CN111235183B

CN111235183B - 一种talen表达载体及其快速制备方法及靶基因和细胞双标记系统和应用

Info

Publication number: CN111235183B
Application number: CN202010035004.9A
Authority: CN
Inventors: 王进科; 张书衍
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2040-01-13
Also published as: CN111235183A

Abstract

本发明公开了一种TALEN表达载体及其快速制备方法及靶基因和细胞双标记系统和应用。本发明可在一天内制备出结合任何18bp靶点的TALEN表达载体比CRISPR更快。本发明由一组线性单体、TALEN骨架质粒，并采用全新流程来组装TALEN。本发明可轻松高效地获得即用型TALEN，通过制备五对TALEN并在三种不同细胞系中编辑NF‑κB家族基因，证明了本发明制备的TALEN表达载体具有高效性、可重复行、可靠性及适用性。本发明的TALEN具有比CRISPR更高的编辑效率。此外，本发明还公开了一种通过同源定向修复对目标蛋白质和细胞同步标记的双标记系统，在基因编辑及生物技术领域具有广泛应用价值。

Description

一种TALEN表达载体及其快速制备方法及靶基因和细胞双标记系统和应用

技术领域

本发明涉及基因编辑生物技术领域，具体涉及一种TALEN表达载体快速制备技术及靶基因和细胞双标记系统及其应用。

背景技术

转录激活因子样效应物(TALE)是从细菌中发现的天然转录激活因子，该因子具有一个可编程的DNA结合结构域(DBD)，该结构域由34个氨基酸序列 (单体)的串联重复序列以及重复可变双残基(RVD)组成。通过与核酸酶FokI 的融合，TALE可形成基因编辑工具TALEN(即TALE-FokI)。TALEN是众所周知的第二代基因编辑工具，被广泛用于编辑基因。由于其高靶向性，TALEN已被用于制备通用嵌合抗原受体T细胞(UCAR-T)，用于临床癌症免疫治疗。然而，随着CRISPR在2013年的诞生，由于CRISPR的简单性，TALEN被CRISPR 完全取代。TALEN的致命弱点是其质粒载体构建过程耗时(5天)、劳动密集且效率低下。尽管已开发出一些方法来克服这一关键缺点，但它们仍然不能使 TALEN像CRISPR一样简单而被广泛使用。因此，目前仍然非常需要像CRISPR 一样容易的TALEN制备新方法。

申请人曾经尝试使用被广泛应用的TALE组装试剂盒“Golden Gate TALEN andTAL Effector Kit 2.0(Addgene)”(简称Addgene试剂盒2.0)来构建TALE。使用该试剂盒材料及组装方案，制备一种TALE质粒需5天时间。然而，发现即使花费5天时间完成该方案，也很难获得可用的TALE质粒。因此，为了提供一种与CRISPR一样方便的TALE制备方案，申请人决定改进TALE组装试剂盒和构建流程。通过制备一组新的线性单体(linear monomer)和一个TALE-VP64/VPR 骨架载体，以及设计一个新的组装流程，申请人开发了一种新的便捷高效的TALE 制备方案(发明专利申请号：201810723261.4)(Molecular Therapy：Methods&Clinical Development，2019；13：310-320)。使用该方案，可以很容易地在两天内高效制备靶向不同DNA序列的TALE-VP64/VPR表达载体，用于转染细胞，激活各种外源和内源基因(Molecular Therapy：Methods&Clinical Development， 2019；13：310-320)。因此，这种TALE-VP64/VPR制备方案为当前各种基于 CRISPR/Cas9-sgRNA的基因激活提供了新的适用性可选方案。

尽管CRISPR是当前广泛使用的基因编辑工具，但其高脱靶性仍制约其临床应用。相比之下，脱靶效应对TALEN来说似乎不是问题。通常，TALEN由18 个重复的34个氨基酸序列组成。一对TALEN必须在靶位点的相对两侧结合，并用14～20个核苷酸的“间隔”隔开。这种补偿设计(offset design)是必需的，因为FokI需要进行二聚化才能实现其活性。因此，除了靶点，可以预期在基因组中很少再能发现这种很长的(约36bp)的DNA结合位点，即脱靶位点。虽然 RVD-DNA结合密码有一些简并性，但在TALEN中几乎没有证据表明错配耐受性或脱靶活性。例如，一项先前的研究表明，人类iPS细胞可被高活性TALEN 编辑，但在与靶位点同源的其他基因组位点未检测到突变活性(PNAS,2014； 111：9253-9258)。由于其相对不受限制的靶位点要求和高度的特异性，TALEN 在临床应用中具有超过CRISPR/Cas9的显著优势，因此TALEN仍然是基因编辑中一个更有价值的选择。

发明内容

发明目的：针对现有基因编辑技术及其所编辑基因及细胞检测分离存在的问题，本发明提供一种TALEN表达载体及其快速制备方法及靶基因和细胞双标记系统。本发明不仅提出了一种TALEN表达载体，而且可高效快速制备TALEN 表达载体，并且通过在HDR中运用双标记系统，可对靶基因及其成功编辑的细胞进行SBP或AviTag的同步标记，为评价编辑效率、分离成功编辑的细胞、靶蛋白及其复合物提供了简单易行而可靠的新方法。

本发明还提供了该种快速制备的TALEN表达载体及靶基因和细胞双标记系统的应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种TALEN表达载体，主要由一组线性单体、一种TALEN骨架质粒组成，所述一组线性单体包括60个碱基决定单体和2个连接单体；所述TALEN骨架质粒由强启动子CMV、TALE-N 端序列、LacZ序列、TALE-C端序列及核酸酶FokI序列构成。

