WO2023234319A1 - 遺伝子導入ブタの製造方法、体細胞クローニング原料、遺伝子導入ブタ、樹立された体細胞、及び組織ないし臓器 - Google Patents

遺伝子導入ブタの製造方法、体細胞クローニング原料、遺伝子導入ブタ、樹立された体細胞、及び組織ないし臓器 Download PDF

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WO2023234319A1
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WO
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organ
pig
tissue
promoter
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PCT/JP2023/020164
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比呂志 長嶋
將人 渡邊
ひとみ 松成
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株式会社ポル・メド・テック
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    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a transgenic pig, a raw material for somatic cell cloning used therein, a transgenic pig, somatic cells established therefrom, and tissues or organs excised therefrom.
  • transgenic pigs that can conditionally express a specific functional protein in tissues or organs selectively (conditionally) or even in a time-selective manner.
  • transgenic pigs Breeding and mating of pigs is more complicated than, for example, rodents such as mice. From this, it is possible to produce transgenic pigs by transfecting pigs with a vector containing both a regulatory gene cassette for conditional gene expression and a functional gene cassette containing a gene encoding a functional protein.
  • the inventors of the present invention initially attempted to do so. However, the present inventors have demonstrated that gene transfer into pigs of a vector containing both a regulatory gene cassette for conditional gene expression and a functional gene cassette containing a gene encoding a functional protein is lethal. It has been found that this causes the pigs to die. As a result, it has been found that it is difficult to produce transgenic pigs in which genes for expressing the above-mentioned functional proteins are conditionally introduced in specific tissues or organs (comparative examples described below). .
  • the present invention has been made in view of the problems of the prior art as described above, and an object of the present invention is to selectively express a specific functional protein in the tissue or organ.
  • the present invention provides a method for producing a transgenic pig into which a group of genes has been introduced, a raw material for somatic cell cloning used therein, a transgenic pig, somatic cells established from the transgenic pig, and tissues or organs excised from the transgenic pig.
  • the present inventors have determined that gene transfer using a functional gene cassette containing a gene encoding a functional protein and gene transfer using a vector containing a control gene cassette for conditional gene expression are possible. It has been found that by dividing the gene introduction into two stages, it is possible to produce transgenic pigs into which a group of genes for expressing functional proteins are conditionally introduced in the tissue or organ concerned. In other words, after constructing a genetically modified cloned pig into which a functional gene cassette containing a gene encoding a functional protein has been introduced, the gene is further introduced into the constructed genetically modified cloned pig using a vector containing a control gene cassette. It has been found that it is possible to produce transgenic pigs into which genes for expressing functional proteins are conditionally introduced in the relevant tissue or organ. The present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention is as follows.
  • Somatic cell cloning of genetically modified pig cells obtained by introducing a gene cassette containing a gene encoding a functional protein and a construct capable of expressing the functional protein using a recombinant enzyme into a safe harbor region.
  • sperm of genetically modified cloned pigs obtained by A method for producing a transgenic pig comprising the step of introducing a gene by microinseminating eggs with a solution containing a vector (1)
  • the vector (1) is A production method comprising a promoter that is expressed in a specific tissue or organ, and a gene encoding the recombinant enzyme that is present downstream of and under control of the promoter that is expressed in the specific tissue or organ.
  • ⁇ 2> The method according to ⁇ 1>, wherein the safe harbor area is a ROSA area.
  • the vector (1) is a plasmid vector or an artificial chromosome vector.
  • a raw material for somatic cell cloning that contains genetically modified pig cells containing a gene cassette in a safe harbor region that contains a gene encoding a functional protein and a construct that allows the functional protein to be expressed by a recombinant enzyme.
  • a raw material for somatic cell cloning to provide a raw material for gene introduction by microinsemination in the presence of the following vector (1).
  • (1) A vector containing a promoter that is expressed in a specific tissue or organ, and a gene encoding the recombinant enzyme that is present downstream of and under the control of the promoter that is expressed in the specific tissue or organ.
  • a promoter expressed in an organ a gene encoding the recombinant enzyme present downstream of and under control of the promoter expressed in a specific tissue or organ
  • a transgenic pig comprising, in a safe harbor region, a gene cassette containing a gene encoding a functional protein and a construct that allows the functional protein to be expressed by the recombinant enzyme.
  • ⁇ 9> Use of a genetically modified pig cell containing a gene cassette in a safe harbor region containing a gene encoding a functional protein and a construct capable of expressing the functional protein by a recombinant enzyme,
  • the above-mentioned use as a raw material for somatic cell cloning to provide a raw material for gene introduction by microinsemination in the presence of the following vector (1).
  • gene introduction in which a group of genes for conditionally expressing a specific functional protein in the tissue or organ selectively (preferably tissue or organ-specifically) is introduced. It is possible to provide a method for producing pigs, a raw material for somatic cell cloning used therein, a transgenic pig, somatic cells established therefrom, and tissues or organs excised therefrom.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a gene cassette containing the loxP-Venus gene constructed in Reference Example 1.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the CreERT2 expression vector constructed in Reference Example 2.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a gene cassette containing the loxP-DTA gene constructed in Reference Example 3.
  • FIG. 4 is an electropherogram showing the results of confirmation of knock-in of the gene cassette into the ROSA region.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of confirmation of cell death induction by tamoxifen in genetically modified pig cells in which a gene cassette containing the loxP-DTA gene was introduced into the pig ROSA region.
  • FIG. 6 is a diagram showing an electropherogram of the male and female determination results.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a gene cassette containing the loxP-Venus gene constructed in Reference Example 1.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the CreERT2 expression vector constructed in Reference Example 2.
  • FIG. 3 is a
  • FIG. 7 is a diagram showing an electropherogram of the gene transfer determination results.
  • FIG. 8 is an electropherogram showing the results of confirmation of CreERT2 expression in the fetal metanephros.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of determining the copy number of a transgene in an individual (diploid genome).
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing an all-in-one vector 1 containing both the mSix2 promoter and CreERT2 and loxP-DTA genes as a comparative example.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing an all-in-one vector 2 containing both the mSix2 promoter and the ERT2CreERT2 and loxP-DTA genes as a comparative example.
  • a first aspect of the present invention is a genetically modified pig obtained by introducing into a safe harbor region a gene cassette containing a gene encoding a functional protein and a construct capable of expressing the functional protein using a recombinant enzyme.
  • Genetically modified cloned pig sperm obtained by somatic cell cloning This is a method for producing a transgenic pig, which includes the step of introducing a gene by microinseminating eggs with a solution containing the vector (1).
  • a vector comprising a promoter that is expressed in a specific tissue or organ, and a gene encoding the recombinant enzyme that is present downstream of and under the control of the promoter that is expressed in the specific tissue or organ.
  • the transgenic pig produced by the production method according to the first aspect includes gene introduction into the safe harbor region of the gene cassette (first gene introduction), and the vector (1) through the microinsemination.
  • a second gene transfer has been carried out in this pig, and it can also be called a double gene transfer pig (double genetically modified pig).
  • the transgenic pig is preferably a transgenic pig that can conditionally express a specific functional protein in the tissue or organ selectively.
  • the transgenic pig produced by the production method according to the first aspect includes a gene cassette that includes a gene encoding a functional protein and a construct that allows the functional protein to be expressed by a recombinant enzyme. Furthermore, the transgenic pig produced by the production method according to the first aspect contains a promoter that is expressed in a specific tissue or organ, and a gene encoding the recombinant enzyme that exists downstream of the promoter and is under control. Thereby, by allowing the recombinant enzyme to coexist with the construct (preferably in the cell, more preferably in the nucleus), the recombinant enzyme can be conditionally (preferably dependent on the expression of the recombinant enzyme) Functional proteins can be expressed.
  • eggs are microinseminated with a solution containing the vector (1) containing the gene encoding the recombinant enzyme, thereby conditionally (preferably, Transgenic pigs capable of expressing the above functional protein in an enzyme expression-dependent manner can be produced.
  • conditionally preferably, Transgenic pigs capable of expressing the above functional protein in an enzyme expression-dependent manner
  • the transgenic pig produced by the production method according to the first aspect selectively (preferably tissue or organ-specifically) expresses the functional protein in the tissue or organ. can do.
  • the number of copies of the gene encoding the functional protein is not particularly limited.
  • (Diploid genome) for example, 1 copy or more, preferably 2 copies or more, and more preferably 4 copies or more.
  • the upper limit of the copy number of the gene encoding the functional protein is not particularly limited, but examples include 200 copies or less, 100 copies or less, 550 copies or less per pig individual (diploid genome).
  • transgenic pigs produced by the production method according to the first aspect and the transgenic pigs according to the third aspect described below there is no particular restriction on the number of copies of the gene encoding the recombinant enzyme, but individual pigs ( per diploid genome), for example, 1 or more copies, preferably 2 or more copies, more preferably 4 or more copies, even more preferably 7 or more copies, particularly preferably 15 or more copies, particularly preferably 30 or more copies.
  • the upper limit of the copy number of the recombinant enzyme is not particularly limited, but examples include 500 copies or less, 300 copies or less, 100 copies or less per pig individual (diploid genome).
  • transgenic pig produced by the production method according to the first aspect and the transgenic pig according to the third aspect described below copy number of the gene encoding the functional protein/copy of the gene encoding the recombinant enzyme.
  • the numerical ratio includes 1/2 to 1/300, preferably 2/3 to 2/100, more preferably 3/5 to 3/50, and even more preferably 4/6 to 4/20. This is from the perspective of improving the production efficiency (survival rate) of transgenic pigs.
  • the construct is not particularly limited as long as it contains a gene encoding the functional protein and the functional protein can be expressed by a recombinant enzyme, and may include a DNA construct, a cDNA construct, an RNA construct, etc. Examples include nucleic acid constructs (preferably gene constructs).
  • the construct preferably includes a specific sequence that is selectively (preferably specifically) recognized by the recombinant enzyme, and which is selectively (preferably specifically) recognized by the recombinant enzyme. More preferably, it contains at least one pair of specific sequences. Thereby, the recombinant enzyme selectively recognizes at least one pair of specific sequences (preferably at least one pair of specific sequences), thereby providing a conditional (preferably, recombinase expression-dependent) Recombination can occur.
  • Combinations of the above-mentioned recombinant enzyme and a specific sequence (preferably at least one pair of specific sequences) selectively recognized by the recombinant enzyme include the following combinations (a) to (d), and the following (a) Cre recombinase and at least one pair of Lox arrays is preferred. (a) a combination of Cre recombinase and at least one pair of Lox sequences; (b) Combination of recombinant enzyme FLP derived from Saccharomyces cerevisiae and the following FRT sequence (Broach, JR, Guarascio, VR, & Jayaram, M. (1982). Recombination within the yeast plasmid 2mu circle is site -specific.
  • the above-mentioned specific sequence is preferably the above-mentioned Lox sequence.
  • a 34-base loxP sequence derived from bacteriophage P1 is a representative example, and a so-called Cre-loxP system can be constructed.
  • An example of a pair of loxP arrays is shown below. 5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID NO: 1) As mentioned above, it can be seen that the 13 bases at both ends, which are Cre binding sites, are symmetrical, and the 8 bases at the center are asymmetrical.
  • loxP has directionality, and if a pair of Lox sequences are arranged in the same direction (the same direction), the sequence between them will be excised by Cre as circular DNA. Excised circular DNA rarely returns to its original state, and the above excision can be said to be substantially irreversible. On the other hand, if a pair of Lox arrays are arranged in opposite directions (opposite directions), the arrays between them are reversed (orientations are swapped). The above reversal can be said to be reversible.
  • the at least one pair of Lox arrays is preferably 1 to 4 pairs of Lox arrays, more preferably 1 to 3 pairs of Lox arrays, and even more preferably 1 or 2 pairs of Lox arrays.
  • At least one pair of Lox arrays includes, as representative examples, not only the loxP array described above, but also lox511 array, lox2272 array, loxFAS array, loxRE array, loxLE array, etc., and two or more pairs of these are used in combination. You may.
  • lox511 array examples include lox2272 array, loxFAS array, loxRE array, and loxLE array. In the sequence below, lowercase letters indicate bases that are different from the loxP sequence.
  • lox2272:5'-ATAACTTCGTATAGgATACtTTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID NO: 3)
  • loxFAS:5'-ATAACTTCGTATAtacctttcTATACGAAGTTAT-3' SEQ ID NO: 4
  • lox RE:5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAcggta-3' SEQ ID NO: 5
  • lox LE 5'-taccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID NO: 6)
  • examples of the combination of two pairs of Lox arrays include a combination of one pair of loxP and one pair of lox2272, a combination of one pair of loxP and one pair of lox511, and the like.
  • the target gene (gene encoding a functional protein) is arranged in the active direction, and is sandwiched between a pair of Lox sequences arranged in the same direction (same orientation) upstream of the target gene.
  • a (Floxed) STOP array can be placed. Since the pair of Lox sequences are arranged in the same direction (same orientation), the STOP sequence is essentially irreversibly excised by Cre, and the target gene (gene encoding a functional protein) can be expressed. can.
  • the STOP sequence is not particularly limited as long as it is a transcription termination sequence, but examples include the SV40 poly A signal sequence, and a sequence in which three SV40 poly A signal cassettes are linked is preferred.
  • a Pause sequence may be included in addition to the STOP sequence as a floxed sequence between a pair of Lox sequences arranged in the same direction (same direction). It is often preferred to include it downstream of the STOP sequence.
  • the above-mentioned pause sequence is not particularly limited, but examples include the human ⁇ 2 globin gene RNA polymerase II transcriptional pause signal sequence.
  • the recombinant enzyme is a fusion protein with a nuclear import protein, that is, the gene encoding the recombinant enzyme is directly or Preferably, they are indirectly fused.
  • the nuclear import protein is not particularly limited as long as it can migrate into the nucleus, but includes proteins having a nuclear import signal, and specifically, the estrogen receptor ER is preferred.
  • the recombinase is Cre recombinase
  • the gene encoding the recombinase is a gene encoding a fusion protein containing the Cre recombinase and the estrogen receptor ER.
  • the Cre recombinase is known as an enzyme (an enzyme derived from bacteriophage P1 ) that recognizes a specific base sequence (for example, a pair of two Lox sequences) and causes DNA homologous recombination.
  • the estrogen receptor ER is known to have a nuclear localization signal.
  • the fusion protein is a fusion protein containing Cre recombinase and estrogen receptor ER, by microinseminating an egg with a solution containing vector (1), the Cre recombinase portion of the fusion protein has at least one pair of Lox sequences. By recognizing this, transgenic pigs that undergo conditional (preferably Cre expression dependent) recombination can be produced.
  • the estrogen receptor ER is ERT2
  • the fusion protein is CreERT2 or ERT2CreERT2.
  • Tamoxifen compounds tamoxifen, 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), etc.
  • ERT2 is known to be a protein that has been modified to bind ER only to the tamoxifen compound and lacks a nuclear localization signal (with estrogen).
  • CreERT2 and ERT2CreERT2 are both fusion proteins of the above-mentioned ERT2 and Cre, can be translocated into the nucleus in the presence of a tamoxifen compound, and can cause recombination with Cre.
  • CreERT2 and ERT2CreERT2 are both fusion proteins of the above-mentioned ERT2 and Cre, can be translocated into the nucleus in the presence of a tamoxifen compound, and can cause recombination with Cre.
  • CreERT2 or ERT2CreERT2 can be used to cause conditional (eg, stage-specific) recombination with a tamoxifen compound.
