组织约100 mg提取总蛋白，对各组织中hCD55和hCD59蛋白表达分别通过Western Bolt进行检测。选用人源293T细胞作为阳性对照。Western blot实验中，蛋白上样量为50 µg。由图结果可知，在基因编辑猪的各组织中均检测到人源CD55和CD59蛋白的表达，而同日龄野生型仔猪组织和野生型PEF中没有检测到人源蛋白的表达（见图6C）。与WB结果一致，免疫组化结果显示克隆猪中均检测到人源CD55和CD59的表达（见图6D）。

4、hCD46-CD55-CD59-KI小型猪模型鉴定

以hCD46-CD55-CD59-30#细胞作为供体细胞，通过自然分娩获得小型猪。采集新生猪耳缘组织，提取基因组为模板进行扩增，鉴定引物同表3。PCR结果显示，新生仔猪均在Rosa26位点发生了定点插入（见图7A）。

新生较弱的仔猪安乐死后，采集仔猪各组织约100 mg，提取总RNA。以WT猪作为对照，对F0代克隆猪表达的hCD46 mRNA转录本采用qPCR进行转录本检测。结果显示，克隆仔猪各组织中均有hCD46转录本 mRNA（见图7B）。

死亡仔猪各组织约100 mg提取总蛋白，对各组织中人源蛋白表达分别通过Western Bolt进行检测。选用人源293T细胞作为阳性对照。Western blot实验中，蛋白上样量为50 µg。由图结果可知，在基因编辑猪的各组织中均检测到3种人源补体调节蛋白的表达，而野生型PEF中没有检测到人源蛋白的表达（见图7C）。

以上结果表明了本发明构建的CRSIPR/Cas9打靶载体pX330-pRosa26-gRNA-4能够有效地编辑pRosa6位点，在pGSI-pRosa26-hCRP作为同源重组供体载体的条件下，能够准确的进行人源补体调节蛋白基因（hCD46、hCD55和/或hCD59）的定点插入，继而成功制备得到表达hCD46、hCD55和/或hCD59的基因编辑猪，该基因编辑猪来源的器官在异种移植中不仅能够有效地抑制超急性免疫排斥反应的发生，而且还可抑制急性排斥反应和细胞免疫排斥反应的发生，此外，所述基因编辑猪还能够应用于神经退行性疾病的研究中，具有重要的临床应用价值。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院医学实验动物研究所

<120> 一种在Rosa26位点定点敲入人源补体调节蛋白小型猪的制备方法

<141> 2022-02-17

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcgcgagct gcaatcctga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccctccccc gcgatctcgt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atttctctat attcccacag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggagatggg aaatgagtcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taatctcaga tgctatactt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaagatggg tagtgttaat 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tacgatacaa ggctgttaga gag 23

<210> 8

<211> 1982

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgggaaggg gcagcatcct cctgctgaga gccgggggag ggccaggccc acgtcccgag 60