其中，所述线性TALEN单体由“Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0(Addgene)试剂盒中的质粒单体作为模板，使用表1和表2中列出的引物和寡核苷酸，通过PCR扩增制备，方法同申请人的在先专利或文献(发明专利申请号：201810723261.4；Generate TALE/TALEN as Easily and Rapidly as Generating CRISPR MolecularTherapy:Methods&Clinical Development 2019，13：310-320)。所述线性单体包括60个碱基决定单体和2个连接单体在96孔板上的分布及其与碱基对应关系如图6所示。

其中，所述线性单体可通过通用引物进行高保真PCR扩增再生产；所述LacZ 序列可被TALE-DNA结合序列替代并可用蓝白斑筛选阳性克隆。

作为优选，所述引物为一对通用引物，序列分别为：

5′-TATCATCATGCCTCCTCTAGAG-3′；

5′-TTGGTCATGGGTGGCTCGAGG-3′。

所述TALEN骨架质粒的功能元件的结构布局及其DNA序列如图1所示。

本发明所述的TALEN表达载体的快速制备方法，包括如下步骤：

(1)四个环状五聚体制备

构建靶向某一18bp靶点5′-N1～N18-3′的TALEN表达载体(N表示核苷酸nucleotide；1～18表示靶点内的核苷酸位置)，先建立N1～N5、N6～N10、 dsDNA10.5-N11～N14和N15～N17-dsDNA17.5-N18四个切割-连接反应；其中 N1～N18为碱基决定单体，dsDNA10.5与dsDNA17.5为连接单体(表2)；其中每个切割-连接反应主要包含BsaI、T4 DNA连接酶和五种单体，制备得到四个环状五聚体；

(2)最终TALEN表达质粒制备

建立一个新的切割-连接反应，该反应主要包含BsmBI、T4 DNA连接酶、 TALEN骨架质粒以及步骤(1)制备的四种环状五聚体，制备得到最终TALEN 表达质粒；

(3)细菌转化及质粒提取

将构建的最终TALEN表达质粒转化细菌，细菌经抗生素液体培养基培养后，提取质粒，得到可用于转染细胞的TALEN表达载体。

其中，步骤(1)和(2)中每个切割-连接反应的温控程序均为：2～5个循环：37℃3～10分钟和16℃5～15分钟；50℃2～10分钟；80℃2～10分钟。

作为优选，步骤(1)和(2)中每个切割-连接反应的温控程序均为：3个循环：37℃5分钟和16℃10分钟；50℃ 5分钟；80℃ 5分钟。

作为优选，步骤(1)中每个切割-连接反应结束后，向其中添加质粒安全核酸酶和ATP，在37℃及70℃下依次下孵育10-20分钟，优选15分钟，消除线性 DNA片段。

进一步地，所述细菌转化及质粒提取，其方法为：将构建的最终TALEN表达质粒转化细菌，细菌经抗生素液体培养基培养数小时后，提取质粒；作为优选，细菌为大肠杆菌DH5α；其中抗生素为卡那霉素或新霉素；作为优选，培养基为LB液体培养基；作为优选，培养时间为4小时。

基于本发明所述的TALEN表达载体的靶基因和细胞双标记系统，所述靶基因和细胞双标记系统为TALEN或CRISPR编辑细胞产生双链断裂后，可用于同源指导修复(HDR)的两种线性供体：SBP-IRES2-displaySBP和 AviTag-IRES2-displayAviTag。

其中，所述SBP-IRES2-displaySBP和AviTag-IRES2-displayAviTag，其中SBP 为链亲和素结合肽，AviTag为生物素酶靶点；其中SBP或AviTag可用于标记靶基因，displaySBP与displayAviTag可用于标记细胞；其中SBP或AviTag标记靶基因后，靶基因所表达的蛋白其羧基末端则带有SBP或AviTag标签；其中SBP 或AviTag标签可用于靶蛋白及细胞的检测、富集、分离。

作为优选，SBP-IRES2-displa ySBP和AviTag-IRES2-displayAviTag的元件布局及DNA序列分别如图3和图4所示。

其中，所述两种线性供体用于指导目标DNA修复时，可针对该目标DNA设计一对引物PCR，其5′端为35nt的靶DNA配对序列，其3′端分别为23nt的GS-linker配对序列及24nt的SBP或AviTag配对序列；所述引物可用于PCR扩增SBP-IRES2-displaySBP或AviTag-IRES2-displayAviTag模板，制备用于指导目标DNA修复的线性供体。

作为优选，上述PCR引物序列为：5′-35nt靶基因退火序列-GGA GGA GGT TCC GGTGGA GGT GG-3′、5′-35nt靶基因退火序列-CTA ACG TGG CTT CTT CTG CCA AAG-3′或5′-35nt靶基因退火序列-TTA AAG GGC AAG GAG TGT GGC ACC-3′；其中5′-35nt靶基因退火序列-GGA GGA GGT TCC GGT GGA GGT GG-3′与5′-35nt靶基因退火序列-CTA ACG TGG CTTCTT CTG CCA AAG-3′配对，可用于扩增模板AviTag-IRES2-displayAviTag；而5′-35nt靶基因退火序列 -GGA GGA GGT TCC GGT GGA GGT GG-3′与5′-35nt靶基因退火序列-TTA AAGGGC AAG GAG TGT GGC ACC-3′可用于扩增模板SBP-IRES2-displaySBP；进一步地，作为实例，用于扩增靶向NF-κB家族5个基因RELA、RELB、CREL、 NF-κB1及NF-κB2的HDR供体的上述PCR引物序列如表3所示。

