CN102858966A - 改进的大范围核酸酶重组系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组遗传构建体,其至少包含第一致重组构建体(i)和第二构建体(ii、iii或iv),所述第一致重组构建体(i)具有至少两个与位点特异性内切核酸酶的DNA靶标位点之前和之后的基因组区域同源的部分,并且还包含插入所述同源部分的阴性选择标记和阳性选择标记以及其中可将目的序列克隆到邻近阳性选择标记的区域;所述第二构建体(ii、iii或iv)包含大范围核酸酶。本发明还涉及包含这些构建体的试剂盒以及使用该组构建体将目的序列引入到靶细胞、组织或生物体之基因组中的方法。
Description
本发明涉及一组试剂,其允许将DNA序列引入靶细胞基因组中的特定位点。特别地,该DNA序列编码基因,并通过诱导型同源重组(homologous recombination,HR)事件被引入靶细胞中。本发明还涉及一组遗传构建体,其包含与大范围核酸酶基因组靶位点侧翼的部分具有同源性的至少两个部分和阳性选择标记及阴性选择标记;以及涉及将DNA序列引入靶细胞基因组的改进方法。
自超过25年前酵母中的首个基因靶向实验(Hinnen等,1978;Rothstein,1983)以来,已在多种细胞中采用同源重组(HR)来插入、替换和缺失基因组序列(Thomas和Capecchi,1987;Capecchi,2001;Smithies,2001)。哺乳动物细胞中靶向事件的发生频率非常低,使得对天然HR的利用变得不切实际。可以通过基因座处的特定DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)来显著提高同源重组的频率(Rouet等,1994;Choulika等,1995)。该DSB可以由大范围核酸酶(meganuclease)诱导,所述大范围核酸酶是识别大DNA识别靶位点(12至30bp)的序列特异性内切核酸酶。
大范围核酸酶对其DNA靶标表现出高特异性,这些蛋白质可切割独特的染色体序列,因此不影响全基因组完整性。天然大范围核酸酶主要以归巢内切核酸酶(homing endonuclease)为代表,所述归巢内切核酸酶是见于真核细胞、细菌和古细菌(archae)中的一类广泛分布的蛋白质(Chevalier和Stoddard,2001)。对I-Scel和HO归巢内切核酸酶的早期研究已阐明了可如何将这些蛋白质的切割活性用于启动活细胞中的HR事件,并且已证明了染色体DSB致重组特性(recombinogenic property)(Dujon等,1986;Haber,1995)。从那时起,大范围核酸酶诱导的同源重组已成功地在细菌(Posfai等,1999)、哺乳动物细胞(Sargent等,1997;Donoho等,1998;Cohen-Tannoudji等,1998)、小鼠(Gouble等,2006)和植物(Puchta等,1996;Siebert和Puchta,2002)中用于基因组工程目的。
最近,已改造TAL效应子内切核酸酶(TAL effector endonuclease,TALEN)以高特异性地识别和切割DNA靶标。这些TALEN包含与核酸酶结构域(例如,FokI)融合的TAL(转录激活因子样)效应子DNA结构域(Christian等,2010)。
另一类核酸酶也可用于切割基因组靶并因此诱导DSB,该另一类核酸酶被称为锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN),并且是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合产生的人造限制酶。可以以与TAL类似的方式改造锌指结构域以靶向任意DNA序列(Kim等,1996)。
虽然可获得可在靶细胞基因组中特定位点处诱导DSB的材料在增加,但是还未开发出常规可重复地转化靶细胞群的方法和材料。所存在的多种原因包括原核生物基因组或更特别是真核生物基因组固有的复杂性。工作人员越来越多地发现基因组具有卓越的抗损伤能力,这恰是DSB的本质所在。此外,在产生转化方法中,对所有转化方法而言都存在的技术限制(即从背景未转化细胞群中常规地鉴别出稀少转化体的能力)继续表现出问题。
提供了利用HR在将目的序列引入靶细胞或生物体的基因组中任意位点的潜能的方法,从而允许可能比以往任何时候更细致地进行基因组操作。
本发明的发明人现在已开发出一组新的遗传构建体,其包含:
a)由核酸分子编码的构建体(i),其至少包含以下组分:
(N)n-HOMO1-P-M-HOMO2-(N)m(i)
其中,n和m是整数并且代表0或1,前提是n=1时,m=0而当n=0时,m=1;因此组分N可设置在HOMO1之前或NOMO2之后,并且,组分P和M在HOMO1与HOMO2之间的顺序可设置为P-M或M-P;
其中N包含组分(PROM1)-(NEG)-(TERM1);P包含组分(PROM2)-(POS)-(TERM2)并且M包含组分(PROM3)-(MCS)-(TERM3);以及
其中PROM1是第一转录启动序列;NEG是阴性选择标记;TERM1是第一转录终止序列;HOMO1是与核酸酶DNA靶序列之前的基因组部分具有同源性的一部分;PROM2是第二转录启动序列;POS是阳性选择标记;TERM2是第二转录终止序列;PROM3是第三转录启动序列;MCS是多克隆位点,其中可以插入目的基因(gene of interest,GOI);TERM3是第三转录终止序列;HOMO2是与大范围核酸酶、TALEN或ZFN的所述DNA靶序列之后的基因组部分具有同源性的部分;
b)至少一种选自包括构建体(ii)或(iii)组成的组的构建体,所述构建体(ii)或(iii)由至少包含一种以下组分的核酸分子编码:
PROM4-NUC1(ii);
NUC2(iii);或
该组还包含序列(iv),其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质:
NUC3(iv);
其中PROM4是第四转录启动序列;NUC1是大范围核酸酶、TALEN或ZFN的开放读码框(ORF);NUC2是所述大范围核酸酶、TALEN或ZFN的信使RNA(mRNA)形式;NUC3是所述大范围核酸酶、TALEN或ZFN的分离或重组蛋白质;其中来自构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN识别并切割所述DNA靶序列;并且其中构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)设置成与构建体(i)共转染到至少一种靶细胞中。
更一般地,任何能够特异性地切割基因组靶并因此诱导DSB并且具有12至45bp双链DNA靶序列的核酸酶均可用于本发明中。本发明所包含的核酸酶的非限制性实例有大范围核酸酶、TALEN、ZFN,但本发明也可以与定义为任意融合蛋白的嵌合内切核酸酶并用,所述融合蛋白至少包含一种能够切割基因组靶并因此诱导DSB并且具有12至45bp双链DNA靶序列的内切核酸酶。
除了可在特定基因组靶标处诱导DSB的核酸酶以外,本发明还包括可在12至45bp的特定基因组靶序列处诱导单链断裂(single strandbreak,SSB)之核酸酶的用途。SSB还称为缺口(nick)并且这种缺口核酸酶明确地包括在本发明中。
在图1中以非限制性方式示出本发明的构建体,整合基质[构建体(i)]和核酸酶表达质粒[构建体(ii)]被共转染到细胞中。基于共转染,经改造的核酸酶被表达,识别其内源识别位点,与其结合并在该特定位点诱导DNA双链断裂。
细胞感知DNA损伤并触发同源重组以对其进行修复,采用经共转染的整合基质作为DNA修复基质,因它包含与周围断裂DNA同源的区域。在该重组事件期间,克隆到整合基质的同源区之间的阳性选择标记(POS)和GOI在大范围核酸酶识别位点被整合。于是,可以选择稳定的靶细胞克隆用于药物抗性和目的重组蛋白的表达。
下文中提供了可用于本发明构建体之遗传元件类型的实例。这些实例仅为示例性的并且不应被以任何方式理解为限制本发明的范围。
如下表I中提供了阳性和阴性选择标记基因的列表。
表I
如下表II提供了顺式活性启动序列的列表。根据所采用的每个细胞类型的内在转录特异性,可以使用多种启动序列和/或内部核糖体进入位点(IRES)来驱动以下的表达:(i)常规大范围核酸酶开放读码框的表达,(ii)选择标记基因和目的基因(GOI)的表达。除了表中所给出的实例以外,还可以将另一些顺式活性调节序列插入到大范围核酸酶表达质粒和整合基质中以增强转录表达水平(即,增强子)和/或降低易感转录沉默[即,沉默子,例如支架/基质结合区(scaffold/matrix attachment region,S/MAR)]。
表II
表III提供了多种标记物元件的列表,可以将这些不同类型的标签序列插入到整合基质的多克隆位点(multiple cloning site,MCS),以在GOI克隆之后进行N-末端和C-末端融合。
表III
表IV提供了最常应用的报告基因的列表。可将不同类型的报告基因引入到整合基质(替代GOI,在MCS序列处)中,以设置阳性对照。
表IV
在本发明中,转录启动序列是当设置为与编码开放读码框的第二核苷酸序列组合时引起开放读码框转录的核苷酸序列。此外,对于RNA分子,启动子还可以指起到提高RNA分子翻译水平之作用的非编码序列。
在本发明中,转录终止序列是当设置于编码开放读码框的核苷酸序列后面时引起所述开放读码框转录终止的核苷酸序列。
在本发明中,同源部分是指与另一核苷酸序列共享相同的核苷酸残基从而引起这些序列之间同源重组的核苷酸序列,更具体地具有至少95%同一性,优选97%同一性,更优选99%同一性。如所指出的,构建体(i)的第一和第二同源部分(HOMO1和HOMO2)可与靶细胞基因组中靶DNA序列核酸酶(例如,大范围核酸酶、TALEN或ZFN)侧翼的序列100%(或更低)相同。
特别地,来自构建体(i)的HOMO1和HOMO2部分与来自宿主细胞基因组的同源部分之间的重叠为至少200bp且不多于6000bp,优选地,该重叠为1000bp至2000bp。
因此,特别地,来自构建体(i)的组分HOMO1和HOMO2分别至少包含200bp且不多于6000bp的序列与宿主细胞基因组同源。
最特别地,来自构建体(i)的组分HOMO1和HOMO2分别至少包含1000bp且不多于2000bp的序列与宿主细胞基因组同源。
本领域中已知允许有效水平的同源重组所需要的重叠的量(Perez等,(2005));从这些已知水平出发,本发明的发明人已确定了用于根据本发明构建体组之重叠的最有效范围。
在本发明中,大范围核酸酶靶DNA位点或大范围核酸酶识别位点意指由LAGLIDADG归巢内切核酸酶识别和切割的22至24bp的双链回文、部分回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列。这些术语是指不同的DNA位点(优选基因组位点),大范围核酸酶在该位点诱导双链断裂(切割)。
所述大范围核酸酶靶DNA位点可以是由野生型大范围核酸酶(例如,I-CreI或I-DmoI)识别和切割的DNA序列。
或者,大范围核酸酶DNA靶标位点可以是由识别和切割不同DNA靶序列的经改造的大范围核酸酶识别和切割的DNA序列。
还描述了通过将N-末端I-DmoI结构域与I-CreI单体融合来产生功能性嵌合的大范围核酸酶(Chevalier等,Mol.Cell.,2002,10,895-905;Epinat等,Nucleic Acids Res,2003,31,2952-62;国际PCT申请WO03/078619和WO 2004/031346)。
本发明的发明人以及另一些人已经证明可以改造大范围核酸酶以识别不同的DNA靶标。特别地,已经对I-CreI酶进行了广泛的研究,并且不同的组已采用半经验方法以局部地改变I-CreI(Seligman等,Genetics,1997,147,1653-1664;Sussman等,J.Mol.Biol.,2004,342,31-41;国际PCT申请WO 2006/097784、WO 2006/097853、WO 2007/060495和WO2007/049156;Arnould等,J.Mol.Biol.,2006,355,443-458;Rosen等,Nucleic Acids Res.,2006,34,4791-4800;Smith等,Nucleic Acids Res.,2006,34,e149)、I-SceI(Doyon等,J.Am.Chem.Soc,2006,128,2477-2484)、PI-SceI(Gimble等J.Mol.Biol.,2003,334,993-1008)和I-MsoI(Ashworth等,Nature,2006,441,656-659)的特异性。