agcaagcgcg aggagacgga ggaggtgacc cttccctccc ccggggcccg gtggtgaggg 120

gaggtctctc ttttctgtcg cacccttacc ttgtcccagg cctgggcccg ggctgcggcg 180

cacggcactc ccggtaggca gcaggactcg agttaggccc agcgcggcgc cacggcgttt 240

cctggccggg aatggcccgt gcccgtgagg tgggggtggg gggcaaaaag gcggagcgag 300

ccaaaggcgg tgagggggag ggccagggaa ggaggggggg gccggcacta ctgtgttggc 360

ggactggcgg gactggggct gcgtgagtct ctgagcgcag gcgggcggcg gccgcccctc 420

ccccggcggc ggcggcggcg gcggcggcgg cggcagcagc tcactcagcc cgctgcccga 480

gcggaaacgc cactgaccgc acggggattc ccagcgccgg cgccaggggc acccgggaca 540

cgccccctcc cgccgcgcca ttggcccctc cgcccaccgt ctcgcaccca ttggccagct 600

ccccgccaat cagcggaagc cgccggggcc gcctagagaa gaggctgtgc tctggggctc 660

cggctcctca gagagcctcg gctaggtagg ggagcgggac tctggtttgg gggagggccg 720

gcggtttggc gggggatggg tgcttgaggt ggtctgaccg gtagcggggg tcgccttccc 780

tagcgggaag tcgggagcat atcgtttgtt acgctggaag gggaagaggt ggtgagaggc 840

aggcgggagt gcggcccgcc ctgcggcaac cggaggggga gggagaaggg agcggaaaag 900

cctggaatac ggacggagcc attgctcccg cagagggagg agcgcttcct gctcttctct 960

tgtcactgat tggccgcttc tcctcccgcc gtgtgtgaaa acacaaatgg cgtgttttgg 1020

ttggagtaaa gctcctgtca gttacagcct cgggagtgcg cagcctccca ggaactctcg 1080

cattgccccc tgggtgggta ggtaggtggg gtggagagag ctgcacaggc gggcgctgtc 1140

ggcctcctgc ggggggaggg gagggtcagt gaaagtggct cccgcgcggg cgtcctgcca 1200

ccctcccctc cgggggagtc ggtttacccg ccgcctgctc ggctttggta tctgattggc 1260

tgctgaagtc ctgggaacgg ccccttgtta ttggcttggg tcccaaatga gcgaaaccac 1320

tacgcgagtc ggcagggagg cggtctttgg tacggccctc cccgaggcca gcgccgcagt 1380

gtctggcccc tcgcccctgc gcaacgtggc aggaagcgcg cgcaggaggc gggggcgggc 1440

tgccgggccg aggcttctgg gtggtggtga ctgcggctcc gccctgggcg tccgccgcct 1500

gaaggacgag actagctctc tacctgctct cggacccgtg ggggtggggg gtggaggaag 1560

gagtgggggg tcggtcctgc tggcttgtgg gtgggaggcg catgttctcc aaaaacccgc 1620

gcgagctgca atcctgaggg agctgcagtg gaggaggcgg agagaaggcc gcacccttct 1680

ccgcaggggg aggggagtgc cgcaatacct ttatgggagt tctctgctgc ctccttttcc 1740

taaggaccgc cctgggccta gaaaaatccc tccctccccc gcgatctcgt catcgcctcc 1800

atgtcagttt gctccttctc gattatgggc gggattcttt tgccctggct taacctgatt 1860

cttgggcgtt gtcctgcagg ggattgagca ggtgtacgag gacgagccca atttctctat 1920

attcccacag tcttgagttt gtgtcacaaa ataattatag tggggtggag atgggaaatg 1980

ag 1982

<210> 9

<211> 1205

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgacctctt ctcttcctcc cacaggggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat 60

cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa 120

ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg 180

gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt 240

ttgccgccag aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg cgggcctggc ctctttacgg 300

gttatggccc ttgcgtgcct tgaattactt ccacctggct gcagtacgtg attcttgatc 360

ccgagcttcg ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgcgcttaa ggagcccctt 420

cgcctcgtgc ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg ccgccgcgtg cgaatctggt 480

ggcaccttcg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct agccatttaa aatttttgat 540

gacctgctgc gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt aaatgcgggc caagatctgc 600

acactggtat ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg ggcccgtgcg tcccagcgca 660

catgttcggc gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag aatcggacgg gggtagtctc 720

aagctggccg gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc gtgtatcgcc ccgccctggg 780

cggcaaggct ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga aagatggccg cttcccggcc 840

ctgctgcagg gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg agagcgggcg ggtgagtcac 900

ccacacaaag gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc ttcatgtgac tccacggagt 960

accgggcgcc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt ttggagtacg tcgtctttag 1020

gttgggggga ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag 1080

ttaggccagc ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat 1140

cttggttcat tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt 1200

cgtga 1205

<210> 10

<211> 1047

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggagcctc ccggccgccg cgagtgtccc tttccttcct ggcgctttcc tgggttgctt 60