作为优选，靶蛋白及细胞的检测采用荧光素标记的链霉亲和素染色，如使用Alexa

488-链霉亲和素、

800CW-链霉亲和素等染色；更进一步地，对细胞检测进行检测时，荧光素标记的链霉亲和素可直接加入细胞培养液进行染色；更进一步地，对靶蛋白为核蛋白时，其检测时可对细胞核进行荧光素标记的链霉亲和素的免疫组化染色；更进一步地，染色后的细胞及细胞核可用荧光显微镜拍照及流式细胞仪定量分析。

作为优选，靶蛋白及细胞的富集、分离可用链霉亲和素偶联的磁珠；作为优选，链霉亲和素偶联的磁珠可直接加入细胞培养液进行细胞结合；更进一步地，链霉亲和素偶联的磁珠结合的细胞，可用磁分离法收集；作为优选，细胞裂解物物中的靶蛋白可用链霉亲和素偶联的磁珠结合，并可用磁分离法收集。

本发明所述的TALEN表达载体和所述的靶基因和细胞双标记系统在基因编辑领域中的应用。

其中，所述TALEN表达载体为可结合任何18bp靶点的TALEN表达载体；并且可在一天内制备出结合任何18bp靶点的TALEN表达载体，比CRISPR更快捷。

为了与TALEN编辑进行比较，本发明还构建了一种使用便利的 CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体(psgRNA-Cas9)，该载体用于构建靶向特定DNA 的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体时，可用切割-连接反应及蓝白斑进行载体快速构建及筛选；作为优选，psgRNA-Cas9的元件布局及DNA序列如图2所示。

进一步地，构建靶向特定DNA的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体时，其切割 -连接反应主要包含BbsI、T4 DNA连接酶、psgRNA-Cas9骨架质粒以及一种退火制备的形成sgRNA靶点的双链寡核苷酸(如表6中序列互补的成对寡核苷酸退火形成的双链寡核苷酸)；其中切割-连接反应的温控程序为：7℃ 5分钟和16℃ 10分钟中孵育10个循环，酶在50℃ 5分钟和80℃ 5分钟灭活。

由于TALE技术的最广泛应用是将TALEN作为基因编辑工具，因此在本发明中，基于申请人在先开发的TALE组装试剂盒和流程(发明专利申请号： 201810723261.4)，本发明中构建了TALE-FokI(TALEN)骨架质粒，并进一步简化了TALEN组装流程。因此，本发明开发了一种比CRISPR更容易的新型高效TALEN制备方法及其组装材料。使用这种新的TALEN制备方法及其组装材料，在一天之内可轻松高效地制备任何定制的TALEN表达载体。运用此方法，本发明通过制备了针对NF-κB家族五个基因的五对TALEN载体，并在三种类型的人细胞系中编辑了这些基因，证明了所构建的TALEN可比CRISPR更有效地编辑各种细胞中的所有基因，表明所制备的TALEN具有比CRISPR更高的编辑效率，证明了该技术具有高效性、可重复行、可靠性及适用性。此外，在本发明中，开发了一种双重标记系统，是一种通过同源定向修复对目标蛋白质和细胞同步标记的双标记系统，通过同源直接修复(HDR)，可用链霉亲和素结合肽(SBP) 或AviTag同时标记目标蛋白和成功编辑的细胞，这种新的HDR双标签供体，在蛋白质(抗原)制备、免疫沉淀和染色质免疫沉淀(ChIP)分析中具有广泛应用价值。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

在本发明中，通过在293T、HepG2和PANC1三种不同的细胞系中同时使用 TALEN和CRISPR/Cas9编辑了RELA基因，并在HepG2细胞中编辑了五个不同的基因，包括RELA、RELB、CREL、NF-κB1和NF-κB2。结果表明，TALEN 在所有编辑的细胞和基因中显示出比CRISPR高得多的编辑效率。这些结果表明，就编辑效率而言，TALEN是比CRISPR更好的基因编辑工具。然而，由于 CRISPR的简单性，TALEN被CRISPR迅速取代。TALEN的构建必须消除表达质粒构建的繁琐、耗时和低效率的过程。在本发明中，专注于解决问题，最终建立了新的TALEN制备方案，该方案由一组线性单体、最终的TALE-FokI(TALEN) 骨架质粒和为期一天的TALEN快速构建流程组成。使用一对通用引物，可以在 96孔板中通过高保真PCR扩增轻松复制该组线性单体。最重要的是，本发明发展的快速TALEN构建流程可以高效(超过80％)获得大量可用的阳性菌落，即高效制备大量最终的TALEN表达载体。

在本发明中，使用HDR双标签系统评估了两种编辑工具的编辑效率，其中，成功编辑的细胞可以通过展示在细胞表面的SBP或AviTag标签进行标记。因此，可以通过荧光链霉亲和素染色很容易地观察到成功编辑的细胞，并通过流式细胞术进行定量分析。此外，值得强调的是，本发明发现可以将荧光链霉亲和素(如

800CW-链霉亲和素和

488-链霉亲和素)直接添加到细胞培养基中以染色细胞。因此，可以轻松地对染色的细胞进行定量分析，并同时通过流式细胞仪进行阳性细胞的富集。

在本发明中，所有研究的基因都通过两个编辑工具(TALEN和 CRISPR/Cas9)，在所有检测到的细胞中成功编辑，TALEN显示的编辑效率比 CRISPR/Cas9高得多。

