CN105142396A

CN105142396A - 缺角家畜

Info

Publication number: CN105142396A
Application number: CN201480013546.9A
Authority: CN
Inventors: S.C.法伦克鲁格; D.F.卡尔森
Original assignee: Recombinetics Inc
Current assignee: Recombinetics Inc
Priority date: 2013-01-14
Filing date: 2014-01-14
Publication date: 2015-12-09
Also published as: WO2014110552A1; AU2014205134A1; JP2016507228A; US20140201857A1; EP2943060A1; NZ629569A; MX2015009122A; AU2019284065A1; PH12015501797A1; CA2897932A1; EP2943060A4; AU2014205134B2; KR20150105475A

Abstract

提出了用于产生带有无角等位基因的家畜的组合物和方法，其包括将无角等位基因迁移到牛种中而不改变其它基因或染色体部分。动物可以经遗传修饰而使得其不具有角。一种此类方法涉及牛无角等位基因的渐渗。因此，产生家畜品种来接收无角等位基因而不改变它们的其它性状。本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，其包含从有角等位基因到无角等位基因的基因组修饰。

Description

缺角家畜

对相关申请的交叉引用

本申请要求2013年1月14日提交的美国临时申请号61/752,232和2013年8月27日提交的美国临时申请号61/870,570的优先权，其各自通过提述特此并入本文。

政府支持声明

本文所述工作的方面由美国国立卫生研究所(NationalInstitutesofHealth)的基金1R43RR033149-01Al和USDA(美国国立粮食和农业研究所(NationalInstituteofFoodandAgriculture)的生物技术风险评估项目竞争性基金号2012-33522-19766支持。美国政府可以拥有这些发明的某些权利。

技术领域

本技术领域涉及经遗传修饰生物体，如细胞，或没有角的动物。

发明背景

在多种物种中移除家畜的角以使饲养这些动物更加容易。有许多用来除去这些角的方法。

发明概述

动物可以遗传修饰为使得它们没有角。一种这样的方法涉及牛无角等位基因(polledallele)的渐渗(introgression)。因此，产生家畜品种来接收无角等位基因而不改变它们的其它性状。

本发明的一个实施方案是经遗传修饰的家畜动物，其包含从有角等位基因(hornedallele)到无角等位基因的基因组修饰。所述动物可以是具有有角等位基因的动物的第一品种，而无角等位基因存在于动物的第二品种中。无角等位基因可以是天然的或合成的。

本发明的一个实施方案是体外细胞，其包含对该细胞的有角等位基因的基因组修饰。在有角等位基因(有角基因座)处的修饰是从有角等位基因到无角等位基因的修饰。所述细胞可以是家畜细胞。

本发明的一个实施方案是创建经遗传修饰的家畜生物体的方法，其包含改变家畜原代细胞、家畜原代体细胞、家畜干细胞、家畜原生殖细胞、家畜合子、家畜胚泡，或家畜胚胎的天然有角等位基因，其中将所述有角等位基因改变为无角等位基因。

实施方案包括任意以上方法，其包含在没有报告基因的情况下将细胞暴露于归巢内切核酸酶(位点特异性内切核酸酶)，创建克隆细胞的集落，并测试集落成员的子集来鉴定在靶定染色体位点处掺入修饰的集落。

进一步的实施方案涉及根据一种或多种这些方法制备的生物体(经遗传修饰的动物、经遗传修饰的建立者动物，或经遗传修饰的细胞)。实施方案包括这些技术中涉及的质粒、载体，以及分离的核酸，例如位点特异性内切核酸酶和HDR模板以及用于表达它们的载体。

本发明的实施方案包括经修饰的细胞用于产生家畜动物的用途。一种用于产生所述动物的技术是克隆。

实施方案包括经修饰的动物或者其后代作为家畜的用途。用于产生细胞或动物的方法可以用于产生带有无角表型的家畜建立者动物。

以下专利申请通过提述特此并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准：US2010/0146655、US2010/0105140、US2011/0059160、US2011/0197290，2月24日提交的美国系列号13/404,662、2011年2月25日提交的美国系列号61/446,651，2012年6月21日提交的美国系列号61/662,767，以及2012年8月24日提交的13/594,694。这些专利申请的每一个通过提述特此并入本文用于所有目的。

附图简述

图1.组a)牛有角/无角基因座的图解。设计TALENs来在箭头指示处切割有角变体。组b)四种TALENs的有义链序列。组c)对使用编码每种TALEN对的mRNA转染后三天的有角荷尔斯泰因牛(Holstein)成纤维细胞细胞的调查者(Surveyor)分析。TALENID和转染后的孵育温度在凝胶上方标明。序列标识符如下：HP1.1左和右(SEQIDNO:1和2)；HP1.2左和右(SEQIDNO:3和4)；HP1.3左和右(SEQIDNO:5和6)；HP1.4左和右(SEQIDNO:7和8)。

图2.TALEN介导的POLLED(无角)渐渗。组a)将无角等位渐渗到荷尔斯泰因牛(HORNED(有角))细胞中的策略图解。所述POLLED(无角)等位基因(底部)是带有10bp缺失(未示出)的212bp串联重复(红色箭头)。TALEN开发为特异性靶向HORNED等位基因(绿色垂直箭头)，其可以使用POLLEDHDR质粒通过同源重组修复。组b)带有POLLED纯合或杂合渐渗的集落的代表性图像。使用了三组引物用于候选集落的阳性分类：F1+R1、F2+R2和F1+P(POLLED特异性)。PCR产物的身份通过对F1+R1扩增子测序来确定。

图3.在分离的集落中无角转化的例子。从图2中所述的细胞群增殖个别的集落。通过图2中所述的PCR方法分析每个集落。克隆3在389和591bp(箭头)两处都有产物，指示对无角等位基因的杂合转化。使用的修复模板长为591个残基。

图4.组a)将有角等位基因转化为无角等位基因的图解。将HP1.3TALEN加上短的修复模板引入有角细胞中。修复模板通过PCR从有角安格斯牛基因组DNA产生；标明了同源性长度。组b)在使用Gal4:RecA包被的2μgTALENmRNA+500ngssDNA转染的有角荷尔斯泰因牛成纤维细胞中对无角转化的PCR评估。每一泳道/PCR反应由从转染群稀释的约3个细胞等同物组成。从有角细胞中使用引物btHP-F1和btHP-R1的PCR产生389bp的产物。转化为无角导致202个碱基对的净插入；因此相同引物的PCR产物产生591bp的产物(左边缘的箭头)。其产物指示无角转化的反应数示于右上角。组c)在使用2μgTALENmRNA+1500ngssDNA转染的有角荷尔斯泰因牛成纤维细胞中对无角转化的PCR评估。其产物指示无角转化的反应数示于右上角。

图5.TALEN和CRISPR/Cas9介导的在猪APC处的HDR的比较。组a)APC14.2TALEN(SEQIDNO:9和10)和gRNA序列APC14.2Gla(SEQIDNO:12)相对于野生型APC序列(SEQIDNO:11)示出。下方，示出了HDR寡聚物(oligo)(SEQIDNO:13)，其递送4bp的插入，产生一个新的HindIII位点。接着，将使用2μΜ寡聚物HDR模板，和1μgTALENmRNA，各1μg编码hCas9的质粒DNA和gRNA表达质粒；或1μg编码hCas9的mRNA和0.5μggRNA表达质粒转染的猪成纤维细胞分开并在30或37℃培养三天，接着在37℃扩增直到第10天。组b)显示RFLP和调查者分析结果的图表。

发明详述

如本文所报道的，已使用遗传技术产生缺角家畜动物(hornlesslivestockanimals)。通常有角但因为自发突变而没有角的动物称为无角动物(polledanimal)。为了保护乳牛场操作员和牛的安宁，在美国、欧洲和其它地区的大部分乳牛例行手动去除角。去角是痛苦的，引起动物应激的暂时性上升，增加动物生产的费用，以及尽管打算保护动物免受后续损伤，该实践被一些人视为不人道的。一些肉牛品种是天然无角的(例如安格斯牛)，即称为POLLED的性状，其是显性的。本文所列的技术通过提供不必经历去角的动物而改善动物福利。最近在1号染色体上鉴定了两种赋予无角性(polledness)的等位变体。带有任一种这些突变的乳牛是罕见的，并且与其有角对应物相比，通常在牛奶场遗传选择指数(dairygeneticselectionindices)上排名要低得多。可以通过传统的杂交繁育完成POLLED等位基因对有角品种的减数分裂渐渗，但杂交动物的遗传价值将受到损害，并要求选择培育许多过长世代来恢复生产能力。

几十年来遗传学家一直在寻找无角性的遗传基因座。简单地说，二十年来无角性一直是密集现代研究的一个目标。见Allais-Bonnet等，(2013)NovelInsightsintotheBovinePolledPhenotypeandHornOntogenesisinBovidae.PLoSONE8(5):e63512。在许多品种中，无角突变快速定位到牛的1号染色体，但是由于各种原因，无角性的遗传成因的实际位点难以捉摸。然而，就在最近，已显示至少存在两种无角等位基因(一个“Celtic”和一个“Friesian”)，并且对于其每一种提出了候选突变。Medugorac等，(2012)Bovinepolledness-anautosomaldominanttraitwithallelicheterogeneity.PLoSOne7:e39477。这些突变中没有一个位于已知的编码区或调控区中。本文中，发明者显示了在非无角(有角)动物中的相当位点处产生遗传变化能产生无角表型。

然而，可以在动物中创建无角性，并且不干扰动物的基因组而做到这一点。在衍生于有角乳用公牛(horneddairybull)的成纤维细胞中完成了CelticPOLLED等位基因(也称为Pc等位基因)(替换10bp的212bp重复)的非减数分裂渐渗。从安格斯牛品种采集到含有包括CelticPOLLED等位基因的1594bp片段的质粒HDR模板(图1，a组)。TALEN经设计使得其能够切割HORNED等位基因，但使POLLED等位基因保持不受影响。令人惊讶的是，这一实验表明，作为mRNA递送的一对TALEN具有与质粒表达盒相比相似的活性(数据未示出)。因此，进行作为mRNA递送TALEN以消除TALEN表达质粒的可能的基因组整合的实验。226个集落中的五个(2％)通过了图1的b组所示的每一个PCR测试以确定POLLEN的渐渗。五个克隆中的三个对于POLLED渐渗是纯合的，并通过测序确认为与意图的等位基因100％相同(数据未示出)。

基于动物交配或人工繁殖技术的传统育种计划涉及将多种基因混合以期最终产生创建或组合期望性状的基因的良好组合。转基因技术提供加速传统育种过程的希望。转基因方法的一些缺点在于尽管该方法是一种改进，但是它是缓慢、昂贵且劳动力密集的。低效率和结果的不可预测性是常见的。此外，仅对想要的基因组位点做出改变的方法不是公知的。

发明人开发了可用于农业、研究工具，或生物医学目的的大致各种家畜细胞和/或动物中的多种基因的精确、高频的编辑。这些家畜基因编辑方法包括TALEN和CRISPR/Cas9刺激的同源性指导修复(HDR)，其使用质粒、rAAV和寡核苷酸模板进行。发明者在本文中显示了将牛POLLED等位基因渐渗到有角荷尔斯泰因牛成纤维细胞中。这一例子证明了可以创建各种没有角的乳牛品种。并且可以不干扰动物的其他基因或基因组的其它部分而完成这种改变。发明者开发出这些方法来达到如此高的效率以致遗传改变可以不需要报告物和/或不需要选择标志物而完成。此外，所述方法可以用于建立者世代(foundergeneration)，来产生仅在意图位点具有意图变化的经遗传修饰的动物。这些方法证明了无角和缺角等位基因对用于研究、农业和生物医学应用的家畜细胞、大型哺乳动物，和家畜的无减数分裂种内和种间渐渗。

图1描述了用于确定是否能产生结合并切割牛DNA中的适当位点的位点特异性核酸酶的实验。问题之一是确定是否能结合串联重复，记住由于分子间重组的高可能性，在期望结合位点处的重复序列可以混淆靶向。此外，这些结合在培养的活细胞中必须是高效的并相互协作。由于无角等位基因与有角等位基因的高度相似性，有角等位基因尤其是一项挑战。TALEN结合位点的选择位置不是明显的；成功的TALEN设计可以切割并结合有角基因座但不允许TALEN切割无角等位基因。发现这些设计是本发明研究中的一项重大成就。这一方法的成功无法预测。如图1所示，选择作为目标的有角等位基因具有212个残基，而无角等位基因具有那212个残基的重复。无角等位基因还具有重复间的10个碱基对(bp)的缺失。a)组描述了212bp序列，带有要在末端删除的10bp，位于左TALEN(通过实心倒三角标记)和右TALEN(通过实心三角标记)之间。因此该TALEN对放置在所述10bp缺失位点的任一边缘。TALEN对在10bp缺失的区域中切割有角等位基因。使用同源依赖性重组(HDR)模板来引导212个残基重复(实际上为202个残基，因为其为带有10bp缺失的重复)插入到TALEN结合的位置之间。如a)组所描述的，在无角上，左TALEN和右TALEN接着以202个残基分开。并且减少对无角等位基因的再次切割。产生了各种TALEN来确定是否可以合理实现结合和切割。b)组中的表格列出了一些经测试的TALEN。c)组显示了测试结果及通过％NHEJ测量的其效率。第三道的TALEN(HP1.3)后续用于无角等位基因的渐渗。