此外,通过将半经验方法和高通量筛选相组合改造了数百个具有局部改变特异性的I-CreI衍生物:
——对I-CreI的残基Q44、R68和R70或者Q44、R68、D75和I77进行诱变处理,并通过筛选鉴定出一组在DNA靶标(5NNN DNA靶标)之位点±3至5处具有改变特异性的变体(国际PCT申请WO 2006/097784和WO 2006/097853;Arnould等,J.Mol.Biol.,2006,355,443-458;Smith等Nucleic Acids Res.,2006,34,e149)。
——对I-CreI的残基K28、N30和Q38或者N30、Y33和Q38或者K28、Y33、Q38和S40进行诱变处理,并通过筛选鉴定出一组在DNA靶标(10NNN DNA靶标)的位点±8至10处具有改变特异性的变体(Smith等,Nucleic Acids Res.,2006,34,e149;国际PCT申请WO 2007/060495和WO 2007/049156)。
将两个不同变体组合并装配到功能性异二聚体内切核酸酶中,该异二聚体内切核酸酶能够切割得自各变体DNA靶序列之不同的两个一半的嵌合靶(Arnould等,之前引用的;国际PCT申请WO 2006/097854和WO2007/034262)。
此外,I-CreI的残基28至40和44至77示出形成两个可分离的功能性亚结构域,其能够结合归巢内切核酸酶半位点的不同部分(Smith等,Nucleic Acids Res.,2006,34,e149;国际PCT申请WO 2007/049095和WO 2007/057781)。
来自相同单体中的I-CreI的两个亚结构域之突变的组合使得新嵌合分子(同源二聚体)设计能够在位置±3至5和±8至10处切割包含核苷酸的回文组合DNA靶序列,其结合各亚结构域(Smith等,Nucleic AcidsRes.,2006,34,e149;国际PCT申请WO 2007/049095和WO2007/057781)。
以下文献中描述了用于产生大范围核酸酶变体的方法和基于哺乳动物或酵母细胞(它们用于筛选具有改变特异性的变体)中切割诱导重组的测定:国际PCT申请WO 2004/067736;Epinat等,Nucleic Acids Res.,2003,31,2952-2962;Chames等,Nucleic Acids Res.,2005,33,e178和Arnould等,J.Mol.Biol.,2006,355,443-458。这些测定导致可通过标准方法监测的功能性LacZ报告基因。
前两个步骤的组合使得能够产生更大的组合方法,其涉及四个不同亚结构域。可以分别修饰不同的亚结构域并将其组合以得到具有选定特异性的完全重新设计的大范围核酸酶变体(异二聚体或单链分子)。在第一步骤中,将几个新大范围核酸酶组合于新分子中(“半大范围核酸酶”),所述新分子切割得自期望切割之靶的回文靶。随后,此类“半大范围核酸酶”的组合可引起切割目的靶标的异二聚体类型。以下中分别描述了将四组突变装配到切割模式靶序列或来自人RAG1、XPC和HPRT基因之序列的异二聚内切核酸酶中:Smith等,(Nucleic Acids Res.,2006,34,el 49);Arnould等,(J.Mol.Biol.,2007,371,49-65)和WO2008/059382。大范围核酸酶的另一些实例也可以用于本发明,例如切割人迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)(DMD21,SEQ ID NO 56)基因中靶标或人钙蛋白酶小亚基1(CAPNS1,SEQ ID NO 57)基因中靶标的那些。
它们所识别和切割的所有此类变体大范围核酸酶和变体DNA靶标均包括在本专利申请中,并且可以将特定大范围核酸酶及其靶的任何组合用作大范围核酸酶靶序列,该大范围核酸酶靶序列存在于靶细胞基因组中并且侧翼为与构建体(i)所示出的HOMO1和HOMO2同源的基因组部分。
类似地,可以改造另一些核酸酶(例如,TALEN和ZFN)以识别和切割特定DNA靶序列并且这包括在本专利申请中,并且可以将特定核酸酶(例如,TALEN和/或ZFN)与其靶标的任何组合用作核酸酶靶序列,该核酸酶靶序列存在于靶细胞基因组中并且侧翼为与构建体(i)所示出的HOMO1和HOMO2同源的基因组部分。
在本发明中,标记基因是当其表达时使得能够将表达标记基因之细胞或细胞群与未表达标记基因之细胞或细胞群区分开的基因产物。
阳性选择标记赋予从选择步骤(例如,补加毒素)恢复或拯救包含它的细胞的特性。
阴性选择标记本身有毒或在选择步骤(例如,补加原毒素)之后引起包含它的细胞死亡,其中阴性标记对原毒素起作用从而形成毒素。
除了采用细胞活力进行的选择外,另一些选择方法(例如,基于标记基因表达的细胞分选)也包括在本发明中。
在本发明中,多克隆位点是包含几个限制位点以允许将目的片段亚克隆到包含多克隆位点之质粒中的短段DNA。
在本发明中,大范围核酸酶意指具有12至45bp双链DNA靶序列的内切核酸酶。其可以是野生型版本的大范围核酸酶(例如,I-CreI或I-DmoI)或者上述这些酶之一的经改造版本或者包含一种或更多种大范围核酸酶之部分的融合蛋白。
本发明的发明人已表明,该系统可以与多种不同模式哺乳动物细胞系的多种GOI并用。
根据本发明的另一些方面,组分(POS)选自:新霉素磷酸转移酶抗性基因nptl(SEQ ID NO 3);潮霉素磷酸转移酶抗性基因hph(SEQ ID NO4);嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因pac(SEQ ID NO 5);杀稻瘟素S脱氨酶抗性基因bsr(SEQ ID NO 6);博来霉素抗性基因sh ble(SEQ ID NO 7)。
优选地,组分(NEG)选自:缺失CpG岛的单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因,HSV TK DelCpG(SEQ ID NO 8);与缺失CpG岛的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶偶联的胞嘧啶脱氨酶,CD:UPRT DelCpG(SEQ ID NO9)。
整合基质的随机胞内线性化可引起构建体随机整合到宿主基因组中。如果阴性标记中发生线性化,并因而使其功能失活,那么这些随机整合事件将不会通过对细胞的前药处理而消除。
因此,根据本发明的另一方面,提供了至少包含两个(N)组分的构建体(i)版本。整合基质上两个阴性选择表达盒的存在解决了该问题,这两个阴性选择表达盒一个在HOMO1区的上游,另一个在HOMO2区的下游。
优选地,元件PROM1、PROM2、ROM3和ROM4选自:巨细胞病毒立即早期启动子pCMV(SEQ ID NO 10);猿病毒40启动子pSV40(SEQ ID NO 11);人延长因子1α启动子phEF1a(SEQ ID NO 12);人磷酸甘油酸激酶启动子phPGK(SEQ ID NO 13);小鼠磷酸甘油酸激酶启动子pmPGK(SEQ ID NO 14);人聚泛素启动子phUbc(SEQ ID NO15);来自人单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子pHSV-TK(SEQ ID NO 16);人生长抑制特异性5启动子phGAS5(SEQ ID NO 17);四环素响应元件pTRE(SEQ ID NO 18);来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)序列IRES EMCV(SEQ ID NO 19);来自口蹄疫病毒的IRES序列IRES FMDV((SEQ ID NO 20),SV40。
优选地,元件TERM1、TERM2、TERM3和TERM4选自:聚腺苷酸化信号SV40pA(SEQ ID NO 21)、牛生长素聚腺苷酸化信号BGH pA(SEQ ID NO 22)。
优选地,元件MCS在其5’或3’端包含框内肽标签(in frame peptidetag),其中所述肽标签选自:FLAG(SEQ ID NO 23)、FLASH/REASH(SEQ ID NO 24)、IQ(SEQ ID NO 25)、组氨酸(SEQ ID NO 26)、STREP(SEQ ID NO 27)、链霉亲和素结合蛋白SBP(SEQ ID NO 28)、钙调素结合蛋白CBP(SEQ ID NO 29)、血凝素HA(SEQ ID NO 30)、c-myc(SEQID NO 31)、V5标签序列(SEQ ID NO 32)、来自核质蛋白(nucleoplasmin)的核定位信号(NLS)(SEQ ID NO 33)、来自SV40的NLS(SEQ ID NO34)、NLS共有序列(SEQ ID NO 35)、凝血酶切割位点(SEQ ID NO 36)、P2A切割位点(SEQ ID NO 37)、T2A切割位点(SEQ ID NO 38)、E2A切割位点(SEQ ID NO 39)。
除了可检测的肽标签、核定位信号和纯化标签外,MCS还可包含另一些有用的附加序列,例如细胞穿透肽、与可检测化合物(例如,荧光团或放射性核素)螯合的肽。
根据本发明的另一个具体方面,所述MSC可包含选自以下的报告基因:萤火虫萤光素酶基因(SEQ ID NO 40)、海肾萤光素酶基因(SEQ IDNO 41)、β-半乳糖苷酶基因LacZ(SEQ ID NO 42)、人分泌型碱性磷酸酶基因hSEAP(SEQ ID NO 43)、小鼠分泌型碱性磷酸酶基因mSEAP(SEQ ID NO 44)。该版本的构建体(i)可以用作阳性对照以确定基因表达水平,所述基因表达起因于利用本发明的构建体组通过HR插入这样的报告基因。
特别地,构建体(i)包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46。
根据本发明的第二方面,提供了在至少一个细胞中引入编码GOI之序列的试剂盒,其包含根据本发明第一方面的遗传构建体组;以及用于使用所述遗传构建体组产生转化细胞的说明。
特别地,所述试剂盒还至少包含一种选自以下的靶细胞:CHO-K1细胞、HEK293细胞、Caco2细胞、U2-OS细胞、NIH 3T3细胞、NSO细胞、SP2细胞、CHO-S细胞、DG44细胞、K-562细胞、U-937细胞、MRC5细胞、IMR90细胞、Jurkat细胞、HepG2细胞、HeLa细胞、HT-1080细胞、HCT-116细胞、Hu-h7细胞、Huvec细胞、Molt 4细胞。
根据本发明的第三方面,提供了一种通过同源重组在至少一种细胞中进行转化的方法,其包括以下步骤:
a)将编码目的基因的序列克隆到构建体(i)的位置MCS中;
b)将靶细胞与步骤a)所述的构建体(i)以及上述构建体(ii)(iii)或(iv)中的至少一种进行共转染;
c)基于以下选择至少一种细胞:所述靶细胞中存在组分(POS)以及不存在组分(NEG)。
特别地,根据(POS)和(NEG)编码的基因产物的活性依次进行步骤c)中的选择。
或者,根据(POS)和(NEG)编码的基因产物的活性同时进行步骤c)中的选择。
定义
-多肽序列中的氨基酸残基在本文中根据单字母代码命名,其中例如Q表示Gln或谷氨酰胺残基,R表示Arg或精氨酸残基,D表示Asp或天冬氨酸残基。
-核苷酸表示如下:单字母代码用于表示核苷的碱基:a是腺嘌呤,t是胸腺嘧啶,c是胞嘧啶,g是鸟嘌呤。对于简并核苷酸而言,r代表g或a(嘌呤核苷酸),k代表g或t,s代表g或c,w代表a或t,m代表a或c,y代表t或c(嘧啶核苷酸),d代表g、a或t,v代表g、a或c,b代表g、t或c,h代表a、t或c,和n代表g、a、t或c。