在本发明中，开发了双标签系统SBP-IRES2-displaySBP和 AviTag-IRES2-displayAviTag，其中将SBP/AviTag融合到目标基因的C末端以标记目标蛋白，并使用了displaySBP/displayAviTag在细胞表面展示SBP/AviTag以标记细胞。证明了两种HDR供体在研究的细胞中均有效。其中， SBP-IRES2-displaySBP更简洁有效。此外，使用AviTag-IRES2-displayAviTag时，还必须另外共转染表达生物素连接酶的质粒(pMy-BirA)。因此，更简洁的HDR 供体SBP-IRES2-displaySBP是未来应用的最理想的HDR供体。尽管如此，生物素和链霉亲和素之间的最高结合亲和力(Kd＝10^-14mol/L)也可能使 AviTag-IRES2-displayAviTag成为未来应用的不错的选择。在本发明中，为避免使用700～800nt的长同源臂载体构建，使用了较短的35nt的同源臂，这使得可通过简单的PCR扩增，更容易制备针对其他目的基因的HDR供体 SBP/AviTag-IRES2-displaySBP/AviTag。

目前，广泛使用的用于分离成功编辑的细胞的方法是药物筛选，这种方法非常耗时并且很难获得纯正的细胞克隆。由于长期的药物治疗，细胞生长也受到严重影响。本发明的双重标签系统提供了一种不使用药物的细胞筛选方法。本发明的研究表明，可以在不损害细胞活力的情况下从编辑的细胞群中快速分离出阳性细胞。简单的单轮磁分离将阳性细胞的百分比可提高到30％。

目标蛋白的纯化对生命科学的各个领域都很重要。纯化的蛋白质可用作抗原，以产生可以与天然状态或结构的蛋白质相互作用的抗体，例如ChIP级抗体。纯化的蛋白质对于通过X晶体学或低温电子显微镜分析其结构至关重要。但是，许多蛋白质没有其免疫沉淀(IP)级抗体。这些蛋白质必须通过构建在原核或真核细胞中表达的表达载体来生产，其中必须将诸如His的标签融合在N或C末端进行纯化。但是，原核细胞中表达的蛋白质可能会失去其天然修饰。在本发明的双标签系统中，将SBP标签融合到目标蛋白的C末端，其中使用了GS连接子。SBP标签是38个残基的肽，对链霉亲和素具有更高的结合亲和力。SBP标签可以以高结合亲和力(Kd＝10^-10mol/L)与链霉亲和素相互作用，高于大多数抗体的结合亲和力(Kd＝10^-6～10^-9mol/L)。因此，SBP标签有助于纯化目标蛋白。此外，可以在GS接头之前放置切割位点(例如凝血酶切点)，因此可以容易地从链霉亲和素包被的磁珠上切割靶蛋白，以便从纯化的靶蛋白中去除GS接头和SBP标签。这种蛋白质对于结构分析和抗体生产更有用。

本发明中编辑了NF-κB家族的五个基因，细胞中带有SBP标签的转录因子 (TFs)可用于通过ChIP富集其结合的DNA，而无需ChIP级抗体。许多TF没有可商购的ChIP级抗体来鉴定其靶DNA和基因，以阐明其在基因调控中的功能。本发明的双标签系统可以为这些TF蛋白提供一种实用的无抗体ChIP分析方法。在这种情况下，可以用一对靶向目标TF的TALEN和HDR供体 SBP-IRES2-displaySBP转染细胞。然后可以用链霉亲和素包被的磁珠富集转染的细胞。随后可以从富集的细胞中分离细胞核，将其用于制备染色质，之后可使用链霉亲和素磁珠沉淀目标TF及其复合的DNA和其他蛋白质。此外，转染的细胞也可以无需细胞富集，而直接用于ChIP，进一步简化ChIP实验。

本发明制备的TALEN表达载体为可结合任何18bp靶点/序列的TALEN表达载体。本发明将目标集中于这种长度的TALEN上，因为TALEN通常由18个重复的34个氨基酸序列组成。加上恒定的T碱基，通过新方案构建的TALEN 实际可结合基因组中的19bp靶序列。这是TALEN经常使用的长度，具有很高的特异性。本发明表明，利用构建的19bp结合的TALEN，可以在各种细胞中有效地编辑不同的靶基因。另外，若有必要，使用在本发明中相同的策略制备线性单体，可以类似地制备其他单体，以制备结合更长靶点的TALEN。

总之，本发明开发了一种新的TALEN表达载体构建材料及其快速TALEN 表达载体制备方法，利用这些材料及方法可以在短短一天的工作时间内(约12 小时)内制备任何定制的18bp结合的TALEN。该TALEN表达载体制备方法使用了一组线性单体、最终的TALE-FokI骨架质粒，并通过全新的流程来快速组装即用型TALEN表达质粒，这些都是本发明新开发的。本发明通过制备5对 TALEN并在不同细胞系中编辑5个NF-κB基因，本发明证明了制备得到的 TALEN表达载体具有很高的效率、可重复性可靠性和适用性。本发明还表明， TALEN具有比CRISPR更高的编辑效率。最后，本发明还开发了一种同时标记目标蛋白和成功编辑细胞的双重标记系统，该系统在蛋白质(抗原)制备，免疫沉淀和TF ChIP-seq分析中具有广泛的应用。