  • the estrogen receptor ER is preferably ERT2
  • the fusion protein is preferably CreERT2 or ERT2CreERT2.
  • the present invention provides a somatic cell cloning material comprising a genetically modified pig cell containing a gene cassette in a safe harbor region containing a gene encoding the above functional protein and a construct capable of expressing the functional protein using a recombinant enzyme.
  • the present invention also relates to a somatic cell cloning raw material for providing a raw material for gene introduction by microinsemination in the coexistence of the vector (1), and a second aspect of the present invention is the somatic cell cloning raw material. .
  • the genetically modified pig cells are stable in culture and have high cell uniformity, and the genetically modified pig cells are based on genes that have been established (e.g., established or cloned). Preferably, it is a modified pig cell.
  • a gene group for conditionally expressing the above-mentioned functional protein in a specific tissue or organ it is possible to omit various steps before establishment such as introducing a gene cassette into a safe harbor region.
  • the present invention is excellent in industrial mass production of transgenic pigs from the viewpoint that transgenic pigs into which has been introduced can be produced in one step (for example, substantially one step) of the above-mentioned microinsemination.
  • the above genetically modified pig cells are not particularly limited as long as they have a safe harbor region (preferably in the genome), but include fibroblasts, preadipocytes, embryonic pluripotent cells, somatic stem cells, Examples include induced pluripotent stem cells, preferably fibroblasts, and more preferably fetal fibroblasts.
  • the safe harbor region into which the gene cassette is introduced in the first and second embodiments refers to a region in the genome into which a transgene can be safely inserted, and includes non-coding regions in the genome into which a transgene can be safely inserted.
  • the safe harbor region is preferably the porcine ROSA region or the H11 region, and more preferably the porcine ROSA region.
  • the porcine ROSA region is not particularly limited as long as it is a ROSA region, but a ROSA region existing between exons 1 and 2 of the 13th porcine chromosome is preferred.
  • the functional protein may be expressed in cells throughout the pig individual by the action of the recombinant enzyme (systemic expression possibility), or in a specific tissue. Although it may be expressed in the cells of organs or organs (possibility of local expression), it is preferable that expression is possible at least in "specific tissues or organs" defined in vector (1) above. Breeding and mating of pigs is more complicated than, for example, rodents such as mice.
  • the above-mentioned functional protein is expressible (systemically expressible).
  • the gene cassette containing the construct is introduced into a safe harbor region in the genome, it can be expressed in cells throughout the pig individual (systemic expression possible).
  • the functional protein is not particularly limited as long as it is a protein that exhibits any function, such as a luminescence (e.g., fluorescence, UV light) function, a labeling function (radiation Examples include proteins that exert arbitrary functions such as labeling, arbitrary tags), gene expression regulation functions, gene recognition functions, and functions lethal to cells (for example, acting on and destroying the cytoplasmic membrane).
  • a luminescence e.g., fluorescence, UV light
  • labeling function radiation Examples include proteins that exert arbitrary functions such as labeling, arbitrary tags), gene expression regulation functions, gene recognition functions, and functions lethal to cells (for example, acting on and destroying the cytoplasmic membrane).
  • fluorescent proteins e.g., Green Fluorescent Protein (GFP), modified GFP such as Venus
  • metabolic-related enzymes e.g., thymidine kinase, drug-metabolizing enzymes (CYP), etc.
  • cells proliferation-related factors e.g., regulator of apoptosis BAX, fibroblast growth factor FGF, etc.
  • growth-related gene proteins e.g., growth hormone receptor, insulin-like growth factor receptor, etc.
  • suicide gene proteins e.g. , iCaspase9, etc.
  • the above-mentioned functional proteins include proteins derived from oncogenic mutations, carcinogenic proteins, and reporter proteins for detecting their expression, in order to more reliably improve production efficiency (survival rate) of transgenic pigs.
  • Fluorescent proteins are generally known to be cytotoxic.
  • the above-mentioned cytotoxin is not particularly limited as long as it causes a lethal effect on cells (for example, acts on and destroys the cytoplasmic membrane), and is preferably a polymeric toxic substance, and more preferably a toxic protein.
  • cytotoxins include diphtheria toxin, ⁇ toxin, streptolysin S, ⁇ , ⁇ toxin, and leukocidin, with diphtheria toxin being preferred and diphtheria toxin A being more preferred.
  • Diphtheria toxin is a bacterial toxin produced by the diphtheria bacterium and consists of two domains, A chain and B chain. The A chain acts as the toxin itself, and the B chain binds to receptors on the cell surface and activates the A chain. It has the function of being taken into cells.
  • the gene encoding the cytotoxin includes the gene encoding the cytotoxin described above, preferably the gene encoding diphtheria toxin, and diphtheria toxin A (hereinafter simply referred to as "DTA"). ) is more preferable.
  • a splicing acceptor sequence (splice
  • the construct further contains a gene encoding a functional protein, and is capable of expressing the functional protein using a recombinant enzyme. It is more preferable that it is further included upstream, and even more preferably that it is further included upstream of "the specific sequence and the gene encoding the functional protein.”
  • a gene encoding a functional protein (preferably a specific sequence and a gene encoding a functional protein) is used to control the expression of the functional protein. It may or may not further contain any promoter upstream of.
  • arbitrary promoter include promoters that function in any cell (preferably, various types of cells), and CAG (cytomagalovirus immediate early enhancer-chiken ⁇ -actin hybrid), CMV, RSV promoters, etc. are preferable, and CAG promoter is more preferable.
  • the gene cassette containing the above construct in the first and second aspects may or may not further include a drug selection sequence for selecting genetically modified pig cells (gene knock-in pig cells). If further included, it is preferably included downstream of the gene encoding the functional protein.
  • the drug selection sequence is not particularly limited, but examples include gene cassettes composed of SV40 promoter, puromycin N-acetyltransferase, and pA (polyA) of herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK).
  • genome editing methods can be used, such as lipofection method, electroporation method, calcium phosphate method, etc. It is preferable to introduce the gene cassette and genome editing tool into the cell (preferably into the nucleus) using any transgene introduction technique, and then introduce the gene cassette and genome editing tool into the safe harbor region using the genome editing method.
  • introduction using genome editing methods include introduction using genome editing tools including artificial nucleases for genome editing such as CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas nuclease.
  • tion Activator-Like Effector Nuclease (TALEN) and zinc Introduction may be performed using a genome editing tool containing an artificial restriction enzyme (artificial nuclease) using a finger nuclease (ZFN).
  • the CRISPR/Cas nuclease includes a guide RNA and a Cas nuclease (preferably Cas9). At least a partial sequence in the safe harbor region that is a target includes an oligonucleotide contained in the safe harbor region.
  • a guide RNA specific for at least a partial sequence in the safe harbor region or a DNA encoding the guide RNA, and a nucleic acid encoding a Cas nuclease or a composition containing the Cas nuclease are administered to eukaryotic cells containing the safe harbor region or A gene cassette containing the above construct can be introduced by transfecting eukaryotes.
  • Nucleic acids encoding Cas nucleases or Cas nucleases and guide RNAs or DNA encoding guide RNAs can be prepared by various methods known in the art, such as microinjection, electroporation, DEAE-dextran treatment, lipofection, nanoparticles.
  • Cells can be introduced into cells by methods such as, but not limited to, mediated transfection, protein transduction domain-mediated transduction, virus-mediated gene delivery, and PEG-mediated transfection of protoplasts.
  • Nucleic acids encoding Cas nucleases or Cas nucleases and guide RNAs can also be transferred into organisms by various methods known in the art for administering genes or proteins, such as injection.
  • a nucleic acid encoding a Cas nuclease or a Cas protein can be introduced into a cell in a complex with a guide RNA or separately.
  • Cas nucleases fused to protein transduction domains such as Tat can also be efficiently delivered into cells.
  • the eukaryotic cell or organism is co-transfected or sequentially transfected with Cas9 nuclease and guide RNA.
  • Sequential transfections can be performed by first transfecting with a nucleic acid encoding a Cas nuclease, followed by a second transfection with naked guide RNA.
  • the second transfection is after 3, 6, 12, 18, 24 hours.
  • a guide RNA expression unit may be used for expression of the guide RNA.
  • the guide RNA expression unit is preferably a CRISPR-Cas9 transcription unit that includes a target sequence (at least a partial sequence in the above-mentioned safe harbor region) and a guide RNA, and includes a promoter region (RNA) for expressing the guide RNA. It preferably has a promoter of polymerase III (for example, a promoter selected from the U6 promoter and H1 promoter), a target sequence (at least a partial sequence in the above safe harbor region), and a guide RNA. It is more preferable that a sequence complementary to at least a partial sequence in the region and the guide RNA are seamlessly linked.
  • CRISPR/Cas nuclease can also use a Cas9 variant that cuts only one strand of double-stranded DNA as a nickase to prevent off-targeting.
  • single-stranded Cas9 mutants include Cas9 (D10A).
  • single-stranded Cas9 mutants are produced by combining a guide RNA with a target sequence complementary to one strand of the target DNA and a guide RNA with a target sequence complementary to the other strand in its immediate vicinity. When used, one strand is cut with a specificity of 20 bases, and the other strand is further cut with a specificity of 20 bases, so the DNA is cut with a total specificity of 40 bases, which increases the specificity of the target. This makes it possible to significantly improve performance.
  • Genetically modified pig cells obtained by introducing the gene cassettes in the first and second embodiments into the above-mentioned safe harbor region can be prepared by any method such as limiting dilution of less than one cell per well, genetic analysis, drug resistance, etc. It can be selected and established using the following method.
  • somatic cell cloning (somatic cell cloning technology) for obtaining genetically modified cloned pigs (gene knockin cloned pigs) from the above-obtained (established) genetically modified pig cells (gene knockin cells).
  • Somatic cell cloning technology involves culturing pig cells (preferably genetically modified pig cells) to be cloned and using them as donor cells, and fusion methods such as cell fusion of these donor cells to recipient enucleated eggs (oocytes). This is a technique in which a clone is produced by carrying out nuclear transfer, culturing, and then transplanting and impregnating a foster mother.
  • the above-obtained (established) genetically modified pig cells can be introduced into mature enucleated unfertilized eggs.
  • Sendai virus, cell fusion method using electrical stimulation, or intracytoplasmic injection method can be used.
  • an activation process can be performed to form nuclei. Examples of this activation treatment method include strontium, ethanol, electrical stimulation, and the like.
  • This nucleus can be introduced into an enucleated fertilized egg as a donor for a second nuclear transfer.
  • the above operation may or may not be performed freehand (for example, freehand under a microscope by a skilled person), but may be performed using a micromanipulator.
  • the obtained constructed eggs derived from genetically modified pig cells are cultured, and the embryos that develop into implantable embryos are implanted into the uterus of a foster mother, resulting in genetically modified cloned pigs (genetically modified pig cells) derived from genetically modified pig cells (gene knock-in pig cells). knock-in cloned pigs) can be generated.
  • the above-mentioned documents (a) to (c) describe the creation of genetically modified cloned pigs by somatic cell cloning of genetically modified established pig cells, and the somatic cell cloning of genetically modified pig established cells.
  • the production of genetically modified cloned pigs can be carried out according to the methods described in the above-mentioned documents (a) to (c).
  • the recipient enucleated eggs include pigs, cows, horses, sheep, goats, primates (e.g., humans, great apes (chimpanzees, monkeys, etc.)), and rodents (e.g., mice, rats).
  • Recipient enucleated oocytes of any mammal such as pigs, sheep, goats, primates (e.g. More preferred are recipient enucleated ova of pigs, and particularly preferred are recipient enucleated ova of pigs.
  • the foster parent to which the above-mentioned implantable embryo is implanted may be any animal such as a pig, cow, horse, sheep, goat, primate (e.g., human, ape (chimpanzee, monkey, etc.)), rodent (e.g., mouse, rat), etc. Mammals are preferred, mammals with characteristics such as physique that are closer to humans than rodents are more preferred, pigs, sheep, goats, and primates (eg, humans, apes) are even more preferred, and pigs are particularly preferred.
  • primate e.g., human, ape (chimpanzee, monkey, etc.
  • rodent e.g., mouse, rat
  • Mammals are preferred, mammals with characteristics such as physique that are closer to humans than rodents are more preferred, pigs, sheep, goats, and primates (eg, humans, apes) are even more preferred, and pigs are particularly preferred.
  • spermatozoa sperm of gene knock-in cloned pig
  • the specific organs or tissues include internal organs (for example, pancreas, kidney, ureter, bladder, liver, heart, stomach, (intestines, etc.), reproductive organs (e.g., ovaries, testes, etc.), fertilized eggs, embryos, fetuses, bone marrow (e.g., blood-forming organs), brain, eyes, nose, mouth, skin, nerves, or tissues derived therefrom;
  • reproductive organs e.g., ovaries, testes, etc.
  • fertilized eggs embryos, fetuses, bone marrow (e.g., blood-forming organs)
  • brain eyes, nose, mouth, skin, nerves, or tissues derived therefrom
  • Examples include artificial tissues (cell sheets such as chondrocyte sheets, organoids, etc.), preferably internal organs, reproductive organs, fertilized eggs, embryos, and fetuses, more preferably internal organs and reproductive organs, pancreas (e.g. pancre
  • the promoter expressed in the specific tissue or organ is not particularly limited as long as it is a promoter expressed in the specific tissue or organ. From the viewpoint of reduction, promoters that are expressed early in development, such as promoters that are expressed in stem cells or progenitor cells, are preferred. If the transgene were to be expressed throughout the whole body of a transgenic pig, it would cause damage throughout the body and be fatal, and the production efficiency (survival rate) of transgenic pigs would be low.
  • the promoters expressed in the above-mentioned specific tissues or organs include a promoter that controls transcription of Six2 (hereinafter also simply referred to as "Six2 promoter”) or a promoter that controls transcription of Sall1 (hereinafter also simply referred to as "Sall1 promoter”). ), Six2 promoter, FGF20 promoter, etc., with Six2 promoter or Sall1 promoter being preferred.
  • Both Six2 and Sall1 are known to be expressed, for example, in the kidney, and in particular, are known to be expressed in kidney progenitor cells, etc., and in particular, are known to be expressed in the metanephric mesenchymal region, etc. In particular, it is known to be expressed in progenitor cells of the metanephric mesenchymal region.
  • Six2 is known to be particularly expressed in the undifferentiated metanephric mesenchymal region surrounding the tip of the ureteric bud.
  • the vector (1) in the first embodiment includes plasmid vectors, virus vectors, artificial chromosome vectors, etc., and plasmid vectors or artificial chromosome vectors are preferred.
  • the plasmid vector and viral vector include any cloning vector.
  • a cloning vector for example, the pCR4Blunt-TOPO vector (manufactured by Thermo Fisher Scientific) is commercially available and can be used in the present invention.
  • artificial chromosome vectors include bacterial artificial chromosomes (BAC), yeast artificial chromosomes (YAC), P1 phage-derived artificial chromosomes (PAC), porcine artificial chromosomes, etc., with BAC, YAC, or PAC being preferred.
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosomes
  • PAC P1 phage-derived artificial chromosomes
  • porcine artificial chromosomes etc.
  • the above-mentioned vector (1) may be linear or circular, but linear is preferable from the viewpoint of being subjected to the microinsemination described below and from the viewpoint of amplification. Linearization can be performed by any method.
  • Microinsemination introductioncytoplasmic sperm injection; also known as ICSI
  • the egg preferably an egg, more preferably a mature egg
  • a solution containing the sperm of the genetically modified cloned pig (sperm of the gene knock-in cloned pig) and the vector (1) described above can be performed via microinsemination (ICSI mediated gene transfer method).