ctggcggcca tggtgttgct gctgtactcc ttctccgatg cctgtgagga gccaccaaca 120

tttgaagcta tggagctcat tggtaaacca aaaccctact atgagattgg tgaacgagta 180

gattataagt gtaaaaaagg atacttctat atacctcctc ttgccaccca tactatttgt 240

gatcggaatc atacatggct acctgtctca gatgacgcct gttatagaga aacatgtcca 300

tatatacggg atcctttaaa tggccaagca gtccctgcaa atgggactta cgagtttggt 360

tatcagatgc actttatttg taatgagggt tattacttaa ttggtgaaga aattctatat 420

tgtgaactta aaggatcagt agcaatttgg agcggtaagc ccccaatatg tgaaaaggtt 480

ttgtgtacac cacctccaaa aataaaaaat ggaaaacaca cctttagtga agtagaagta 540

tttgagtatc ttgatgcagt aacttatagt tgtgatcctg cacctggacc agatccattt 600

tcacttattg gagagagcac gatttattgt ggtgacaatt cagtgtggag tcgtgctgct 660

ccagagtgta aagtggtcaa atgtcgattt ccagtagtcg aaaatggaaa acagatatca 720

ggatttggaa aaaaatttta ctacaaagca acagttatgt ttgaatgcga taagggtttt 780

tacctcgatg gcagcgacac aattgtctgt gacagtaaca gtacttggga tcccccagtt 840

ccaaagtgtc ttaaaggtcc taggcctact tacaagcctc cagtctcaaa ttatccagga 900

tatcctaaac ctgaggaagg aatacttgac agtttggatg tttgggtcat tgctgtgatt 960

gttattgcca taggaaagca gatggtggag ctgaatatgc cacttaccag actaaatcaa 1020

ccactccagc agagcagaga ggctgaa 1047

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54

<210> 12

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaccgtcg cgcggccgag cgtgcccgcg gcgctgcccc tcctcgggga gctgccccgg 60