附图说明

图1为TALEN骨架载体图谱和序列信息示意图；

图2为CRISPR psgRNA-Cas9骨架载体图谱和序列信息示意图；

图3为HDR供体：SBP-IRES2-displaySBP；

图4为HDR供体：AviTag-IRES2-display AviTag；

图5为所有TALEN和CRISRP/Cas9-sgRNA的结合靶点的位置示意图；

图6为本发明TALEN表达载体构建材料及其快速TALEN表达载体制备方法的示意图；A.96孔PCR板中单体的示意图，总共有60个碱基决定单体和2 个连接单体(dsDNA10.5和dsDNA17.5)，还构建了TALEN骨架(TALE-FokI) 质粒；B.TALEN表达质粒的结构；C.线性单体和TALEN骨架质粒的结构，使用一对通用引物可通过96孔PCR扩增来复制所有单体，CMV：巨细胞病毒启动子；N和C，TALEN的非重复氨基和羧基末端；BsmBI：用于插入定制TALEN DNA结合结构域的IIs型限制性酶切位点；LacZa：LacZa表达盒，用于蓝白斑筛选；NLS：核定位信号；FokI：FokI核酸内切酶的催化结构域；D.用TALEN (左和右TALEN)切割DNA的示意图，可以产生特定位点的双链断裂(DSB)，可以增强DNA同源指导修复(HDR)；E.用线性单体和TALEN骨架质粒构建定制TALEN的流程图，给出了每个步骤所花费的时间，整个过程可以在一天内完成，可在一天之内获得即可转染哺乳动物细胞的TALEN表达载体；

图7为使用本发明的TALEN制备方法制备定制TALEN；A.在琼脂培养基平板上生长的TALEN质粒转化的大肠杆菌菌落；B.随机挑选的白色菌落的菌落PCR检测，检测两个RELATALEN的八个菌落，分别检测两个RELB、CREL、 NF-κB1和NF-κB2的TALEN的菌落各四个，全长PCR产物长2051bp，梯形效果有力地表明组装成功，培养所有菌落PCR检测到的菌落以提取质粒，用EcoRI 消化获得的质粒，其中阳性菌落产生全长3537-bp的TALEN片段，而阴性菌落(未插入序列)产生2143bp的条带；C.利用PCR和EcoRI检测菌落筛选制备的TALEN(上)和不经过菌落筛选制备的TALEN(下)，针对每个 CRISPR/Cas9-sgRNA筛选两个菌落；

图8为用TALEN和CRISPR编辑NF-κB中的RELA的示意图；A.带有两个不同双标签系统的同源供体及其标记的细胞和靶蛋白示意图；B～D.在三个细胞系中用TALEN和CRISPR编辑NF-κB的RELA，并通过NIRF成像进行检测, 用两个不同的双标签系统分别用同源供体修复编辑的基因，B.微孔板中被 IRDye800CW-链霉亲和素染色的细胞，C.量化的NIRF强度，D.通过胰蛋白酶消化从孔中收集的细胞的NIRF成像，上：NIRF成像；下：明场成像。

图9为用TALEN和CRISPR编辑NF-κB的RELA的示意图；A.用TALEN 和CRISPR在HepG2细胞中编辑NF-κB的RELA，并用可见荧光进行检测，分别用两个不同的双标签系统的同源供体修复编辑的基因，细胞用

488-链霉亲和素染色，并用荧光显微镜成像；B.用流式细胞仪对

488-链霉亲和素染色的细胞进行定量分析；C.流式细胞仪分析的统计结果；D.Image J分析的统计结果；

图10为用TALEN和CRISPR编辑五个NF-κB基因的示意图；A.用TALEN 和CRISPR编辑HepG2细胞中的五个NF-κB基因，并用可见荧光进行检测，用 SBP双标签系统的同源供体分别修复编辑的基因，细胞用

488-链霉亲和素染色的细胞进行定量分析；C.仅用脂质转染的对照细胞未显示荧光；

图11为用TALEN和CRISPR编辑五个NF-κB基因的示意图；A.用TALEN 和CRISPR编辑HepG2细胞中的五个NF-κB基因，并用qPCR检测，用SBP双标签系统的同源供体分别修复编辑的基因，从编辑的细胞制备gDNA，并通过 qPCR检测，分别使用一对与靶基因和插入序列退火的引物；B.用琼脂糖凝胶电泳观察qPCR产物；C.qPCR检测的统计结果；倍数：编辑效率的倍数，计算公式为(Ct_TALEN/Ct_CRISPR)×10。

图12为编辑细胞的磁分离。由TALENs编辑的HepG2细胞靶向五个NF-κB 基因，并用SBP双标签系统的同源供体修复；A.用链霉亲和素包被的磁珠分离的细胞；B和C.将富集的细胞培养48小时，并用

488-链霉亲和素染色；染色的细胞用荧光显微镜细胞成像(B)，并用流式细胞仪定量分析(C)； D.通过

488-链霉亲和素染色编辑过的细胞核，检测NF-κB的RELA 标签。染色的细胞用荧光显微镜细胞成像(左)，并用流式细胞仪定量分析(右)。用TNFα处理编辑的细胞以激活NF-κB的RELA。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例

三种细胞中NF-κB家族基因的TALEN及CRISPR编辑

1.材料和方法

1.1.线性TALEN单体的制备

线性TALEN单体由“Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0(购自Addgene)”(简称Addgene kit 2.0；Addgene试剂盒2.0)试剂盒中的质粒单体作为模板，使用表1和表2中列出的引物和寡核苷酸，通过PCR扩增制备，方法同申请人的在先专利或文献(发明专利申请号：201810723261.4；Generate TALE/TALEN as Easily and Rapidly asGenerating CRISPR Molecular Therapy: Methods&Clinical Development 2019，13：310-320)。将制备的62个线性TALEN 单体排布在96孔板上，作为新的PCR模板，使用一对通用引物(PCR-TAL-F/R；表1)，通过96孔PCR扩增来复制单体(单体的再生产)。所有线性的单体PCR 再扩增反应体积均为240μL，其中包含5μL线性单体，10μM PCR-TAL-F、10μM PCR-TAL-R和