-“大范围核酸酶”意指具有12至45bp双链DNA靶序列的内切核酸酶。实例包括:I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、I-Csm I、PI Sce I、PI-Tli I、PI-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、Pi-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-MshI、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-RmaI、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-Mja I、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-Msol。
-“同二聚体LAGLIDADG归巢内切核酸酶”意指野生型同二聚体LAGLIDADG归巢内切核酸酶,其具有单个LAGLIDADG基序以及切割回文DNA靶序列,例如I-CreI或I-MsoI或其功能性变体。
-“LAGLIDADG归巢内切核酸酶变体”或“ZFN变体”或“TALEN变体”或“变体”意指通过用不同的氨基酸分别替换LAGLIDADG归巢内切核酸酶序列或TALEN序列或ZFN序列的至少一个氨基酸所得到的蛋白质。
-“功能性变体”意指能够切割DNA靶标的LAGLIDADG归巢内切核酸酶变体或TALEN变体或ZFN变体,优选不被野生型LAGLIDADG归巢内切核酸酶或TALEN变体或ZFN变体切割的新DNA靶标。例如,这些变体在与DNA靶序列接触或者直接或间接地与所述DNA靶标相互作用的位置处具有氨基酸变异。
-“具有新特异性的核酸酶变体”意指具有与其亲本核酸酶不同的靶标切割模式(切割谱)的变体。所述变体可以比亲本核酸酶切割更少的靶(受限谱)或更多的靶。优选地,所述变体能够切割至少一个不被亲本核酸酶切割的靶。
-术语“新的特异性”、“经修饰特异性”、“新的切割特异性”、“新的底物特异性”等同并且无差异地使用,是指变体对DNA靶序列的核苷酸的特异性。
-“I-CreI”意指具有序列SWISSPROT P05725或pdb登记代码1g9y的野生型I-CreI。
-“结构域”或“核心结构域”意指“LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域”,它是LAGLIDADG家族的归巢内切核酸酶的特征性αββαββα折叠,对应于约100个氨基酸残基的序列。所述结构域包含折叠在反向平行β片层中的4条β链,其与DNA靶标的一半相互作用。该结构域能够与另一LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域(其与DNA靶标的另一半相互作用)结合,从而形成能够切割所述DNA靶标的功能性内切核酸酶。例如,在二聚体归巢内切核酸酶I-CreI(163个氨基酸)的情况下,LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域对应于残基6至94。在单体归巢内切核酸酶的情况下,在内切核酸酶的序列中发现了两个这样的结构域;例如在I-DmoI(194个氨基酸)中发现的第一结构域(残基7至99)和第二结构域(残基104至194)被短的接头(残基100至103)分开。
-“亚结构域”意指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域的与归巢内切核酸酶DNA靶标半位点的不同的部分相互作用的区域。两个不同的亚结构域独立地或部分独立地作用,并且一个亚结构域中的突变不会改变另一亚结构域的结合与切割性质,或者在很多情况下不改变。因此,两个亚结构域与归巢内切核酸酶DNA靶标半位点的不同部分结合。
-“β-发夹”意指LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域的反向平行β片层的两条连续β-链,其由环或转角连接。
-“单链大范围核酸酶”、“单链嵌合大范围核酸酶”、“单链大范围核酸酶衍生物”、“单链嵌合大范围核酸酶衍生物”或“单链衍生物”意指包含通过肽间隔区连接的两个LAGLIDADG归巢内切核酸酶结构域或核心结构域的大范围核酸酶。单链大范围核酸酶能够切割嵌合DNA靶序列,所述嵌合DNA靶序列包含各亲本大范围核酸酶靶序列中不同的一半。
-通过“切割活性”,本发明变体的切割活性可以通过在酵母或哺乳动物细胞中使用报告基因载体直接重复重组测定来测量,如PCT申请WO2004/067736;Epinat等,Nucleic Acids Res.,2003,31,2952-2962;Chames等,Nucleic Acids Res.,2005,33,e178和Arnould等,J.Mol.Biol.,2006,355,443-458中所述的那样。所述报告基因载体包含报告基因的两段截短的、无功能的拷贝(直接重复)和位于间插序列中的嵌合DNA靶序列,所述间插序列克隆在酵母或哺乳动物表达载体中。通过用不同的核苷酸替换至少一个核苷酸来从亲本归巢内切核酸酶切割位点得到DNA靶序列。优选地,测试表现为在DNA切割位点的一个或更多个位置的四种碱基(g、a、c、t)的不同组合的一系列回文或非回文DNA靶标(对于n个突变位置而言,为4n个回文靶标)。变体的表达导致能够切割DNA靶序列的功能性内切核酸酶。该切割诱导直接重复之间的同源重组,导致功能性报告基因,其表达可以通过合适的测定来监测。
-“DNA靶标”、“DNA靶序列”、“靶序列”、“靶位点”、“靶标”、“位点”、“识别位点”、“识别序列”“归巢识别位点”、“归巢位点”、“切割位点”意指由LAGLIDADG归巢内切核酸酶识别并切割的22至24bp的双链回文、部分回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列。这些术语是指要通过内切核酸酶诱导双链断裂(切割)的独特DNA位点,优选基因组位点。DNA靶标通过双链多核苷酸中一条链的5’→3’序列来定义。或者,“DNA靶标”、“DNA靶序列”、“靶序列”、“靶位点”、“靶标”、“位点”、“识别位点”、“识别序列”“归巢识别位点”、“归巢位点”、“切割位点”意指由核酸酶(例如,TALEN或ZFN)识别并切割的双链回文、部分回文(假回文)或非回文的多核苷酸序列。
-“DNA靶标半位点”“半切割位点”或“半位点”意指DNA靶标上被各内切核酸酶结构域如LAGLIDADG归巢内切核酸酶核心结构域或各TAL结构域或各锌指结构域结合的部分。
-“嵌合DNA靶标”或“杂交DNA靶标”意指两个亲本核酸酶靶序列不同的一半的融合物。此外,在LAGLIDADG归巢内切核酸酶靶的情况下,所述靶的至少一半可包含与分开的亚结构域结合的核苷酸组合(组合DNA靶标)。
-“突变”意指核酸/氨基酸序列中一个或更多个核苷酸/氨基酸的替换、缺失和/或添加。
-“核酸酶”意指可切割特定基因组DNA靶标,并因此诱导DSB或SSB并且具有12至45bp的双链DNA靶序列的任何天然或人造的酶、分子或其他手段。
-“同源”意指一序列与另一序列具有足够的同一性从而导致序列间的同源重组,更具体地具有至少95%的同一性,优选97%同一性,更优选99%。
-“同一性”是指两条核酸分子或多肽之间的序列同一性。可通过比较各序列中可为比较目的而排列的位置来测定同一性。当所比较序列中的一个位置被相同的碱基占据时,则这些分子在该位置上是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度是核酸序列间共有的位置上相同或匹配的核苷酸数量的函数。可使用多种比对算法和/或程序计算两条序列之间的同一性,包括FASTA或BLAST,它们可作为GCG序列分析包(University of Wisconsin,Madison,Wis.)的一部分获得,并可以例如默认设定使用。
-“个体”包括哺乳动物,以及其他脊椎动物(例如,鸟类、鱼类和爬行类)。本文所使用的术语“哺乳动物”和“哺乳类动物”是指任何对其幼崽进行哺乳并且分娩活的幼崽(真哺乳亚纲(eutharian)或胎盘哺乳动物)或产卵(后兽亚纲(metatharian)或无胎盘(nonplacental)哺乳动物)的脊椎动物,包括单孔目动物、有袋目动物和有胎盘动物。哺乳类物种的实例包括人和其他灵长类动物(例如,猴、黑猩猩)、啮齿类动物(例如,大鼠、小鼠、豚鼠)以及反刍类动物(例如,牛、猪、马)。
-“目的基因”或“GOI”是指编码已知或假定基因产物的任何核苷酸序列。
-“遗传病”是指任何部分或全部、直接或间接地由一个或若干基因异常引起的疾病。所述异常可以是突变、插入或缺失。所述突变可以是点突变。所述异常可以影响基因的编码序列或其调节序列。所述异常可以影响基因组序列的结构或所编码的mRNA的结构或稳定性。该遗传病可以是隐性的或显性的。这样的遗传病可以是但不限于囊性纤维化、亨廷顿舞蹈病、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、成肝细胞瘤、威尔逊病(Wilson’s disease)、先天性肝卟啉病、遗传性肝代谢障碍、莱-尼综合征(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞贫血、地中海贫血、着色性干皮病、范科尼贫血(Fanconi’s anemia)、视网膜色素变性、毛细血管扩张性共济失调(ataxia telangiectasia)、布卢姆综合征(Bloom’s syndrome)、成视网膜细胞瘤、迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)和泰-萨病(Tay-Sachs disease)。
-“载体”:可以用在本发明中的例如作为如上所定义的构建体(ii)或(iii)的载体包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体或者线性或环状DNA或RNA分子,其可以由染色体、非染色体、半合成或合成核酸组成。优选的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达其所连接的核酸(表达载体)的载体。大量合适的载体是本领域技术人员已知的并且可商业获得。
病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如,腺伴随病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如,流感病毒)、棒状病毒(例如,狂犬病病毒和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如,麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒如小核糖核酸病毒和甲病毒属、以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如,1型和2型单纯疱疹病毒、爱-巴病毒(Epstein-Barr virus)、巨细胞病毒)和痘病毒(例如,牛痘病毒、禽痘病毒和痘病毒(例如牛痘病毒、鸟痘病毒和金丝雀痘病毒))。另一些病毒包括例如诺沃克病毒(Norwalk virus)、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括:禽白血病-肉瘤病毒,哺乳动物C型、B型、D型病毒、HTLV-BLV病毒群、慢病毒属、泡沫病毒属(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,第三版,B.N.Fields,等,Eds.,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。术语“载体”是指能够运送其所连接的其他核酸的核酸分子。一种优选载体为附加体,即能够染色体外复制的核酸。优选的载体为能够自主复制和/或表达其所连接之核酸的那些。能够指导与其可操作地连接的核酸的表达的载体在本文中称作“表达载体”。根据本发明的载体包括但不限于YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、杆状病毒载体、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒载体、质粒、RNA载体或者线性或环状DNA或RNA分子,其可由染色体、非染色体、半合成或合成DNA组成。一般而言,在重组DNA技术中使用的表达载体通常为“质粒”形式,其一般是指环状双链DNA环,其载体形式不与染色体结合。大量合适的载体是本领域技术人员已知的。