ctgctgctgc tggtgctgtt gtgcctgccg gccgtgtggg gtgactgtgg ccttccccca 120

gatgtaccta atgcccagcc agctttggaa ggccgtacaa gttttcccga ggatactgta 180

ataacgtaca aatgtgaaga aagctttgtg aaaattcctg gcgagaagga ctcagtgatc 240

tgccttaagg gcagtcaatg gtcagatatt gaagagttct gcaatcgtag ctgcgaggtg 300

ccaacaaggc taaattctgc atccctcaaa cagccttata tcactcagaa ttattttcca 360

gtcggtactg ttgtggaata tgagtgccgt ccaggttaca gaagagaacc ttctctatca 420

ccaaaactaa cttgccttca gaatttaaaa tggtccacag cagtcgaatt ttgtaaaaag 480

aaatcatgcc ctaatccggg agaaatacga aatggtcaga ttgatgtacc aggtggcata 540

ttatttggtg caaccatctc cttctcatgt aacacagggt acaaattatt tggctcgact 600

tctagttttt gtcttatttc aggcagctct gtccagtgga gtgacccgtt gccagagtgc 660

agagaaattt attgtccagc accaccacaa attgacaatg gaataattca aggggaacgt 720

gaccattatg gatatagaca gtctgtaacg tatgcatgta ataaaggatt caccatgatt 780

ggagagcact ctatttattg tactgtgaat aatgatgaag gagagtggag tggcccacca 840

cctgaatgca gaggaaaatc tctaacttcc aaggtcccac caacagttca gaaacctacc 900

acagtaaatg ttccaactac agaagtctca ccaacttctc agaaaaccac cacaaaaacc 960

accacaccaa atgctcaagc aacacggagt acacctgttt ccaggacaac caagcatttt 1020

catgaaacaa ccccaaataa aggaagtgga accacttcag gtactacccg tcttctatct 1080

ggttctcgtc ctgtcaccca ggctggtatg cggtggtgtg atcgtagctc actgcagtct 1140

cgaactcctg ggttcaagcg atccttccac ttcagcctcc caagtagctg gtactacagg 1200

tgtgtgccac gacacccggc taagtttttg aaatttattt tttgtagaga caggattttc 1260

ctatgttgcc caggctggtt tcaaactcct ggccgtaagc gatttttccg gcctcccaaa 1320

acgttgcgat taggaagcgg a 1341

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57

<210> 14

<211> 387

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgggaatcc aaggagggtc tgtcctgttc gggctgctgc tcgtcctggc tgtcttctgc 60

cattcaggtc atagcctgca gtgctacaac tgtcctaacc caactgctga ctgcaaaaca 120

gccgtcaatt gttcatctga ttttgatgcg tgtctcatta ccaaagctgg gttacaagtg 180

tataacaagt gttggaagtt tgagcattgc aatttcaacg acgtcacaac ccgcttgagg 240

gaaaatgagc taacgtacta ctgctgcaag aaggacctgt gtaactttaa cgaacagctt 300

gaaaatggtg ggacatcctt atcagagaaa acagttcttc tgctggtgac tccatttctg 360

gcagcagcct ggagccttca tccctaa 387

<210> 15

<211> 2100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agcggccgcg actctagatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt 60

taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg 120

ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca 180

caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat 240

cttataaccc ttaatataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatt aggtctgaag 300

aggagtttac gtccagccaa gctagcttgg ctgcaggtcg tcgaaattct accgggtagg 360

ggaggcgctt ttcccaaggc agtctggagc atgcgcttta gcagccccgc tgggcacttg 420

gcgctacaca agtggcctct ggcctcgcac acattccaca tccaccggta ggcgccaacc 480

ggctccgttc tttggtggcc ccttcgcgcc accttctact cctcccctag tcaggaagtt 540

cccccccgcc ccgcagctcg cgtcgtgcag gacgtgacaa atggaagtag cacgtctcac 600

tagtctcgtg cagatggaca gcaccgctga gcaatggaag cgggtaggcc tttggggcag 660

cggccaatag cagctttgct ccttcgcttt ctgggctcag aggctgggaa ggggtgggtc 720

cgggggcggg ctcaggggcg ggctcagggg cggggcgggc gcccgaaggt cctccggagg 780

cccggcattc tgcacgcttc aaaagcgcac gtctgccgcg ctgttctcct cttcctcatc 840

tccgggcctt tcgacctgca gcctgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata 900

gtataatacg acaaggtgag gaactaaacc atgggatcgg ccattgaaca agatggattg 960

cacgcaggtt ctccggccgc ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag 1020

acaatcggct gctctgatgc cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt 1080

tttgtcaaga ccgacctgtc cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc agcgcggcta 1140

tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg 1200

ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt 1260

gctcctgccg agaaagtatc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat 1320

ccggctacct gcccattcga ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg 1380

atggaagccg gtcttgtcga tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca 1440

gccgaactgt tcgccaggct caaggcgcgc atgcccgacg gcgatgatct cgtcgtgacc 1500

catggcgatg cctgcttgcc gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc 1560

gactgtggcc ggctgggtgt ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat 1620

attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc 1680

gctcccgatt cgcagcgcat cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgaggggat 1740

caattctcta gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 1800

gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 1860

taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 1920

ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 1980

gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctcgac tagagcttgc 2040

ggaaccctta atataacttc gtataatgta tgctatacga agttattagg tccctcgagg 2100

<210> 16

<211> 2052

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tccaggcaac acctaagcct gattttatgc attgagactg cgtgttatta ctaaagatct 60