  • Microinsemination can be performed by injecting a liquid containing the sperm and the vector (1) into the egg (preferably a mature egg) by any method (e.g., injection, glass tube, capillary tube) and fertilizing the egg. .
  • the above-mentioned injection operation may or may not be performed freehand (for example, freehand under a microscope by a skilled person), but may be performed using a micromanipulator.
  • the obtained fertilized eggs may or may not be activated by ultrasonication.
  • the fertilized egg is implanted into the uterus of a recipient female (foster parent) to generate the desired transgenic pig (double genetically modified pig).
  • the liquid containing the spermatozoa and the vector (1) is not particularly limited as long as it allows the spermatozoa and the vector (1) to coexist, but it may optionally contain inorganic salts, buffers, nutritional components, serum albumin, etc. Examples include any aqueous solution, any buffer solution, any culture solution, etc., with a pH of around 7.0 to 8.0.
  • the pig eggs to be subjected to the above-mentioned microinsemination are preferably eggs, and more preferably mature eggs.
  • a third aspect of the present invention includes a promoter that is expressed in a specific tissue or organ, and a gene encoding the recombinant enzyme that is present downstream of and under control of the promoter that is expressed in a specific tissue or organ,
  • a promoter expressed in a specific tissue or organ, a gene encoding the recombinant enzyme that exists downstream of and is under the control of the promoter expressed in a specific tissue or organ is the gene-transgenic pig (preferably, the gene encoding the recombinant enzyme) It may be present (integrated) at any location in the transgenic pig's cells), for example, in the cytoplasm, genome, mitochondrial genome, etc. of the transgenic pig (preferably the transgenic pig's cells). It is preferable to be present (integrated) in the cytoplasm or genome. When present in the cytoplasm, it may be present in a form contained in a plasmid.
  • the above-mentioned safe harbor region containing the above-mentioned gene cassette containing the above-mentioned construct containing a gene encoding a functional protein contains "a promoter that is expressed in a specific tissue or organ, or a promoter that is expressed in a specific tissue or organ downstream of the above-mentioned promoter.
  • the gene encoding the recombinant enzyme that exists and is under control may or may not be present (or integrated), but from the viewpoint of the balance of expression levels between the regulatory gene cassette and the functional gene cassette, Preferably, it is not present (incorporated) in the safe harbor area.
  • the transgenic pig according to the third aspect can be produced by the manufacturing method according to the first aspect.
  • promoter expressed in a specific tissue or organ include those similar to the specific examples and preferred examples described above for the first aspect. .
  • the transgenic pigs (double genetically modified pigs) produced by the production method according to the first aspect and the transgenic pigs according to the third aspect may be fetuses, juveniles, or adults; From the viewpoint of low sex, a fetus is preferable.
  • the transgenic pig produced by the production method according to the first aspect and the transgenic pig according to the third aspect selectively (preferably tissue or organ-specifically) Specific functional proteins can be conditionally expressed within tissues or organs.
  • the functional protein is a cytotoxin
  • at least some of the cells in the tissue or organ can be conditionally killed.
  • cells inside the tissue or organ excluding cells on the surface and surface layer of the tissue or organ
  • the internal cells preferably, cells inside the tissue or organ excluding cells on the surface and surface layer of the tissue or organ.
  • the transgenic pig produced by the production method according to the first aspect and the transgenic pig according to the third aspect express a specific functional protein in a period-specific condition. You can also do it.
  • the functional protein is a cytotoxin
  • at least some of the cells in the tissue or organ preferably can also conditionally kill cells inside the tissue or organ (excluding cells on the surface and surface layer of the tissue or organ) in a time-specific manner.
  • the transgenic pig (double genetically modified pig) produced by the production method according to the first aspect and the transgenic pig according to the third aspect may or may not be materials for somatic cell cloning.
  • somatic cells are obtained or collected by any method from a transgenic pig (double genetically modified pig) produced by the production method according to the first aspect, or a transgenic pig according to the third embodiment.
  • the above-mentioned somatic cells are used as donor cells, and the donor cells are nuclear-transferred into recipient enucleated eggs (oocytes) by a fusion method such as cell fusion, and after culturing, they are transplanted and impregnated into foster mothers to create clones. It's okay.
  • the present invention relates to transgenic pigs (double genetically modified pigs) produced by the production method according to the first aspect, and transgenic pigs produced from the transgenic pig according to the third aspect (e.g., established, cloned). It is also an invention related to somatic cells. Since the somatic cells have been established, the culture is stable and the cells are highly homogeneous. As a result, the transgenic pig (double genetically modified pig) produced by the production method according to the first aspect and the clone of the transgenic pig according to the third embodiment are excellent in industrial mass production.
  • the transgenic pig (double genetically modified pig) produced by the production method according to the first aspect and the transgenic pig according to the third aspect may contain the above-mentioned clone.
  • Tissues or organs can be industrially produced from the transgenic pig (double genetically modified pig) produced by the production method according to the first embodiment or the transgenic pig according to the third embodiment.
  • the fourth aspect of the present invention is a tissue extracted by any method from the transgenic pig (double genetically modified pig) produced by the production method according to the first aspect or the transgenic pig according to the third aspect. Or an organ.
  • the organs or tissues mentioned above include internal organs (e.g. pancreas, kidney, ureter, bladder, liver, heart, stomach, intestines, etc.), reproductive organs (e.g. ovaries, testes, etc.), fertilized eggs, embryos, fetuses, bone marrow (e.g.
  • tissue or organ can conditionally express a specific functional protein within the tissue or organ.
  • the functional protein when the functional protein is a cytotoxin, at least a portion of the cells in the tissue or organ (preferably excluding cells on the surface and superficial layer of the tissue or organ) (cells inside the tissue or organ) can be conditionally killed.
  • the functional protein when the functional protein is a cytotoxin, at least a portion of the cells (preferably inside the tissue or organ excluding the surface and superficial cells of the tissue or organ) It is possible to replace the conditionally killed portion of cells (cells) with a foreign substance.
  • the foreign substance refers to a substance originating from a source other than the above tissue or organ, and includes substances derived from humans or animals, drugs (eg, pharmaceuticals), and the like. Examples of the substance include cells, growth factors, hormones, cytokines, and the like, with cells being preferred.
  • the above cells may or may not be established cells (eg, genetically modified cells, ES cells, iPS cells).
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the gene cassette containing the loxP-Venus gene constructed above.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the gene cassette containing the loxP-Venus gene constructed above.
  • SA indicates a splicing acceptor sequence for accepting transcription by the ROSA promoter into the gene cassette
  • STOP indicates a sequence in which three SV40 poly A signal cassettes are linked
  • Pause indicates a sequence of human ⁇ 2 globin.
  • gene RNA polymerase II transcriptional pause signal sequence Venus indicates the Venus sequence
  • pA indicates the 3'-UTR (untranslated region) of the Rabbit ⁇ -globin gene
  • PuroR indicates the SV40 promote r, puromycin N-acetyltransferase, and herpes
  • pA poly A
  • HSV-TK simplex virus thymidine kinase
  • ⁇ Reference example 2> (Construction of tissue- or organ-specific CreERT2 expression vector) Approximately 7 k bases upstream of the region around the start codon of the mouse Six2 gene is used as the mSix2 promoter, and the gene cassette in which CreERT2 and pA are linked to the 3' end of the mSix2 promoter is inserted into the pCR4Blunt-TOPO vector (manufactured by Thermo Fisher Scientific). A tissue- or organ-specific CreERT2 expression vector was constructed.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the CreERT2 expression vector constructed above. In FIG. 2, pA indicates the 3'-UTR of the Rabbit ⁇ -globin gene.
  • the obtained tissue- or organ-specific CreERT2 expression vector was linearized and then used in the microinsemination method (ICSI mediated gene transfer method) described below.
  • FIG. 3(a) is a schematic diagram of the gene cassette containing the loxP-DTA gene constructed above.
  • FIG. 3(a) is a schematic diagram of the gene cassette containing the loxP-DTA gene constructed above.
  • SA indicates a pricing acceptor sequence for promoting transcription by the ROSA promoter
  • STOP indicates a sequence in which three SV40 poly A signal cassettes are linked
  • Pause indicates a sequence of human ⁇ 2 globin gene.
  • RNA polymerase II transcriptional pause signal sequence DTA indicates diphtheria toxin A fragment sequence
  • pA indicates 3'-UTR (untranslated region) of Rabbit ⁇ -globin gene
  • PuroR indicates SV40 promoter
  • puroR omycin N-acetyltransferase and herpes simplex virus thymidine kinase HSV-TK).
  • FIG. 3(b) is a schematic diagram of knock-in of the above gene cassette into the ROSA region.
  • the gene cassette containing the loxP-DTA gene, the gRNA complex, and the RNP complex consisting of recombinant Cas9 were introduced into 5.0 ⁇ 10 5 fetal pig fibroblast cells by electroporation.
  • the above gRNA complex consists of tracrRNA (Trans-activating crRNA) and porcine ROSA region-gRNA (guide RNA) represented by the following sequence.
  • the following sequence possessed by the pig ROSA region-gRNA is located from 65,757,140 to 65,757,159 on the 13th pig chromosome, and is a sequence that exists between exons 1 and 2 of ROSA.
  • the above gene position number is the position number in the UCSC genome browser as of May 24, 2022, and may change due to database updates.
  • FIG. 4 is an electropherogram showing the results of confirmation of knock-in of the gene cassette into the ROSA region. As is clear from the results shown in FIG. 4, it was confirmed that the gene cassette was knocked into the ROSA region.
  • enucleated unfertilized eggs in the second meiotic metaphase obtained by maturing eggs collected from the ovaries of wild-type sows in vitro were used as recipient cytoplasm.
  • the nuclear transfer operation was performed in an egg operation solution. Electrofusion method was used to fuse nuclear donor cells and recipient cytoplasm. After the fused eggs were cultured in a culture solution for 30 minutes to 1 hour, direct current electrical stimulation was applied. At least some of those eggs successfully activated and began development.
  • embryos that split normally on days 1 to 2 or embryos that develop into blastocysts on days 5 to 6 are transferred to the oviduct or uterus of embryonic pigs whose oestrus cycle has been synchronized. It was transplanted to. Neonates were born from at least some of the transplanted embryos, making it possible to construct genetically modified cloned pigs.
  • Sperm were collected from the genetically modified cloned pigs obtained above. The above-mentioned sperm can be used in the subsequent microinsemination method (ICSI mediated gene transfer method).
  • ⁇ Reference example 4> Construction of transgenic pigs using tissue- or organ-specific CreERT2 expression vectors via ICSI
  • the spermatozoa used in the microinsemination method were subjected to ultrasonication to separate the head and tail.
  • the sonication intensity was such that approximately 70% of the spermatozoa had their heads and tails separated.
  • An injection pipette was used to inject into the oocyte. After confirming that the injection pipette had reached the egg cytoplasm, the sperm head was immediately injected into the egg. Sperm injections were performed in egg handling solution.
  • Pre-implantation culture After ICSI, the eggs injected with sperm were transferred into a PZM5 culture solution drop prepared on a plastic culture dish (manufactured by IWAKI). At 20 and 44 hours of culture, normal one-cell stage embryos and normal split embryos were observed. Alternatively, blastocyst stage embryos were observed at 116 and 140 hours.
  • Embryo transfer The embryos cultured for the above period in microdroplets of PZM culture solution were transferred into the oviduct or uterus of recipient pigs. Normal one-cell stage embryos and normal cleavage embryos were transplanted into the oviduct within 1 day after ovulation, and blastocysts were transplanted into the uterus 4 days after ovulation.
  • sex determination test A total of 42 fetuses were obtained from four embryonic recipient pigs (#236, #365, K364, #238). After obtaining the tail from the fetus, genomic DNA was extracted using a DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue Kit, manufactured by QIAGEN), and sex was determined by PCR using primers targeting amelogenin (AMEL X and AMEL Y). . The electropherograms of the sex determination results for the 42 animals obtained are shown in FIG. As is clear from FIG.
  • FIG. 7 is an electropherogram showing the gene introduction determination results.
  • M is a DNA molecular weight marker
  • N is a negative control, using wild-type pig genomic DNA
  • P is a positive control, using a CreERT2 expression gene vector.
  • CreERT2 primer sequence 1 st 5'-CATGTCCATGCTGCCCACCTTCG-3' (SEQ ID NO: 9)/5'-GTATATCCTGGCAGCGATCGC-3' (SEQ ID NO: 10) 2nd : 5'-TCGCAAGAACCTGATGGACA-3' (SEQ ID NO: 11)/5'-CGCCGCATAACCAGTGAAAC-3' (SEQ ID NO: 12)
  • FIG. 8 is an electropherogram showing the results of confirmation of CreERT2 expression in the fetal metanephros.
  • +RT is data with reverse transcriptase for sample amplification.
  • all metanephros of the tissue- or organ-specific CreERT2-expressing gene-modified pig fetuses (#236-2, 5, 6, #365-3, 4, and 12) were expressed under the mouse Six2 promoter. CreERT2 gene expression was confirmed.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of determining the copy number of transgenes in the diploid genome.
  • ⁇ -actin is an internal standard (2 copies).
  • the copy number of the transgene in #236-2 is 5 copies
  • the copy number of the transgene in #236-5 is 2 copies.
  • the copy number of the transgene in #236-6 is 1 copy
  • the copy number of the transgene in #365-3 is 16 copies
  • the copy number of the transgene in #365-4 is 6 copies.
  • the copy number of the transgene in #365-12 is 19 copies
  • the copy number of the transgene in #238-5 is over 200 copies
  • the copy number of the transgene in #238-7 is There were 10 copies.
  • fetuses of transgenic pigs were obtained in which one or more copies, and even more than 200 copies, of the tissue- or organ-specific CreERT2 gene were introduced per individual (diploid).
  • Example 1> Establishment of cells into which a gene cassette containing the loxP-Venus gene was introduced into the ROSA region by CRISPR/Cas9
  • the RNP complex consisting of the loxP-Venus gene-containing gene cassette constructed above in ⁇ Reference Example 1>, the gRNA complex, and recombinant Cas9 was produced at 5.0 ⁇ 10 5 fetal pig fibroblast cells were introduced.
  • the gRNA complex consists of tracrRNA (Trans-activating crRNA) and the porcine ROSA region-gRNA (guide RNA) represented by the sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the following sequence possessed by the pig ROSA region-gRNA is located from 65,757,140 to 65,757,159 on the 13th pig chromosome, and is a sequence that exists between exons 1 and 2 of ROSA.
  • the above gene position number is the position number in the UCSC genome browser as of May 24, 2022, and may change due to database updates. After selection for puromycin resistance, limiting dilution of less than one cell per well was performed, and genetic analysis was performed on the clones derived from the proliferated single cells, and the gene cassette containing the loxP-Venus gene constructed above was transferred to pig ROSA. Genetically modified pig cells introduced into the area were established.
  • Genetically modified pig cells obtained by introducing the gene cassette containing the loxP-Venus gene into the pig ROSA region were placed in a 35 mm diameter dish at 5 x 10 cells in Dulbecco's modified Eagle (DMEM) culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). 5 cells are seeded and passaged once. 14 to 18 hours after passage, half of the culture solution is removed, and after 2 hours of culture, the culture solution is collected by gentle pipetting, and the cells are collected by centrifugation at 1000 rpm for 3 minutes. This will be used as a donor nucleus for nuclear transplantation.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle
  • FBS fetal bovine serum
  • enucleated unfertilized eggs in the second meiotic metaphase obtained by maturing eggs collected from the ovaries of wild-type sows in vitro were used as recipient cytoplasm.