载体可以包含可选择标记,例如:用于培养真核细胞的新霉素磷酸转移酶、组氨醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸苷激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰氨合成酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶;用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1;大肠杆菌(E.coli)中的四环素、利福平或氨苄西林抗性。这些选择标记还可用作根据本发明的构建体(i)和(ii)的一部分。
优选地,所述载体为表达载体,其中编码本发明多肽的序列位于适当的转录和翻译控制元件的控制之下,从而允许产生或合成所述蛋白质。因此,所述多核苷酸被包含在表达盒中。更具体地,所述载体包括复制起点、与所述编码多核苷酸可操作地连接的启动子、核糖体位点、RNA剪接位点(在使用基因组DNA时)、聚腺苷酸化位点和转录终止位点。所述载体还可包含增强子或沉默子元件。启动子的选择将取决于其中表达有多肽的细胞。
为了更好地理解本发明以及为了示出如何可实施本发明,现参照附图仅以举例的方式示出根据本发明的具体实施方案、方法和过程,其中:
图1:大范围核酸酶介导的靶向整合过程的示意图。将整合基质和大范围核酸酶表达质粒共转染到真核细胞中。共转染之后,表达经改造的大范围核酸酶,识别其内源性识别位点,与之结合并诱导DNA双链在该精确位点处断裂。细胞感知DNA损伤并且使用共转染的整合基质(用作DNA修复基质,因为其含有与断裂DNA周围同源的区域)触发同源重组以修复所述损伤。在该重组事件期间,已被克隆到整合基质同源区之间的多克隆位点(MCS)中的选择标记和目的基因(GOI)在大范围核酸酶识别位点处整合。
图2:对编码大范围核酸酶之质粒的描述。可以使用两种不同的策略来驱动大范围核酸酶单体亚基的表达,即在两个单独的质粒中引入每个单体的开放读码框(情况1)或在唯一质粒中引入每个单体的开放读码框,其中以单链形式表达单体亚基(情况2)。
图3:对通用整合基质的描述。在通用整合基质中引入不同遗传元件的示意图。首先,在两个不同位置添加阳性和选择标记基因:前者插入诱重组元件中而后者插在诱重组元件外。其次,引入不同的限制位点:用于克隆任何类型的整合基因座的左同源臂和右同源臂的8bp切割位点,在克隆附加元件(即,增强子、沉默子)的情况下,用于插入任何GOI和其他限制位点的多克隆位点(multiple cloning site,MCS)。
图4:通用整合质粒图谱。通过改变阳性选择标记基因[即,例如新霉素(NeoR)和潮霉素(HygroR)]和阴性选择标记基因(即,HSV TK DelCpG和CD:UPRT DelCpG)的类型给出了通用整合基质的两个实例。标出了用于克隆目的基因(GOI)的多克隆位点(MCS)。通过在AscI位点插入左同源臂而在FseI或SbfI位点插入右同源臂,这些质粒骨架可以用作任何类型染色体基因座中的HR,在此意义上来说,这些质粒骨架是通用的。相对于经典的6bp切割工具(cutter),优选8bp切割工具,以降低在待扩增的所期望染色体区域中发现位点的可能性。
图5:大范围核酸酶介导的靶向整合过程(反选择)的示意图。在阳性选择过程之后,预期基因座中不需要的随机整合和/或最终基于质粒的多联体多重整合可通过施加反选择过程而排除。可以通过用前药处理最终选择的细胞克隆来绕开存在于诱重组遗传元件外的自杀基因标记,所述前药取决于所使用自杀基因标记的类型(即,例如用于HSV TK的更昔洛韦和用于CD:UPRT的5-氟胞嘧啶)。尽管同基因(单拷贝)整合对前药有抗性,但是其他所有类型的整合体(随机或多联体)对前药敏感。
图6:用于靶向人RAG1基因座的整合质粒图谱。人RAG1基因座的左同源臂和右同源臂已被克隆到pIM-Universal-TK-Neo质粒中。
图7:对HEK 293中所靶向克隆之选择过程的描述。用RAG1大范围核酸酶表达和整合基质转染HEK 293。转染后3天,将2,000个经转染的细胞接种到10cm培养皿中。转染后10天,通过在G418存在下培养克隆7天来鉴定新霉素抗性的克隆。转染后17天,通过添加更昔洛韦5天来分离新霉素抗性和更昔洛韦抗性的克隆。在选择过程的最后,将双抗性克隆重新排列在96孔板中。复制96孔板中的克隆以用PCR进行筛选。
图8:对HEK293中目标克隆进行的筛选PCR。A.靶向整合后RAG1基因座的示意图。描述了PCR引物的位置。B.和C.经溴化乙锭染色的96孔琼脂糖凝胶的紫外光图,用于鉴定PCR阳性克隆。每块凝胶可加载6排的16个孔。在每一排的每一侧,加载DNA分子量标准(DNA markerladder)(L)。DNA条带的大小为(从上到下):10kb、8kb、2kb、0.8kb、0.4kb。
图9:HEK293中目标克隆的分子表征(Southern印迹)。A.在用HindIII限制酶消化的gDNA上用基因组探针杂交。B.在用EcoRV限制酶酶切的gDNA上用新霉素探针杂交。C.在用HindIII限制酶消化的gDNA上用新霉素探针杂交。D.单拷贝靶向整合后人RAG1基因座的示意图以及预期的条带大小。E.多拷贝靶向整合后人RAG1基因座的示意图以及预期的条带大小。缩写:GCV R,更昔洛韦抗性;GCV S,对更昔洛韦敏感;C-,未转染的HEK293细胞;C+,阳性的目标HEK293克隆;kb,千碱基;HIII,HindIII;EV,EcoRV;LH,左同源臂;RH,右同源臂;Neo,新霉素抗性基因;Luc,萤光素酶报告基因;HSV TK,单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。
图10:人RAG1-目标HEK293克隆中的萤光素酶报告基因表达的稳定性。A.在存在选择剂的情况下,20次传代过程中萤光素酶的表达(4个萤光素酶目标克隆的平均值)。B.在不存在选择剂的情况下,20次传代过程中萤光素酶的表达(4个萤光素酶目标克隆的平均值)。
图11:在靶向人RAG1目标HEK293克隆中的3种不同启动子控制下TagGFP2报告基因的稳定性。在EFIa(正方形)、CMV(三角形)或GAS5(圆形)启动子的控制下,20次传代过程中TagGFP2的表达(GFPX-平均值)。
图12:对目标HCT 116克隆中的单等位和双等位破坏之RAG1基因的Southern印迹分析。左图:在用HindIII限制酶消化的来自NeoRGCVRPCR+克隆的gDNA上用基因组探针杂交。对照泳道(来自天然HCT 116的gDNA)。黑色星(用于第二靶向实验的D12克隆)。右图:在用HindIII限制酶消化的来自HygroRGCVRPCR+克隆的gDNA上用基因组探针杂交。T:目标等位基因,WT:野生型等位基因。
现在以示例的方式描述本发明的发明人所构想的具体方式。在以下的描述中,给出了很多具体细节以提供全面的理解。然而,对与本领域技术人员来说显而易见的是,本发明的实施可不受这些具体细节的限制。在另一些情形中,为了避免使描述不必要地模糊化,没有对公知的方法和结构进行描述。
实施例1:设计编码大范围核酸酶的质粒
为了靶向特定的目的天然基因组DNA序列,包括本发明发明人在内的几个小组已经改变了大范围核酸酶的识别能力。根据天然存在的大范围核酸酶设计这些新开发的酶;申请人已经将它们用于靶向明确定义的DNA序列用于给定的应用。申请人已经开发出了大范围核酸酶的高通量筛选平台,以产生大量“DNA剪刀”并使它们与特异性修饰技术联合。
关于此类具有经修饰的识别特异性的经改造的大范围核酸酶,发明提出的本文中所给出的实施例涉及来自I-CreI初始骨架的蛋白质修饰。但是,本发明可应用于任何其他大范围核酸酶骨架,例如I-SceI、I-CreI、I-MsoI、PI-SceI、I-AniI、PI-PfuI、I-DmoI、I-CeuI、I-Tsp0611,或者功能性杂合蛋白质,例如与I-Crel肽融合的I-Dmol部分。
大多数大范围核酸酶蛋白质实际上是单体,但是它们保持双重内部对称,具有两个DNA结合半位点,每个半位点与靶DNA的一半相互作用。对于I-CreI衍生的经改造的大范围核酸酶而言并非如此,其由两个单独的亚单位构成并因此形成异二聚体组合物,其中每个亚单位识别识别基因座的半位点。申请人已证明通过将两个单体与短肽序列连接可将所述单体融合,同时保持功能性切割活性(即由染色体外和染色体内靶序列给出了示范)。根据这个最初的范例以及如图2所示,可使用以下进行I-CreI衍生的经改造的大范围核酸酶的表达:
——通过相同质粒中的两个单独的DNA质粒/序列,每个单体部分从其中表达;
——由通过使用由两个单体部分的融合体构成的单链形式的相同质粒。
对于包含其他表达盒之整合基质的情况,驱动大范围核酸酶开放读码框转录(即,启动序列和聚腺苷酸化信号)的顺式作用DNA元件可根据靶细胞系和其中的此类遗传元件的相对特性而改变。
实施例2:设计整合基质
为了使大范围核酸酶能够在任何细胞类型中驱动HR,已设计并构建了通用的质粒骨架(图3)。克隆到整合基质中的某些遗传元件是强制性的,例如同源臂、选择盒和GOI表达盒。
对于实现特异性基因靶向来说,同源臂是必需的。它们使用以下特异性引物通过PCR扩增而产生:i)大范围核酸酶靶位点上游的基因组区(左同源臂)和ii)大范围核酸酶靶位点下游的基因组区(右同源臂)。同源臂的长度为500bp至2kb,通常为1.5kb。
阳性选择盒由启动子区域和终止子序列控制的抗性基因构成,反(阴性)选择盒的情况也是如此。图4中给出了插入通用整合基质中的这些类型遗传元件之质粒图谱的实例[pIM-Universal-TK-Neo(SEQ ID NO 1),pIM-Universal-CD:UPRT-Hygro(SEQ ID NO 2)],其中指出了阳性(新霉素和潮霉素)和阴性(HSV TK或CD:UPRT)选择标记基因。表I给出了涉及阳性选择和反(阴性)选择之基因的列表,并且所述基因包含新霉素磷酸转移酶抗性基因nptl(SEQ ID NO 3),潮霉素磷酸转移酶抗性基因hph(SEQ ID NO 4),嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因pac(SEQ ID NO5),杀稻瘟素S脱氨酶抗性基因bsr(SEQ ID NO 6),博来霉素抗性基因sh ble(SEQ ID NO 7),缺失CpG岛的单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶核苷激酶基因HSV TK DelCpG(SEQ ID NO 8),缺失CpG岛的与尿嘧啶磷酸核糖基转移酶偶联的胞嘧啶脱氨酶CD:UPRT DelCpG(SEQ ID NO 9)。
表达盒由多克隆位点(MCS)构成,其中使用经典的分子生物学技术克隆GOI。启动子(上游)和终止子(下游)序列在MCS的侧翼。表II中给出了此类遗传元件的列表,并且所述元件包括巨细胞病毒立即早期启动子pCMV(SEQ ID NO 10),猿病毒40启动子pSV40(SEQ ID NO11),人延伸因子1α启动子phEF1α(SEQ ID NO 12),人磷酸甘油酸激酶启动子phPGK(SEQ ID NO 13),小鼠磷酸甘油酸激酶启动子pmPGK(SEQ ID NO 14),人聚泛素启动子phUbc(SEQ ID NO 15),来自人单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子pHSV-TK(SEQ ID NO 16),人生长抑制特异性5启动子phGAS5(SEQ ID NO 17),四环素响应元件pTRE(SEQID NO 18),来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)序列IRESEMCV(SEQ ID NO 19),来自口蹄疫病毒的IRES序列IRES FMDV(SEQ ID NO 20),SV40聚腺苷酸化信号SV40pA(SEQ ID NO 21),牛生长激素聚腺苷酸化信号BGH pA(SEQ ID NO 22)。