ttgtgtcgca atttcctgat gaagggagat aggttaaaaa gcacggatct actgagtttt 120

acagtcatcc catttgtaga cttttgctac accaccaaag tatagcatct gagattaaat 180

attaatctcc aaaccttagg ccccctcact tgcatcctta cggtcagata actctcactc 240

atactttaag cccattttgt ttgttgtact tgctcatcca gtcccagtcc cattggcttt 300

ctcctcacct gttttaggta gccagcaagt catgaaatca gataagttcc accaccaatt 360

aacactaccc atcttgagca taggcccaac agtgcattta ttcctcattt actgatgttc 420

gtgaatattt accttgattt tcattttttt ctttttctta agctgggatt ttactcctga 480

ccctattcac agtcagatga tcttgactac cactgcgatt ggacctgagg ttcagcaata 540

ctccccttta tgtcttttga atacttttca ataaatctgt ttgtattttc attagttagt 600

aactgagctc agttgccgta atgctaatag cttccaaact agtgtctctg tctccagtat 660

ctgataaatc ttaggtgttg ctgggacagt tgtcctaaaa ttaagataaa gcatgaaaat 720

aactgacaca actccattac tggctcctaa ctacttaaac aatgcattct atcatcacaa 780

atgtgaaaaa ggagttccct cagtggacta accttatctt ttctcaacac ctttttcttt 840

gcacaatttt ccacacatgc ctacaaaaag tacttctctg ctcaagtcac actgagttga 900

ttgctattta ccgaaatcaa agtaacatta tcagatctct gtagggtggt tccctctgga 960

atgctaccct ccatagtcct tacccttcaa gtaaagagca tgaagactga aatatctctg 1020

tgatctgtca tcctttaagc cagaatcccc cataaaaaag ttagtattgc tttctcctga 1080

tcccatagca ggttgaatca tagcacttat caggttgttg tcattgcttg cttaaattct 1140

cctaactatt tggagcttct tgagggcaca ggttcttgtt gagtcttgta cctaagcacc 1200

tagtatagtc cttgatgtct agccaaccct aaataaaatg cagtgagtga catgtagatg 1260

tctttataag gtttgatagg ttggtctctc aaacagttct tttgtatgtt tggtagtgct 1320

ctagattagc actggccagt ataactctga tgatggaaat gttctatagc tatgctgtct 1380

aatatggtag tcactactaa catatgttac tgttgagcct tggaaatatg gcttttgtga 1440

caaaactgaa tttttcatgc tatgtaattt aagtctaaat tgctactgtg tacattgtgg 1500

ctgtagccac aaatttgtgc tgtggattgc agaataatta atatggacat tgataatttt 1560

cttttcatac taagcagtaa ggaaagaaaa gttgaaactc tgtggtccat ttaggttata 1620

tgtgtatttg tacttgattg gtttgtttga atacctattt ctatacttta gctgagagct 1680

aaagccaaca aaccagtact gtagataacc tgctttggac aacaatgtgt tgactagttg 1740

gatttcatca aagaatgcct aataaatttt aagaaaatga gatttcatta aaccataata 1800

ctgacataag tttagggaag aatcagacta tatctggtgt ttgtgaaact acccctgaat 1860

ttcagtccta caaagttttc agttttggaa aaactttcat cagagagggc actaagttac 1920

aggaagccat cacaaagtaa gttttcatct gatgaattat aaatttaaga tatattttaa 1980

taccaaaatt ctttatggtt tatgtgctaa cttaaaattt ctccttaaaa tatgagaact 2040

aagtacacaa tt 2052

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgtgtattt tgaggagggc g 21

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ctctaggcac cggttcaatt g 21

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgtgccttc tagttgccag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gatccgagcc acatatggac 20

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcggaatcat acatggctac ctg 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

caccacaata aatcgtgctc t 21

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccgtacaagt tttcccgagg ata 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ataatggtca cgttcccctt gaa 23

Claims

1.一种用于有效编辑猪ROSA26基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ IDNO:4所示。