HS DNA聚合酶(Takara)。PCR程序为96℃预变性3分钟；28个循环：96℃20秒、55℃20秒、72℃3分钟；72℃延伸3分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳检测或抽检PCR产物。用苯酚/氯仿萃取纯化PCR产物，并用无水乙醇沉淀。将PCR产物重悬于水中。

表1.用于TALE单体扩增和克隆PCR的引物

表2.合成双链DNA

1.2.TALEN骨架和sgRNA-CRISPR/Cas9质粒的构建

通过PCR扩增从pTAL3-His(Addgene试剂盒2.0)中克隆了FokI片段，其中在上游和下游分别引入EcoRI和NotI酶切位点。PCR反应(30μL)由1ng pTAL3-His、10μM FokI-F(表3)、10μM FokI-R(表3)和

HS DNA聚合酶组成。PCR程序为：96℃预变性3分钟；28个循环：96℃ 20秒、 58℃ 20秒、72℃ 30秒；72℃延伸3分钟。将扩增片段连接到pPIRES2-EGFP (Takara)质粒中，制备质粒pPIE-FokI。通过DNA测序验证了pPIE-FokI。用BamHI从Addgene试剂盒2.0中的pTAL2质粒中切出TAL(LacZa)片段，连接到PIE-FokI中，制备TALEN骨架质粒pTALEN(图1)。该TALEN骨架质粒由强启动子CMV、TALE-N端序列、LacZ序列、TALE-C端序列及核酸酶FokI 序列元件构成(图1)，每个元件的DNA序列如图1所示。

构建Cas9和sgRNA共表达质粒用于转染哺乳动物细胞。使用

HSDNA聚合酶通过PCR扩增，使用引物Lac-px-F和Lac-px-R(表 3)，通过PCR扩增从pEASY-Blunt-simple(Transgen，CB101-01)克隆了两端具有BbsI和BsaI(New England Biolabs)位点的lac操纵子序列。将该lac操纵子序列连接到px459(Addgene质粒ID：62988)中，构建px459-lac。定制的 Cas9和sgRNA共表达质粒px459-lac可以通过蓝白斑筛选。通过测序验证px459-lac。为直观起见，将新构建的px459-lac质粒命名为psgRNA-Cas9(图2)。

1.3.同源臂克隆的制备

选择五个NF-κB家族基因RELA、RELB、CREL、NF-κB1、NF-κB2作为靶标。合成了SBP-IRES2-DisplaySBP(图3)和AviTag-IRES2-DisplayAviTag(图 4)双标签供体。将PCR扩增制备HDR供体的引物的末端设计为靶向各基因的同源臂(仅35nt)(表3)，通过PCR扩增制备双标签供体。PCR反应(30μL) 包含1ng SBP-IRES2-DisplaySBP或AviTag-IRES2-DisplayAviTag、10μM hom-F (表3)、10μM hom-R(表3)和

HSDNA聚合酶。PCR程序为： 96℃预变性3分钟；28个循环：96℃ 20秒、最佳退火温度20秒、72℃ 1.5 分钟；72℃延伸5分钟。用凝胶提取试剂盒纯化PCR产物。

表3.用于制备TALEN和CRISPR/Cas9骨架载体和同源臂以及鉴定CRISPR 阳性克隆的PCR引物

1.4.TALEN和CRISPR靶标的设计

通过在线程序TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (https://tale-nt.cac.cornell.edu/)为每个基因选择一对TALEN靶点(左、右TALEN 靶点)(表4；图1)。通过在线程序CHOPCHOP(https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/) 设计Cas9/sgRNA靶点(表5；图5)。图5显示了这些靶点在基因上位置信息。

表4.设计的TALEN靶序列

表5.设计sgRNA靶序列

名称	序列(5′→3′)(下划线碱基为PAM)
		RELA-sgRNA-PAM	GAGTCAGATCAGCTCCTAAG<u>GGG</u>
RELB-sgRNA-PAM	GCCCCGCGATGCCAGAGGAG<u>GGG</u>
		CREL-sgRNA-PAM	AGGTGGTATCAAGATTTAAA<u>AGG</u>
NF-κB1-sgRNA-PAM	GGGCTTTGGTTTACACGGTG<u>TGG</u>
		NF-κB2-sgRNA-PAM	TGTACAGGGGGTCCGGGAAG<u>GGG</u>