从这个基本的骨架可衍生出多种整合基质。例如,可引入被IRES序列分开的双MCS以表达两个GOI。在框架中MCS可与短序列(N-末端或C-末端)一起装配以允许标记GOI。之后,根据所附标签的类型,可考虑多种应用(显像、纯化、免疫检测、细胞寻址)。
表III给出了可被引入整合载体中的任选遗传元件的概览,所述元件包括FLAG(SEQ ID NO 23),FLASH/REASH(SEQ ID NO 24),IQ(SEQID NO 25),组氨酸(SEQ ID NO 26),STREP(SEQ ID NO 27),链霉亲和素结合蛋白SBP(SEQ ID NO 28),钙调素结合蛋白CBP(SEQ ID NO29),血凝素HA(SEQ ID NO 30),c-myc(SEQ ID NO 31),V5标签序列(SEQ ID NO 32),来自核质蛋白的核定位信号(NLS)(SEQ ID NO 33),来自SV40的NLS(SEQ ID NO 34),NLS共有序列(SEQ ID NO 35),凝血酶切割位点(SEQ ID NO 36),P2A切割位点(SEQ ID NO 37),T2A切割位点(SEQ ID NO 38),E2A切割位点(SEQ ID NO 39)。
另外,来自表IV中所给出列表的报告基因也可被克隆到MCS中并且可充当阳性对照用于评价在期望的染色体基因座上靶向整合后的表达水平。这些包括萤火虫萤光素酶基因(SEQ ID NO 40),海肾萤光素酶基因(SEQ ID NO 41),β-半乳糖苷酶基因LacZ(SEQ ID NO 42),人分泌型碱性磷酸酶基因hSEAP(SEQ ID NO 43),鼠分泌型碱性磷酸酶基因mSEAP(SEQ ID NO 44)。
最后,大范围核酸酶诱导的靶向整合有时可伴有不期望的事件,例如在宿主基因组中随机插入整合基质。通常,这种现象涉及包括质粒骨架序列在内的整合基质的完整插入。为了避免、至少部分地避免这种现象,反(阴性)选择标记存在于质粒的骨架部分(即,同源臂的外侧)中,例如在Khanahmad等,2006和Jin等,2003中所描述的那样。
在大范围核酸酶驱动的靶向整合的情况下,使用这种类型的自杀基因表达系统尤其与消除与潜在随机插入相关的目标细胞克隆有关。
整合基质的细胞内线性化也可导致在宿主基因组中随机整合。如果在阴性标记内发生线性化并且之后使它的功能失活,那么那些随机整合事件不会通过对细胞进行前药处理而消除。为了避免这个缺点,本发明的发明人提出了在整合基质上存在两个阴性选择表达盒的整合基质;例如,一个在HOMO1区的上游和一个在HOMO2区的下游。本发明的发明人证明了使用至少一个阴性选择表达盒防止多拷贝靶向整合。描述了之前使用反阴性选择标记用于防止随机整合。本发明的发明人现已证明这些标记还允许用于防止多拷贝靶向整合。
在除诱重组元件以外的质粒骨架中包含自杀基因表达盒的整合基质允许在期望的染色体基因座处对具有富含整合事件的目标细胞克隆进行选择。在一些目标细胞克隆中维持自杀基因表达盒是不期望的整合事件,因为准确的靶向过程一般拒绝整合基于质粒的位于诱重组元件以外的序列。因此,通过用与自杀基因系统相关的有毒前药处理细胞克隆,可杀死包含此类型整合体的克隆(图5)。
用于在给定染色体基因座处靶向整合的本发明还可通过使用不同于经典的基于质粒的系统的来自其他类型DNA来源的整合基质而得到。这些包括任何类型的病毒载体(其中产生了DNA中间体),例如通过利用逆转录病毒和慢病毒的1LTR和2LTR环形前病毒的非整合逆转录病毒和慢病毒,包括腺病毒和腺相关病毒在内的附加型DNA病毒载体,以及具有附加型复制状态的其他类型DNA病毒。
实施例3:转染和选择
在这个实施例中,我们提出了使用特异性针对位于人RAG1基因中的靶标的大范围核酸酶导致鉴定GOI靶向整合的技术过程。图6中示出了与用于下文给出示范的RAG1特异性整合基质[pIM-RAG1-MCS(SEQID NO 45)pIM-RAG1-Luc(SEQ ID NO 46)]相关的质粒图谱。由于经改造的大范围核酸酶可识别人RAG1基因并在其中切割,所以靶向整合可在几乎所有的人细胞系中获得。根据细胞附着于塑料的能力,转染和选择方法不同,但是两者都导致有效地鉴定目标细胞克隆。
使用已知技术将整合基质和大范围核酸酶表达载体转染到细胞中。有多种方法将外源DNA引入到真核细胞中并且许多材料已用作转染载体,所述材料可被分为3类:(阳离子)聚合物、脂质体和纳米颗粒。另一些转染方法包括核转染(nucleofection)、电穿孔(例如,Cyto Pulse(Cellectis))、热休克、磁转染(magnetofection)以及专有的转染试剂,例如Lipofectamine、Dojindo Hilymax、Fugene、JetPEI、Effectene、DreamFect、PolyFect、Nucleofector、Lyovec、Attractene、Transfast、Optifect。
3.1转染和选择贴壁的HEK-293细胞
在此作为实施例描述了用于以转染HEK-293(人贴壁细胞系)的方法(图7)。
材料和方法
在转染前一天,将HEK-293细胞接种在10cm组织培养皿(每皿106个细胞)中。在转染当天(D),在300μl无血清培养基中稀释人RAG1大范围核酸酶表达质粒和整合基质(pIM-RAG1-MCS(SEQ ID NO 45)及其衍生的具有用GOI代替MCS的包含GOI的质粒,或pIM-RAG1-Luc(SEQ ID NO 46)作为阳性对照)。另一方面,在290μl无血清培养基中稀释10μl试剂。在室温下孵育这两种混合物5分钟。之后,将经稀释的DNA添加至经稀释的试剂(反之不行)。该混合物通过将管倒转轻轻地混合均匀并在室温下孵育20分钟。之后将转染混合物分散在铺板的细胞上并使转染的细胞在37℃、5% CO2潮湿的培养箱中孵育。第二天,用新鲜的完全培养基更换转染培养基。
转染后3天,收获细胞并对其进行计数。之后,在总体积为10ml的完全培养基中以200个细胞/ml的密度将细胞接种在10cm组织培养皿中。将10cm组织培养皿在37℃、5%CO2下孵育总共7天。7天结束时,可见细胞的单克隆。
转染后10天(或者铺板后7天),用补充了选择剂(即对应于整合基质上所存在的抗性基因)的新鲜培养基更换培养基。在本实施例中,整合基质包含完整的新霉素抗性基因(图6)。因此,通过使用浓度为0.4mg/ml的G418硫酸盐对克隆进行选择。每2天或3天更换培养基,共持续7天。在该选择阶段结束时,对于反选择,抗性细胞可在96孔板中被分离或者被维持在10cm皿(贴壁细胞)中或者在新的96孔板(悬浮细胞)中重新排列。
由于在整合基质上存在HSK TK反选择标记(图6),所以可在10μM更昔洛韦(GCV)存在的情况下培养抗性细胞或克隆以消除不期望的整合事件,例如随机插入和多拷贝靶向整合。在GCV存在的情况下培养5天后,可分离双重抗性(G418R-GCVR)细胞克隆用于进一步表征。
在该选择阶段的结束时,可分离抗性(G418R-GCVR)细胞集落用于通过PCR进行分子筛选(参见§3.8)。
3.2转染和选择贴壁的U-2OS细胞
材料和方法
在转染当天(D),细胞不应有多于80%的汇合。通过胰蛋白酶消化从亚培养容器(T162组织培养瓶)中收获细胞并将其收集在15ml圆锥管中。对所收获的细胞进行计数。每个转染点需要106个细胞。将细胞以300g离心5分钟并以106个细胞/100μl的浓度重悬于细胞系溶液V中。通过添加下列物质准备Amaxa电穿孔池:i)包含目的基因的hsRAG1整合基质CMV Neo(pIM.RAG1.CMV.Neo SEQID NO:58),或者hsRAG1整合基质CMV Neo Luc(pIM.RAG1.CMV.Neo.Luc SEQ ID NO:59)和hsRAG1大范围核酸酶质粒(SEQ ID NO:60)(无内毒素品质的制品),ii)100μl细胞悬液(106个细胞)。使细胞和DNA轻轻地混合并使用程序X-001进行电穿孔。电穿孔后,立即将预热的完全培养基添加至细胞,然后将细胞悬液分入两个10cm皿(每皿5ml)中,所述皿包含5ml 37℃预热的完全培养基。之后将10cm皿在37℃、5% CO2潮湿的培养箱中孵育。
转染后2天(D+2),用补充有0.4mg/ml G418的新鲜完全培养基更换完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续7天。在D+9天,用补充有0.4mg/ml G418和50μM更昔洛韦的新鲜完全培养基更换补充有0.4mg/ml G418的完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续5天。在D+14天,在96孔板中挑选G418和GCV抗性克隆。在该步骤,细胞被维持在仅补充有0.4mg/ml G418的完全培养基中。
在该选择阶段结束时,可分离抗性(G418R-GCVR)细胞集落用于通过PCR进行分子筛选(参见§3.8)。
3.3转染和选择贴壁的HCT116细胞
材料和方法
在转染前一天,将HCT 116细胞接种在10cm组织培养皿(每皿5×105个细胞)中。在转染当天(D),在500μl无血清培养基中稀释人RAG1大范围核酸酶表达质粒和整合基质(pIM-RAG1-MCS(SEQ ID NO 45)及其衍生的具有用GOI代替MCS的包含GOI的质粒,或pIM-RAG1-Luc(SEQ ID NO 46)作为阳性对照)。之后,在DNA混合物中稀释15μlHD试剂。通过将管倒转使混合物轻轻地混合均匀并在室温下孵育15分钟。之后将转染混合物分散在铺板的细胞上并使转染的细胞在37℃、5%CO2潮湿的培养箱中孵育。
转染后1天(D+1),用补充有0.4mg/ml G418的新鲜的完全培养基更换完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续7天。在D+9天,用补充有0.4mg/ml G418和50μM更昔洛韦的新鲜完全培养基更换补充有0.4mg/ml G418的完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续5天。在D+14天,在96孔板中挑选G418和GCV抗性克隆。在该步骤中,细胞被维持在仅添加了0.4mg/ml G418的完全培养基中。
在该选择阶段结束时,可分离抗性(G418R-GCVR)细胞集落用于通过PCR进行分子筛选(参见§3.8)。
3.4转染和选择贴壁HepG2细胞
材料和方法
在转染前一天,将HCT116细胞接种在10cm组织培养皿(每皿106个细胞)中。在转染当天(D),在500μl无血清培养基中稀释人RAG1大范围核酸酶表达质粒和整合基质(pIM-RAG1-MCS(SEQ ID NO 45)及其衍生的具有用GOI代替MCS的包含GOI的质粒,或pIM-RAG1-Luc(SEQ ID NO 46)作为阳性对照)。之后,在DNA混合物中稀释15μlHD试剂。通过将管倒转使混合物轻轻地混合均匀并在室温下孵育15分钟。之后将转染混合物分散在铺板的细胞上并使转染的细胞在37℃、5%CO2潮湿的培养箱中孵育。
转染后3天(D+3),通过胰蛋白酶消化收获经转染的细胞并将其分入两个10cm皿中。用补充有0.8mg/ml G418的新鲜完全培养基更换完全培养基。每3天重复该步骤,共持续10天。在D+13天,用补充有0.8mg/ml G418和50μM更昔洛韦的新鲜完全培养基更换补充有0.8mg/mlG418的完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续5天。在D+18天,将细胞培养在补充有0.8mg/ml G418的新鲜完全培养基中。在D+24天,在96孔板中挑选G418和GCV抗性克隆。在该步骤中,细胞被维持在仅补充有0.8mg/ml G418的完全培养基中。
在该选择阶段结束时,可分离抗性(G418R-GCVR)细胞集落用于通过PCR进行分子筛选(参见§3.8)。
3.5转染和选择贴壁的MRC-5细胞
材料和方法