  • the nuclear transfer operation was performed in an egg operation solution. Electrofusion method was used to fuse nuclear donor cells and recipient cytoplasm. After the fused eggs were cultured in a culture solution for 30 minutes to 1 hour, direct current electrical stimulation was applied. At least some of those eggs successfully activated and began development.
  • embryos that split normally on days 1 to 2 or embryos that develop into blastocysts on days 5 to 6 are transferred to the oviduct or uterus of embryonic pigs whose oestrus cycle has been synchronized. It was transplanted to. Neonates were born from at least some of the transplanted embryos, making it possible to construct genetically modified cloned pigs.
  • Sperm were collected from the genetically modified cloned pigs obtained above. The above-mentioned sperm can be used in the subsequent microinsemination method (ICSI mediated gene transfer method).
  • tissue- or organ-specific CreERT2 expression vector constructed in the above ⁇ Reference Example 2> and the above pig sperm head were co-cultivated in a culture solution, and the ICSI operation, oocyte culture, and embryo transfer were carried out in the same manner as in the above ⁇ Reference Example 4>.
  • Normally developed transgenic pig fetuses are obtained from embryonic recipient pigs by embryo transfer into the recipient pig's uterus.
  • Tamoxifen is administered to a sow carrying the above normally developed fetus, or the metanephros collected from the above normally developed fetus is transplanted into an immunodeficient mouse, then tamoxifen is administered to the mouse, or the collected metanephros is cultured in vitro.
  • tamoxifen is administered to the solution, Venus fluorescence can be observed conditionally in a specific tissue or organ.
  • ⁇ Example 2> (Construction of transgenic pigs using tissue- or organ-specific CreERT2 expression vectors via ICSI)
  • Sperm of a genetically modified cloned pig into which the tissue- or organ-specific CreERT2 expression vector constructed in ⁇ Reference Example 2> above and the gene cassette containing the loxP-DTA gene obtained in ⁇ Reference Example 3> above have been introduced are placed in a culture medium.
  • Normally developed fetuses of transgenic pigs are obtained from the recipient pigs by co-culturing, performing the same ICSI operation as in ⁇ Reference Example 4>, culturing eggs, and transplanting the embryos into the uterus of the recipient pigs.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing all-in-one vector 1 containing both the mSix2 promoter and CreERT2 and loxP-DTA genes constructed above.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing all-in-one vector 2 containing both the mSix2 promoter and CreERT2 and loxP-DTA genes constructed above.
  • the obtained all-in-one vectors 1 and 2 containing both the mSix2 promoter and CreERT2 and loxP-DTA genes were linearized and used in the following ICSI.
  • Transgenic pigs were produced in the same manner as in Example 1 except that the "tissue- or organ-specific CreERT2 expression vector" was changed to the all-in-one vector 1 or 2 containing both the mSix2 promoter and the CreERT2 and loxP-DTA genes. was constructed.
  • the results of constructing transgenic pigs using all-in-one vector 1 or 2 via ICSI are summarized in Tables 1 and 2 below.
  • transgenic pig fetuses were obtained by gene transfer using all-in-one vector 1 via ICSI, the production efficiency of transgenic pig fetuses was less than 0.35%. Efficiency was extremely low. This is thought to be due to the unbalanced (excessive) copy number of the loxP-DTA gene with respect to the copy number of the CreERT2 gene.
  • transgenic pigs using an all-in-one vector containing both the mSix2 promoter and CreERT2 and loxP-DTA genes.

Abstract

組織ないし臓器選択的に、当該組織ないし臓器内で特定の機能性タンパク質を発現するための遺伝子群が導入された遺伝子導入ブタの製造方法、それに使用される体細胞クローニング原料、遺伝子導入ブタ、それから樹立された体細胞、及びそれから摘出された組織ないし臓器を提供すること。　機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域へ導入して得られた遺伝子改変ブタ細胞を体細胞クローニングして得られる遺伝子改変クローンブタの精子と、　ベクター（１）とを含む液を卵に顕微授精することにより遺伝子導入する工程を含む遺伝子導入ブタの製造方法であって、　前記ベクター（１）が、　特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含む、製造方法。

Description

遺伝子導入ブタの製造方法、体細胞クローニング原料、遺伝子導入ブタ、樹立された体細胞、及び組織ないし臓器
　本発明は、遺伝子導入ブタの製造方法、それに使用される体細胞クローニング原料、遺伝子導入ブタ、それから樹立された体細胞、及びそれから摘出された組織ないし臓器に関する。
　組織ないし臓器選択的なコンディショナル（条件的）に、更には時期選択的なコンディショナルに当該組織ないし臓器内で特定の機能性タンパク質を発現することができる遺伝子導入ブタの開発が求められている。
　ブタは、例えば、マウス等のげっ歯類と比較して、繁殖ないし交配が煩雑である。このことから、コンディショナルな遺伝子発現を行うための制御遺伝子カセットと、機能性タンパク質をコードする遺伝子を含む機能遺伝子カセットとの両方を含むベクターをブタに遺伝子導入して遺伝子導入ブタを製造することを、本発明者らは当初試みていた。
　しかしながら、本発明者らは、コンディショナルな遺伝子発現を行うための制御遺伝子カセットと、機能性タンパク質をコードする遺伝子を含む機能遺伝子カセットとの両方を含むベクターのブタへの遺伝子導入は致死的であり、当該ブタは死滅してしまうことを見出している。その結果、コンディショナルに特定の組織ないし臓器内で上記機能性タンパク質を発現するための遺伝子群が導入された遺伝子導入ブタを製造することは困難であることを見出している（後述の比較例）。
　本発明は、以上のような従来技術の問題に鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、組織ないし臓器選択的に、当該組織ないし臓器内で特定の機能性タンパク質を発現するための遺伝子群が導入された遺伝子導入ブタの製造方法、それに使用される体細胞クローニング原料、遺伝子導入ブタ、それから樹立された体細胞、及びそれから摘出された組織ないし臓器の提供にある。
　本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、機能性タンパク質をコードする遺伝子を含む機能遺伝子カセットによる遺伝子導入と、コンディショナルな遺伝子発現を行うための制御遺伝子カセットを含むベクターによる遺伝子導入とを分割して２段階の遺伝子導入とすることにより、コンディショナルに当該組織ないし臓器内で機能性タンパク質を発現ための遺伝子群が導入された遺伝子導入ブタを製造することができることを見出した。つまり、機能性タンパク質をコードする遺伝子を含む機能遺伝子カセットを遺伝子導入した遺伝子改変クローンブタを構築した後、構築された遺伝子改変クローンブタを、制御遺伝子カセットを含むベクターにより更に遺伝子導入することにより、コンディショナルに当該組織ないし臓器内で機能性タンパク質を発現するための遺伝子群が導入された遺伝子導入ブタを製造することができることを見出した。
本発明は、上記知見に基づき完成されるに至ったものである。
　すなわち本発明は以下の通りである。
＜１＞機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域へ導入して得られた遺伝子改変ブタ細胞を体細胞クローニングして得られる遺伝子改変クローンブタの精子と、
　ベクター（１）とを含む液を卵に顕微授精することにより遺伝子導入する工程を含む遺伝子導入ブタの製造方法であって、
　前記ベクター（１）が、
　特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含む、製造方法。
＜２＞前記セーフハーバー領域がＲＯＳＡ領域である、＜１＞に記載の方法。
＜３＞前記ベクター（１）がプラスミドベクター、又は、人工染色体ベクターである、＜１＞に記載の方法。
＜４＞上記＜１＞～＜３＞請求項１～３のいずれか１項に記載の方法により製造された遺伝子導入ブタから樹立された体細胞。
＜５＞機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域中に含む遺伝子改変ブタ細胞を含む、体細胞クローニング原料であって、
　下記ベクター（１）共存下の顕微授精による遺伝子導入用原料を提供するための、体細胞クローニング原料。
　（１）特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含む、ベクター
＜６＞特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含み、
　機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域中に含む、遺伝子導入ブタ。
＜７＞上記＜６＞に記載の遺伝子導入ブタから樹立された体細胞。
＜８＞上記＜６＞に記載の遺伝子導入ブタから摘出された組織ないし臓器。
＜９＞機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域中に含む遺伝子改変ブタ細胞の使用であって、
　下記ベクター（１）共存下の顕微授精による遺伝子導入用原料を提供するための体細胞クローニング原料への前記使用。
　（１）特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含む、ベクター
　本発明によれば、組織ないし臓器選択的に（好ましくは組織ないし臓器特異的に）、当該組織ないし臓器内で特定の機能性タンパク質をコンディショナルに発現させるための遺伝子群が導入された遺伝子導入ブタの製造方法、それに使用される体細胞クローニング原料、遺伝子導入ブタ、それから樹立された体細胞、及びそれから摘出された組織ないし臓器を提供することができる。
図１は、参考例１において構築したｌｏｘＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含む遺伝子カセットを示す概略図である。 図２は、参考例２において構築したＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターを示す概略図である。 図３は、参考例３において構築したｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットを示す概略図である。 図４は、上記遺伝子カセットのＲＯＳＡ領域へのノックイン確認結果を示す電気泳動図である。 図５は、ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットをブタＲＯＳＡ領域に導入した遺伝子改変ブタ細胞のタモキシフェンによる細胞死誘導確認結果を示す図である。 図６は、雌雄判定結果の電気泳動図を示す図である。 図７は、遺伝子導入判定結果の電気泳動図を示す図である。 図８は、胎仔後腎でのＣｒｅＥＲＴ２発現確認結果を示す電気泳動図である。 図９は、個体（二倍体ゲノム）中のトランス遺伝子のコピー数決定結果を示す図である。 図１０は、比較例のｍＳｉｘ２プロモーター及びＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクター１を示す概略図である。 図１１は、比較例のｍＳｉｘ２プロモーター及びＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクター２を示す概略図である。
　以下、本発明の実施態様について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施態様に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。
≪遺伝子導入ブタの製造方法≫
　本発明の第１の態様は、機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域へ導入して得られた遺伝子改変ブタ細胞を体細胞クローニングして得られる遺伝子改変クローンブタの精子と、
　ベクター（１）とを含む液を卵に顕微授精することにより遺伝子導入する工程を含む遺伝子導入ブタの製造方法である。
　（１）特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含む、ベクター。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタは、上記遺伝子カセットの上記セーフハーバー領域への遺伝子導入（第１の遺伝子導入）、及び、上記顕微授精を介した上記ベクター（１）による第２の遺伝子導入がなされており、二重遺伝子導入ブタ（ダブル遺伝子改変ブタ）とも言える。
　本発明において、上記遺伝子導入ブタは、組織ないし臓器選択的に、当該組織ないし臓器内で特定の機能性タンパク質をコンディショナルに発現させることができる遺伝子導入ブタであることが好ましい。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタは、機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットを含む。
　また、第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタは、特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、上記プロモーターの下流に存在し制御下にある上記組み換え酵素をコードする遺伝子を含む。
　それにより、上記組み換え酵素を上記コンストラクトと（好ましくは細胞内で、より好ましくは核内で）共存させることにより、コンディショナルに（条件的に（好ましくは、上記組み換え酵素発現依存的に））上記機能性タンパク質を発現することができる。
　つまり、第１の態様に係る製造方法において、上記組み換え酵素をコードする遺伝子を含むベクター（１）を含む液を卵に顕微授精させることにより、コンディショナルに（条件的に（好ましくは、上記組み換え酵素発現依存的に））上記機能性タンパク質を発現可能とする遺伝子導入ブタを製造することができる。
　その結果として、第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタは、組織ないし臓器選択的に（好ましくは組織ないし臓器特異的に）、当該組織ないし臓器内で上記機能性タンパク質を発現することができる。
　ブタにおいては、コンディショナルな遺伝子発現を行うための制御遺伝