1.5.定制18bp TALEN的构建

分两个步骤制备所有具有18bp结合位点的TALEN(表4)。第一步：制备四个环状五聚体。首先，建立四个Golden Gate反应(也称切割-连接反应，简称切连反应)：N1-N2-N3-N4-N5、N6-N7-N8-N9-N10、dsDNA10.5-N11-N12-N13-N14 和N15-N16-N17-dsDNA17.5-N18，进行切连反应，以产生四个五聚体；其中 N1～N18指位于18bp靶序列(表4)位置1～18的核苷酸，每个核苷酸结合一个对应的碱基决定单体(其位置序号为图6A所示)；例如，若靶序列位置1的核苷酸分别为C、G、A、T时，则对应的碱基决定单体则分别为HD1、NG1、NI1、 NN1(图6A微孔板第一列A～D行)。以制备靶向表4中靶序列5′-CTGAG TCAGA TCAG CTCC-3′的TALEN表达载体为例，则构建四个环状五聚体的切连反应中分别加入下列线性单体：切连反应N1-N2-N3-N4-N5中加入线性单体HD1、NG2、 NN3、NI4、NN5；切连反应N6-N7-N8-N9-N10中加入线性单体NG6、HD7、 NI8、NN9、NI10；切连反应dsDNA10.5-N11-N12-N13-N14中加入线性单体dsDNA10.5、NG11、HD2、NI3、NN14；切连反应N15-N16-N17-dsDNA17.5-N18 中加入线性单体HD15、NG16、HD7、dsDNA17.5、HD18。注意：图6A中的碱基决定单体HD2、NG2、NI2、NN2既可以用于N2位的碱基决定单体，也可以用于N12位的碱基决定单体；图6A中的碱基决定单体HD3、NG3、NI3、NN3 既可以用于N3位的碱基决定单体，也可以用于N13位的碱基决定单体；图6A中的碱基决定单体HD7、NG7、NI7、NN7既可以用于N7位的碱基决定单体，也可以用于N17位的碱基决定单体。每个反应(20μL)包含10U BsaI、400U T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)、1×T4 DNA连接酶缓冲液、2μg BSA和200 ng每种单体(共5个单体)。反应温控程序为：3个循环：37℃5分钟和16℃10 分钟；50℃ 5分钟；80℃ 5分钟。之后在每个反应中添加1μL质粒安全核酸酶 (Plasmid-Safe nuclease)(储存浓度10U/μL；EpicenterBiotechnologies)和1μL ATP(储存浓度10mM)。将反应在37℃下孵育15分钟、在70℃下孵育15分钟。第二步：制备最终的TALEN表达质粒。进行一个新的切连反应，反应(20μL) 包含75ng BsmBI预先消化的TALEN骨架质粒、10U BsmBI(New England Biolabs)、400U T4 DNA连接酶、1×T4 DNA连接酶缓冲液和200ng每种五聚体(共4个五聚体)。反应温控程序为：3个循环：37℃5分钟和16℃10分钟； 50℃ 5分钟；80℃ 5分钟。之后将反应液(20μL)用于转化感受态大肠杆菌DH5α (Tiangen，中国)。向转化的DH5α(200μL)中加入800μL LB培养基，并在 37℃下孵育1小时。然后将转化的DH5α(100μL)涂布在含有100μg/mL卡那霉素的琼脂培养基上37℃培养过夜。然后使用引物TAL-F和TAL-R通过菌落 PCR鉴定菌落(表1)。菌落PCR反应(30μL)包含3μL菌落悬浮液、1×Premix Taq(Takara)、10μM TAL-F和10μM TAL-R。PCR反应程序为：96℃预变性10 分钟；30个循环：96℃20秒、55℃20秒、72℃3分钟；72℃延伸10分钟。 PCR产物(10μL)用1％琼脂糖凝胶(1％Tris-acetate-EDTA(TAE)电泳。阳性菌落用含有100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基培养，并按照制造商的说明使用QIAprep SpinMiniprep Kit(Qaigen)提取质粒。通过EcoRI消化进一步确认质粒。EcoRI反应包含1μgTALEN质粒、15U EcoRI和1x EcoRI Buffer。将反应在37℃下孵育30分钟。用1％琼脂糖凝胶(1×TAE)进行电泳检测。根据制造商的说明，使用EndoFree Plasmid kit(CWBio，中国)提取用于转染哺乳动物细胞的质粒，即TALEN表达载体。

1.6.构建靶向NF-κB的sgRNA-CRISPR/Cas9

为了与TALEN进行比较，本发明构建了五个针对NF-κB家族的 psgRNA-Cas9质粒，分别命名为pRELA-sgRNA-Cas9、pRELB-sgRNA-Cas9、 pCREL-sgRNA-Cas9、pNF-κB1-sgRNA-Cas9和pNF-κB2-sgRNA-Cas9。为了制备靶向特定靶点的CRISPR/Cas9表达载体，将质粒psgRNA-Cas9用BbsI消化线性化，并进行凝胶纯化。将一对序列互补的寡核苷酸(如RELA-sgRNA与 RELA-sg-S；表6)以100μM的浓度溶解在ddH₂O中，等摩尔混合，使其终浓度为10μM。将混合物在水浴中于95℃变性5分钟，然后逐渐冷却至25℃退火成双链寡核苷酸。用于制备psgRNA-Cas9的20μL反应包含10U BbsI、400U T4 DNA连接酶、1×T4 DNA连接酶缓冲液、50ng psgRNA-Cas9和100μM上述制备的双链寡核苷酸。反应体系在热循环仪中分别在37℃5分钟和16℃ 10分钟中孵育10个循环，酶在50℃ 5分钟和80℃ 5分钟灭活。通过向每个反应中添加1μL质粒安全核酸酶(10U/μL)和1μL ATP(10mM)并在37℃下孵育 30分钟，去除残留的线性DNA。在70℃灭活质粒安全核酸酶30分钟。用 psgRNA-Cas9产物转化大肠杆菌DH5α，并在37℃下含有氨苄青霉素(100 μg/mL)、X-gal(20mg/mL)和IPTG(200mg/mL)的LB琼脂上培养过夜。阳性菌落分别用引物U6-test-F(表3)和下游引物(RELA-sgRNA-test-R、RELB-sgRNA-test-R、CREL-sgRNA-test-R、NF-κB1-sgRNA-test-R、 NF-κB2-sgRNA-test-R之一；表3)以及1×Premix Taq进行菌落PCR鉴定。PCR 程序为96℃ 15分钟，96℃ 20秒、58℃ 20秒、72℃ 30秒下30个循环和72℃延伸2分钟。最后，将选定的菌落在37℃下含有100μg/mL氨苄青霉素的LB 液体培养基中培养过夜。使用无内毒素质粒提取试剂盒(EndoFreePlasmid)提取质粒。