在转染前一天,将MRC-5细胞接种在10cm组织培养皿(每皿2.5×105个细胞)中。在转染当天(D),在275μl无血清培养基中稀释人RAG1大范围核酸酶表达质粒和整合基质(pIM-RAG1-MCS(SEQ ID NO 45)及其衍生的具有用GOI代替MCS的包含GOI的质粒,或pIM-RAG1-Luc(SEQ ID NO 46)作为阳性对照)。之后,在DNA混合物中稀释50μlHD试剂。通过将管倒转使混合物轻轻地混合均匀并在室温下孵育10分钟。将700μl完全培养基添加至转染混合物中,之后将最终混合物分散在铺板的细胞上并使经转染的细胞在37℃、5% CO2潮湿的培养箱中孵育。
转染后3天,收获细胞并对其进行计数。之后,在总体积为10ml的完全培养基中以1000个细胞/ml的密度将细胞接种在10cm组织培养皿中。将10cm组织培养皿在37℃、5% CO2下孵育总共7天。7天结束时,可见细胞的单个集落。转染后10天(或者铺板后7天),用补充有0.4mg/ml浓度的G418硫酸盐的新鲜培养基更换培养基。每2天或3天进行培养基更换,共持续7天。在D+13天,用补充有0.4mg/ml G418和50μM更昔洛韦的新鲜完全培养基更换补充有0.4mg/ml G418的完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续5天。
在该选择阶段结束时,可分离抗性(G418R-GCVR)细胞集落用于通过PCR进行分子筛选(参见§3.8)。
3.6转染和选择Jurkat细胞悬液
材料和方法
在转染当天(D),将Jurkat细胞收集在15ml圆锥管中并对其进行计数。每个转染点需要2×106个细胞。将细胞以300g离心5分钟并以2×106个细胞/100μl的浓度重悬于细胞系溶液V中。通过添加下列物质准备Amaxa电穿孔池:i)包含目的基因的hsRAG1整合基质CMVNeo(pIM.RAG1.CMV.Neo SEQ ID NO:58),或者hsRAG1整合基质CMV Neo Luc(pIM.RAG1.CMV.Neo.Luc SEQ ID NO:59)和hsRAG1大范围核酸酶质粒(SEQ ID NO:60)(无内毒素品质的制品),ii)100μl细胞悬液(2×106个细胞)。使细胞和DNA轻轻地混合并使用程序X-001进行电穿孔。电穿孔后,立即将预热的完全培养基添加至细胞并将细胞转移到包含2.4ml预热完全培养基的6孔板的孔中。之后将6孔板在37℃、5%CO2潮湿的培养箱中孵育。
转染后3天(D+2),用补充有0.7mg/ml G418的新鲜完全培养基更换完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续17天。在该选择期之后,在补充有0.7mg/ml G418的新鲜完全培养基中以10个细胞/孔的密度在圆底96孔板中收获抗性细胞并对其进行克隆。足够的生长(10~15天)之后,可分离抗性(G418R)细胞集落用于通过PCR进行分子筛选(参见§3.8)。
在Jurkat细胞的情况下,不应用反选择过程(更昔洛韦),这是因为即使在很低的浓度,Jurkat细胞系也对药物极为敏感。
3.7转染和选择K-562细胞悬液
材料和方法
在转染当天(D),将K-562细胞收集在15ml锥形管中并对其进行计数。每个转染点需要106个细胞。将细胞以300g离心5分钟并以106个细胞/100μl的浓度重悬于细胞系溶液V中。通过添加下列物质准备Amaxa电穿孔池:i)包含目的基因的hsRAG1整合基质CMVNeo(pIM.RAG1.CMV.Neo SEQ ID NO:58),或者hsRAG1整合基质CMV Neo Luc(pIM.RAG1.CMV.Neo.Luc SEQ ID NO:59)和hsRAG1大范围核酸酶质粒(SEQ ID NO:60)(无内毒素品质的制品),ii)100μl细胞悬液(106个细胞)。使细胞和DNA轻轻地混合并使用程序X-001进行电穿孔。电穿孔后,立即将预热的完全培养基添加至细胞并且将细胞悬液转移到包含2.4ml预热完全培养基的6孔板的孔中。之后将6孔板在37℃、5% CO2潮湿的培养箱中孵育。
转染后3天(D+3),用补充有0.5mg/ml G418的新鲜完全培养基更换完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续7天。在D+10天,用补充有0.5mg/ml G418和50μM更昔洛韦的新鲜完全培养基更换补充有0.4mg/ml G418的完全培养基。每2天或3天重复该步骤,共持续5天。
在该选择期之后,在补充有0.5mg/ml G418的新鲜的完全培养基中以10个细胞/孔的密度在圆底96孔板中收获抗性细胞并对其进行克隆。足够的生长(10~15天)之后,可分离抗性(G418R-GCVR)细胞克隆用于通过PCR进行分子筛选(参见§3.8)。
3.8PCR筛选
一旦完成选择和任选的反选择,就以96孔形式维持96孔板中重新排列的抗性集落或克隆。为了从抗性细胞中产生基因组DNA,对板进行复制。之后进行PCR以鉴定靶向整合。
材料和方法
基因组DNA制备:根据制造商的推荐,用ZR-96基因组DNA试剂盒TM(Zymo Research)制备来自双重抗性细胞克隆的基因组DNA(gDNA)。
PCR引物设计:在本实施例(人RAG1基因座)中,根据以下规则并且如图8A中所示选择PCR引物。正向引物位于异源序列中(即,同源臂之间)。例如,正向PCR引物处于BGH polyA序列(SEQ ID NO 22)中,该序列终止GOI的转录。反向PCR引物位于RAG1基因座内,但是在右同源臂外侧。因此,仅当发生特异性靶向整合时才可能进行PCR扩增。另外,引物的这种组合可被用于筛选靶向事件,独立于待整合的GOI。
F_HS1_PCRSC:GGAGGATTGGGAAGACAATAGC(SEQ IDNO:47)
R_HS1_PCRSC:CTTTCACAGTCCTGTACATCTTGT(SEQ IDNO:48)
PCR条件:PCR反应在终体积为25μl的含有每种引物0.25μM、10μM dNTP和0.5μlHerculase II FusionDNA聚合酶(Stratagene)的5μlgDNA上进行。
PCR程序:
图8中呈现出在人RAG1系统中用于靶向事件之PCR筛选过程的一个实例。在图A中示出了靶向整合之后的RAG1基因座的示意图,其具有筛选PCR引物之位置和预期条带大小。在图B和图C中示出了对来自通过上述过程已得到的G418R-GCVR目标细胞克隆的gDNA进行PCR筛选的结果。将双抗性克隆在96孔板中重新排列。培养几天后,96孔板被复制并且复制品之一用于gDNA制备,同时继续培养另一平行的96孔板。对gDNA进行PCR扩增,然后将10μl PCR反应物加载到0.8%琼脂糖胶上并进行电泳。迁移之后,用溴化乙锭对凝胶进行染色并将其暴露于紫外光以鉴定PCR阳性克隆。在图B中,我们从96个克隆中鉴定出显示特定DNA条带的8个克隆,这表示成功率为8.3%。在图C中,从96个克隆中鉴定出20个克隆,表示成功率为20.8%。
根据通过PCR的这种分子筛选,靶向整合到不同人细胞系的hsRAG1基因座中的结果归纳于表V中,对于这些细胞系,已开发了特定的方案(参见§3.1至3.7)。特异性靶向整合的水平为7%至44%,证明了cGPS定制系统的效力。这证明了本发明可应用于任何种类的细胞系(贴壁细胞系、悬浮细胞系、原代细胞系)。
表V:不同细胞系中靶向整合的总结。
为了进一步表征这些阳性克隆,将保留在培养物中的来自相应孔的细胞从96孔板形式各自扩增至10cm培养平皿形式。
3.9分子表征(Southern印迹)
可以容易地通过Southern印迹分析在分子水平上对双抗性克隆中的正确靶向插入进行鉴定(图9)。
材料和方法
使用血液和细胞培养物DNA中量试剂盒(Blood and Cell cultureDNA midi kit)(Qiagen)从107个细胞(约在10cm平皿中完全汇合)中纯化来自目标克隆的gDNA。通过用10倍过量的限制酶(在此为HindIII或EcoRV限制酶)过夜孵育来酶切消化5μg至10μg的gDNA。在0.8%琼脂糖凝胶上将经酶切消化的gDNA进行分离并转移到尼龙膜上。然后用对新霉素基因或者用对位于3’同源臂外侧的RAG1特异性序列具有特异性的32P DNA探针探查尼龙膜(图9中的图D和图E)。在适当洗涤之后,通过放射自显影显示探针的特异性杂交(图9中的图A至图C)。
结果
在此处所呈现的实施例中,我们比较了具有不同表型之G418R克隆的杂交模式(显示在图A顶部)。对于G418R-PCR+的细胞克隆,已对10种GCVR和6种GCVS靶向细胞克隆进行了分析,并且还通过Southern印迹对来自G418R-PCR-表型的4个G418R细胞克隆进行了表征。来自这些克隆的gDNA用HindIII限制酶(图A和图C)或者用EcoRV(图B)酶切消化,并且与RAG1基因组探针(图A)或与新霉素探针(图B和C)进行杂交。图D中描述了RAG1靶向基因座以及根据限制酶酶切消化和所使用探针之预期条带大小的示意图。所有的G418R-GCVR-PCR+克隆表明分子遗传模式符合同基因(单拷贝)整合的最初预测。图A中,因为我们使用了RAG1基因组探针,在5.2kb处发现了另一条带,其对应于未被靶向的RAG1等位基因之一。该带还存在于阴性对照(C-:未转染的HEK293细胞)和G418R-GCVS-PCR的阳性克隆和阴性克隆中。这些结果证明,对于所有的G418R-GCVR-PCR+克隆而言,人RAG1基因座的一个等位基因已通过大范围核酸酶诱导的同源重组而被靶向。
相反,G418R-GCVS-PCR-克隆未显示出指示靶向事件的任何特异性条带。虽然特异性条带是用新霉素探针得到的,但是其大小与预期的大小不匹配。这些克隆来自宿主基因组中整合基质的随机整合。使用反选择标记(例如,HSV TK)及其GCV活性前药使得能够消除此类不期望的事件。
此外,G418R-GCVS-PCR+克隆表现出略不同于G418R-GCVR-PCR+阳性克隆的遗传模式。事实上,G418R-GCVS-PCR+阳性克隆表现出与图E中描述的多拷贝靶向整合相容的模式。所述多拷贝靶向整合涉及HSVTK基因(来自整合基质的质粒DNA骨架)的整合,并因此使细胞对GCV敏感。
本实施例中呈现的所有数据证明,将定制大范围核酸酶诱导的基因靶向技术与稳健的选择过程相结合可导致对靶向事件的有效鉴定。此类靶向事件可以是单拷贝或多拷贝靶向整合,其可通过已开发的稳健的反选择过程进行区别。在一种类似的方法中,这种反选择过程还允许排除在其染色体中具有随机相关整合的细胞克隆。
实施例4:GOI表达和稳定性
4.1萤光素酶表达
在本实施例中,本发明的发明人监测了四个表达萤光素酶基因的目标克隆的表达水平。将萤火虫萤光素酶报告基因(SEQ ID NO 40)克隆到pIM-RAG1-MCS(SEQ ID NO 45)中。将所得载体(pIM-RAG1-Luc,SEQID NO 46)根据实施例3中描述的方案转染到HEK293细胞中。对实施例3中描述的选择和反选择过程中存活的目标细胞克隆进行分离并且根据章节§3.7和§3.8对其进行表征。
将4个HEK293萤光素酶目标克隆在培养基中维持20代(每周两代)的时间。每个克隆均在存在选择药物(G418:0.4mg/ml)的情况下培养。此外,在对应于20代的时间内,本发明的发明人对不含选择药物(即,在完全DMEM培养基中)的相同克隆的报告基因表达进行了评价。
材料和方法
萤光素酶表达:将来自目标克隆的细胞在PBS中洗涤两次,然后与5ml的胰蛋白酶-EDTA溶液一起孵育。在37℃下孵育5分钟后,将细胞收集在15ml锥形管中并对其进行计数。
然后将细胞以50,000个细胞/ml的密度重悬于完全DMEM培养基中。以100μl(5,000个细胞)分装至白色96孔板(Perkin-Elmer)中,一式三份。每孔中添加100μl One-Glo试剂(Promega),在短时间孵育后可以在微孔板光度计(Viktor,Perkin-Elmer)上对板进行读数。
结果
数据呈现在图10中。在图A和图B中,在存在或不存在选择剂的情况下,分别作为时间的函数而示出4个萤光素酶目标克隆的萤光素酶表达之平均水平。这些数据表明,即使在长时间培养之后,萤光素酶报告基因的表达也非常稳定。此外,选择剂的存在对于确保持久表达转基因来说不是必需的,因为在无选择剂的情况下培养目标克隆时报告基因表达的稳定性不变。
4.2GFP表达和稳定性