子カセットは多い（多コピー数）ことが要求されることと比較して、機能性タンパク質をコードする遺伝子を含む機能遺伝子カセットは、少量（少コピー数）で十分である。制御遺伝子カセットによるコンディショナルな発現を行うために十分な遺伝子導入（トランスフェクト）が達成されると、上記機能遺伝子カセットのコピー数が多すぎて、制御遺伝子カセットと機能遺伝子カセットとの量的なバランスが、ブタにとっては十分に適切ではないことが、従来技術の問題として、上記遺伝子導入ブタの製造を困難にしていると本発明者らは推測している。また、機能遺伝子カセットの非特異的発現（リーク）の発生も、上記遺伝子導入ブタの製造を困難にしている従来技術の問題の理由と本発明者らは推測している。
　より具体的には、例えば、上記制御遺伝子カセットと、上記機能遺伝子カセットとの両方を含むオールインワン型ベクター（後述の比較例参照）の組込みコピー数が低い場合、組織特異的に組み換え酵素を発現する遺伝子の発現量が不十分となり、その結果、機能性タンパク質をコードする遺伝子の発現が不十分となる。
　一方、上記制御遺伝子カセットと、上記機能遺伝子カセットとの両方を含むオールインワン型ベクターの組込みコピー数が多い場合、機能性タンパク質をコードする遺伝子の発現が、リークにより致死的に過剰となり、当該ブタが死滅してしまう。その結果、遺伝子導入ブタの作出効率（生存率）への影響等が生じる。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ、後述する第３の態様に係る遺伝子導入ブタにおいて、上記機能性タンパク質をコードする遺伝子のコピー数としては特に制限はないが、ブタ個体（二倍体ゲノム）当たり、例えば、１コピー以上が挙げられ、２コピー以上が好ましく、４コピー以上が更に好ましい。
　上記機能性タンパク質をコードする遺伝子のコピー数の上限としては特に制限はないが、ブタ個体（二倍体ゲノム）当たり、例えば、２００コピー以下、１００コピー以下、５５０コピー以下等が挙げられる。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ、後述する第３の態様に係る遺伝子導入ブタにおいて、上記組み換え酵素をコードする遺伝子のコピー数としては特に制限はないが、ブタ個体（二倍体ゲノム）当たり、例えば、１コピー以上が挙げられ、２コピー以上が好ましく、４コピー以上がより好ましく、７コピー以上が更に好ましく、１５コピー以上が特に好ましく、３０コピー以上がとりわけ好ましい。
　上記組み換え酵素のコピー数の上限としては特に制限はないが、ブタ個体（二倍体ゲノム）当たり、例えば、５００コピー以下、３００コピー以下、１００コピー以下等が挙げられる。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ、後述する第３の態様に係る遺伝子導入ブタにおいて、上記機能性タンパク質をコードする遺伝子のコピー数／上記組み換え酵素をコードする遺伝子のコピー数の比率としては、１／２～１／３００が挙げられ、２／３～２／１００が好ましく、３／５～３／５０がより好ましく、４／６～４／２０が更に好ましい。遺伝子導入ブタの作出効率（生存率）向上の観点からである。
　第１の態様において、上記コンストラクトとしては、上記機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、かつ組み換え酵素によって上記機能性タンパク質が発現可能となる限り特に制限はなく、ＤＮＡコンストラクト、ｃＤＮＡコンストラクト、ＲＮＡコンストラクト等の核酸コンストラクト（好ましくは遺伝子コンストラクト）が挙げられる。
　第１の態様において、上記コンストラクトは、上記組み換え酵素が選択的に（好ましくは特異的に）認識する特定配列を含むことが好ましく、上記組み換え酵素が選択的に（好ましくは特異的に）認識する少なくとも１対の特定配列を含むことがより好ましい。
　それにより、上記組み換え酵素が少なくとも１対の特定配列（好ましくは少なくとも１対の特定配列）を選択的に認識することにより、コンディショナルな（条件的（好ましくは、上記組み換え酵素発現依存的））組み換えを起こすことができる。
　上記組み換え酵素と、それにより選択的に認識される特定配列（好ましくは少なくとも１対の特定配列）の組み合わせとしては、下記（イ）～（ニ）の組み合わせが挙げられ、下記（イ）Ｃｒｅリコンビナーゼと、少なくとも１対のＬｏｘ配列との組み合わせが好ましい。
　（イ）Ｃｒｅリコンビナーゼと、少なくとも１対のＬｏｘ配列との組み合わせ、
　（ロ）出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来の組換え酵素ＦＬＰと、下記ＦＲＴ配列との組み合わせ（Broach, J.R., Guarascio, V.R., & Jayaram, M. (1982). Recombination within the yeast plasmid 2mu circle is site-specific. Cell, 29(1), 227-34.）
ＦＲＴ配列：5'-GAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3'（配列番号７）
　（ハ）醤油酵母（Zygosaccharomyces rouxii）由来の組換え酵素ＲとＲＳ配列との組み合わせ（Araki, H., Jearnpipatkul, A., Tatsumi, H., Sakurai, T., Ushio, K., Muta, T., & Oshima, Y. (1985). Molecular and functional organization of yeast plasmid pSR1. Journal of molecular biology, 182(2), 191-203.）
　（ニ）バクテリオファージMu由来の組換え酵素Ｇｉｎとｇｉｘ配列との組み合わせ（Maeser, S., & Kahmann, R. (1991). The Gin recombinase of phage Mu can catalyse site-specific recombination in plant protoplasts. Molecular & general genetics : MGG, 230(1-2), 170-6.）
　上記特定配列としては、上記Ｌｏｘ配列が好ましく、上記Ｌｏｘ配列の中でも、バクテリオファージＰ１に由来する３４塩基のｌｏｘＰ配列が代表例であり、いわゆるＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムを構築することができる。
　１対のｌｏｘＰ配列の一例を以下に示す。
5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'（配列番号１）
　上記の通り、Ｃｒｅ結合部位である両末端の１３塩基は対称で、中心部の８塩基は非対称であることが分かる。
　ｌｏｘＰには方向性があり、１対のＬｏｘ配列が同じ方向（同じ向き）に配置されていれば、その間の配列が、Ｃｒｅによって環状ＤＮＡとして切り出される。切り出された環状ＤＮＡが元に戻ることは稀であり、上記切り出しは実質的に不可逆的と言える。
　一方、１対のＬｏｘ配列が逆方向（逆向き）に配置されていれば、その間の配列が反転する（向きが入れ替わる）。上記反転は可逆的と言える。
　第１の態様において、少なくとも１対のＬｏｘ配列は１～４対のＬｏｘ配列が好ましく、１～３対のＬｏｘ配列がより好ましく、１又は２対のＬｏｘ配列が更に好ましい。
　少なくとも１対のＬｏｘ配列としては、代表例として上記したｌｏｘＰ配列のみならず、ｌｏｘ５１１配列、ｌｏｘ２２７２配列、ｌｏｘＦＡＳ配列、ｌｏｘＲＥ配列、ｌｏｘＬＥ配列等が挙げられ、これらのうちの２対以上を組み合わせて使用してもよい。
　ｌｏｘ５１１配列、ｌｏｘ２２７２配列、ｌｏｘＦＡＳ配列、ｌｏｘＲＥ配列、ｌｏｘＬＥ配列の一例を以下に示す。下記配列中、小文字はｌｏｘＰ配列と相違する塩基である。
lox511:5'-ATAACTTCGTATAGtATACATTATACGAAGTTAT-3'（配列番号２）
lox2272:5'-ATAACTTCGTATAGgATACtTTATACGAAGTTAT-3'（配列番号３）
loxFAS:5'-ATAACTTCGTATAtacctttcTATACGAAGTTAT-3'（配列番号４）
lox RE:5'-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAcggta-3'（配列番号５）
lox LE:5'-taccgTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3'（配列番号６）
　ｌｏｘＰ－ｌｏｘＰ間、ｌｏｘ５１１－ｌｏｘ５１１間、ｌｏｘ２２７２－ｌｏｘ２２７２間はそれぞれ特異的に組換えを起こす一方、ｌｏｘＰ－ｌｏｘ５１１間、ｌｏｘＰ－ｌｏｘ２２７２間では組換えを起こすことはないことが知られている。
　この特異的組み換え特性を利用して、２対以上のＬｏｘ配列（各々の１対の配列間では逆方向（逆向き）に配置）を使用して、目的遺伝子（機能性タンパク質をコードする遺伝子）を逆向きに配置し（不活性型）、Ｃｒｅによって「不可逆的に」組換えを起こしてエクソンフリップにより活性化するＦＬＥｘ（Flip-excision）ｓｗｉｔｃｈとすることができる（実験医学２０１４年１１月号Ｖｏｌ．３２Ｎｏ．１８）。これにより、１対のＬｏｘ配列が逆方向（逆向き）に配置されている場合の反転の可逆性を克服することができる。
　ＦＬＥｘ　ｓｗｉｔｃｈとする場合、２対のＬｏｘ配列の組み合わせとしては、１対のｌｏｘＰと、１対のｌｏｘ２２７２との組み合わせ、１対のｌｏｘＰと、１対のｌｏｘ５１１との組み合わせ等が挙げられる。
　ＦＬＥｘ　ｓｗｉｔｃｈとは別に、１対のＬｏｘ配列を使用する形態例を以下説明する。
　上記遺伝子カセットにおいて、目的遺伝子（機能性タンパク質をコードする遺伝子）を活性型の向きに配置し、目的遺伝子の上流に、同じ方向（同じ向き）に配置された１対のＬｏｘ配列で挟まれた（Ｆｌｏｘｅｄ）ＳＴＯＰ配列を配置することができる。
　１対のＬｏｘ配列が同じ方向（同じ向き）に配置されていることから、ＣｒｅによってＳＴＯＰ配列が実質的に不可逆的に切り出され、目的遺伝子（機能性タンパク質をコードする遺伝子）を発現することができる。
　上記ＳＴＯＰ配列としては、転写停止用配列である限り特に制限はないが、ＳＶ４０　ｐｏｌｙ　Ａ　ｓｉｇｎａｌ配列が挙げられ、ＳＶ４０　ｐｏｌｙ　Ａ　ｓｉｇｎａｌカセットが３つ連結された配列が好ましい。
　非特異的組み換え（リーク）の防止の観点から、同じ方向（同じ向き）に配置された１対のＬｏｘ配列で挟む（Ｆｌｏｘｅｄ）配列として、上記ＳＴＯＰ配列とともに、更に、Ｐａｕｓｅ配列を含んでいてもよく、ＳＴＯＰ配列の下流に含んでいることが好ましい。
　上記Ｐａｕｓｅ配列としては特に制限はないが、ヒトα２　ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＩＩ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｐａｕｓｅ　ｓｉｇｎａｌ配列等が挙げられる。
　第１の態様に係る製造方法において、上記組み換え酵素は核内移行タンパク質との融合タンパク質であることが好ましく、つまり、上記組み換え酵素をコードする遺伝子が、核内移行タンパク質をコードする遺伝子と直接又は間接に融合していることが好ましい。
　核内移行タンパク質としては、核内へ移行し得る限り特に制限はないが、核移行シグナルを有するタンパク質が挙げられ、具体的には、エストロゲン受容体ＥＲが好ましい。
　上記組み換え酵素がＣｒｅリコンビナーゼであり、上記組み換え酵素をコードする遺伝子が、上記Ｃｒｅリコンビナーゼ及びエストロゲン受容体ＥＲを含む融合タンパク質をコードする遺伝子であることがより好ましい。
　上記Ｃｒｅリコンビナーゼは、特異的塩基配列（例えば、２つのＬｏｘ配列からなる対）を認識してＤＮＡ相同組み換えを起こす酵素（バクテリオファージＰ１に由来する酵素）として知られている。
　エストロゲン受容体ＥＲは、核移行シグナルを有することが知られている。
　上記融合タンパク質がＣｒｅリコンビナーゼ及びエストロゲン受容体ＥＲを含む融合タンパク質である場合、ベクター（１）を含む液を卵に顕微授精させることにより、上記融合タンパク質のＣｒｅリコンビナーゼ部分が少なくとも１対のＬｏｘ配列を認識することにより、コンディショナルな（条件的（好ましくは、Ｃｒｅ発現依存的））組み換えを起こす遺伝子導入ブタを製造することができる。
　第１の態様に係る製造方法において、上記エストロゲン受容体ＥＲがＥＲＴ２であり、上記融合タンパク質がＣｒｅＥＲＴ２又はＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２であることがより好ましい。
　タモキシフェン化合物（タモキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）等）は、細胞質内に存在するＥＲと結合し核内に移行し得る。
　ＥＲＴ２はＥＲをタモキシフェン化合物のみに結合するように改変され、核移行シグナル（エストロゲンとの）を欠損したタンパク質であることが知られている。
　ＣｒｅＥＲＴ２、ＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２はいずれも、前記ＥＲＴ２とＣｒｅとの融合タンパク質であり、タモキシフェン化合物存在下で核内に移行することができ、Ｃｒｅにより組み換えを起こすことができる。
（Feil R, Brocard J, Mascrez B, LeMeur M, Metzger D and Chambon P (1996): Ligand-activated site-specific recombination in mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 93: 10887-10890. 1996.
Feil R, Wagner J, Metzger D and Chambon P (1997): Regulation of Cre recombinase activity by mutated estrogen receptor ligand-binding domains. Biochemical and Biophysical Research Communications, 237: 752-727. 1997.）
　第１の態様において、ＣｒｅＥＲＴ２又はＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２を使用することにより、タモキシフェン化合物により、コンディショナルな（例えば、時期特異的）組み換えを起こすことができる。
　第１及び２の態様において、上記エストロゲン受容体ＥＲがＥＲＴ２が好ましく、上記融合タンパク質がＣｒｅＥＲＴ２又はＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２が好ましい。
（上記機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域中に含む遺伝子改変ブタ細胞）
　本発明は、上記機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域中に含む遺伝子改変ブタ細胞を含む、体細胞クローニング原料であって、上記ベクター（１）共存下の顕微授精による遺伝子導入用原料を提供するための、体細胞クローニング原料に関する発明でもあり、本発明の第２の態様は、当該体細胞クローニング原料である。
　第１及び２の態様において、上記遺伝子改変ブタ細胞は、培養が安定的であり、また、細胞の均一性が高い観点から、樹立された（例えば、株化された、クローン化された）遺伝子改変ブタ細胞であることが好ましい。
　また、樹立されることにより、遺伝子カセットをセーフハーバー領域中に導入する等の樹立前の各工程を省略して、特定の組織ないし臓器でコンディショナルに上記機能性タンパク質を発現するための遺伝子群が導入された遺伝子導入ブタを、上記顕微授精という１段階（例えば、実質的に１工程）で製造することができる観点から、遺伝子導入ブタの工業的量産性に優れる。
　上記遺伝子改変ブタ細胞としては、セーフハーバー領域を（好ましくはゲノム中に）有するブタ細胞である限り特に制限はないが、線維芽細胞、前駆脂肪細胞、胚由来多能性細胞、体性幹細胞、人工多能性幹細胞等が挙げられ、線維芽細胞が好ましく、胎仔線維芽細胞がより好ましい。
　第１及び２の態様における遺伝子カセットを導入するセーフハーバー領域は、ゲノム上、安全にトランス遺伝子を挿入し得る領域をいい、ゲノム上、安全にトランス遺伝子を挿入し得る非コード領域等が挙げられる。
　上記セーフハーバー領域としては、ブタＲＯＳＡ領域又はＨ１１領域が好ましく、ブタＲＯＳＡ領域がより好ましい。
　ブタＲＯＳＡ領域としては、ＲＯＳＡ領域である限り特に制限はないが、１３番目のブタ染色体のエクソン１及び２の間に存在するＲＯＳＡ領域が好ましい。
　第１及び２の態様において、上記組み換え酵素の作用により上記機能性タンパク質が発現可能となることは、当該ブタ個体全身の細胞においてであってもよいし（全身的発現可能性）、特定の組織ないし臓器の細胞においてであってもよいが（局在的発現可能性）、少なくとも上記ベクター（１）で規定された「特定の組織ないし臓器」で発現可能となることが好ましい。
　ブタは、例えば、マウス等のげっ歯類と比較して、繁殖ないし交配が煩雑である。
　様々な組織ないし臓器で発現するプロモーターを含む様々な上記ベクター（１）を用意し、様々な上記ベクター（１）共存下で顕微授精を行うことで、各々特定の組織ないし臓器でコンディショナルに上記機能性タンパク質を発現することができる様々な遺伝子導入ブタバリエーションを、上記顕微授精という１段階（例えば、実質的に１工程）で製造することができる観点から、当該ブタ個体全身の細胞において、上記機能性タンパク質が発現可能（全身的発現可能性）であることが好ましい。
　上記コンストラクトを含む上記遺伝子カセットがゲノム中のセーフハーバー領域に導入される場合、当該ブタ個体全身の細胞において、発現可能（全身的発現可能性）となり得る。
　第１及び２の態様における遺伝子カセットにおいて、上記機能性タンパク質としては、任意の機能を発揮するタンパク質である限り特に制限はなく、例えば、発光（例えば、蛍光、ＵＶ光）機能、標識機能（放射線標識、任意のタグ）、遺伝子発現調節機能、遺伝子認識機能、細胞に対して致死的な機能（例えば、細胞質膜に作用してそれを破壊するなど）等の任意の機能を発揮するタンパク質が挙げられ、より具体的には、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescent Protein,ＧＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ等の改変ＧＦＰ）、代謝関連酵素（例えば、チミジンキナーゼ、薬物代謝酵素（ＣＹＰ）など）、細胞増殖関連因子（例えば、アポトーシスの調節因子ＢＡＸ、線維芽細胞増殖因子ＦＧＦなど）、成長関連遺伝子タンパク質（例えば、成長ホルモン受容体、インスリン様成長因子受容体など）、細胞毒素、自殺遺伝子タンパク質（例えば、iCaspase9など）等が挙げられる。
　上記機能性タンパク質としては、遺伝子導入ブタの作出効率（生存率）向上をより確実に達成する観点から、発がん性変異に由来するタンパク質、発がん性タンパク質、それらの発現を検出するためのレポータータンパク質ではないことが好ましい。
　蛍光タンパク質は一般に細胞毒性を有することが知られている。