用于减少位点特异性(也称为靶向性)内切核酸酶的再结合的实施方案包括将外源性无角等位基因渐渗到细胞的染色体DNA中的同源性指导的修复(HDR)的方法，其包括将靶向性核酸酶系统和含有外源性等位基因的HDR模板导入细胞中，所述靶向性核酸系统包含DNA结合成员，用于特异性结合染色体DNA中的内源性关联有角等位基因序列，其中所述靶向性核酸酶系统和HDR模板起作用以将染色体DNA改变为与HDR模板序列具有同一性，并将外源性等位基因渐渗到染色体DNA中代替内源性等位基因，其中所述HDR模板序列经设计为减少DNA结合成员与HDR模板序列的特异性结合。

图2显示了用于将无角等位基因渐渗到带有有角等位基因的细胞中的研究策略和结果。有角等位基因在PCR引物F1和R1之间有1546个bp。在这一序列中，PRC引物F2和R2之间有365个bp。带有以箭头代表的212bp序列的有角等位基因位于该区域中。POLLED等位基因(底部)具有含10bp缺失(未示出)的212bp的串联重复序列(以两个箭头示出)。PCR引物F2和R2之间的长度为567bp；567bp等于有角等位基因中的365bp加上212bp重复减去10bp缺失。HDR模板的长度为1594bp。一旦将模板序列渐渗到细胞的染色体中，引物F1和R1之间有1746bp；1746bp等于有角等位基因的1546bp加上212bp重复减去10bp缺失。此外，对于无角等位基因独特的PCR产物在串联重复序列区中标为P。开发了TALEN来特异性靶向HORNED等位基因(图1)，其能够通过使用HDR模板的同源重组来修复。稀释接收TALEN和HDR模板的细胞并作为单细胞铺板，将所述单细胞培养并允许在克隆集落中复制。测试集落成员的无角等位基因。b组显示了带有POLLED纯合或杂合渐渗的集落的代表性图像。使用三个引物组用于候选集落的阳性分类：F1+R1、F2+R2和F1+P(POLLED特异性)。通过测序F1+R1扩增子来确定PCR产物的身份。

图3是无角转化的例子。除了使用不同的HDR模板，无角等位基因以图1和图2所述相似的方式渐渗到细胞中。模板长591bp：

5'gtctggggtgagatagttttcttggtaggctgtgaaatgaagagtacgtggtaccaactactttctgagctcacgcacagctggacgtctgcgcctttcttgttatactgcagatgaaaacattttatcagatgtttgcctaagtatggattacatttaagatacatatttttctttcttgtctgaaagtctttgtagtgagagcaggctggaattatgtctggggtgagatagttttctttgctctttagatcaaaactctcttttcatttttaagtctatcccaaaagtgtgggaggtgtccttgatgttgaattataggcag(SEQIDNO：14).

如箭头所指示，12个集落中的一个具有表明无角等位基因的渐渗的PCR产物。

图4描述了用于将无角等位基因渐渗到细胞中的另一种方案。使用了325bp的HDR模板。渐渗的等位基因是红安格斯牛无角，而接收者是有角荷尔斯泰因牛成纤维细胞。模板具有29bp的上游重叠和84bp的下游重叠。212bp重复位于重叠间。重复用作天然212bp序列的10bp缺失的代替。除了使用TALEN的热变性(单链)寡聚物外，这一过程与图1-3中所描述的那些相似。如图4，b和c组中所示，测试了两种条件。在b)组中，使用经Gal4：RecA包被的2μgTALENmRNA+500ngssDNA转染细胞。每条泳道/PCR反应由从转染群稀释的约3个细胞等同物组成。从角细胞(horbcell)使用btHP-F1和btHP-R1引物的PCR产生389bp的产物。无角的转化导致202个碱基对的净插入；因此相同引物的PRC产物导致591bp的产物(左边缘的箭头)。产物指示无角转化的反应数示于右上角。c组)对使用2ugTALENmRNA+1,500ngssDNA转化的有角荷尔斯泰英牛成纤维细胞中无角转化的PCR评估。产物指示无角转化的反应数示于右上角。

图5显示了使用CRISRP/cas9的等位基因渐渗。将这一方法与TALEN方法比较。渐渗的等位基因是腺瘤性结肠息肉病(Adenomatouspolyposiscoli，APC)。在a组)中，APC14.2TALEN和gRNA序列APC14.2Gla相对于野生型APC序列示出。在下方，示出了HDR寡聚物，其递送4bp的插入(见方框部分)，产生新的HindIII位点。然后，将用2μΜ寡聚物HDR模板，和1μgTALENmRNA、各1μg编码hCas9的质粒DNA和引导RNA(gRNA)表达质粒；或者1μg编码hCas9的mRNA和0.5μggRNA表达质粒转染的猪成纤维细胞分开并在30或37℃培养三天，其后在37℃扩增直到第10天。在b组)中，该图表显示了RFLP和调查者分析的结果。正如以前所确定的，TALEN刺激的HDR在30℃最有效率，而CRISPR/Cas9介导的HDR在37℃最有效率。对于该基因座，TALENS比CRISPR/Cas9系统在刺激HDR上更有效率，尽管调查者分析测量到了相似的DNA切割频率。与TALEN形成对比，当hCas9作为mRNA递送时相对于质粒，HDR的差异很小。

根据本文的公开，教导了用位点特异性内切核酸酶(如TALEN)创建无角动物。产生经遗传修饰家畜的障碍之一在于使用常规最佳实施时，对动物细胞做出修饰的效率只有百分之几。即使低效率对于创建经遗传修饰的低等动物(如果蝇或小鼠)可以是有用的，因为它们具有短且多产的生殖周期，这提供了创建、测试，和筛选数百个动物来确定是否有已经成功修饰的几个。然而，常规达到的这些效率水平不适合于具有长得多的妊娠时间以及每次妊娠相对较少的后代的家畜偶蹄动物。使用遗传工具修饰家畜的另一个障碍是在原代细胞中内切核酸酶介导的DNA修饰是困难的，因为细胞是不稳定的。实际上，在缺乏富集或选择方法时，TALEN修饰的细胞的频率随着时间显著下降。不受限于具体的理论，理论化的是在非意图位点处的DNA切割可以通过诱导凋亡或使非靶标基因失能(disable)而危害细胞的稳定性。术语原代细胞表示从活体动物分离的细胞，其中细胞自从其自组织分离起已经历了0至2次复制。作为结果，通常用于创建和检测转化细胞的成功遗传修饰的技术由于原代细胞衰老的倾向而不能在其中使用。作为结果，当使用涉及修饰原代细胞以用于体细胞核转移或其它动物克隆技术的常规方法时，无法合理预期高成功率。然而，如本文所报道的，TALEN和其它位点特异性核酸酶工具已用于产生经遗传修饰的家畜原代细胞。这些修饰适合于通过克隆或直接胚胎注射产生经遗传修饰动物品系的建立者。

本发明的一个实施方案是组合物和方法，其用于使用位点特异性内切核酸酶来遗传修饰家畜(如牛、水牛、偶蹄动物、山羊，或绵羊)，使得动物及其后代不具有角。上文讨论了使用常规方法产生这些动物的许多问题。遗传修饰可以是例如选自下组：插入、缺失、外源性核酸片段的插入或改变为外源性核酸片段、倒位、易位、物种间等位基因迁移、物种内等位基因迁移、基因转化为天然的、合成的，或新的等位基因。例如，可以使用正常的序列替换染色体或染色体对中不希望的突变。通常来说，鉴定目标DNA位点，并且创建会特异性识别该位点的TALEN对。例如，TALEN作为蛋白、mRNA或通过编码TALEN的载体递送到细胞或胚胎。TALEN切割DNA来产生双链断裂，其随后被修复，通常导致插入或缺失(indel)的建立，或掺入伴随的外源性核酸中含有的序列或多态性，所述外源性核酸是插入的或充当模板以用经修饰的序列修复断裂。术语外源性核酸表示加到细胞或胚胎的核酸，不论核酸与细胞中天然的核酸序列相同或者不同。外源性序列指代用于改变目标细胞的序列，不论序列是否实际上是插入染色体DNA中的核酸，或序列是否用作模板来改变细胞DNA。术语核酸片段是广泛的，包括染色体、表达盒、基因、DNA、RNA、mRNA，或其片段。术语ssDNA包括ss-寡核苷酸。细胞或胚胎可以是例如选自下组：家畜、偶蹄动物、牛、猪、绵羊和山羊。术语家畜表示驯养的动物，其作为用于食物或生物材料的商品饲养。术语偶蹄动物表示偶蹄目(Artiodactyla)的有蹄哺乳动物，其包括每只脚具有偶数数量的脚趾，通常为两个或有时为四个的牛、鹿、骆驼、河马、绵羊和山羊。

一个实施方案涉及产生无角而非有角的经遗传修饰的家畜的组合物或方法，其包含将TALEN对或其它位点特异性核酸酶系统导入细胞或胚胎中，从而在位点特异性核酸酶(例如TALEN对)特异性结合的位点处对细胞或胚胎DNA做出遗传修饰，以及从所述细胞产生家畜动物。直接注射可以用于细胞或胚胎，例如注射到合子、胚泡，或胚胎中。或者，可以使用用于蛋白、RNA、mRNA、DNA，或载体导入的多种已知技术之任一种，将位点特异性核酸酶、HDR模板，和/或其它因子导入细胞中。可以从胚胎或细胞根据已知方法(例如将胚胎移植到妊娠期的宿主中)，或各种克隆方法产生经遗传修饰的动物。短语“在TALEN特异性结合的位点处对细胞DNA的遗传修饰”或“在靶定的染色体位点”等表示当TALEN被特异性结合其靶位点时，在TALEN上的核酸酶切割的位点处做出遗传修饰。核酸酶并不在TALEN对结合的地方精确切割，而是在两个结合位点之间的确定位点处切割。

另一个此类实施方案涉及创建替换有角等位基因的无角等位基因的组合物或对细胞或胚胎的处理。细胞或动物胚胎可以用于研究，或用于克隆动物。细胞可以是家畜、偶蹄动物、牛、山羊、绵羊、培养的细胞、永生化的细胞、原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、原生殖细胞、胚泡，或干细胞的。例如，一个实施方案是创建遗传修饰的组合物或方法，其包含将培养物中的复数个原代细胞暴露于TALEN蛋白或编码一种或多种TALEN的核酸。TALEN可以作为蛋白质或核酸片段(例如由mRNA或载体中的DNA序列编码)导入。

可以使用报告物或不使用报告物进行使动物无角的遗传修饰。避免报告物是有益的，因为后来不必将其除去，或是容许的(如果其不除去的话)。但是，在胚胎/细胞水平修饰阶段的报告物的表达允许消除不表达报告物的细胞。或者，它允许将表达报告物的细胞从培养物中移出，以通过克隆或其它转基因动物技术用于动物中，或者转移到第二个培养物中，用于进一步培养和/或数量扩增和/或增加其它载体和/或核酸和/或TALEN和/或其它遗传修饰。基于不依赖于感兴趣基因的其报告物的表达选择细胞是一类共选择方法。如本文所使用的，术语报告物包括报告物和选择标志物。如本文所使用的，术语选择标志物指代遗传表达的生物分子，其赋予通过阳性或阴性存活选择标准而允许分离的性状。报告物可以是例如荧光标志物，例如绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。报告物可以是选择标志物，例如嘌呤霉素、更昔洛韦(ganciclovir)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)，或黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xanthin-guaninephosphoribosyltransferase,XGPRT)。其它表型标志物可以用于选择动物；这些标志物基于可辨别的物理性状(例如表位或颜色)、生长速率，和/或生存能力。用于产生经遗传修饰的细胞、胚胎，或动物的方法包括测试暴露于核酸酶-整合系统(例如Cas9或TALEN)的报告物表达，并且在产生经遗传修饰的家畜和/或偶蹄动物或其它动物(鱼、斑马鱼、犬、小鼠、禽、鸡、大鼠或实验室动物)的方法或组合物中使用所述细胞或胚胎。例如，可以从细胞培养物取出原代细胞并用于克隆。或者，可以从培养物中取出原代细胞并置于第二个培养物中，来产生克隆系或用于进一步的方法。或者，表达报告物的胚胎或合子可以用于植入替代母兽(surrogatedam)中或者可以用于克隆，而其它不表达报告物的胚胎或合子不用于克隆。在一些实施方案中，报告物是选择标志物，其用于选择表达标志物的细胞或胚胎。