在本实施例中,本发明的发明人监测了表达来自大型多管水母(Aequorea macrodactyla)的绿色荧光蛋白基因(TagGFP2 Evrogen SEQID NO 49)的目标克隆的表达水平。将TagGFP2报告基因(SEQ ID NO49)克隆到pIM-RAG1-MCS(SEQ ID NO 45)、pIM.RAG1.EFIa.MCS(SEQ ID NO 50)和pIM.RAG1.GAS5.MCS(SEQ ID NO 51)中。将所得载体(pIM-RAG1-TagGFP2,SEQ ID NO 52;pIM.RAG.EF1a.TagGFP2,SEQ ID NO 53和pIM.RAG1.GAS5.TagGFP2,SEQ ID NO 54)根据实施例3.1中描述的方案转染到HEK293细胞中。对实施例3中描述的选择和反选择过程中存活的目标细胞克隆进行分离并且根据章节§3.7和§3.8对其进行表征。
将来自3种构建体的每一种中的一个HEK293 TagGFP2目标克隆在培养物中维持20代的时间(每周两代)。将每个克隆在不存在选择药物(G418)的情况下进行培养,因为已表明选择压力对于维持表达来说不是必须的(参见§4.1)。
材料和方法
Tag2GFP表达:将来自目标克隆的细胞在PBS中洗涤两次,然后与5ml胰蛋白酶-EDTA溶液一起孵育。在37℃下孵育5分钟后,将细胞收集在15ml锥形管中并对其进行计数。
然后将细胞以50,000个细胞/ml的密度重悬于完全DMEM培养基中。然后使用MACSQuant装置(Miltenyi Biotec)通过流式细胞术对细胞样品进行分析。使用绿色通道收集荧光并且表示为平均荧光单元。
结果
数据呈现在图11中。作为时间的函数示出3种不同TagGFP2目标克隆的TagGFP表达之平均荧光水平。这些数据表明即使不存在选择剂,即使在长时间培养(10周)之后,TagGFP2报告基因在3种不同启动子控制下的表达非常稳定。
根据启动子序列,荧光的平均水平是可变的。EF1a启动子给出最强的TagGFP2表达,而GAS5启动子给出较弱表达。结果表明,TagGFP2表达可通过使用不同启动子进行调节。
4.3融合蛋白表达
实施例5:通过靶向整合使基因失活(敲除)
在本实施例中,本发明的发明人表明,RAG1基因座被连续hs RAG1大范围核酸酶驱动的以下整合基质的靶向整合所破坏:i)具有新霉素抗性基因的RAG1整合基质(pIM-RAG1-Luc,SEQ ID NO 46),和ii)具有潮霉素抗性基因的RAG1整合基质(pIM-RAG1-Hygro,SEQ ID NO 55)。
材料和方法
根据章节§3.3中描述的方案对HCT 116细胞进行了转染。通过章节§3.8中描述的PCR对NeoR-GCVR抗性克隆进行了筛选。通过Southern印迹(参见章节§3.9)对NeoR-GCVR-PCR+克隆进行分析。在RAG1等位基因之一上经鉴定的目标克隆当中,已选择了一个克隆(D12)并对其进行了扩增。除了使用具有潮霉素抗性基因的RAG1整合基质(SEQ ID NO55)之外,在章节§3.3中描述的克隆上进行了第二靶向实验。从而基于潮霉素(0.6mg/ml)而不是新霉素来选择克隆。通过PCR已对HygroR克隆进行了筛选并且通过章节§3.8和§3.9中描述的Southern印迹已对PCR阳性克隆进行了分析。
结果
图12的左图呈现出第一靶向实验后得到的neoR-GCVR-PCR+克隆的杂交模式。HindIII酶切消化基因组DNA后,用基因组探针进行杂交(参见图9)。如对照泳道(HCT 116)所示,未被靶向的RAG1基因座由5.2kb的条带鉴定。除第二条带(9.6kb)之外,所述5.2kb条带存在于所有的目标克隆中,这表明RAG1基因的一个等位基因是被靶向的(T)而另一等位基因为野生型(WT)。这些克隆之一(克隆D12,用黑星标记)已被用于第二实验,目的是靶向第二RAG1等位基因。图12的右图中示出杂交模式。同样,HindIII酶切消化基因组DNA后,用基因组探针进行杂交(参见图9)。在所有的目标克隆中不再能观察到5.2kb的WT条带。反而在所有的克隆(除了两个)中观察到针对整合基质中存在的异源序列靶向整合有特异性的9.6kb的独特条带。这些结果证明,两种RAG1等位基因都已被破坏,从而引起RAG1基因完全失活。这种用于基因失活的顺序方法可以应用于使用其他大范围核酸酶的其他基因座中。
参考文献
Capecchi(2001)Generating mice with targeted mutations.Nat Med,7,1086-90.Chevalier and Stoddard(2001)Homing endonucleases:structural and functionalinsight into the catalysts ofintron/intein mobility.Nucleic Acids Res,29,3757-74.Choulika,Perrin,Dujon and Nicolas(1995)Induction of homologous recombinationin mammalian chromosomes by using the I-SceI system of Saccharomyces cerevisiae.Mol Cell Biol,15,1968-73.
Christian,Cermak,Doyle,Schmidt,Zhang,Hummel,Bogdanove and Voytas(2010)Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases.Genetics 186:757-761.
Cohen-Tannoudji,Robine,Choulika,Pnto,El Marjou,Babinet,Louvard and Jaisser(1998)I-SceI-induced gene replacement at a natural locus in embryonic stem cells.Mol Cell Biol,18,1444-8.
Donoho,Jasin and Berg(1998)Analysis of gene targeting and intrachromosomalhomologous recombination stimulated by genomic double-strand breaks in mouseembryonic stem cells.Mol Cell Biol,18,4070-8.
Dujon,Colleaux,Jacquier,Michel and Monteilhet(1986)Mitochondrial introns asmobile genetic elements:the role of intron-encoded proteins.Basic Life Sci,40,5-27.Gouble,Smith,Bruneau,Perez,Guyot,Cabaniols,Leduc,Fiette,Ave,Micheau,Duchateau and Paques(2006)Efficient in toto targeted recombination in mouse liverby meganuclease-induced double-strand break.J Gene Med,8,616-22.
Haber(1995)In vivo biochemistry:physical monitoring of recombination induced bysite-specific endonucleases.Bioessays,17,609-20.
Hinnen,Hicks and Fink(1978)Transformation of yeast.Proc Natl Acad Sci USA,75,1929-33.
Dong-Il Jin,Seung-Hyeon Lee,Jin-Hee Choi,Jae-Seon Lee,Jong-Eun Lee,Kwang-Wook Park and Jeong-Sun Seo(2006)Targeting efficiency of alpha-1,3-galactosyltransferasegene in pig fetal firoblast cells EMM 35(6),2003;572
Kim,Cha,Chandrasegaran(1996).Hybrid restriction enzymes:zinc finger fusions toFok I cleavage domain.Proc Natl Acad Sci USA 93(3):1156-60.
Khanahmad,Noori Daloii,Shokrgozar,Azadmanesh,Niavarani,Karimi,Rabbani,Khalili,Bagheri,Maryami,Zeinali(2006)A novel single step double positive doublenegative selection strategy for β-globin gene replacementBiochemical and Biophysical Research Communications no.1,14-20.
Perez C,Guyot V,Cabaniols J,Gouble A,Micheaux B,Smith J,Leduc S,Paques F,Duchateau P,(2005)BioTechniques vol.39,n°1,pp.109-115
Posfai,Kolisnychenko,Bereczki and Blattner(1999)Markerless gene replacement inEscherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome.NucleicAcids Res,27,4409-15.
Puchta,Dujon and Hohn(1996)Two different but related mechanisms are used inplants for the repair of genomic double-strand breaks by homologous recombination.Proc Natl Acad Sci USA,93,5055-60.
Rothstein(1983)One-step gene disruption in yeast.Methods Enzymol,101,202-11.
Rouet,Smih and Jasin(1994)Introduction of double-strand breaks into the genome ofmouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.Mol Cell Biol,14,8096-106.
Sargent,R.G.,Brenneman,M.A.,and Wilson,J.H.(1997)Repair of site-specificdouble-strand breaks in a mammalian chromosome by homologous and illegitimaterecombination.Mol Cell Biol,17,267-77.
Siebert and Puchta(2002)Efficient Repair of Genomic Double-Strand Breaks byHomologous Recombination between Directly Repeated Sequences in the PlantGenome.Plant Cell,14,1121-31.
Smithies(2001)Forty years with homologous recombination.Nat Med,7,1083-6.Thomas and Capecchi(1987)Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouseembryo-derived stem cells.Cell,51,503-12.