　上記細胞毒素としては細胞に対して致死的な作用（例えば、細胞質膜に作用してそれを破壊するなど）を引きおこす限り特に制限はなく、高分子の毒性物質が好ましく、毒性タンパク質がより好ましい。上記細胞毒素として具体的には、ジフテリア毒素(Diphtheria Toxin)、θ毒素、ストレプトリジンS、α,δ毒素、ロイコシジン等が挙げられ、ジフテリア毒素が好ましく、ジフテリア毒素Ａがより好ましい。
　ジフテリア毒素はジフテリア菌が産生する細菌毒素であり、Ａ鎖及びＢ鎖の２つのドメインからなり、Ａ鎖は毒素本体の役割を、Ｂ鎖は細胞表面にある受容体と結合し、Ａ鎖を細胞内に取り込む機能を有する。
　第１及び２の態様における遺伝子カセットにおいて、細胞毒素をコードする遺伝子としては、上記細胞毒素をコードする遺伝子が挙げられ、ジフテリア毒素をコードする遺伝子が好ましく、ジフテリア毒素Ａ（以下、単に「ＤＴＡ」ともいう。）をコードする遺伝子がより好ましい。
　第１及び２の態様における遺伝子カセットにおいて、上記セーフハーバー領域のプロモーター又は上記セーフハーバー領域の上流に存在するプロモーターによる転写を当該遺伝子カセットへ受容させるために、ＡＧ等を含むスプライシングアクセプター配列（スプライスアクセプター配列）を更に含んでいてもいなくてもよいが、更に含んでいることが好ましく、「機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクト」の上流に更に含んでいることがより好ましく、「特定配列、及び、機能性タンパク質をコードする遺伝子」の上流に更に含んでいることが更に好ましい。
　第１及び２の態様における上記コンストラクトを含む遺伝子カセットにおいて、上記機能性タンパク質の発現を制御するために、機能性タンパク質をコードする遺伝子（好ましくは特定配列、及び、機能性タンパク質をコードする遺伝子）の上流に任意のプロモーターを更に含んでいてもいなくてもよい。上記任意のプロモーターとしては、任意の細胞（好ましくは、多種の細胞）に機能するプロモーターが挙げられ、ＣＡＧ（cytomagalovirus immediate early enhancer-chiken β-actin hybrid）、ＣＭＶ、ＲＳＶプロモーター等が好ましく、ＣＡＧプロモーターがより好ましい。
　第１及び２の態様における上記コンストラクトを含む遺伝子カセットにおいて、遺伝子改変ブタ細胞（遺伝子ノックインブタ細胞）の選抜のための薬剤選抜用配列を更に含んでいてもいなくてもよい。更に含んでいる場合、機能性タンパク質をコードする遺伝子の下流に含んでいることが好ましい。
　上記薬剤選抜用配列として特に制限はないが、ＳＶ４０ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、及びｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ＨＳＶ－ＴＫ）のｐＡ（ポリＡ）で構成される遺伝子カセット等が挙げられる。
　第１及び２の態様における遺伝子カセットを上記セーフハーバー領域へ導入する方法（第１の遺伝子改変方法）としては、ゲノム編集法を使用することができ、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等の任意のトランス遺伝子導入技術により、上記遺伝子カセット及びゲノム編集ツールを細胞内（好ましくは核内）へ導入後、ゲノム編集法により上記セーフハーバー領域へ導入することが好ましい。
　ゲノム編集法による導入としては、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｄ　Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　Ｓｈｏｒｔ　Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓヌクレアーゼ等のゲノム編集用の人工ヌクレアーゼを含むゲノム編集ツールによる導入が挙げられ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いた人工制限酵素（人工ヌクレアーゼ）を含むゲノム編集ツールによる導入であってもよい。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼ（好ましくはＣａｓ９）を含む。
　標的となる上記セーフハーバー領域中の少なくとも部分配列は、上記セーフハーバー領域中に含まれるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
　上記セーフハーバー領域中の少なくとも部分配列に特異的なガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸もしくはＣａｓヌクレアーゼを含有する組成物を、上記セーフハーバー領域を含む真核細胞又は真核生物にトランスフェクトすることにより上記コンストラクトを含む遺伝子カセットを導入することができる。
　Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓヌクレアーゼ、及びガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、当技術分野において公知の様々な方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ－デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、タンパク質形質導入ドメイン媒介性形質導入、ウイルス媒介性遺伝子送達、及びプロトプラストへのＰＥＧ媒介性トランスフェクションなどによって、細胞内に移入されうるが、これらに限定されない。また、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡは、注入などの遺伝子もしくはタンパク質を投与するための、当技術分野において公知の様々な方法によって、生物内に移入されうる。Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸又はＣａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡとの複合体の形態で、もしくは別々に、細胞内に移入されうる。Ｔａｔなどのタンパク質形質導入ドメインと融合されたＣａｓヌクレアーゼもまた、細胞内に効率的に送達され得る。
　好ましくは、真核細胞又は真核生物は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが同時トランスフェクトまたは連続トランスフェクトされる。
　連続トランスフェクションは、最初にＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸によるトランスフェクション、続いて裸のガイドＲＮＡによる第二のトランスフェクションによって行われうる。好ましくは、第二のトランスフェクションは、３、６、１２、１８、２４時間後であるが、それらに限定されない。
　ガイドＲＮＡの発現は、ガイドＲＮＡ発現ユニットを用いてもよい。ガイドＲＮＡ発現ユニットとしては、標的配列（上記セーフハーバー領域中の少なくとも部分配列）とガイドＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の転写ユニットとすることが好ましく、ガイドＲＮＡを発現するためのプロモーター領域（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩのプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーターおよびＨ１プロモーターから選択されるプロモーター））、標的配列（上記セーフハーバー領域中の少なくとも部分配列）及びガイドＲＮＡを有することが好ましく、プロモーター、標的配列（上記セーフハーバー領域中の少なくとも部分配列）に相補的な配列及びガイドＲＮＡがシームレスに連結していることがより好ましい。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼは、オフターゲットを防ぐために、ニッカーゼとして二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを切断するＣａｓ９変異体を用いることもできる。一本鎖切断型Ｃａｓ９変異体としては、例えば、Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）が挙げられる。一本鎖切断型Ｃａｓ９変異体は例えば、標的ＤＮＡの一方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドＲＮＡと、そのごく近傍の他方の鎖に相補的な標的配列を有するガイドＲＮＡとを組み合わせて用いると、一方の鎖を２０塩基の特異性で切断し、他方の鎖をさらに２０塩基の特異性で切断するため、併せて４０塩基の特異性でＤＮＡを切断することになり、標的の特異性を大幅に向上させることが可能となる。
　第１及び２の態様における遺伝子カセットを上記セーフハーバー領域へ導入して得られた遺伝子改変ブタ細胞（遺伝子ノックインブタ細胞）は、１穴当たり１細胞未満の限界希釈、遺伝子解析、薬剤耐性等任意の手法により選抜し、樹立することができる。
　下記文献（イ）～（ハ）にはゲノム編集による遺伝子改変ブタ細胞の樹立、及び上記樹立された遺伝子改変ブタ細胞の体細胞クローニングによる遺伝子改変クローンブタの作出が記載されている。
　（イ）Masahito Watanabe, Kazuhiro Umeyama, Kazuaki Nakano, Hitomi Matsunari, Toru Fukuda, Kei Matsumoto, Susumu Tajiri, Shuichiro Yamanaka, Koki Hasegawa, Kazutoshi Okamoto, Ayuko Uchikura, Shuko Takayanagi, Masaki Nagaya, Takashi Yokoo, Hiromitsu Nakauchi and Hiroshi Nagashima (2022) Generation of heterozygous PKD1 mutant pigs exhibiting earlyonset renal cyst formation. Laboratory Investigation, 102:560-569; https://doi.org/10.1038/s41374-021-00717-z
　（ロ）Hitomi Matsunari, Michiyo Honda, Masahito Watanabe, Satsuki Fukushima, Kouta Suzuki, Shigeru Miyagawa, Kazuaki Nakano, Kazuhiro Umeyama, Ayuko Uchikura, Kazutoshi Okamoto,Masaki Nagaya, Teruhiko Toyo-oka, Yoshiki Sawa, Hiroshi Nagashima (2020) Pigs with δ-sarcoglycan deficiency exhibit traits of genetic cardiomyopathy. Laboratory Investigation, 100:887-899; https://doi.org/10.1038/s41374-020-0406-7
　（ハ）Masahito Watanabe, Kazuaki Nakano, Hitomi Matsunari, Taisuke Matsuda, Miki Maehara, Takahiro Kanai, Mirina Kobayashi, Yukina Matsumura, Rieko Sakai, Momoko Kuramoto, Gota Hayashida, Yoshinori Asano, Shuko Takayanagi, Yoshikazu Arai, Kazuhiro Umeyama, Masaki Nagaya, Yutaka Hanazono, Hiroshi Nagashima (2013) Generation of Interleukin-2 Receptor Gamma Gene Knockout Pigs from Somatic Cells Genetically Modified by Zinc Finger Nuclease-Encoding mRNA. PLOS ONE, Volume 8, Issue 10, e76478
　上記遺伝子カセットの上記セーフハーバー領域へ導入、遺伝子改変ブタ細胞の樹立は上記文献（イ）～（ハ）に記載の方法に準じて実施することができる。
（遺伝子改変クローンブタ）
　第１の態様において、上記得られた（樹立された）遺伝子改変ブタ細胞（遺伝子ノックイン細胞）から遺伝子改変クローンブタ（遺伝子ノックインクローンブタ）を得る体細胞クローニング（体細胞クローン技術）としては特に制限はない。
　体細胞クローン技術は、クローンを作製したいブタ細胞（好ましくは遺伝子改変ブタ細胞）を培養してドナー細胞とし、このドナー細胞をレシピエント除核卵子（卵母細胞）に細胞融合等の融合法等により核移植したのち、培養後、仮親に移植及び受胎させクローンを作製する技術をいう。
　具体的には、一回目の核移植において、上記得られた（樹立された）遺伝子改変ブタ細胞（遺伝子ノックインブタ細胞）を、成熟した除核未受精卵に導入することができる。この導入にはセンダイウィルス、電気刺激による細胞融合法や細胞質内注入法を用いることができる。続いて、活性化処理を行い核を形成することができる。この活性化処理法には、ストロンチウム、エタノール、電気刺激、等が挙げられる。この核を二回目の核移植のドナーとして除核受精卵に導入することができる。
　上記作業はフリーハンド（例えば、熟練者による顕微鏡下でのフリーハンド）で行っても行わなくてもよいが、マイクロマニピュレーターを使用して実施してもよい。
　得られた遺伝子改変ブタ細胞由来構築卵は培養後、移植可能胚へ発生したものを仮親の子宮内に移植することで、遺伝子改変ブタ細胞（遺伝子ノックインブタ細胞）由来の遺伝子改変クローンブタ（遺伝子ノックインクローンブタ）の個体を発生することができる。
　また、上記文献（イ）～（ハ）には、上述したように、遺伝子改変ブタ樹立細胞の体細胞クローニングによる遺伝子改変クローンブタの作出が記載されており、遺伝子改変ブタ樹立細胞の体細胞クローニングによる遺伝子改変クローンブタの作出は上記文献（イ）～（ハ）に記載の方法に準じて実施することができる。
　上記レシピエント除核卵子（卵母細胞）としては、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、ヒト、類人猿（チンパンジー、サル等））、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）等の任意の哺乳類のレシピエント除核卵子が好ましく、げっ歯類よりも体格等の特徴がヒトに近い哺乳類のレシピエント除核卵子がより好ましく、ブタ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、ヒト、類人猿）のレシピエント除核卵子が更に好ましく、ブタのレシピエント除核卵子が特に好ましい。
　上記移植可能胚を移植される仮親としてはブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、ヒト、類人猿（チンパンジー、サル等））、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）等の任意の哺乳類が好ましく、げっ歯類よりも体格等の特徴がヒトに近い哺乳類がより好ましく、ブタ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、ヒト、類人猿）が更に好ましく、ブタが特に好ましい。
（遺伝子改変クローンブタの精子）
　上記得られた遺伝子改変クローンブタ（遺伝子ノックインクローンブタ）の個体から、後述の顕微授精による遺伝子導入に供される精子（遺伝子ノックインクローンブタの精子）を任意の方法で取得ないし採取することができる。
（ベクター（１））
　第１の態様において後述する顕微授精による遺伝子導入に使用する上記ベクター（１）において、上記特定の臓器ないし組織としては、内臓（例えば、膵臓、腎臓、尿管、膀胱、肝臓、心臓、胃、腸等）、生殖器（例えば、卵巣、精巣等）、受精卵、胚、胎仔、骨髄（例えば、造血器官）、脳、眼、鼻、口、皮膚、神経、若しくは、それらに由来する組織、又は人工組織（軟骨細胞シート等の細胞シート、オルガノイド等）が挙げられ、内臓、生殖器、受精卵、胚、胎仔が好ましく、内臓、生殖器がより好ましく、膵臓（例えば、膵島）、腎臓（例えば、後腎、特に、後腎、尿管及び膀胱を含む泌尿器）がさらに好ましい。
　上記ベクター（１）において、上記特定の組織ないし臓器で発現するプロモーターとしては、上記特定の組織ないし臓器で発現するプロモーターである限り特に制限はないが、上記特定の組織ないし臓器の免疫原性の低減の観点から、幹細胞ないし前駆細胞で発現するプロモーター等の発生初期で発現するプロモーターが好ましい。
　仮に、遺伝子導入ブタの全身でトランス遺伝子が発現してしまうと、全身でダメージが生じ致死的であり、遺伝子導入ブタの作出効率（生存率）は低い。これに対し、上記特定の組織ないし臓器で発現するプロモーターであることにより、トランス遺伝子の発現を上記特定の組織ないし臓器に止めることができ、致死的ではなく、遺伝子導入ブタの作出効率（生存率）を向上することができる。
　上記特定の組織ないし臓器で発現するプロモーターとしては、Ｓｉｘ２の転写を制御するプロモーター（以下、単に「Ｓｉｘ２プロモーター」ともいう。）又はＳａｌｌ１の転写を制御するプロモーター（以下、単に「Ｓａｌｌ１プロモーター」ともいう。）、Ｓｉｘ２プロモーター、ＦＧＦ２０プロモーター等が挙げられ、Ｓｉｘ２プロモーター又はＳａｌｌ１プロモーターが好ましい。
　Ｓｉｘ２、Ｓａｌｌ１はいずれも、例えば、腎臓等で発現することが知られ、なかでも、腎臓前駆細胞等で発現することが知られ、特に、後腎間葉領域等で発現することが知られ、とりわけ、後腎間葉領域の前駆細胞で発現することが知られている。
　Ｓｉｘ２は、特に、尿管芽先端周囲を取り囲む未分化な後腎間葉領域等で発現することが知られている。
　第１の態様における上記ベクター（１）としてはプラスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等が挙げられ、プラスミドベクター、又は、人工染色体ベクターが好ましい。
　プラスミドベクター、ウイルスベクターとしては、任意のクローニングベクターが挙げられる。クローニングベクターとして、例えば、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)等が市販されており、本発明に使用し得る。
　人工染色体ベクターとしては、細菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome;ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１ファージ由来人工染色体（ＰＡＣ）、ブタ人工染色体、等が挙げられ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、又はＰＡＣが好ましい。
　上記ベクター（１）は直鎖状であっても、環状であってもよいが、下記顕微授精に供する観点、及び、増幅する観点から、直鎖状が好ましい。直鎖化は任意の方法で行うことができる。
（顕微授精することにより遺伝子導入する工程）