一些家畜性状与等位基因相关，如多态性(大或者小)，单核苷酸多肽性、缺失、插入，或其它变异。例如，众所周知来自比利时蓝牛(BelgianBluecattle)的肌肉生长抑制素(myostatin)等位基因(11-bp缺失)导致双肌性(double-muscling)表型。比利时蓝牛等位基因不干扰正常发育。

相似地，对于无角等位基因，本文教导的方法精确放置等位基因，而不破坏其它基因，并且不掺入外源性基因。因为无角等位基因涉及角的不发育，修饰(直接注射或通过克隆)为无角的胚胎预期成功妊娠并产生健康动物的活产。细胞已经从有角等位基因修饰为无角等位基因，并且在申请的时间时，已采取步骤从这些细胞克隆动物并产生活产的动物。

本发明的一个实施方案是将无角等位基因从第一家畜品系或品种转移到第二家畜品系或物种的方法，其包括在含有第一家畜品系/品种的无角等位基因的核酸的存在下，在第二家畜品系/品种的细胞或胚胎中使用TALEN对或位点特异性内切核酸酶切割DNA。胚胎或细胞可以用于建立具有第一品系/品种的无角等位基因的第二品系/品种的动物。含有等位基因的DNA提供用于同源性依赖性修复的模板。作为模板，它与切割的每侧的DNA部分具有同源性，并且还含有期望的等位基因。

本发明的实施方案包含将无角等位基因从一个品种移动到另一个品种。例如，等位基因可以从安格斯牛移动到其它牛。有角品种包括：赫里福德种牛(Hereford)、短角牛(Shortorn)、夏洛莱牛(Charolais)、利木赞牛(Limousin)、西门塔尔牛(Simmental)、婆罗门牛(Brahman)、布兰格斯莱牛(Brangus)、和Wagyu，以及圣热特鲁迪斯牛(SantaGertrudis)、爱尔夏牛(Ayrshire)、瑞士褐牛(BrownSwiss)、Canadienne、荷兰白带牛(DutchBelted)、根西乳牛(Guernsey)、荷尔斯泰因牛(Holstein)(荷尔斯泰因-黑白花牛(Holstein-Friesian))、泽西牛(Jersey)、克雷牛(Kerry)、德文乳牛(MilkingDevon)、短角乳牛(MilkingShorthorn)、挪威红牛(NorwegianRed)、布萨牛(Busa)、Canadienne、艾尔沙尼亚红牛(EstonianRed)、Fleckveih、弗里塞牛(Frieian)、Girolando、伊拉瓦拉短角乳牛(Illawarra)、IrishMoiled、莱恩巴克牛(Lineback)、MeuseRhineIssel、Montbeliarede、诺曼底牛(Normande)、兰德尔牛(Randall)、萨希瓦尔牛(Sahhiwal)、AustralianMilkingZebu、西门塔尔牛(Simmental)、ChianinaMarchigiana、罗马诺拉肉牛(Romagnola)。以上列出的品种中的一些也有无角变体，但是这些品系中遗传特征通常不如有角的版本。无角品种的例子包括：安格斯牛、红安格斯牛(RedAngus)、无角红牛(RedPoll)、盖勒韦牛(Galloway)、白带盖勒韦牛(BeltedGalloway)、AmericanWhitePark、英国白牛(BritishWhite)、Amerifax、牙买加黑牛(JamaicaBlack)、牙买加红牛(JamaicaRed)、莫瑞灰牛(MurrayGrey)、布兰格斯莱牛、布兰格斯红牛(RedBrangus)、Senopol、布尔羊(Boergoats)。如本文它处所列出的，位点特异性内切核酸酶工具(例如TALEN)可以作为蛋白递送或由核酸(例如mRNA或载体)编码。术语品种表示一群驯养的动物或植物，其带有将其与同一物种的其它动物或植物区分的同质的外形、行为，以及其它特性。属于具体品种的动物对于在这些领域实践的技术人员是已知的。

术语等位基因表示基因或遗传基因座的两种或更多种形式的一种。生物的群体或物种在各个个体之间通常在每个基因座包括多种等位基因。基因座处的等位变异作为存在的等位基因(多态性)的数量或者群体中杂合子的比例是可测量的。术语天然等位基因用于本文表示自然界中找到的等位基因。术语新等位基因表示非天然等位基因。术语合成的等位基因表示在自然界中找不到的等位基因。外源性等位基因是引入生物体中的等位基因，而内源性等位基因是天然存在于细胞中的等位基因，通常是以其野生型未修饰状态在生物体中的等位基因。杂合的动物具有两种等位基因。在一些情况下，期望引入外源等位基因来产生在已经存在于杂合动物中的等位基因方面纯合的动物。等位基因种间移动表示从一个物种的动物到另一个，而种内移动表示在相同物种的动物之间移动。

已经在牛的1号染色体上鉴定了无角的两种牛等位基因(Medugorac,2012)。P_c,Celtic起源(212bp,1,705,834-1,706,045bp)是重复的(并替换了10bp的序列(1,706,051-1,706,060bp)。带有该等位基因的一些品种包括安格斯牛、盖勒韦牛(Galloway)、弗莱维赫牛(Fleckvieh)、盖普威牛(Gelbvieh)和Murnau-Werdenfelser。黑白花牛(Friesian)起源的第二种无角等位基因(P_F)特征如下：P5ID(替换7bp(使用TTCTCAGAATAG(SEQIDNO:26替换CGCATCA)；1,649,163-1,649,169)以及80,128bp重复(1,909,352-1,989,480bpP80kbID)，加上在位置处的5个点突变(G1654405A,C1655463T,T1671849G,T1680646C,C1768587A))。这些改变通常作为固定区块(block)遗传。所有的染色体坐标来自于UMD3.1牛基因组构件(build)。

不使用任何报告物遗传修饰的动物；TALEN技术；等位迁移

本发明的某些实施方案涉及不使用报告物和/或选择标志物修饰细胞或胚胎的方法。通常来说，在不存在富集或选择方法(如报告基因的使用)时，观察到经TALEN-修饰细胞的频率随着时间显著下降。这一观察导致了诸如涉及报告基因的本文所报道的共转染，共选择技术等方法。

然而，已发现能以如此大的效率进行TALEN修饰，使得不需要报告物，并且其使用仅延迟转基因动物品系的创建。不限于具体理论，许多因素独立促成无报告物实施方案的发明。一个是TALEN倾向于快速并高效率起作用的认识。然而，TALEN修饰在几天的时间范围内倾向于不稳定，使得根据取样的时间，效率可以看起来较低。此外，一般常识认为只有稳定修饰的生物体应该用于产生转基因动物，使得很少有动机去了解短期的修饰。有动机使用细胞存活基因来选择稳定的整合，其在其它系统中常规完成。另一个因素是与表达TALEN的载体相比，TALENmRNA是有效得出乎意料的。直接引入编码TALEN的mRNA通常是有用的，并用于实施例8和9。

另一个有助于无报告物实施方案的发现的因素是ssDNA(ss寡核苷酸)模板和TALEN活性之间出乎意料的协同。这一协同的基础是未知的。例如，通过核转染将0.5-10微克TALEN编码mRNA递送到500,000-700,000个细胞，接着在30摄氏度培养3天，导致一致水平的修饰。但是使用0.2-1.6nMolssODN补充相同条件导致TALEN活性的增加，正如通过调查者测定法测定的NHEJ增加观察到的。通常来说，转染由1-4微克TALENmRNA和0.2-0.4nMolssDNA组成。实施方案包括向细胞或胚胎导入多于约0.05μg每500,000个细胞，或在约0.05μg至约100μg每500,000个细胞范围内的TALENmRNA量；技术人员将立即理解，在明确述及范围内的所有范围和数值都是涵盖的。实施方案包括进一步导入浓度为超过约0.02nMol或在从约0.01至约10nMolssDNA的范围内的ssDNA。

术语直接导入(例如直接mRNA导入)指代mRNA材料的导入。与此相反，通过编码mRNA的载体的方式导入称作间接导入。多种直接导入的方法是已知的，例如电穿孔、转染、脂转染、脂质体、核转染、生物射弹颗粒、纳米颗粒、脂质转染、电融合，以及直接注射。

可以直接从修饰的细胞或胚胎创建建立者(founder)无角动物，而不需要创建随后为了创建新转基因品系的基础而育种的最初修饰的动物。术语建立者或建立者动物用于指代第一代(“F0”)转基因动物，其直接从修饰的克隆细胞或处理/注射的胚胎发育而来。本文报道的方法提供创建仅在染色体目标位点处遗传修饰的建立者，而没有育种和/或近交的中间步骤。此外，实施方案包括在修饰方面纯合的建立者。可以在永不将细胞和/或胚胎暴露于报告基因(和/或选择标志物基因)的情况下制备建立者。

实施方案包括产生经遗传修饰的无角动物的方法，所述方法包含将胚胎或细胞暴露于编码TALEN的mRNA，所述TALEN特异性结合胚胎或细胞中的染色体目标位点，在替代母体(surrogatemother)中克隆细胞，或将胚胎植入替代母体中，所述替代母体孕育没用报告基因并仅在TALEN结合的染色体目标位点处遗传修饰的动物。动物可以没有所有的报告基因或可以没有选择标志物，例如，没有选择标志物但是具有报告物，如荧光蛋白。选项包括直接导入作为mRNA的TALEN和/或提供用于遗传修饰的模板(例如等位基因)的ss寡核苷酸。

产生经遗传修饰的无角动物的方法包含将TALEN和/或载体导入培养的细胞(例如原代家畜细胞)中。TALEN被引导到特定的染色体位点，并在该位点处引起遗传改变。也可以将HDR模板导入细胞中，例如作为双链载体、单链DNA，或作为ss核苷酸直接导入。接着，将培养细胞培养以形成克隆细胞的集落。集落通过PCR测试和/或测序，或以其它方式测定遗传修饰，优选地在没有报告基因和/或没有选择标志物的情况下。从在意图位点处遗传修饰的集落中取出细胞并用于克隆。例如，10至50,000个细胞用于产生植入替代者中的10到50,000个胚胎，例如，以每个替代者1-500个胚胎的组中；技术人员将立即理解在明确表述的范围内的所有范围和数值是涵盖的。实施方案包含将细胞在没有报告基因的情况下暴露于TALEN，创建克隆细胞的集落，并检测集落成员的子集来鉴定在染色体目标位点处掺入修饰的集落。

从培养的细胞产生克隆细胞的集落的方法是已知的。一种此类方法涉及将来自第一培养物的细胞分散到第二培养物中，其中各个细胞不互相接触，例如，通过将细胞稀释到多孔板中，或稀释到对于其中放置的细胞数具有相对较大表面积的板中。将细胞培养一段允许细胞增殖的时间。增殖的细胞在它们不太可能移动得远离它们原来的位置的条件下培养。作为结果，一段时间后使用者可以观察到细胞并看到全部由单细胞及其后代构成的多个集落。可以对集落中细胞的子集取样，而不破坏集落中的其它细胞。

位点特异性核酸酶系统

基因组编辑工具(如转录激活物样效应器核酸酶(TALEN))和锌指核酸酶(ZFN)已经影响了生物技术、基因治疗，以及许多物种中的功能基因组研究领域。最近，RNA引导的内切核酸酶(RGEN)通过互补RNA分子引导到其目标位点。Cas9/CRISPR系统是REGEN。tracrRNA是另一种此类工具。这些是靶向性核酸酶系统的例子：这些系统具有将所述核酸酶定位到目标位点的DNA结合成员。接着，核酸酶切割位点。TALEN和ZFN具有融合到DNA结合成员的核酸酶。Cas9/CRISPR是在目标DNA上找到彼此的关联物。DNA结合成员具有染色体DNA中的关联序列。DNA结合成员通常根据意图的关联序列设计，以获得在意图位点处或附近获得核水解作用。某些实施方案可不受限地应用于所有此类系统；包括最小化核酸酶再切割的实施方案，在意图残基处精确产生SNP的实施方案，以及在DNA结合位点处渐渗的等位基因的放置。

TALEN

术语TALEN用于本文是广泛的，包括不需要另一个TALEN辅助而能切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还用于指代工程化改造成共同起作用以在相同位点处切割DNA的TALEN对的一个或两个成员。共同起工作的TALEN可以称为左-TALEN和右-TALEN，其参考DNA或TALEN对的手性。