Claims (15)
1.一组遗传构建体,其包含:
a)构建体(i),其由至少包含以下组分的核酸分子所编码:
(N)n-HOMO1-P-M-HOMO2-(N)m(i)
其中,n和m为整数并且代表0或1,前提是当n=1时m=0而当n=0时m=1;因此组分N可被设置在HOMO1之前或HOMO2之后,并且组分P和M可按顺序P-M或M-P设置;
其中N包含组分(PROM1)-(NEG)-(TERM1);P包含组分(PROM2)-(POS)-(TERM2);并且M包含组分(PROM3)-(MCS)-(TERM3);以及
其中PROM1为第一转录启动序列;NEG为阴性选择标记;TERM1为第一转录终止序列;HOMO1为与核酸酶DNA靶序列之前的基因组部分同源的部分;PROM2为第二转录启动序列;POS为阳性选择标记;TERM2为第二转录终止序列;PROM3为第三转录启动序列;MCS为多克隆位点;TERM3为第三转录终止序列;HOMO2为与所述核酸酶DNA靶序列之后的基因组部分同源的部分;
b)至少一种选自包括构建体(ii)或(iii)在内的组的构建体,所述构建体(ii)或(iii)由至少包含以下组分的核酸分子所编码:
PROM4-NUC1(ii);
NUC2(iii);或
所述组还包含序列(iv),其为至少包含以下组分的分离或重组蛋白质:
NUC3(iv);
其中PROM4为第四转录启动序列;NUC1为大范围核酸酶、TALEN或ZFN的开放读码框(ORF);MEGA2为所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的信使RNA(mRNA)形式;MEGA3为所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN的分离或重组蛋白质;其中来自构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)的所述大范围核酸酶、所述TALEN或所述ZFN识别并切割所述核酸酶DNA靶序列;并且其中构建体(ii)或(iii)或者序列(iv)被设置成与构建体(i)共转染到至少一种靶细胞中。
2.权利要求1的构建体组,其中来自构建体(i)的所述组分HOMO1和HOMO2包含与所述核酸酶DNA靶序列侧翼的靶细胞基因组部分具有同源性的至少200bp并且不多于6000bp的序列。
3.权利要求1或2的构建体组,其中来自构建体(i)的所述组分HOMO1和HOMO2包含与所述核酸酶DNA靶序列侧翼的靶细胞基因组部分具有同源性的至少1000bp并且不多于2000bp的序列。
4.权利要求1、2或3的构建体组,其中所述组分(POS)选自:新霉素磷酸转移酶抗性基因nptl(SEQ ID NO 3)、潮霉素磷酸转移酶抗性基因hph(SEQ ID NO 4)、嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因pac(SEQ ID NO5)、杀稻瘟素S脱氨酶抗性基因bsr(SEQ ID NO 6)、博来霉素抗性基因sh ble(SEQ ID NO 7)。
5.权利要求1至4中任一项的构建体组,其中所述组分(NEG)选自:缺失CpG岛的单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因HSV TK DelCpG(SEQID NO 8)、与缺失CpG岛的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因偶联的胞嘧啶脱氨酶CD:UPRT DelCpG(SEQ ID NO 9)。
6.权利要求1至5中任一项的构建体组,其中所述元件PROM1、PROM2、PROM3和PROM4选自:巨细胞病毒的立即早期启动子pCMV(SEQ ID NO 10);猿病毒40启动子pSV40(SEQ ID NO 11);人延伸因子1α启动子phEF1α(SEQ ID NO 12);人磷酸甘油酸激酶启动子phPGK(SEQ ID NO 13);小鼠磷酸甘油酸激酶启动子pmPGK(SEQ IDNO 14);人多聚泛素启动子phUbc(SEQ ID NO 15);来自人单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子pHSV-TK(SEQ ID NO 16);人生长抑制特异性5启动子phGAS5(SEQ ID NO 17);四环素响应元件pTRE(SEQ ID NO18);来自脑心肌炎病毒的内部核糖体进入位点(IRES)序列IRES EMCV(SEQ ID NO 19);来自口蹄疫病毒的IRES序列IRES FMDV(SEQ IDNO 20),SV40。
7.权利要求1至6中任一项的构建体组,其中所述元件TERM1、TERM2、TERM3和TERM4选自:聚腺苷化信号SV40pA(SEQ ID NO21)、牛生长激素聚腺苷化信号BGH pA(SEQ ID NO 22)。
8.权利要求1至7中任一项的构建体组,其中所述元件MCS在其5’端或3’端包含框内肽标签,其中所述肽标签选自:FLAG(SEQ ID NO 23)、FLASH/REASH(SEQ ID NO 24)、IQ(SEQ ID NO 25)、组氨酸(SEQID NO 26)、STREP(SEQ ID NO 27)、链霉亲和素结合蛋白SBP(SEQID NO 28)、钙调素结合蛋白CBP(SEQ ID NO 29)、血凝素HA(SEQ IDNO 30)、c-myc(SEQ ID NO 31)、V5标签序列(SEQ ID NO 32)、来自核质蛋白的核定位信号(NLS)(SEQ ID NO 33)、来自SV40的NLS(SEQID NO 34)、NLS共有序列(SEQ ID NO 35)、凝血酶切割位点(SEQ IDNO 36)、P2A切割位点(SEQ ID NO 37)、T2A切割位点(SEQ ID NO 38)、E2A切割位点(SEQ ID NO 39)。
9.权利要求1至8中任一项的构建体组,其中所述元件MCS包含报告基因,所述报告基因选自:萤火虫萤光素酶基因(SEQ ID NO 40)、海肾萤光素酶基因(SEQ ID NO 41)、β-半乳糖苷酶酶基因LacZ(SEQ IDNO 42)、人分泌型碱性磷酸酶基因hSEAP(SEQ ID NO 43)、鼠分泌型碱性磷酸酶基因mSEAP(SEQ ID NO 44)。
10.权利要求1至9中任一项的遗传构建体组,其中构建体(i)包含SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:46。
11.一种将编码GOI的序列引入至少一种细胞中的试剂盒,其包含根据权利要求1至10中任一项的遗传构建体组;以及使用所述遗传构建体组产生转化细胞的说明。
12.权利要求11的试剂盒,其还至少包含一种靶细胞,所述靶细胞选自:CHO-K1细胞、HEK293细胞、Caco2细胞、U2-OS细胞、NIH 3T3细胞、NSO细胞、SP2细胞、CHO-S细胞、DG44细胞。
13.一种通过同源重组转化至少一种细胞的方法,其包括以下步骤:
a)将编码目的基因的序列克隆到权利要求1至9中任一项的构建体(i)的位置MCS中;
b)用步骤b)中的所述构建体(i)与权利要求1至9中任一项的构建体(ii)、(iii)或序列(iv)中至少一种共转染靶细胞;
c)基于以下条件从所述靶细胞中选择至少一种细胞:存在组分(POS)以及不存在组分(NEG)。
14.权利要求13的方法,其中根据(POS)和(NEG)编码的基因产物的活性依次进行步骤c)中的选择。
15.权利要求13的方法,其中根据(POS)和(NEG)编码的基因产物的活性同时进行步骤c)中的选择。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104497146A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-04-08 | 广州古藤兰生物科技有限公司 | 一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用 |
CN105142396A (zh) * | 2013-01-14 | 2015-12-09 | 重组股份有限公司 | 缺角家畜 |
CN106554943A (zh) * | 2015-09-30 | 2017-04-05 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种重组过表达Creb3L1基因的CHO细胞株CHO-Creb3L1 |
CN106715694A (zh) * | 2014-06-23 | 2017-05-24 | 瑞泽恩制药公司 | 核酸酶介导的dna组装 |
CN108026542A (zh) * | 2015-07-20 | 2018-05-11 | 蒂宾根大学医学院 | 重组Orf病毒载体 |
CN112301024A (zh) * | 2013-03-15 | 2021-02-02 | 通用医疗公司 | 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性 |
US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103468801A (zh) * | 2013-08-27 | 2013-12-25 | 武汉大学 | 一种转录激活子样效应因子核酸酶的内源活性检测方法 |
SG11201601263WA (en) * | 2013-09-12 | 2016-03-30 | Lanzatech New Zealand Ltd | Recombinant microorganisms and methods of use thereof |
DK3122870T3 (da) * | 2014-03-25 | 2022-09-12 | Ginkgo Bioworks Inc | Fremgangsmåder og genetiske systemer til celleteknik |
US10233454B2 (en) | 2014-04-09 | 2019-03-19 | Dna2.0, Inc. | DNA vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification |
US10500290B2 (en) * | 2014-08-22 | 2019-12-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Peptide reagents and methods for detection and targeting of dysplasia, early cancer and cancer |
EP3359671B1 (en) * | 2015-10-08 | 2021-08-18 | Dna Twopointo Inc. | Dna vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification |
CN110199020A (zh) * | 2016-11-03 | 2019-09-03 | 坦普尔大学-高等教育联盟 | 用于快速产生用于细胞系开发的同源重组载体的dna质粒 |
CN111235183B (zh) * | 2020-01-13 | 2021-07-27 | 东南大学 | 一种talen表达载体及其快速制备方法及靶基因和细胞双标记系统和应用 |
WO2022173636A1 (en) * | 2021-02-12 | 2022-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for molecular cloning |
WO2023081756A1 (en) | 2021-11-03 | 2023-05-11 | The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone | Precise genome editing using retrons |
WO2023141602A2 (en) | 2022-01-21 | 2023-07-27 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Engineered retrons and methods of use |
WO2024044723A1 (en) | 2022-08-25 | 2024-02-29 | Renagade Therapeutics Management Inc. | Engineered retrons and methods of use |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1500141A (zh) * | 2001-12-04 | 2004-05-26 | �Ϻ���ͨ��ѧ | 基因靶向方法和载体 |
EP2105505A1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-09-30 | Celonic AG | Methods and materials for the reproducible generation of high producer cell lines for recombinant proteins |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5464764A (en) * | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
JP2005520519A (ja) | 2002-03-15 | 2005-07-14 | セレクティス | ハイブリッドおよび単鎖メガヌクレアーゼならびにその使用 |
WO2004031346A2 (en) | 2002-09-06 | 2004-04-15 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins |
US20060206949A1 (en) | 2003-01-28 | 2006-09-14 | Sylvain Arnould | Custom-made meganuclease and use thereof |
WO2007034262A1 (en) | 2005-09-19 | 2007-03-29 | Cellectis | Heterodimeric meganucleases and use thereof |
US20110158974A1 (en) | 2005-03-15 | 2011-06-30 | Cellectis | Heterodimeric Meganucleases and Use Thereof |
WO2006097784A1 (en) | 2005-03-15 | 2006-09-21 | Cellectis | I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof |
WO2007049095A1 (en) | 2005-10-25 | 2007-05-03 | Cellectis | Laglidadg homing endonuclease variants having mutations in two functional subdomains and use thereof |
WO2007060495A1 (en) | 2005-10-25 | 2007-05-31 | Cellectis | I-crei homing endonuclease variants having novel cleavage specificity and use thereof |
BRPI0718747A2 (pt) | 2006-11-14 | 2013-12-03 | Cellectis | Variantes meganuclease que clavam uma ou sequência alvo de dna a partir do gene hprt e usos das mesmas. |
EP2180058A1 (en) * | 2008-10-23 | 2010-04-28 | Cellectis | Meganuclease recombination system |
-
2010
- 2010-02-18 WO PCT/IB2010/000546 patent/WO2011101696A1/en active Application Filing
-
2011
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1500141A (zh) * | 2001-12-04 | 2004-05-26 | �Ϻ���ͨ��ѧ | 基因靶向方法和载体 |
EP2105505A1 (en) * | 2008-03-28 | 2009-09-30 | Celonic AG | Methods and materials for the reproducible generation of high producer cell lines for recombinant proteins |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
DONG-IL JIN ET AL: "Targeting efficiency of α-1,3-galactosyl transferase gene in pig fetal fibroblast cells", 《EXPERIMENTAL AND MOLECULAR MEDICINE》 * |
H. KHANAHMAD ET AL: "A novel single step double positive double negative selection strategy for b-globin gene replacement", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 * |
JEAN-PIERRE CABANIOLS ET AL: "Targeted gene modifications in drug discovery and development", 《CURRENT OPINION IN PHARMACOLOGY》 * |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
CN105142396A (zh) * | 2013-01-14 | 2015-12-09 | 重组股份有限公司 | 缺角家畜 |
CN112301024A (zh) * | 2013-03-15 | 2021-02-02 | 通用医疗公司 | 使用RNA引导的FokI核酸酶(RFN)提高RNA引导的基因组编辑的特异性 |
CN106715694A (zh) * | 2014-06-23 | 2017-05-24 | 瑞泽恩制药公司 | 核酸酶介导的dna组装 |
CN104497146A (zh) * | 2014-12-01 | 2015-04-08 | 广州古藤兰生物科技有限公司 | 一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用 |
CN104497146B (zh) * | 2014-12-01 | 2018-03-06 | 广州古藤兰生物科技有限公司 | 一种融合蛋白及其载体的构建方法和应用 |
CN108026542A (zh) * | 2015-07-20 | 2018-05-11 | 蒂宾根大学医学院 | 重组Orf病毒载体 |
US11286500B2 (en) | 2015-07-20 | 2022-03-29 | Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät | Recombinant Orf virus vector |
CN108026542B (zh) * | 2015-07-20 | 2022-12-09 | 蒂宾根大学医学院 | 重组Orf病毒载体 |
CN106554943A (zh) * | 2015-09-30 | 2017-04-05 | 北京吉尚立德生物科技有限公司 | 一种重组过表达Creb3L1基因的CHO细胞株CHO-Creb3L1 |
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