2.一种靶向猪Rosa26基因内含子1的CRISPR/Cas9系统表达载体，其特征在于，所述表达载体由权利要求1所述的sgRNA和骨架载体px330构成。

3.一种表达人源补体调节蛋白同源重组供体载体，其特征在于，所述同源重组供体载体包含5’端同源臂（5’HA）、EF1α启动子、人源补体调节蛋白基因（hCRP）、CMV启动子转录表达的新霉素抗性基因（PKG-Neo）、3’端同源臂（3’HA）和/或2A短肽；

所述人源补体调节蛋白基因包括hCD46、hCD55和/或hCD59；

所述2A短肽依次串联hCD46、hCD55和/或hCD59；

所述2A短肽包括T2A短肽和/或p2A短肽。

4.根据权利要求3所述的同源重组供体载体，其特征在于，所述同源重组供体载体包括表达hCD46的同源重组供体载体、同时表达hCD55和hCD59的同源重组供体载体、同时表达hCD46、hCD55和hCD59的同源重组供体载体；

所述5’HA的序列如SEQ ID NO:8所示；

所述EF1α的序列如SEQ ID NO:9所示；

所述hCD46的序列如SEQ ID NO:10所示；

所述T2A的序列如SEQ ID NO:11所示；

所述hCD55的序列如SEQ ID NO:12所示；

所述p2A的序列如SEQ ID NO:13所示；

所述hCD59的序列如SEQ ID NO:14所示；

所述PKG-Neo的序列如SEQ ID NO:15所示；

所述3’HA的序列如SEQ ID NO:16所示。

5.一种用于在Rosa26位点定点敲入人源补体调节基因的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统包含权利要求2所述的表达载体、权利要求3或4所述的同源重组供体载体。

6.一种表达人源补体调节蛋白小型猪的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表达载体px330-pRosa26-gRNA的构建包括如下步骤：

2) 将权利要求1中所述的sgRNA与酶切后的线性化表达载体px330连接，得到靶向猪Rosa26基因内含子1的CRISPR/Cas9系统表达载体px330-pRosa26-gRNA；

所述5’HA的序列如SEQ ID NO:8所示；

所述EF1α的序列如SEQ ID NO:9所示；

所述hCD46的序列如SEQ ID NO:10所示；

所述T2A的序列如SEQ ID NO:11所示；

所述hCD55的序列如SEQ ID NO:12所示；

所述p2A的序列如SEQ ID NO:13所示；

所述hCD59的序列如SEQ ID NO:14所示；

所述PKG-Neo的序列如SEQ ID NO:15所示；

所述3’HA的序列如SEQ ID NO:16所示；

8.一种表达人源补体调节蛋白的小型猪，其特征在于，所述表达人源补体调节蛋白的小型猪为采用权利要求6或7所述的方法构建得到。

9.一种源自权利要求8所述的表达人源补体调节蛋白小型猪的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括器官或组织；

所述器官包括心脏、脾脏、肺、肾脏、肝脏；

所述组织包括上皮组织、结缔组织、肌组织或神经组织。

10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：

(1) 权利要求1所述的sgRNA在特异识别和靶向编辑猪ROSA26基因中的应用；

(2) 权利要求1所述的sgRNA在制备ROSA26基因定点整合转基因猪中的应用；

(3) 权利要求1所述的sgRNA在制备表达人源补体调节蛋白的小型猪中的应用；

(4) 权利要求2所述的表达载体在制备表达人源补体调节蛋白的小型猪中的应用；

(5) 权利要求3或4所述的同源重组供体载体在制备表达人源补体调节蛋白的小型猪中的应用；

(6) 权利要求5所述的CRISPR/Cas9系统在制备表达人源补体调节蛋白的小型猪中的应用；

(7) 权利要求8所述的表达人源补体调节蛋白的小型猪在异种器官移植中的应用；

(8) 权利要求8所述的表达人源补体调节蛋白的小型猪在作为异种器官移植供体猪中的应用；

(9) 权利要求9所述的生物材料在制备异种器官移植材料中的应用；

(10) 权利要求8所述的表达人源补体调节蛋白的小型猪在神经退行性疾病研究中的应用。