TAL的密码(cipher)已有报道(PCT申请WO2011/072246)，其中每个DNA结合重复负责识别目标DNA序列中的一个碱基对。可以装配残基以靶向DNA序列。简言之，确定用于TALEN结合的目标位点，并创建包含核酸酶和一系列识别目标位点的RVD的融合蛋白。在结合后，核酸酶切割DNA，使得细胞修复机器能够运行以在切割末端处产生遗传修饰。术语TALEN表示包含转录激活物样(TAL)效应器结合域和核酸酶域的蛋白，并包括本身功能性的单体TALEN以及其它要求与另一个单体TALEN二聚化的TALAN。当两个单体TALEN相同时二聚化可以产生同二聚体TALEN，或者当单体TALEN不同时可以产生异二聚体TALEN。已显示了TALEN在永生化的人类细胞中通过两种主要的真核DNA修复途径(非同源末端连接(NHEJ)和同源性指导的修复)来诱导基因修饰。

本文中提供了用于将TALEN导入细胞或胚胎中，以及从其形成动物的多个工作例。用于TALEN处理的细胞包括培养细胞、永生化细胞、原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、原生殖细胞、胚泡，或干细胞。实施例10详细说明了用于修饰精原干细胞的实验结果。这些细胞提供了用于动物(例如家畜)遗传修饰的另一种方法。遗传修饰或基因编辑可以在从供体睾丸分离的精原干细胞(雄性种系干细胞，本文中缩写为GSC)中在体外执行。将经修饰的细胞移植到受体的生殖细胞消减的睾丸中。植入的精原干细胞产生带有遗传修饰的精子，其可以用于通过人工受精(AI)或体外受精(IVF)的繁殖，来得到建立者动物。这一方法具有超出产生经遗传修饰的建立者的优势。一个这样的优势当用于特定疾病模型的建立者不健康并且不适合生长到生殖年龄时是明显的。如此，导入GSC中的相同修饰可以植入健康个体的睾丸中，从而允许从健康动物繁殖品系来产生新生儿小猪中的疾病模型。

在精原干细胞中产生TALEN介导的插入和缺失(indel)的可能性和效率首先通过转染编码靶向至猪杜氏肌营养不良症基因座(DucheneMuscularDystrophylocus)(DMD)的外显子7的TALEN的质粒来探索。尽管生殖细胞转染率为25％，几种核转染条件、质粒量和孵育温度的测试产生了19％NHEJ的最大效率，TALEN活性在30℃培养的复制物中最高。GSC在30℃培养超过5天后仍然存活，虽然整体来说，生殖细胞的存活在37℃更高。与质粒DNA相比转染TALEN编码mRNA导致家畜体细胞和GSC的更大的活性和存活力两者。值得注意的是，虽然在这个实验中，mRNA转染的活性峰值没有超过质粒DNA转染，但是达到相同水平的修饰要求显著更低的mRNA量。实施例11详细描述了在原生殖细胞(禽)中成功的TALEN刺激的HDR。

在一些实施方案中，可以使用单体TALEN。TALEN通常作为跨越具有间隔物的两分识别位点的二聚体发挥功能，使得两个TAL效应器域的每一个融合到FokI限制酶的催化域，每一个所得的TALEN的DNA识别位点被间隔物序列分开，并且每一个TALEN单体与识别位点的结合允许Fokl二聚化并在间隔物内创建双链断裂。然而，也可以构建单体TALEN，使得单个TAL效应器与不需要二聚化来发挥功能的核酸酶融合。一种此类核酸酶例如是FokI的单链变体，其中两个单体作为单个多肽表达。其它天然存在或工程化的单体核酸酶也可以起到这一作用。用于单体TALEN的DNA识别域可以衍生于天然存在的TAL效应器。或者，DNA识别域可以经工程化来识别特定的DNA目标。工程化的单链TALEN可以更易于构建和采纳，因为其仅要求一个工程化的DNA识别域。可以使用两个不同DNA结合域(例如一个TAL效应器结合域和一个来自于另一类分子的结合域)产生二聚体DNA序列特异性核酸酶。TALEN可以作为跨越具有间隔物的两分识别位点的二聚体发挥功能。这种核酸酶结构也可以用于从例如一个TALEN单体和一个锌指核酸酶单体生成的目标特异性核酸酶。在这种情况下，TALEN和锌指核酸酶单体的DNA识别位点可以通过适当长度的间隔物分开。两个单体的结合可以允许FokI二聚化，并在间隔物序列内创建双链断裂。除了锌指之外的其它DNA结合域(例如同源域、myb重复或亮氨酸拉链)，也可以融合到FokI并充当TALEN单体的配偶来创建功能性核酸酶。

术语核酸酶包括外切核酸酶和内切核酸酶。术语内切核酸酶指代能够催化DNA或RNA分子(优选DNA分子)内的核酸之间的键的水解(切割)的任意野生型或变体酶。内切核酸酶的非限制性例子包括II类限制性内切核酸酶，如FokI,HhaI,HindIII,NotI,BbvCl,EcoRI,BglII,和AlwI。当具有通常长度约12-45个碱基对(bp)，更优选14-45bp的多核苷酸识别位点时，内切核酸酶还包含切点罕见内切核酸酶(rare-cuttingendonucleases)。切点罕见内切核酸酶在限定基因座处诱导DNA双链断裂(DSB)。切点罕见内切核酸酶可以是例如归巢内切核酸酶，即由工程化锌指域与限制性酶(如FokI)或化学内切核酸酶的催化域融合得到的嵌合锌指核酸酶(ZFN)。在化学内切核酸酶中，化学或肽切割剂与核酸聚合物或另一个识别特定目标序列的DNA缀合，从而将切割活性靶向到特定的序列。化学内切核酸酶也包括合成的核酸酶，如邻二氮杂菲、DNA切割分子，以及已知结合特定DNA序列的三链体形成寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotides，TFO)的缀合物。根据本发明，这些化学内切核酸酶包含于术语“内切核酸酶”中。这些内切核酸酶的例子包括I-SeeI,I-ChuLI-CreI,I-CsmI,Pi-SeeLPI-TtiLPI-MtuI,I-CeuI,I-SeeIL1-SeeIII,HO,Pi-CivI,PI-CtrLPI-AaeI,PI-BsuI,PI-DhaI,PI-DraLPI-MavLPI-MehI,PI-MfuLPI-MflI,PI-MgaLPI-MgoI,PI-MinLPI-MkaLPI-MleI,PI-MmaI,PI-30MshLPI-MsmI,PI-MthI,PI-MtuI,PI-MxeI,PI-NpuI,PI-PfuLPI-RmaI,Pl-SpbI,PI-SspLPI-FaeLPI-MjaI,PI-PhoLPi-TagLPI-ThyI,PI-TkoI,PI-TspI,I-Msol。

同源性指导的修复(HDR)

同源性指导的修复(HDR)是细胞中修复ssDNA和双链DNA(dsDNA)损伤的一种机制。当存在有与损伤位点具有显著同源性的序列的HDR模板时，细胞可以使用这一修复机制。特异性结合在该术语在生物领域中通常使用时指代分子以与非目标组织相比相对较高的亲和力结合目标，并且通常涉及多个非共价相互作用，如静电相互作用、范德华相互作用、氢键键合等等。特异性杂交是一种具有互补序列的核酸之间的特异性结合的形式。蛋白也可以特异性结合DNA，例如，在TALEN或CRISPR/Cas9系统中或通过Gal4基序。等位基因的渐渗指代将外源性等位基因通过模板引导方法复制到内源性等位基因上的过程。在一些情况下，内源性等位基因实际上可以被切出并由外源性核酸等位基因代替，但现在的理论是这一过程是复制机制。由于等位基因是基因对，它们之间具有显著的同源性。等位基因可以是编码蛋白的基因，或其可以具有其它功能，如编码生物活性RNA链，或提供位点以接受调节蛋白或RNA。

HDR模板是包含渐渗的等位基因的核酸。模板可以是dsDNA或单链DNA(ssDNA)。ssDNA模板优选的是从约20到约5000个残基，虽然也可以使用其它长度。技术人员将立即理解，明确陈述的范围内的所有范围和数值都是涵盖的；例如，从500到1500个残基，从20到100个残基，等等。模板可以进一步包含侧翼序列，其提供与要取代的内源性等位基因或DNA邻近的DNA的同源性。模板还可以包括结合靶向性核酸酶系统的序列，并因此是系统的DNA结合成员的关联结合位点。术语关联指代通常相互作用的两种生物分子，例如受体及其配体。在HDR过程的语境中，生物分子中的一个可以设计为带有结合意图(例如关联)DNA位点或蛋白位点的序列。

一个用于减少对靶向性核酸酶系统的特异性结合的实施方案包括相对于其与内源性DNA的比对在HDR模板中做出改变。一种改变的类型设计为在关联成员之间创建错配。一种改变是插入或缺失一个或多个残基。另一种改变是使用一个残基取代另一个不促进结合的残基。术语残基指代分子链中的单位，例如蛋白中的氨基酸或核酸中的碱基。一个进行改变的位置是系统的DNA结合成员的关联结合位点。

另一种改变类型设计为在与间隔物一起运行的系统(例如TALEN对)中通过在间隔物中产生改变来干扰核酸酶的运行，改变可以在间隔物区域中产生。这些改变可以包括缺失，例如，使得核酸酶受到阻碍而不能产生切口。这些各种改变在本文中通常称为错配，因为当序列比对时，它们创建错配；在这一语境中，缺失、插入，或取代是错配。核酸酶对需要提供协同性的间隔；其活性可以通过对间隔物的增加或扣除来破坏。

进一步的实施方案在外源性等位基因中置入错配。系统的DNA结合成员设计为在至少与内源性等位基因部分重叠的位点处结合。一旦其被渐渗而与外源性等位基因具有同一性，DNA结合成员具有降低的结合。因此，DNA结合成员的关联位点从优选的内源性等位基因改变为非优选的外源性等位基因。关联位点可以涵盖等位基因的全部，或仅其部分。令人惊讶的是，将错配引入外源性等位基因对于稳定外源性等位基因的渐渗是需要的。显然，再切割的问题对渐渗的等位基因的稳定性具有非常大的影响。显示这一影响的数据之前尚未由其他人获得，因为具有相当效率的方法并不是常规可用的。

实施方案包括使用HDR模板化(templating)过程，在这些各个位置处通过残基的插入、缺失，或取代创建错配。例如，可以插入、缺失，或取代1-1000个残基；技术人员将立即理解在明确陈述的范围内的所有范围和数值都是涵盖的；例如1-3个残基，至少10个残基，4个残基，4-20个残基，1-205个残基，1-220个残基，1-300个残基，1-500个残基，10-1000个残基，等等。这些中的一种或多种可以组合，例如在一个位置处的插入，在另一个位置处的缺失，以及在其它位置处的取代。

可以在无报告物的系统中进行这些各种实施方案，并产生SNP或涉及SNP的实施方案。细胞或动物可以是例如家畜、猪、母牛、绵羊、山羊、鸡、兔、鱼、斑马鱼、犬、小鼠、猫、大鼠，以及实验室动物。

组合物和试剂盒

本发明还提供组合物和试剂盒，其含有例如编码位点特异性内切核酸酶、CRISPR、Cas9、ZNF，TALEN的核酸，它们的多肽，含有这些核酸分子或多肽的组合物，或工程化的细胞系。还可以提供对于无角等位基因的渐渗有效的HDR。这些物品可以作为例如研究工具或治疗性使用。

载体和核酸

可以将多种核酸导入偶蹄动物或其它细胞中，用于敲除的目的，或获得基因的表达用于其它目的。可以用于产生转基因动物的核酸构建体包括目标核酸序列。如本文所使用的，术语核酸包括DNA、RNA，以及核酸类似物，以及双链或单链(例如正义或反义单链)的核酸。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分，或磷酸主链处修饰以改进例如核酸的稳定性，杂交，或溶解性。碱基部分处的修饰包括脱氧尿苷代替脱氧胸苷，以及5-甲基-2’-脱氧胞苷和5-溴-2’脱氧胞苷代替脱氧胞苷。糖部分的修饰包括修饰核糖的2’羟基来形成2’-O-甲基或2’-O-烯丙基糖。可以修饰脱氧核糖磷酸主链来产生吗啉代核酸，其中每一个碱基部分与六元吗啉环或肽核酸相连，其中脱氧磷酸主链被假肽主链代替，而保留四种碱基。见Summerton和Weller(1997)AntisenseNucleicAcidDrugDev.7(3):187；和Hyrup等(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5。此外，脱氧磷酸主链可以使用例如硫代磷酸或二硫代磷酸主链、亚磷酰胺、或烷基磷酸三酯主链取代。