　上記遺伝子改変クローンブタの精子（遺伝子ノックインクローンブタの精子）及び上記ベクター（１）を含む液と卵（好ましくは卵子、より好ましくは成熟卵子）との顕微授精（卵細胞質内精子注入；ＩＣＳＩともいう。）により、顕微授精を介した上記ベクター（１）による更なる遺伝子導入（第２の遺伝子改変）を行うことができる（ICSI mediated gene transfer method）。
　顕微授精は、上記精子及び上記ベクター（１）を含む液を任意の方法（例えば、注射、ガラス管、毛細管）により上記卵（好ましくは成熟卵子）へ注入し、受精させることにより行うことができる。
　上記注入作業はフリーハンド（例えば、熟練者による顕微鏡下でのフリーハンド）で行っても行わなくてもよいが、マイクロマニピュレーターを使用して実施してもよい。
　得られた受精卵を超音波処理により活性化してもしなくてもよい。
　次いで、上記受精卵をレシピエント雌（仮親）の子宮内に移植して目的の遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）の個体を発生させることができる。
　上記精子及び上記ベクター（１）を含む液としては、上記精子及び上記ベクター（１）を共存させ得る限り特に制限はないが、無機塩、緩衝剤、栄養成分、血清アルブミン等を任意に含んでいてもよい、ｐＨ７．０～８．０付近の、任意の水溶液、任意の緩衝液、任意の培養液等が挙げられる。
　上記顕微授精に供されるブタの卵としては、卵子が好ましく、成熟卵子がより好ましい。
≪遺伝子導入ブタ≫
　本発明の第３の態様は、特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある上記組み換え酵素をコードする遺伝子を含み、
　機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットを含む、遺伝子導入ブタである。
　「特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある上記組み換え酵素をコードする遺伝子」は、当該遺伝子導入ブタ（好ましくは、当該遺伝子導入ブタの細胞）中の任意の位置に存在していて（組み込まれていて）よく、例えば、当該遺伝子導入ブタ（好ましくは、当該遺伝子導入ブタの細胞）の細胞質中、ゲノム中、ミトコンドリアゲノム中等に存在する（組み込まれる）ことが挙げられ、細胞質中又はゲノム中に存在する（組み込まれる）ことが好ましい。細胞質中に存在する場合、プラスミドに含まれる形態で存在していてもよい。
　機能性タンパク質をコードする遺伝子を含む上記コンストラクトを含む上記遺伝子カセットが含まれる上記セーフハーバー領域中に、「特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある上記組み換え酵素をコードする遺伝子」も存在しても（組み込まれても）しなくてもよいが、制御遺伝子カセットと機能性遺伝子カセットとの発現量のバランスの観点から、上記セーフハーバー領域中に存在しない（組み込まれない）ことが好ましい。
　第３の態様に係る遺伝子導入ブタは、第１の態様に係る製造方法により製造することができる。
　第３の態様において、「特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター」、「組み換え酵素」、「組み換え酵素をコードする遺伝子」、「機能性タンパク質」、「機能性タンパク質をコードする遺伝子」、「機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクト」、「遺伝子カセット」、「遺伝子導入ブタ」の具体例、及び好ましい例としては、第１の態様について上述した具体例、及び好ましい例と同様のものが挙げられる。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）、第３の態様に係る遺伝子導入ブタは、胎仔、幼体、成体のいずれであってもよいが、免疫原性が低い観点から、胎仔であることが好ましい。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ、第３の態様に係る遺伝子導入ブタは、上述のように、組織ないし臓器選択的に（好ましくは組織ないし臓器特異的に）、当該組織ないし臓器内で特定の機能性タンパク質をコンディショナルに発現させることができる。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ、第３の態様に係る遺伝子導入ブタは、上記機能性タンパク質が細胞毒素である場合、当該組織ないし臓器内の細胞の少なくとも一部（好ましくは、当該組織ないし臓器の表面及び表層の細胞を除いた当該組織ないし臓器内部の細胞）をコンディショナルに死滅させることができる。
　これにより、所望の組織ないし臓器だけ、内部の細胞の少なくとも一部（好ましくは、当該組織ないし臓器の表面及び表層の細胞を除いた当該組織ないし臓器内部の細胞）をコンディショナルに死滅させることができる。
　また、第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ、第３の態様に係る遺伝子導入ブタは、上述のように、時期特異的なコンディショナルに特定の機能性タンパク質を発現することもできる。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ、第３の態様に係る遺伝子導入ブタは、上記機能性タンパク質が細胞毒素である場合、組織ないし臓器内の細胞の少なくとも一部（好ましくは、当該組織ないし臓器の表面及び表層の細胞を除いた当該組織ないし臓器内部の細胞）を時期特異的なコンディショナルに死滅させることもできる。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）、第３の態様に係る遺伝子導入ブタは、体細胞クローン用の材料であってもなくてもよい。
　具体的には、第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）、第３の態様に係る遺伝子導入ブタから任意の方法により体細胞を取得ないし採取して、上記体細胞をドナー細胞とし、このドナー細胞をレシピエント除核卵子（卵母細胞）に細胞融合等の融合法等により核移植したのち、培養後、仮親に移植及び受胎させクローンを作製してもよい。
　本発明は、第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）、第３の態様に係る遺伝子導入ブタから樹立された（例えば、株化された、クローン化された）体細胞に関する発明でもある。
　上記体細胞が、樹立されていることにより、培養が安定的であり、また、細胞の均一性が高い。その結果、第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）、第３の態様に係る遺伝子導入ブタのクローンを工業的量産性に優れる。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）、第３の態様に係る遺伝子導入ブタは、上記クローンを含んでいてもよい。
　第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）又は第３の態様に係る遺伝子導入ブタを、このような体細胞クローン用の材料として使用することにより、第１の態様に係る製造方法により製造される遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）又は第３の態様に係る遺伝子導入ブタから組織ないし臓器を工業的に製造することができる。
≪組織ないし臓器≫
　本発明の第４の態様は、第１の態様に係る製造方法により製造された遺伝子導入ブタ（二重遺伝子改変ブタ）又は、第３の態様に係る遺伝子導入ブタから任意の方法により摘出した組織ないし臓器である。
　上記臓器ないし組織としては、内臓（例えば、膵臓、腎臓、尿管、膀胱、肝臓、心臓、胃、腸等）、生殖器（例えば、卵巣、精巣等）、受精卵、胚、胎仔、骨髄（例えば、造血器官）、脳、眼、鼻、口、皮膚、神経、若しくは、それらに由来する組織、又は人工組織（軟骨細胞シート等の細胞シート、オルガノイド等）が挙げられ、内臓、生殖器、受精卵、胚、胎仔が好ましく、内臓、生殖器がより好ましく、膵臓（例えば、膵島）、腎臓（例えば、後腎、特に、後腎、尿管及び膀胱を含む泌尿器）がさらに好ましい。
　第４の態様に係る組織ないし臓器は、上記組織ないし臓器内で特定の機能性タンパク質をコンディショナルに発現することができる。
　第４の態様に係る組織ないし臓器は、上記機能性タンパク質が細胞毒素である場合、上記組織ないし臓器内の細胞の少なくとも一部（好ましくは、当該組織ないし臓器の表面及び表層の細胞を除いた当該組織ないし臓器内部の細胞）をコンディショナルに死滅させることができる。
　第４の態様に係る組織ないし臓器において、上記機能性タンパク質が細胞毒素である場合、上記細胞の少なくとも一部（好ましくは、当該組織ないし臓器の表面及び表層の細胞を除いた当該組織ないし臓器内部の細胞）をコンディショナルに死滅させた部分を外来物に置き換えることができる。
　ここで、上記外来物は、上記組織ないし臓器以外に由来する物質を意味し、ヒト又は動物由来の物質、薬物（例えば、医薬品）等が挙げられる。物質としては、例えば、細胞、成長因子、ホルモン、サイトカイン等が挙げられ、中でも細胞が好ましい。上記細胞は樹立済みの細胞（例えば、遺伝子組み換え細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）であってもなくてもよい。
　以下に本発明の実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
＜参考例１＞
（ｌｏｘＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含む遺伝子カセットの構築）
　スプライシングアクセプター配列にｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－Ｐａｕｓｅ－ｌｏｘＰ配列が続き、その下流にＶｅｎｕｓ－ｐＡ、薬剤選択用のＰｕｒｏＲ（ピューロマイシン耐性遺伝子カセット）で構成されたノックインベクターを構築した。当該ベクターの両末端（５’側及び３’側）にノックインのためのホモロジーアームとしてＲＯＳＡ領域の配列（それぞれ７００塩基対程度）が連結されている。
　図１は、上記構築したｌｏｘＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含む遺伝子カセットの概略図である。
　図１中、ＳＡは、ＲＯＳＡプロモーターによる転写を当該遺伝子カセットへ受容させるためのスプライシングアクセプター配列を示し、ＳＴＯＰはＳＶ４０　ｐｏｌｙ　Ａ　ｓｉｇｎａｌカセットが３つ連結された配列を示し、Ｐａｕｓｅは、ヒトα２　ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＩＩ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｐａｕｓｅ　ｓｉｇｎａｌ配列を示し、ＶｅｎｕｓはＶｅｎｕｓ配列を示し、ｐＡは、Ｒａｂｂｉｔ　β－ｇｌｏｂｉｎ遺伝子の３’－ＵＴＲ（非翻訳領域）を示し、ＰｕｒｏＲはＳＶ４０ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、及びｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ＨＳＶ－ＴＫ）のｐＡ（ポリＡ）で構成される遺伝子カセットを示す。
＜参考例２＞
（組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターの構築）
　マウスＳｉｘ２遺伝子の開始コドン周辺領域より上流の約７ｋ塩基をｍＳｉｘ２プロモーターとし、当該ｍＳｉｘ２プロモーターの３’末端にＣｒｅＥＲＴ２及びｐＡが連結されている遺伝子カセットをｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ－ＴＯＰＯベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)に導入して組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターを構築した。
　図２は、上記構築したＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターを示す概略図である。
　図２中、ｐＡは、Ｒａｂｂｉｔ　β－ｇｌｏｂｉｎ遺伝子の３’－ＵＴＲを示す。
　得られた組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターはリニアライズ後、下記顕微授精法（ICSI mediated gene transfer method）で使用した。
＜参考例３＞
（ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットの構築）
　スプライシングアクセプター配列にｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－Ｐａｕｓｅ－ｌｏｘＰ配列が続き、その下流にＤＴＡ－ｐＡ、薬剤選択用のＰｕｒｏＲ（ピューロマイシン耐性遺伝子カセット）で構成されたノックインベクターを構築した。当該ベクターの両末端（５’側及び３’側）にノックインのためのホモロジーアームとしてＲＯＳＡ領域の配列（それぞれ７００塩基対程度）が連結されている。
　図３（ａ）は、上記構築したｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットの概略図である。
　図３（ａ）中、ＳＡは、ＲＯＳＡプロモーターによる転写を促進するためのプライシングアクセプター配列を示し、ＳＴＯＰはＳＶ４０　ｐｏｌｙ　Ａ　ｓｉｇｎａｌカセットが３つ連結された配列を示し、Ｐａｕｓｅは、ヒトα２　ｇｌｏｂｉｎ　ｇｅｎｅ　ＲＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＩＩ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｐａｕｓｅ　ｓｉｇｎａｌ配列を示し、ＤＴＡはジフテリア毒素Ａフラグメント配列を示し、ｐＡは、Ｒａｂｂｉｔ　β－ｇｌｏｂｉｎ遺伝子の３’－ＵＴＲ（非翻訳領域）を示し、ＰｕｒｏＲはＳＶ４０　ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ　Ｎ－ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、及びｈｅｒｐｅｓ　ｓｉｍｐｌｅｘ　ｖｉｒｕｓ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ＨＳＶ－ＴＫ）のｐＡ（ポリＡ）で構成される遺伝子カセットを示す。
　図３（ｂ）は、上記遺伝子カセットのＲＯＳＡ領域へのノックインの概略図である。
　（ＲＯＳＡ領域にｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により導入した細胞の樹立）
　ブタ胎仔繊維芽細胞５．０×１０５cellに対し、上記ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセット、gRNA複合体及びリコンビナントCas9からなるRNP複合体を上記細胞にエレクトロポレーション法により導入した。
　ここで、上記gRNA複合体はtracrRNA（Trans-activating crRNA）及び下記配列で表されるブタＲＯＳＡ領域－ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）からなる。下記ブタＲＯＳＡ領域－ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）が有する下記配列は、ブタ染色体１３番目の65,757,140から65,757,159に位置し、ＲＯＳＡのエクソン１及び２の間に存在する配列である。ただし、上記遺伝子の位置番号は、２０２２年５月２４日時点でのＵＣＳＣゲノムブラウザにおける位置番号であり、データベースのアップデートにより変動することもある。
 
ブタＲＯＳＡ領域－ｇＲＮＡ
5’-GTAGTGCTCTAGATTAGCAC-3’（配列番号８）
 
　ピューロマイシン耐性による選抜を行った後、１穴当たり１細胞未満の限界希釈を行い、増殖したシングルセル細胞由来のクローンについて遺伝子解析を行い、上記構築したｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットをブタＲＯＳＡ領域に導入した遺伝子改変ブタ細胞を樹立した。
　図４は、上記遺伝子カセットのＲＯＳＡ領域へのノックイン確認結果を示す電気泳動図である。
　図４に示された結果から明らかなように、上記遺伝子カセットがＲＯＳＡ領域へノックインされたことが確認された。
　（上記ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットをブタＲＯＳＡ領域に導入した遺伝子改変ブタ細胞におけるＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２及びタモキシフェンによる細胞死誘導の確認）
　別途構築したＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターを、エレクトロポレーションにより上記ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットをブタＲＯＳＡ領域に導入した遺伝子改変ブタ細胞に導入した。
　その後、１０ｎＭのタモキシフェン（４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ））を添加した培地で培養した。結果を図５に示す。
　図５に示した結果から明らかなように、ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットをブタＲＯＳＡ領域に導入した遺伝子改変ブタ細胞の細胞死が確認された。
　（上記遺伝子改変ブタ細胞から遺伝子改変クローンブタの構築）
　上記ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットをブタＲＯＳＡ領域に導入した遺伝子改変ブタ細胞を直径３５ｍｍディッシュに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）加ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培養液中の５×１０５ｃｅｌｌ播種し、１回継代した。継代後１４～１８時間目に培養液の半量を除き、培養２時間後、軽くピペッティングしてから培養液を回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心して細胞を集めた。これを核移植の核ドナー細胞として用いた。
　核移植には野生型雌ブタの卵巣から採取した卵子を体外で成熟させて得た第二減数分裂中期の未受精卵の除核したものをレシピエント細胞質として用いた。核移植操作は卵子操作液中で行った。核ドナー細胞とレシピエント細胞質の融合には電気融合法を用いた。融合が完了した卵を３０分～１時間培養液中で培養した後、直流電気刺激を与えた。それらの卵の少なくとも一部が正常に活性化し、発生を開始した。
　体外培養した核移植胚のうち、1～２日目に正常分割した胚、あるいは５～６日目に胚盤胞に発生した胚を、発情周期を同期化した受胚ブタの卵管あるいは子宮へ移植した。