目标核酸序列可以可操作地连接到调控区，如启动子。调控区可以是猪调控区，或者可以来自其它物种。如本文所使用的，可操作地连接指代将调控区相对于核酸序列以允许或促进目标核酸转录的方式定位。

任意类型的启动子可以可操作地连接到目标核酸序列。启动子的例子包括但不限于组织特异性启动子，组成性启动子，以及对特定刺激物响应或者不响应的启动子。适合的组织特异性启动子可以产生β细胞中核酸转录物的优先表达，并包括例如人胰岛素启动子。其它组织特异性启动子可以导致例如肝细胞或心脏组织中的优先表达，并分别可以包括白蛋白或α-肌球蛋白重链启动子。在其它实施方案中，可以使用促进核酸分子表达而没有显著的组织或时间特异性的启动子(例如，组成性启动子)。例如，可以使用β-肌动蛋白启动子(如鸡β-肌动蛋白基因启动子、泛素启动子、miniCAG启动子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子)及病毒启动子(如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子，或巨细胞病毒(CMV)启动子)。在一些实施方案中，鸡β肌动蛋白基因启动子和CMV增强子的融合作为启动子使用。见例如Xu等，(2001)Hum.GeneTher.12:563；和Kiwaki等，(1996)Hum.GeneTher.7:821。

诱导型启动子的一个例子是四环素(tet)-开启启动子系统，其可以用于调节核酸的转录。在这一系统中，突变的Tet阻抑物(TetR)融合到单纯疱疹病毒VP16反式激活物蛋白的激活域以创建四环素控制的转录激活物(tTA)，其由tet或多西环素(dox)调控。在没有抗生素时，转录最小，而在tet或dox存在时，转录被诱导。备选的诱导型系统包括蜕皮激素或雷帕霉素系统。蜕皮激素是一种昆虫蜕皮激素，其产生蜕皮激素受体和超气门蛋白(ultraspiracle)基因(USP)产物的异二聚体控制。通过使用蜕皮激素或蜕皮激素类似物(如幕黎甾酮A(muristeroneA))处理诱导表达。施用到动物来触发诱导型系统的药剂称为诱导剂。

可以用于核酸构建体的另外的调控区包括但不限于多聚腺苷酸化序列，翻译控制序列(例如内部核糖体进入区段，IRES)，增强子，诱导型元件，或内含子。这些调控区可能不是必要的，尽管它们可以通过影响转录、mRNA的稳定性，翻译效率等等来增加表达。在想要时核酸构建体中可以包含此类调控区以获得核酸在细胞中的最优表达。然而，有时可以在没有此类另外的元件的情况下获得足够的表达。

可以使用编码信号肽或选择标志物的核酸构建体。可以使用信号肽，使得编码的多肽定向到特定的细胞位置(例如细胞表面)。选择标志物的非限制性例子包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)，二氢叶酸还原酶(DHFR)，潮霉素-B-磷酸转移酶，胸苷激酶(TK)，以及黄嘌呤(xanthin,xanthine)-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。此类标志物对于在培养物中选择稳定的转化体是有用的。其它的选择标志物包括荧光多肽，如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

在一些实施方案中，编码选择标志物的序列在侧翼可以有重组酶(如例如Cre或Flp)的识别序列。例如，选择标志物在侧翼可以有loxP识别位点(由Cre重组酶识别的34-bp识别位点)或者FRT识别位点，使得选择标志物可以从构建体切除。见Orban等,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:6861(关于Cre/lox技术的综述)及BrandandDymecki,Dev.Cell(2004)6:7。含有由选择标志物基因中断的Cre-或Flp-可激活转基因的转座子也可以用于获得带有转基因的条件性表达的转基因动物。例如，驱动标志物/转基因表达的启动子可以是遍在的或者组织特异性的，其可以导致标志物在F0动物(例如猪)中的遍在或组织特异性表达。转基因的组织特异性激活可以通过例如将遍在表达标志物中断的转基因的猪与以组织特异性的方式表达Cre或Flp的猪杂交，或通过以组织特异性的方式表达标志物中断的转基因的猪与遍在表达Cre或Flp重组酶的猪杂交来完成。转基因的受控表达或标志物的受控切除允许转基因的表达。

在一些实施方案中，目标核酸编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包括编码“标签”的标签序列，所述标签设计为促进编码多肽的后续操作(例如，促进定位或检测)。可以将标签序列插入编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签定位于多肽的羧基或氨基末端。编码的标签的非限制性例子包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和FLAG^TM标签(Kodak,NewHaven,CT)。

在其它实施方案中，目标核酸序列诱导针对目标核酸的RNA干扰，使得目标核酸的表达减少。例如，目标核酸序列可以诱导针对编码囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)多肽的核酸的RNA干扰。例如，与CFTRDNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)可以用于减少该DNA的表达。可以生成siRNA的构建体，如例如描述于Fire等，(1998)Nature391:806；Romano和Masino(1992)Mol.Microbiol6:3343；Cogoni等，(1996)EMBOJ.15:3153；Cogoni和Masino(1999)Nature399:166；Misquitta和Paterson(1999)Proc.Natl.AcadSci.USA96:1451；以及Kennerdell和Carthew(1998)Cell95:1017。可以生成shRNA的构建体，如描述于Mclntyre和Fanning(2006)BMCBiotechnology6:1。一般来说，shRNA转录为含有可以退火并形成短发夹的互补区的单链RNA分子。

核酸构建体可以使用SsslCpG甲基化酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA)甲基化。一般来说，核酸构建体可以与缓冲液中的S-腺苷甲硫氨酸和SsslCpG-甲基化酶在37℃一起孵育。可以通过将构建体与1个单位HinP1I内切核酸酶在37℃孵育1小时和通过琼脂糖凝胶电泳测定确认超甲基化。

可以使用多种技术，将核酸构建体导入任意类型的胚胎、胎儿，或成年偶蹄动物细胞(包括例如生殖细胞，如卵母细胞或卵细胞，祖细胞、成体或胚胎干细胞，原生殖细胞，肾细胞，如PK-15细胞、胰岛细胞、β细胞、肝细胞，或成纤维细胞，如皮肤成纤维细胞)中。技术的非限制性例子包括使用转座子系统、能感染细胞的重组病毒，或脂质体或能够将核酸递送到细胞的其它非病毒方法，如电穿孔，显微注射，或磷酸钙沉淀。

在转座子系统中，核酸构建体的转录单元(即可操作地连接到目标核酸序列的调控区)侧翼有转座子的反向重复。已开发了几种转座子系统(包括，例如SleepingBeauty(见美国专利号6,613,752和美国公布号2005/0003542)；FrogPrince(Miskey等，(2003)NucleicAcidsRes.31:6873)；Tol2(Kawakami(2007)GenomeBiology8(Suppl.l):S7；Minos(Pavlopoulos等，(2007)GenomeBiology8(Suppl.l):S2)；Hsmar1(Miskey等，(2007))MolCellBiol.27:4589)；以及Passport)来将核酸导入细胞(包括小鼠、人和猪细胞)中。SleepingBeauty和Passport转座子尤其有用。转座酶可以作为蛋白递送，与目标核酸在相同的核酸构建体上编码，可以在分开的核酸构建体上引入，或作为mRNA(例如，体外转录并加帽的mRNA)提供。

核酸可以整合到载体中。载体是广义的术语，其包括设计为从携带者(carrier)移动到目标DNA中的任意特定DNA区段。载体可以称为表达载体，或载体系统，其为引起DNA插入基因组或其它靶定DNA序列(如附加体、质粒，或甚至病毒/噬菌体DNA区段)中需要的一组组分。在动物中用于基因递送的载体系统(如病毒载体(例如逆转录病毒、腺伴随病毒以及整合噬菌体病毒)，以及非病毒载体(例如转座子))具有两个基本组分：1)由DNA(或RNA，其逆转录成cDNA)组成的载体，以及2)转座酶、重组酶，或其它整合酶，其识别载体和DNA目标序列两者，并将载体插入目标DNA序列中。载体最常含有一个或多个表达盒，其包含一个或多个表达控制序列，其中表达控制序列是控制并调节另一个DNA序列或mRNA分别转录和/或翻译的DNA序列。

许多不同类型的载体是已知的。例如，质粒和病毒载体(如逆转录病毒载体)是已知的。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点，适合的启动子和可选的增强子，以及还有任意必要的核糖体结合位点，多聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，以及5’侧翼非转录序列。载体的例子包括：质粒(其也可以是其他种类载体的携带者)，腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、慢病毒(例如HIV-1、SIV或FIV)，逆转录病毒(例如ASV、ALV或MoMLV)，以及转座子(例如SleepingBeauty、P-元件、Tol-2、FrogPrince、piggyBac)。

如本文所使用的，术语核酸指代RNA和DNA两者，包括例如cDNA、基因组DNA、合成(例如化学合成)DNA，以及天然存在的和经化学修饰的核酸，例如合成的碱基或替代主链。核酸分子可以是双链或单链的(例如有义或反义单链)。术语转基因在本文中广泛使用，指代其遗传材料已经使用遗传工程技术改变的经遗传修饰的生物体或遗传工程化生物体。因此，敲除偶蹄动物是转基因的，无论外源性基因或核酸是否在动物或其后代中表达与否。

根据允许缩写“T”代表“T”或者“U”的常规实践(DNA或RNA可以是该情况)，本文中所列的核酸序列意图代表DNA和RNA序列两者。多核苷酸是至少三个核苷酸亚单位的核酸分子。多核苷酸类似物或多核酸是化学修饰的多核苷酸或多核酸。在一些实施方案中，多核苷酸类似物可以通过使用备选的官能团取代多核苷酸的糖-磷酸骨架的部分来产生。吗啉代修饰的多核苷酸(本文称为“吗啉代”)是多核苷酸类似物，其中碱基由吗啉代-磷二酰胺主链连接(见例如美国专利号5,142,047和5,185,444)。除了吗啉代外，多核苷酸类似物的其它例子包括其中的碱基由聚乙烯主链相连的类似物，其中的碱基通过由假肽2-氨基乙基-甘氨酸基团形成的酰胺键相连的肽核酸(PNA)，其中的核苷亚单位由甲基膦酸酯基团相连的类似物，其中连接核苷亚单位的磷酸残基被磷酰胺(phosphoroamidate)基团取代的类似物，以及硫代磷酸化(phosphorothioated)DNA，含有具有2’O-甲基基团的糖部分的类似物)。本发明的多核苷酸可以通过公知以及常规使用的固相合成技术产生。或者，可以使用适合用于此类合成的其它方法(例如，常见的分子克隆和化学核酸合成技术)。类似技术还可以用于制备多核苷酸类似物，如吗啉带或硫代磷酸衍生物。另外，多核苷酸和多核苷酸类似物可以商购获得。对于寡核苷酸，药学上可接受的组合物的例子是盐，其包括例如(a)使用阳离子(如纳、钾、铵等)形成的盐；(b)使用无机酸(如盐酸、氢氢溴酸)形成的酸加成盐(c)使用有机酸(例如，例如乙酸、草酸、酒石酸)形成的盐；和(d)从阴离子元素(如氯、溴和碘)形成的盐。

序列比对是排列DNA、RNA或蛋白序列来鉴定相似性区域的方法。核苷或氨基酸残基的比对序列通常表示为矩阵内的行，残基间插入缺口，使得相同或相似的字母以连续的列比对。

多肽

存在有通常可以在氨基酸序列中产生而不改变活性的多种保守改变。这些改变被称作保守取代或突变；也就是说，用属于具有特定的大小或特征的氨基酸分组的氨基酸取代另一个氨基酸。氨基酸序列的取代可以选自氨基酸所属的类别的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸，和赖氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这些改变预期实质上不影响通过聚丙烯酰氨凝胶电泳或等电点测定的表观分子量。示例性的保守取代包括但不限于，Lys取代Arg及反之亦然来保持正电荷；Glu取代Asp及反之亦然来保持负电荷；Ser取代Thr使得游离--OH得到保持；以及Gln取代Asn来保持游离NH₂。此外，在一些情况下，可以在多肽序列或对应的核酸序列中产生点突变、缺失，和插入，而不损失多肽或核酸片段的功能。取代可以包括例如1个，2个，3个，或更多残基。本文所述的氨基酸残基采用单字母氨基酸标示符或三字母缩写。本文使用的缩写与标准的多肽命名法，J.Biol.Chem.,(1969),243,3552-3559一致。本文中以氨基末端到羧基末端的常规方向通过用左和右取向的式表示所有氨基酸残基序列。

在一些情况下，可能需要测定肽与本文所列的序列的百分比同一性。在这种情况下，百分比同一性按照肽或肽部分的残基数量测量。例如，90％同一性的多肽也可能是较大肽的部分。实施方案包括具有列于本文的序列的指示同一性和/或保守取代的此类多肽。

术语纯化的在本文中关于多肽使用时表示没有天然存在的对应物(例如肽模拟物(peptidomimetic))，或已经化学合成，并且如此基本不被其它多肽污染，或从与其天然伴随的其它大多数细胞组分(例如，其它细胞蛋白，多核苷酸，或细胞组分)分离或纯化的多肽。纯化的多肽的例子是至少70％(按干重计)不含与其天然伴随的蛋白和天然存在的有机分子的多肽。因此，纯化多肽的制剂可以是例如至少80％、至少90％，或至少99％(按干重计)的多肽。多肽还可以经工程化而含有标签序列(例如多聚组氨酸标签、myc标签，或标签)，其促进多肽被纯化或标记(例如，在亲和基质上捕获，在显微镜下显现)。因此，包含多肽的纯化的组合物指代纯化的多肽，除非另有说明。

多肽可包括化学修饰；该术语在本语境中指代在氨基酸的天然存在的化学结构中的改变。这种修饰可以对侧链或末端产生，例如改变氨基末端或羧基末端。在一些实施方案中，修饰对于创建化学基团是有用的，所述化学基团可以便利地用于将多肽连接到其它材料，或附于治疗剂。

重组酶

本发明的实施方案包括将靶向性核酸酶系统与重组酶(例如RecA蛋白，Rad51)或其它与DNA重组相关的DNA结合蛋白一同施用。重组酶与核酸片段形成细丝，并且实际上搜索细胞DNA来寻找与序列基本同源的DNA序列。例如重组酶可以与充当HDR模板的核酸序列组合。接着，重组酶与HDR模板组合以形成细丝并放入细胞中。重组酶和/或与重组酶组合的HDR模板可以作为蛋白、mRNA，或用编码重组酶的载体置于细胞或胚胎中。美国公布2011/0059160(美国系列号12/869,232)的公开内容通过提述特此并入本文中用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。术语重组酶指代遗传重组酶，其在细胞中酶促催化两条相对较长的DNA链之间相对短的DNA部分的连接。重组酶包括Cre重组酶，Hin重组酶、RecA、RAD51、Cre，以及FLP。Cre重组酶是来自PI噬菌体的I类拓扑异构酶，其催化loxP位点之间的DNA的位点特异性重组。Hin重组酶是由198个氨基酸组成的21kD蛋白，其存在于细菌沙门氏菌属(Salmonella)中。Hin属于DNA转化酶的丝氨酸重组酶家族，其中它依赖于活性位点丝氨酸来启动DNA切割和重组。RAD51是人类基因。由该基因编码的蛋白是RAD51蛋白家族的成员，其辅助DNA双链断裂的修复。RAD51家族成员与细菌RecA和酵母Rad51同源。Cre重组酶是实验中用来删除侧翼有loxP位点的特定序列的酶。FLP指代衍生于面包酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2μ质粒的翻转酶(Flippase)重组酶(FLP或Flp)。

本文中，“RecA”或“RecA蛋白”指代RecA样重组蛋白家族，其具有基本上全部或大部分相同的功能，特别是：(i)将寡核苷酸或多核苷酸正确定位到其同源目标以用于DNA聚合酶的后续延伸的能力；(ii)在拓扑学上制备双链体核酸以合成DNA的能力；和(iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸复合物高效寻找并结合互补序列的能力。表征得最好的RecA蛋白来自于大肠杆菌；除了蛋白的最初等位形式外，已鉴定了许多突变体RecA样蛋白，例如RecA803。此外，许多生物体具有RecA样链转移蛋白，包括例如酵母、果蝇(Drosophila)、哺乳动物(包括人)，以及植物。这些蛋白包括例如Ree1、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2以及DMC1。重组蛋白的一个实施方案是来自大肠杆菌的RecA。或者，RecA蛋白可以是大肠杆菌的突变体RecA-803蛋白，来自另一种细菌来源的蛋白，或来自另一种生物体的同源重组蛋白。

经遗传修饰的动物

本领域已知的各种技术可以用于将核酸构建体导入非人类动物中，来产生建立者动物，其中核酸构建体整合到基因组中。这些技术包括但不限于原核(pronuclear)显微注射(美国专利号4,873,191)，逆转录病毒介导的对种系的基因转移(retrovirusmediatedgenetransferintogerm)，对胚胎干细胞的基因靶向，胚胎的电穿孔，精子介导的基因转移(Lavitrano等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,14230-14235；Lavitrano等，(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19-23)，以及体细胞(例如卵丘细胞或乳腺细胞)，或成体、胎儿或胚胎干细胞的体外转化，接着进行核移植。原核显微注射、精子介导的基因转移，以及体细胞核转移以及胞质注射、原生殖细胞移植，以及胚泡嵌合体的产生(其中生殖细胞在胚胎中增殖)是特别有用的技术。

通常来说，在原核显微注射中，将核酸构建体导入受精卵中；1个或2细胞受精卵用作含有来自精子头部的遗传材料的原核，并且卵在原生质内可见。原核分期的受精卵可以在体外或体内获得(即从供体动物的输卵管中手术回收)，并且可以产生体外受精卵。例如，在猪中，成熟的卵母细胞可以在500μlMinitubePORCPROIVFMEDIUMSYSTEM(Minitube,Verona,WI)中在Minitube5孔受精皿中受精。在体外受精(IVF)的准备中，可以将新鲜收集的或冷冻的公猪精液清洗，并在PORCPROIVF培养基中重悬至4x10⁵个精子。精子浓度可以使用计算机辅助精液测试(SPERMVISION,Minitube,Verona,WI)分析。最后，体外授精可以在10μl体积中以终浓度为约40个能动精子/卵母细胞进行，这取决于公猪。将所有受精的卵母细胞在5.0％CO₂气氛中在38.7℃孵育6小时。授精后六小时，推定的合子可以在NCSU-23中清洗两次并移到0.5ml的相同培养基中。该系统通常可以在大多数公猪间以10-30％的多精授精率(polyspermicinseminationrate)产生20-30％的胚泡。

在体细胞核转移中，可以将经遗传修饰的细胞或分裂球(例如，胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞，成体耳成纤维细胞，或颗粒细胞)导入无核的卵母细胞中来建立组合细胞。在一些约定中，停滞于减数分裂-2的卵母细胞称为“卵细胞(egg)”。产生胚胎后(例如，通过融合和活化卵母细胞)，在活化后约20至24小时，将胚胎转移到受体雌性的输卵管中。可以使用标准的育种技术，从最初的杂合建立者动物创建在目标核酸方面纯合的动物。

实施例1：TALEN设计和产生

使用在线工具“TALEFFECTORNUCLEOTIDETARGTER”鉴定候选TALEN目标DNA序列和RVD序列。接着，通过遵循GoldenGateAssembly方案，使用pCGOLDYTALEN(AddgeneID38143)和RCIscript-GOLDYTALEN(AddgeneID38143)作为最终目的载体构建用于TALENDNA转染或体外TALENmRNA转录的质粒(Carlson2012)。通过使用HIPUREPLASMIDMIDIPREP试剂盒(LifeTechnologies)制备最终的pC-GoldyTALEN载体，并在使用前测序。使用QIAPREPSPINMINIPREP试剂盒(Qiagen)制备的组装RCIscript载体通过SacI线性化作为模板使用，用于使用mMESSAGET3试剂盒(Ambion)的体外TALENmRNA转录，如先前所指示的(Carlson,2010)。代替由3'-0-Mem7G(5')ppp(5')GRNA帽类似物(NewEnglandBiolabs)，5-甲基胞苷三磷酸假尿嘧啶三磷酸(TriLinkBiotechnologies,SanDiego,CA)和腺苷三磷酸鸟苷三磷酸组成的核糖核苷酸混合物，如以前描述的(Carlson2012)，从RCIScript-GOLDYTALEN载体合成修饰的mRNA。最终核苷酸反应浓度对于帽类似物是6mM，对于鸟苷三磷酸是1.5mM，而对于其它核苷酸是7.5mM。所得的mRNA在使用MEGACLEARREACTIONCLEANUP试剂盒(AppliedBiosciences)纯化前，使用DNA酶处理。

实施例2：CRISPR/Cas9设计和产生

基因特异性gRNA序列根据其方法(Mali,2013)克隆到Church实验室gRNA载体中(AddgeneID:41824)。通过共转染hCas9质粒(AddgeneID:41815)或从RCIScript-hCas9合成的mRNA来提供Cas9核酸酶。该RCIScript-hCas9通过将来自hCas9质粒(含有hCas9cDNA)的XbaI-AgeI片段亚克隆到RCIScript质粒中来构建。mRNA的合成除了使用KpnI进行线性化外如上述实施。

实施例3：供体修复模板制备

A)BB-HDR(1623bp)质粒。从比利时蓝牛基因组DNAPCR扩增涵盖比利时蓝牛等位基因的1,695bp片段(btGDF8BB5-1:5'-CAAAGTTGGTGACGTGACAGAGGTC(SEQIDNO:15)；btGDF8BB3-1:5'-GTGTGCCATCCCTACTTTGTGGAA(SEQIDNO:16))，并TOPO克隆到PRC2.1载体(LifeTechnologies)中。此质粒作为分析引物组的阳性对照模板，并用于通过PCR使用以下引物(BBdelHR16235-1:5'-GATGTATTCCTCAGACTTTTCC(SEQIDNO:17)；BBdelHR16233-1:5'-GTGGAATCTCATCTTACCAA(SEQIDNO:18))衍生1,623bpBB-HDR模板，并如前TOPO克隆。每种质粒在使用前测序验证。使用Fast-IonMIDIPLASMIDENDO-FREE试剂盒(IBIScientific)制备转染级质粒。rAAV包装。BB-HDR克隆到pAAV-MCS中，并使用ADENO-ASSOCIATEDVIRUSHELPER-FREE系统(Agilent)包装。简单的说，使用以下各5μl转染10cm皿AAV-293细胞：pAAV-Helper、pAAV-RC和AAV-BB-HDR质粒。转染后两天，细胞通过刮到1ml培养基中从板移出。通过3次冷冻-融化循环释放病毒颗粒，接着以最大速度在微型离心机中离心5分钟。吸出上清液并直接用于目标细胞的转染。

B)无角1594模板。从安格斯牛基因组DNAPCR扩增涵盖383POLLED等位基因的1784bp片段(F1:5'-GGGCAAGTTGCTCAGCTGTTTTTG(SEQIDNO:19)；R1-5'-TCCGCATGGTTTAGCAGGATTCA(SEQIDNO:20))，并TOPO克隆到PRC2.1载体(LifeTechnologies)中。该质粒用作分析引物组的阳性对照模板，并用于通过PCR使用使用以下引物(1594F:5'-ATCGAACCTGGGTCTTCTGCATTG(SEQIDNO:21)；R1:5'-TCCGCATGGTTTAGCAGGATTCA(SEQIDNO:22))衍生1,592bpHDR模板，并如前TOPO克隆。每种质粒在使用前测序验证。使用Fast-IonMIDIPlasmidEndo-Free试剂盒(IBIScientific)制备转染级质粒，并与2μgHP1.3TALENmRNA一起转染5μg或10μg。所有寡核苷酸模板由IntergratedDNATechinologies合成，100nmole合成通过标准脱盐纯化，并在TE中重悬至400μΜ。

实施例4：组织培养和转染

在补充有10％胎牛血清、100I.U./ml青霉素和链霉素以及2mML-谷氨酰胺的DMEM中在5％CO₂于37或30℃(如所示)维持猪或牛成纤维细胞。对于转染，除了另有说明，使用NEON转染系统(LifeTechnologies)通过转染递送所有TALEN和HDR模板。简单的说，达到100％汇合的低传代奥斯萨巴猪(Ossabaw)、兰德瑞斯猪(Landrace)、和Wagyu，或荷尔斯泰因牛成纤维细胞以1:2分开，并在次日在70％-80％汇合时收获。每次转染由500,000-600,000个重悬于“R”缓冲液的细胞构成，所述细胞与质粒DNA或mRNA以及寡聚物混合，并通过以下参数使用100μl尖端电穿孔：输入电压；1800V；脉冲宽度；20ms；以及脉冲数；1。通常来说，每次转染中包括2-4μgTALEN表达质粒或1-2μgTALENmRNA和2-3μΜ对于感兴趣基因特异性的寡聚物。与那些量的偏差示于图例中。转染后，将细胞以60:40分到6孔板的两个分开的孔中，分别在30或37℃培养三天。三天后，细胞群在37℃扩增直到至少第10天，来评估编辑的稳定性。