　移植された胚の少なくとも一部から新生仔が生まれ、遺伝子改変クローンブタを構築できた。上記得られた遺伝子改変クローンブタから精子を回収した。上記精子は以降の顕微授精法（ICSI mediated gene transfer method）に使用することができる。
＜参考例４＞
（ＩＣＳＩを介した組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターによる遺伝子導入ブタの構築）
　顕微授精法に用いる精子に超音波処理を加え、頭部と尾部とを分離した。超音波処理は、約７０％の精子において頭部と尾部の分離が生じる強度とした。上記＜参考例２＞で構築した組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクター及びブタ精子頭部を培養液中で共培養した後１個の精子頭部を注入ピペット内へ吸い込み、１回以上のピエゾパルスを用いて注入ピペットを卵子内に注入した。注入ピペットが卵細胞質内に到達したことを確認し、速やかに精子頭部を卵子内に注入した。精子の注入は卵操作用溶液中で行った。
　着床前の培養：ＩＣＳＩ後、精子を注入した卵子は、プラスチック製カルチャーディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）の上に作製したＰＺＭ５培養液ドロップ中に移した。培養２０及び４４時間目に、正常１細胞期胚及び正常分割胚を観察した。あるいは１１６及び１４０時間目に、胚盤胞期胚を観察した。
　胚移植：ＰＺＭ培養液の微小滴中で上記期間培養した胚を、受胚レシピエントブタの卵管内あるいは子宮内へ移植した。正常１細胞期胚及び正常分割胚は、排卵後１日以内の卵管に、また胚盤胞は排卵後４日目の子宮へ移植した。
（雌雄判定試験）
　受胚レシピエントブタ４頭（＃２３６、＃３６５、Ｋ３６４、＃２３８）から合計４２頭の胎仔が得られた。胎仔より尾を取得後、ＤＮＡ抽出キット（ＤＮｅａｓｙ　Ｂｌｏｏｄ　ａｎｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ製）でゲノムＤＮＡを抽出し、アメロゲニン（ＡＭＥＬ　ＸとＡＭＥＬ　Ｙ）を対象としたＰｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲにより雌雄判定を実施した。
　得られた４２頭についての雌雄判定結果の電気泳動図を図６に示す。
　図６から明らかなように、＃２３６－１、５、６、８、＃３６５－１、２、４、９、１０、１１、１２、１３、Ｋ３６４－３、４、５、６、８、＃２３８－１、３、５、６は雄であり、＃２３６－２、３、４、７、９、＃３６５－３、５、６、７、８、Ｋ３６４－１、２、７、＃２３８－２、４、７～１２であった。
（遺伝子導入判定試験）
　上記４２頭の胎仔のゲノムＤＮＡ（上記）を用いて、導入遺伝子上のｍＳｉｘ２プロモーターからＣｒｅＥＲＴ２対象としたＰｒｉｍｅｒを用いたＰＣＲを実施した。
　ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（トリス－酢酸－ＥＤＴＡ）を用いて電気泳動して遺伝子導入判定を行った。結果を図７に示す。
　図７は、遺伝子導入判定結果を示す電気泳動図である。
　図７中、ＭはＤＮＡ分子量マーカーであり、Ｎはネガティブ対照であり、野生型ブタのゲノムＤＮＡを使用し、Ｐはポジティブ対照であり、ＣｒｅＥＲＴ２発現遺伝子ベクターを使用した。
　図７から明らかなように、上記４２頭の胎仔のうち、合計９頭の組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現遺伝子導入ブタの胎仔が得られ、遺伝子導入ブタの作出効率は２１％であった（＃２３６－２、５、６、＃３６５－３、４、１２、Ｋ３６４－８、＃２３８－５、７）。ただし、＃３６５－１２、Ｋ３６４－８は退行胎仔であった。
（胎仔後腎でのＣｒｅＥＲＴ２発現確認試験）
　上記組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現遺伝子導入ブタの胎仔のうち、＃２３６－２、５、６、＃３６５－３、４、１２について、各々から後腎１個を採取し、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌｕｓ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）添付の組織溶液中でバイオマッシャー(ニッピ製)を用いてホモジナイズし、製品プロトコールに従ってｔｏｔａｌＲＮＡを回収した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ　Ｒｅｖｅｒｅｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により逆転写反応を行いｃＤＮＡを得た。Ｖｅｒｉｔｉサーマルサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＣｒｅＥＲＴ２プライマー及びＰｉｇＳｉｘ２プライマーを用いて増幅反応を行い、ＲＴ－ＰＣＲ（ネステッドＰＣＲ）にて胎仔後腎でのＣｒｅＥＲＴ２発現確認試験を行った。
　ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル（トリス－酢酸－ＥＤＴＡ）を用いて電気泳動して胎仔後腎でのＣｒｅＥＲＴ２発現確認試験を行った。結果を図８に示す。
 
ＣｒｅＥＲＴ２プライマー配列
１ｓｔ： 5’-CATGTCCATGCTGCCCACCTTCG-3’（配列番号９）/ 5’-GTATATCCTGGCAGCGATCGC-3’ （配列番号１０）
２ｎｄ： 5’-TCGCAAGAACCTGATGGACA-3’ （配列番号１１）/ 5’-CGCCGCATAACCAGTGAAAC-3’ （配列番号１２）
 
ＰｉｇＳｉｘ２プライマー配列
１ｓｔ： 5’-AGTCGCAGCGTGCTGCGCGAG-3’ （配列番号１３）/ 5’-CTAGGAGCCCAGGTCCACGA-3’ （配列番号１４）
２ｎｄ： 5’-ACCACGCAGGTCAGCAACTGG-3’ （配列番号１５）/ 5’-TCCGAGCTGCCTAGCACCGAC-3’ （配列番号１６）
　図８は、胎仔後腎でのＣｒｅＥＲＴ２発現確認結果を示す電気泳動図である。
　図８中、＋ＲＴは、試料増幅のための逆転写酵素ありのデータである。
　図８から明らかなように、上記組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現遺伝子改変導入ブタの胎仔全て（＃２３６－２、５、６、＃３６５－３、４、１２）の後腎でマウスＳｉｘ２プロモーター下でのＣｒｅＥＲＴ２遺伝子発現が確認された。
（トランス遺伝子のコピー数決定）
　上記組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現遺伝子導入ブタの胎仔のうち、＃２３６－２、５、６、＃３６５－３、４、１２、＃２３８－５、７について、上記尾組織から抽出したゲノムＤＮＡを抽出し、デジタルＰＣＲによりゲノム中のトランス遺伝子（導入遺伝子）のコピー数を決定した。結果を図９に示す。
　図９は、二倍体ゲノム中のトランス遺伝子のコピー数決定結果を示す図である。図９中、β－アクチンは内部標準（２コピー）である。
　図９に示した結果から明らかなように、二倍体ゲノム中、＃２３６－２中のトランス遺伝子のコピー数は５コピーであり、＃２３６－５中のトランス遺伝子のコピー数は２コピーであり、＃２３６－６中のトランス遺伝子のコピー数は１コピーであり、＃３６５－３中のトランス遺伝子のコピー数は１６コピーであり、＃３６５－４中のトランス遺伝子のコピー数は６コピーであり、＃３６５－１２中のトランス遺伝子のコピー数は１９コピーであり、＃２３８－５中のトランス遺伝子のコピー数は２００コピー以上であり、＃２３８－７中のトランス遺伝子のコピー数は１０コピーであった。
　以上のように、１個体（二倍体）当たり、１コピー又は２コピー以上、更には、２００コピー以上の組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２遺伝子が導入された遺伝子導入ブタの胎仔が得られた。
＜実施例１＞
　（ＲＯＳＡ領域にｌｏｘＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含む遺伝子カセットをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により導入した細胞の樹立）
　Neon Transfection System (Thermo Fisher Scientific)を用いたエレクトロポレーションにより、＜参考例１＞で上記構築したｌｏｘＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含む遺伝子カセット、gRNA複合体及びリコンビナントCas9からなるRNP複合体を、５．０×１０５のブタ胎仔繊維芽細胞に導入した。
　ここで、上記gRNA complexはtracrRNA（Trans-activating crRNA）及び配列番号８の配列で表される上記ブタＲＯＳＡ領域－ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）からなる。下記ブタＲＯＳＡ領域－ｇＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）が有する下記配列は、ブタ染色体１３番目の65,757,140から65,757,159に位置し、ＲＯＳＡのエクソン１及び２の間に存在する配列である。ただし、上記遺伝子の位置番号は、２０２２年５月２４日時点でのＵＣＳＣゲノムブラウザにおける位置番号であり、データベースのアップデートにより変動することもある。
　ピューロマイシン耐性による選抜を行った後、１穴当たり１細胞未満の限界希釈を行い、増殖したシングルセル細胞由来のクローンについて遺伝子解析を行い、上記構築したｌｏｘＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含む遺伝子カセットをブタＲＯＳＡ領域に導入した遺伝子改変ブタ細胞を樹立した。
　（上記遺伝子改変ブタ細胞から遺伝子改変クローンブタの構築）
　上記ｌｏｘＰ－Ｖｅｎｕｓ遺伝子を含む遺伝子カセットをブタＲＯＳＡ領域に導入して得られる遺伝子改変ブタ細胞を直径３５ｍｍディッシュに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）加ダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥＭ）培養液中の５×１０５ｃｅｌｌ播種し、１回継代する。継代後１４～１８時間目に培養液の半量を除き、培養２時間後、軽くピペッティングしてから培養液を回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心して細胞を集める。これを核移植のドナー核として用いる。
　核移植には野生型雌ブタの卵巣から採取した卵子を体外で成熟させて得た第二減数分裂中期の未受精卵の除核したものをレシピエント細胞質として用いた。核移植操作は卵子操作液中で行った。核ドナー細胞とレシピエント細胞質の融合には電気融合法を用いた。融合が完了した卵を３０分～１時間培養液中で培養した後、直流電気刺激を与えた。それらの卵の少なくとも一部が正常に活性化し、発生を開始した。
　体外培養した核移植胚のうち、1～２日目に正常分割した胚、あるいは５～６日目に胚盤胞に発生した胚を、発情周期を同期化した受胚ブタの卵管あるいは子宮へ移植した。
　移植された胚の少なくとも一部から新生仔が生まれ、遺伝子改変クローンブタを構築できた。上記得られた遺伝子改変クローンブタから精子を回収した。上記精子は以降の顕微授精法（ICSI mediated gene transfer method）に使用することができる。
（ＩＣＳＩを介した組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターによる遺伝子導入ブタの構築）
　上記＜参考例２＞で構築した組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクター及び上記ブタ精子の頭部を培養液中で共培養し上記＜参考例４＞と同様のＩＣＳＩ操作、卵子培養、及び受胚レシピエントブタの子宮への胚移植により、受胚レシピエントブタから遺伝子導入ブタの正常発達胎仔を得る。
　上記正常発達胎仔を孕む雌ブタにタモキシフェンを投与、あるいは上記正常発達胎仔から採取した後腎を免疫不全マウス体内に移植後、そのマウスにタモキシフェンを投与、あるいは採取した後腎を体外培養し、培養液にタモキシフェンを添加することにより、特定の組織ないし臓器においてコンディショナルにＶｅｎｕｓ蛍光を観察することができる。
＜実施例２＞
（ＩＣＳＩを介した組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクターによる遺伝子導入ブタの構築）
　上記＜参考例２＞で構築した組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクター及び上記＜参考例３＞で得た上記ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子を含む遺伝子カセットを導入した遺伝子改変クローンブタの精子を培養液中で共培養し上記＜参考例４＞と同様のＩＣＳＩ操作、卵子培養、及び受胚レシピエントブタの子宮への胚移植により、受胚レシピエントブタから遺伝子導入ブタの正常発達胎仔を得る。
＜比較例＞
（ｍＳｉｘ２プロモーター及びＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクター１の構築）
　マウスＳｉｘ２遺伝子の開始コドン周辺領域より上流の約７ｋ塩基をｍＳｉｘ２プロモーターとし、当該ｍＳｉｘ２プロモーターの３’末端にＣｒｅＥＲＴ２及びｐＡが連結され、更に上記ｐＡの下流にＣＡＧプロモーターが連結し、更にＣＡＧプロモーターの３’末端にｌｏｘＰ－ＳＴＯＰ－ｌｏｘＰ配列が続き、その下流にＤＴＡ－ｐＡで構成されたオールインワン型ノックインベクターを構築した。
　図１０は、上記構築したｍＳｉｘ２プロモーター及びＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクター１を示す概略図である。
（ｍＳｉｘ２プロモーター及びＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクター２の構築）
　マウスＳｉｘ２遺伝子の開始コドン周辺領域より上流の約７ｋ塩基をｍＳｉｘ２プロモーターとし、当該ｍＳｉｘ２プロモーターの３’末端にＰ２Ａ（ブタテスコウイルス－１由来自己切断２Ａペプチド）が更にＥＲＴ２ＣｒｅＥＲＴ２及びｐＡが連結され、更に上記ｐＡの下流にＣＡＧプロモーターが連結し、更にＣＡＧプロモーターの３’末端にＦＬＥｘ　ｓｗｉｔｃｈ型のｌｏｘＰｌｏｘ２２７２とｌｏｘＰｌｏｘ２２７２（逆向き）とで挟まれたＤＴＡ－ｐＡ配列（逆向き）で構成されたオールインワン型ノックインベクター２を構築した。
　図１１は、上記構築したｍＳｉｘ２プロモーター及びＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクター２を示す概略図である。
　得られたｍＳｉｘ２プロモーター及びＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクター１及び２はリニアライズ後、下記ＩＣＳＩで使用した。
（ＩＣＳＩを介したオールインワン型ベクター１及び２による遺伝子導入ブタの構築）
　「組織ないし臓器特異的ＣｒｅＥＲＴ２発現ベクター」を上記ｍＳｉｘ２プロモーター及びＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクター１又は２に変更する以外は実施例１と同様にしてＩＣＳＩを介した遺伝子導入ブタの構築を行った。
　ＩＣＳＩを介したオールインワン型ベクター１又は２による遺伝子導入ブタの構築結果を下記表１及び２にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１から明らかなように、ＩＣＳＩを介したオールインワン型ベクター１による遺伝子導入では、正常発達遺伝子導入胎仔が１頭得られたものの、遺伝子導入ブタ胎仔の作出効率は０．３５％未満であり作出効率は極めて低かった。ＣｒｅＥＲＴ２遺伝子のコピー数に対する、ｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子のコピー数のバランスが悪かった（過剰であった）ことが影響しているものと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２から明らかなように、ＩＣＳＩを介したオールインワン型ベクター２による遺伝子導入では、正常発達遺伝子導入胎仔は得られなかった（遺伝子導入ブタ胎仔の作出効率０％）。また、遺伝子導入された胎仔は全て退行してしまった。
　以上のように、ｍＳｉｘ２プロモーター及びＣｒｅＥＲＴ２並びにｌｏｘＰ－ＤＴＡ遺伝子の両方を含むオールインワン型ベクターでは、遺伝子導入ブタの構築は困難であった。

Claims (8)

  1. 　機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域へ導入して得られた遺伝子改変ブタ細胞を体細胞クローニングして得られる遺伝子改変クローンブタの精子と、
    　ベクター（１）とを含む液を卵に顕微授精することにより遺伝子導入する工程を含む遺伝子導入ブタの製造方法であって、
    　前記ベクター（１）が、
    　特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含む、製造方法。
  2. 　前記セーフハーバー領域がＲＯＳＡ領域である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ベクター（１）がプラスミドベクター、又は、人工染色体ベクターである、請求項１に記載の方法。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の方法により製造された遺伝子導入ブタから樹立された体細胞。
  5. 　機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域中に含む遺伝子改変ブタ細胞を含む、体細胞クローニング原料であって、
    　下記ベクター（１）共存下の顕微授精による遺伝子導入用原料を提供するための、体細胞クローニング原料。
    　（１）特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含む、ベクター
  6. 　特定の組織ないし臓器で発現するプロモーター、特定の組織ないし臓器で発現する前記プロモーターの下流に存在し制御下にある前記組み換え酵素をコードする遺伝子を含み、
    　機能性タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記組み換え酵素によって前記機能性タンパク質が発現可能となるコンストラクトを含む遺伝子カセットをセーフハーバー領域中に含む、遺伝子導入ブタ。
  7. 　請求項６に記載の遺伝子導入ブタから樹立された体細胞。
  8. 　請求項６に記載の遺伝子導入ブタから摘出された組織ないし臓器。
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