实施例5：稀释克隆

转染后三天，50-250个细胞接种到10cm皿中并培养直到集落个体直径达到约5mm。在这点时，添加6ml以1:5(vol/vol)稀释于PBS的TRYPLE(LifeTechnologies)，并吸出集落，转移到24孔皿孔的孔中并在相同420种条件下培养。收集达到汇合的集落并分开，用于冷冻保存和基因型分型。样品制备：从6孔皿的孔中收集第3和第10天的转染细胞群，并将10-30％重悬于50μl1xPCR裂解缓冲液：10mMTris-ClpH8.0,2mMEDTA,0.45％TrytonX-100(vol/vol),0.45％Tween-20(vol/vol)，新鲜补充有200μg/ml蛋白酶K。使用以下参数在热循环仪中处理裂解液：55℃60分钟，95℃15分钟。来自稀释克隆的集落样品使用20-30μl裂解缓冲液如上处理。

实施例6

通过PRC进行POLLEN渐渗的检测，其使用F1引物(见实施例3，上文)和“P”引物(5'-ACGTACTCTTCATTTCACAGCCTAC)(SEQIDNO:23)，使用IXMyTaqRed混合物(Bioline)持续38个循环(95℃,25s；62℃,25s；72℃,60s)。使用(F2:5'-GTCTGGGGTGAGATAGTTTTCTTGG(SEQIDNO:24)；R2-5'-GGCAGAGATGTTGGTCTTGGGTGT)(SEQIDNO:25)进行第二次PCR测定法。通过这两次测试的候选物通过使用侧翼F1和R1引物的PCR，随后通过TOPO克隆和测序分析。

实施例7：扩增子测序和分析

从转染群体分离DNA并将100-250ng加到50μl根据制造商的推荐装配的PLATINUMTAQDNAPOLYMERASEHIGHFIDELITY(LifeTechnologies)。每个样品分配带有独特条形码(barcode)的引物组来实现多重测序。PCR产物的一部分溶解于2.5％琼脂糖凝胶上来确定大小，之后使用MINELUTEPCRPURIFICATION试剂盒(Qiagen)进行PCR清洁。样品经量化并合并到单个样品中用于测序。单个组合样品掺入25％PhiX(用于序列递送)并在IlluminaMISEQ测序仪上测序，产生150个碱基对配对末端读出。读出质量使用具有重叠末端的FASTQC读出对(Read-pairs)评估，并使用来自EC-UTILS包的FASTQ-JOIN连接。使用自定义PERL脚本来多路分解(demultiplex)连接的读出并计算插入类型。在多路分解步骤中，需要与正向和反向引物的准确匹配。克隆的动物通过RELP测定和测序来测定基因型。

实施例8：用编码TALEN的mRNA转染家畜细胞导致有效的目标切割

如先前所描述的(Carlson,2010)，将TALENcDNA(TALEN对p6511.1和DMD7.1)克隆到pT3TS克隆载体中T3启动子的下游，并根据制造商的方案使用MINELUTEPCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化，之后使用MMESSAGEMACHINET3试剂盒(AppliedBiosciences)合成mRNA。还可见Carlson2013。代替由3'-0-Me-m⁷G(5')ppp(5')GRNA帽类似物(NewEnglandBiolabs)，5-甲基胞苷三磷酸假尿嘧啶三磷酸(TriLinkBiotechnologies,SanDiego,CA)和两种标准核糖核苷酸，腺苷三磷酸和鸟苷三磷酸组成的核糖核苷酸混合物，使用MMESSAGEMACHINET3试剂盒(AppliedBiosciences)从相同的载体合成经修饰的mRNA。用DNA酶处理mRNA合成反应，之后使用MEGACLEARREACTIONCLEANUP试剂盒(AppliedBiosciences)纯化。a)使用具有以下设置的NEON核转染系统(LifeTechnologies)将指定量的p6511.1TALEN转染到猪成纤维细胞中(每个重复500,000-750,000个细胞)：1次脉冲，1800v；20ms宽度和100μl尖端(tip)。经转染的细胞在30或37摄氏度培养3天，之后通过调查者测定法(Transgenomic)进行插入缺失分析。如描述于Guischin等，2010的那样计算NHEJ百分比，并绘制在图上。4微克编码p6511.1TALEN的质粒DNA(pDNA)也在相同的条件下转染，用于％NHEJ的比较。b)mRNA结构、组成或体外合成反应方案对TALEN活性具有很小的影响。编码DMD7.1TALEN的mRNA通过使用标准的或经修饰的核糖核苷酸，单独地(“I”在分开的反应中左和右TALEN)或在同一个反应(双重“D”)中合成。接着，将反应分为两个重复，其中一个根据制造商的方案使用Poly(A)加尾(Tailing)试剂盒(Ambion)加上额外的polyA尾。

从质粒DNA表达TALEN已经是一种用于诱导家畜细胞中TALEN介导的插入缺失的有效方法；然而，TALEN编码质粒可能整合到细胞的基因组中。相反，mRNA不能整合到宿主细胞的基因组中。为了避免TALEN编码质粒的整合，进行了实验来确定是否能通过转染编码TALEN的mRNA来达到相似水平的TALEN活性。使用标准或经修饰的核糖核苷酸产生编码p6511.1TALEN对的TALENmRNA。通过核转染将两个量的每种TALENmRNA制备物转染到猪成纤维细胞中，在30或37摄氏度培养3天，之后分析插入缺失。对于所有在30摄氏度孵育的mRNA转染，NHEJ百分比都是相似的，而对于在37摄氏度孵育的转染细胞，可以观察到剂量反应。然而，在这一重复中，不能检测到经修饰的和标准的核糖核苷酸之间NHEJ百分比的显著性差异，没有使用相等的量。值得注意的是，在30摄氏度孵育的所有组中的mRNA转染显著地胜过了在相同条件下作为质粒DNA转染的p6511.1TALEN。

进行了另一个实验以在第二个基因座，猪DMD检测修饰的相对于标准的核苷酸合成的mRNA的影响。这一实验也评价polyA尾的增加是否影响TALEN的活性，以及每一个TALEN单体(左和右单体)是否能够在同一个转录反应(双重)中合成，或者它们是否必须单独合成并在转染前混合。一或四微克DMD7.1TALENmRNA转染到猪成纤维细胞中，并在30或37摄氏度培养三天。与p6511.1TALEN一样，观察到在30摄氏度培养的细胞中TALEN活性的差别不大，提示经修饰的核糖核苷酸、mRNA的体外多聚腺苷酸化或mRNA的双重转录对活性都没有影响。可以在37度培养的重复中再次观察到剂量反应，因为4μgmRNA胜过了1μg转染。还有，在37度重复中，多聚腺苷酸化的mRNA似乎胜过了非腺苷酸化的mRNA。

值得注意的是，当编码DMD7.1TALEN的质粒DNA转染到猪成纤维细胞中时，注意到了相对于培养至第14天的细胞，在第3天测量到的％NHEJ水平的显著下降(40-60％)。这种％NHEJ的下降在本文所示的任何mRNA转染重复中都没有观察到，第14天的修饰水平数据未示出。因此mRNA转染似乎是优于DNA转染的，不仅在于TALEN活性，也在于在延长的培养期后维持修饰细胞的高比例。不受限于具体的理论，相信这一结果是由于当相对于质粒DNA使用mRNA转染时，细胞存活力的改善。

实施例9：在无选择的情况下分析通过mRNA转染创建的集落

如实施例8中，1至4微克编码TALEN的mRAN加到牛或猪原代成纤维细胞。细胞在暴露于TALEN后在30℃培养三天，并对细胞计数并将其以1-20个细胞/cm²的密度范围铺到10cm培养皿上。培养细胞10-15天，直到可以观察到直径为3-4mm的集落个体。使用p-200移液器在温和抽吸下吸出集落，并排入带有500μl培养基的24孔板的孔中(Carlson,2011)。选择带有清晰确定集落(约10-30个/板)的板用于集落抽吸以限制从多个集落吸出细胞的机会。一旦在24孔皿中集落达到70-90％汇合，收获一部分用于插入缺失分析，而剩余部分冷冻保存。插入缺失分析的结果位于成纤维细胞克隆的基因型分布表的最后五行中。这些结果证明，可以不使用选择标志物从TALENmRNA转染的成纤维细胞容易地分离集落。通过在第3天来源群体的修饰水平准确预测分析克隆中的突变频率。也可以容易地鉴定带有双等位修饰的克隆。

成纤维细胞克隆中的基因型分布表

^A通过PCR产物测序鉴定双等位KO。使用这一技术，仅可以鉴定重叠或纯合缺失。^B在两周内，使用相同的TALEN对转染并回收成纤维细胞两次。

^C5/15的双等位集落确定为双重移码等位基因。

^D仅分析在PCR扩增子中具有可辨识的大体缺失(grossdeletion)的集落。

^E通过高限定熔解分析鉴定双等位KO集落。仅能够鉴定纯合修饰。

95％置信区间超出预期的双等位无效假设。

实施例10：DNA和mRNA编码的TALEN在精原干细胞中是活性的

从10wk龄公猪中分离猪生殖细胞，并通过差异富集。使用AMAXANUCLEOFECTOR系统Amaxa溶液“V”和“L”以及“B”使用X-001和X-005程序将编码eGFP和DMD特异性TALEN的质粒转染到生殖细胞中。也见Carlson2013。每个转染反应使用10⁶个富集的生殖细胞，和指定微克的TALEN编码质粒DNA进行。同样的方法用于递送编码DMD7.1TALEN的mRNA。核转染之后，它们在5％CO₂气氛中在37℃或30℃培养5天。通过对GFP和UCH-L1表达共定位的免疫荧光分析来评价转染效率。通过台盼蓝拒染法(trypanblueexclusion)来评价细胞存活力。

实施例11：原生殖细胞中TALEN刺激的HDR

也在鸡的原生殖细胞(PGC)中的鸡Ddx4基因座处检测TALEN刺激的HDR。针对内含子1(Tal1.1)和外显子7(Tal7.1)构建两个TALEN对，并且其功能在DF1鸡细胞中证实。还可见实施例8和Carlson2013。随后，每个TALEN对与供体靶向载体共转染，所述供体靶向载体经设计成将GFP和Ddx4基因的外显子2融合。正如所期待的，使用Tal1.1的切割刺激了同源重组，而Tal7.(其位于供体靶向载体中的同源序列外)不刺激HDR。

实施例12：通过TALEN刺激的HR将牛无角等位基因渐渗入有角细胞中

最近已鉴定了无角等位基因(Medugorac,Seichter等2012)，示意图在图1中。设计了四个TALEN对来切割无角中的重复区域的3’(图1)。使用编码TALEN对的mRNA转染有角荷尔斯泰因牛成纤维细胞，并在转染后3天分析活性。调查者测定法揭示了每个TALEN对的活性(图1)。用HP1.3观察到了峰值活性，因此选择其用于后续实验。使用2微克HP1.3TALENmRNA及指定量和处理的ssDNA修复模板一起转染有角荷尔斯泰因牛原代成纤维细胞(图4)。转染后三天的细胞群体通过PCR分析无角转化。使用NLS-RecA-Gal4(Liao和Essner2011)包被修复模板对于无角转化的频率有显著影响(图4，b和c组)。在个体集落中无角转化也很明显(图3)。

方法：使用NEON转染系统在以下参数下(1次脉冲；1800v；20ms宽度)转染约600,000个细胞。每个转染由2微克TALENmRNA与指定的修复模板构成。修复模板通过以下方法使用Gal4:RecA包被。500纳克(共3μl)修复模板PCR产物在95℃孵育10分钟，并在冰上放置2分钟，之后加入0.8μl缓冲液[100mMTrisOAc,pH7.5；500mMNaOAc；10mMDTT；10mMMg(OAc)₂]，0.6μl16.2mMATPγS(Sigma)和1,250ngNLS-RecA-Gal4，总反应体积为8μl。这一反应接着在37℃孵育30分钟并放置在冰上。全部的体积用于单一转染中。使用先前描述的方法(Carlson,Tan等，2012)培养和分析细胞。使用591bpHDR模板。

实施例13

将通过渐渗无角等位基因的本文所描述的方法制成的细胞，或修饰的胚胎克隆和/或放入替代雌性中，孕育，并作为包含无角等位基因的活体动物出生。

进一步公开

1.一种经遗传修饰的家畜动物，其包含从有角等位基因到无角等位基因的基因组修饰。2.项1的动物，其中所述动物是具有有角等位基因的动物的第一品种，而所述无角等位基因存在于动物的第二品种中。3.项1或2的动物，其中所述无角等位基因选自下组：天然等位基因和合成等位基因。4.项3的动物，其中所述天然等位基因对于该品种是典型的，或是该品种中的突变体等位基因。5.项1-4任一项的动物，其中所述第一品种选自下组：赫里福德种牛(Hereford)、安格斯牛(Angus)、短角牛、夏洛莱牛(Charolais)、利木赞牛(Limousin)、西门塔尔牛(Simmental)、婆罗门牛(Brahman)、布兰格斯莱牛(Brangus)、和Wagyu，以及圣热特鲁迪斯牛(SantaGertrudis)、爱尔夏牛(Ayrshire)、瑞士褐牛(BrownSwiss)、Canadienne、荷兰白带牛(DutchBelted)、根西乳牛(Guernsey)、荷尔斯泰因牛(荷尔斯泰因-黑白花牛)、泽西牛(Jersey)、克雷牛(Kerry)、德文乳牛(MilkingDevon)、短角乳牛、挪威红牛(NorwegianRed)、布萨牛(Busa)、Canadienne、艾尔沙尼亚红牛(EstonianRed)、Fleckveih、弗里塞牛(Frieian)、Girolando、伊拉瓦拉短角乳牛(Illawarra)、IrishMoiled、莱恩巴克牛(Lineback)、MeuseRhineIssel、Montbeliarede、诺曼底牛(Normande)、兰德尔牛(Randall)、萨希瓦尔牛(Sahhiwal)、AustralianMilkingZebu、西门塔尔牛、ChianinaMarchigiana、罗马诺拉肉牛(Romagnola)。6.项1-5任一项的动物，其中所述第二品种选自下组：安格斯牛、安格斯红牛(RedAngus)、无角红牛(RedPoll)、盖勒韦牛(Galloway)、白带盖勒韦牛(BeltedGalloway)、AmericanWhitePark、英国白牛(BritishWhite)、Amerifax、牙买加黑牛(JamaicaBlack)、牙买加红牛(JamaicaRed)、莫瑞灰牛(MurrayGrey)、布兰格斯莱牛、布兰格斯红牛(RedBrangus)、Senopol、布尔羊(Boergoats)。7.项1-6任一项的动物，其中所述无角等位基因选自下组：PcCeltic起源和PFFriesian起源。8.项1-7任一项的动物，其是建立者动物或建立者动物的后代。9.项1-8任一项的动物，其没有标志物和/或没有报告物。10.项1-9任一项的动物，其中所述基因组修饰仅在无角等位基因处做出。11.项10的方法，其中所述经遗传修饰的生物选自下组：牛、山羊、绵羊，和偶蹄动物。12.项1-11任一项的动物或所述动物的后代作为家畜的用途。13.一种体外的细胞，其包含对所述细胞的有角等位基因的基因组修饰。14.项13的细胞，其中所述在有角基因座的修饰是从有角等位基因修饰到无角等位基因的修饰。15.项13或14的细胞，其中所述细胞是家畜细胞。16.项13-15任一项的细胞，其中所述细胞选自下组：牛、山羊、绵羊，和偶蹄动物。17.项13-15任一项的细胞，其中所述细胞是选自下组的家畜细胞：赫里福德种牛、安格斯牛、短角牛、夏洛莱牛、利木赞牛、西门塔尔牛、婆罗门牛、布兰格斯莱牛、和Wagyu，以及圣热特鲁迪斯牛、爱尔夏牛、瑞士褐牛、Canadienne、荷兰白带牛、根西乳牛、荷尔斯泰因牛(荷尔斯泰因-黑白花牛)、泽西牛、克雷牛、德文乳牛、短角乳牛、挪威红牛、布萨牛、Canadienne、艾尔沙尼亚红牛、Fleckveih、弗里塞牛、Girolando、伊拉瓦拉短角乳牛、IrishMoiled、莱恩巴克牛、MeuseRhineIssel、Montbeliarede、诺曼底牛、兰德尔牛、萨希瓦尔牛、AustralianMilkingZebu、西门塔尔牛、ChianinaMarchigiana、和罗马诺拉肉牛。18.项13-17任一项的细胞，其中所述细胞是原代细胞，原代体细胞，或合子。19.项13-17任一项的细胞，其为家畜干细胞或原生殖细胞。20.项13-19任一项的细胞，其包含当所述细胞经历修饰时编码无角等位基因的同源依赖性重组模板。21.项20的细胞，其进一步包含定点(site-directed)内切核酸酶来在细胞的有角等位基因处切割染色体DNA。22.项12-21任一项的细胞用于克隆动物的用途。23.一种分离的(或合成的，或从自然界分离的)核酸，其编码无角等位基因并包含与天然有角等位基因重叠的序列，例如作为mRNA和/或HDR模板。24.一种质粒或其它载体，其表达项23的分离的核酸。25.一种创建经遗传修饰的家畜生物体的方法，其包含改变家畜原代细胞、家畜原代体细胞，家畜干细胞、家畜原生殖细胞，家畜合子、家畜胚泡，或家畜胚胎的天然有角等位基因，其中将所述有角等位基因改变为无角等位基因。26.项25的方法，其中所述家畜选自下组：牛、山羊，和绵羊。27.项25或26的方法，其包含将以下项引入家畜原代细胞、家畜原代体细胞、家畜干细胞、家畜原生殖细胞、家畜合子、家畜胚泡，或家畜胚胎的天然有角等位基因中：编码位点特异性核酸酶的核酸，和含有无角等位基因的核酸同源依赖性重组模板，所述位点特异性核酸酶特异性切割天然有角等位基因中的位点。28.项25-27任一项的方法，其中所述位点特异性核酸酶选自下组：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应器核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)。29.项25-28任一项的方法，其中改变所述原代体细胞。30.项25-28任一项的方法，其中改变胚胎。31.项25-28或30任一项的方法，进一步包含将合子、胚泡或胚胎放入妊娠期的动物母体中。32.项25-29任一项的方法，进一步包含克隆所述原代细胞、原代体细胞，或合子，来产生完整的动物。33.使用项25-32任一项的方法产生的家畜动物。34.项25-32任一项的方法用于产生带有无角表型的家禽建立者动物的用途。

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列于本说明书中任何地方的专利申请、专利、出版物和期刊文章出于所有目的通过提述并入本文；在冲突的情况下，以本说明书为准。

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Claims

1.一种经遗传修饰的家畜动物，其包含从有角等位基因到无角等位基因的基因组修饰。

2.权利要求1的动物，其中所述动物是具有所述有角等位基因的动物的第一品种，而所述无角等位基因存在于动物的第二品种中。

3.权利要求1或2的动物，其中所述无角等位基因选自下组：天然等位基因和合成等位基因。

4.权利要求3的动物，其中所述天然等位基因对于所述品种是典型的，或是所述品种中的突变体等位基因。

5.权利要求1-4任一项的动物，其中所述第一品种选自下组：赫里福德种牛(Hereford)、安格斯牛(Angus)、短角牛(Shorthorn)、夏洛莱牛(Charolais)、利木赞牛(Limousin)、西门塔尔牛(Simmental)、婆罗门牛(Brahman)、布兰格斯莱牛(Brangus)、和Wagyu、以及圣热特鲁迪斯牛(SantaGertrudis)、爱尔夏牛(Ayrshire)、瑞士褐牛(BrownSwiss)、Canadienne、荷兰白带牛(DutchBelted)、根西乳牛(Guernsey)、荷尔斯泰因牛(Holstein)(荷尔斯泰因-黑白花牛(Holstein-Friesian))、泽西牛(Jersey)、克雷牛(Kerry)、德文乳牛(MilkingDevon)、短角乳牛(MilkingShorthorn)、挪威红牛(NorwegianRed)、布萨牛(Busa)、Canadienne、艾尔沙尼亚红牛(EstonianRed)、Fleckveih、弗里塞牛(Frieian)、Girolando、伊拉瓦拉短角乳牛(Illawarra)、爱尔兰耕牛(IrishMoiled)、莱恩巴克牛(Lineback)、MeuseRhineIssel、Montbeliarede、诺曼底牛(Normande)、兰德尔牛(Randall)、萨希瓦尔牛(Sahhiwal)、澳洲乳用瘤牛(AustralianMilkingZebu)、西门塔尔牛(Simmental)、ChianinaMarchigiana、罗马诺拉肉牛(Romagnola)。

6.权利要求1-5任一项的动物，其中所述第二品种选自下组：安格斯牛、红安格斯牛(RedAngus)、无角红牛(RedPoll)、盖勒韦牛(Galloway)、白带盖勒韦牛(BeltedGalloway)、AmericanWhitePark、英国白牛(BritishWhite)、Amerifax、牙买加黑牛(JamaicaBlack)、牙买加红牛(JamaicaRed)、莫瑞灰牛(MurrayGrey)、布兰格斯莱牛(Brangus)、布兰格斯红牛(RedBrangus)、Senopol、布尔山羊(Boergoats)。

7.权利要求1-6任一项的动物，其中所述无角等位基因选自下组：PcCeltic来源和PFFriesian来源。

8.权利要求1-7任一项的动物，其是建立者动物或建立者动物的后代。

9.权利要求1-8任一项的动物，其没有标志物和/或没有报告物。

10.权利要求1-9任一项的动物，其中所述基因组修饰仅已经在所述无角等位基因处产生。

11.权利要求10的方法，其中所述经遗传修饰的生物体选自下组：牛、山羊、绵羊，和偶蹄动物。

12.权利要求1-11任一项的动物或所述动物的后代作为家畜的用途。

13.一种体外的细胞，其包含对所述细胞的有角等位基因的基因组修饰。

14.权利要求13的细胞，其中在有角基因座处的所述修饰是从有角等位基因到无角等位基因的修饰。

15.权利要求13或14的细胞，其中所述细胞是家畜细胞。

16.权利要求13-15任一项的细胞，其中所述细胞选自下组：牛、山羊、绵羊，和偶蹄动物。

17.权利要求13-15任一项的细胞，其中所述细胞是选自下组的家畜细胞：赫里福德种牛、安格斯牛、短角牛、夏洛莱牛、利木赞牛、西门塔尔牛、婆罗门牛、布兰格斯莱牛、和Wagyu，以及圣热特鲁迪斯牛、爱尔夏牛、瑞士褐牛、Canadienne、荷兰白带牛、根西乳牛、荷尔斯泰因牛(荷尔斯泰因-黑白花牛)、泽西牛、克雷牛、德文乳牛、短角乳牛、挪威红牛、布萨牛、Canadienne、艾尔沙尼亚红牛、Fleckveih、弗里塞牛、Girolando、伊拉瓦拉短角乳牛、爱尔兰耕牛、莱恩巴克牛、MeuseRhineIssel、Montbeliarede、诺曼底牛、兰德尔牛、萨希瓦尔牛、澳洲乳用瘤牛、西门塔尔牛、ChianinaMarchigiana、和罗马诺拉肉牛。

18.权利要求13-17任一项的细胞，其中所述细胞是原代细胞，原代体细胞，或合子。

19.权利要求13-17任一项的细胞，其为家畜干细胞或原生殖细胞。

20.权利要求13-19任一项的细胞，在所述细胞经历所述修饰时所述细胞包含编码无角等位基因的同源依赖性重组模板。

21.权利要求20的细胞，其进一步包含定点内切核酸酶以在所述细胞的有角等位基因处切割染色体DNA。

22.权利要求12-21任一项的细胞用于克隆动物的用途。

23.一种分离的核酸，其编码无角等位基因并包含与天然有角等位基因重叠的序列。

24.一种质粒，其表达权利要求23的分离的核酸。

25.一种创建经遗传修饰的家畜生物体的方法，其包括改变家畜原代细胞、家畜原代体细胞，家畜干细胞、家畜原生殖细胞，家畜合子、家畜胚泡，或家畜胚胎的天然有角等位基因，其中将所述有角等位基因改变为无角等位基因。

26.权利要求25的方法，其中所述家畜选自下组：牛、山羊、和绵羊。

27.权利要求25或26的方法，其包含对所述家畜原代细胞、家畜原代体细胞、家畜干细胞、家畜原生殖细胞、家畜合子、家畜胚泡，或家畜胚胎的天然有角等位基因引入：

a.编码位点特异性核酸酶的核酸，所述位点特异性核酸酶特异性切割所述天然有角等位基因中的位点，和

b.包含所述无角等位基因的核酸同源依赖性重组模板。

28.权利要求25-27任一项的方法，其中所述位点特异性核酸酶选自下组：锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应器核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)。

29.权利要求25-28任一项的方法，其中改变所述原代体细胞。

30.权利要求25-28任一项的方法，其中改变所述胚胎。

31.权利要求25-28或30任一项的方法，其进一步包括将所述合子、胚泡或胚胎放入妊娠期母体动物中。

32.权利要求25-29任一项的方法，其进一步包括克隆所述原代细胞、原代体细胞，或合子，来产生完整的动物。

33.使用权利要求25-32任一项的方法产生的家畜动物。

34.权利要求25-32任一项的方法用于产生带有无角表型的家畜建立者动物的用途。