表6.用于制备sgRNA靶标区(20bp)的寡核苷酸

S，正义；AS，反义

1.7.细胞培养和转染

用含有10％胎牛血清(FBS)(HyClone)、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM(HyClone)培养293T、HepG2和PANC1细胞(中国科学院上海生物科学研究所)，在5％CO₂的潮湿培养箱中于37℃孵育。将细胞以5×10⁴细胞/孔的密度接种在24孔板中，孵育24小时。然后使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)将质粒转染细胞。所有用于转染的载体均使用EndoFree质粒试剂盒提取。转染前，小心除去培养基。然后用PBS冲洗HepG2和PANC1细胞，但不得用PBS冲洗293T细胞。随后，将500μL包含2μg Lipofectamine 2000和 800ng质粒的opti-MEM(Invitrogen)添加到24孔板的每个孔中。将细胞孵育4 小时。除去转染培养基，并加入新鲜的完全培养基。将细胞再培养24小时或48 小时。

1.8.检测基因编辑的效率

用TALEN编辑细胞时，用400ng TALEN表达载体(200ng left-TALEN和 200ngright-TALEN)(如编辑RELA基因是加入RELA-left-TALEN和 RELA-right-TALEN两种表达载体(表4))和400ng同源臂供体共转染在24 孔板上培养的293T、HepG2和PANC1细胞。用CRISPR编辑细胞时，用400ng sgRNA-Cas9和400ng同源臂供体共转染在24孔板中培养的293T、HepG2和 PANC1细胞。再培养细胞24小时。当使用供体AviTag-IRES2-DisplayAviTag时，转染质粒中需再额外添加100ng pMy-BirA(Addgene)质粒以共转染细胞。

向孔中的细胞添加1μL

800CW-链霉亲和素(储存浓度1mg/mL；Li-CORBioscience)，并培养4小时，用PBS漂洗细胞，并用Odyssey红外成像系统(Li-CORBioscience)在NIRF 800nm的通道成像。在孔中的细胞中加入1 μL Alexa

488-链霉亲和素(0.9mg/mL；YEASEN，中国)，并培养过夜，用PBS漂洗细胞，并用荧光显微镜(DP71-IX51；Olympus)拍照；用胰酶消化收集细胞，用流式细胞仪Calibur(BD)定量分析。除了流式测定，也可对收集的细胞滴片，用荧光显微镜拍照，再用Image J进行明场和荧光细胞计数，计算荧光细胞的比例，来确定基因编辑的效率。这种方法可不依赖于流式细胞仪对编辑效率进行测定。

1.9.通过RT-qPCR进行同源重组验证

将24孔板中培养的HepG2细胞与TALEN载体或pTsgRNA-Cas9以及同源臂供体一起共转染。EndoFree质粒试剂盒的洗脱缓冲液用作空白对照。转染后 72小时，通过gDNA提取试剂盒(Tiangen，中国)提取基因组DNA(gDNA)。通过荧光定量PCR(qPCR)检测gDNA。PCR反应(20μL)包含100ng gDNA、 10μM正向引物(RELA-F、RELB-F、CREL-F、NFKB1-F或NFKB2-F)、10μM IRES2-R和2×SYBR Mix(罗氏)。PCR反应程序为：95℃ 3分钟；40个循环： 95℃ 15秒和60℃ 1分钟。在此qPCR检测中，使用一对PCR引物(表7)扩增 TALEN/CRISPR切割位点附近的区域，其中一个引物与目标基因序列退火，另一个引物与插入的IRES2编码序列退火。PCR产物(3μL)用1.5％琼脂糖凝胶电泳。凝胶以15V/cm的速度运行，直到所有条带均清晰分离。

表7.PCR验证同源重组的引物。

1.10.阳性细胞的筛选

通过胰蛋白酶消化收集TALEN载体和同源臂供体共转染的HepG2，或 pTsgRNA-Cas9和同源臂供体共转染的HepG2。将细胞重悬于500μL磁珠分选缓冲液中，然后与5μLDynabeads^TMM-280链霉亲和素磁珠(10mg/mL； Invitrogen)混合。将细胞在室温下孵育30分钟，每隔10分钟轻轻摇动一次，以避免磁珠沉淀。用磁分离器分离细胞5～8分钟，并丢弃未结合磁珠的细胞。珠子结合的细胞用1mL磁珠分选缓冲液洗涤3次，然后在37℃下培养48小时以去除磁珠。

1.11.免疫荧光测定

将未编辑的HepG2细胞和筛选富集的TALEN编辑的HepG2细胞接种到孔中，并在37℃的5％CO₂中孵育24小时。然后将细胞以最终浓度为10ng/mL 的TNFα(Sigma)诱导30分钟。细胞用Alexa

488-链霉亲和素染色，并用荧光显微镜成像。然后，将细胞用冷PBS洗涤并通过胰蛋白酶消化收集。用冷PBS洗涤收集的细胞，并立即用流式细胞仪定量分析部分细胞。在室温下，将剩余的细胞在37％(g/mL)甲醛(Sigma)中固定10分钟。通过添加终浓度为0.125M的甘氨酸终止交联。通过在4℃下以1500rpm离心10分钟沉淀细胞。用500μL裂解缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.4、10mM NaCl、3mM MgCl₂、 0.1％IGEPAL CA-630)裂解细胞。通过在4℃下以1500rpm离心10分钟收集细胞核。细胞核用0.1％(v/v)Triton X-100处理15分钟，然后与Alexa

488- 链霉亲和素在37℃下孵育过夜。用PBS洗涤细胞核两次。最后，用荧光显微镜 (DP71-IX51；Olympus)对细胞核成像并用流式细胞仪进行定量分析。

2.结果

2.1.制备单体和TALEN骨架载体

通过使用一组PCR引物(表1)，以Addgene试剂盒2.0中的质粒为模板，进行PCR扩增，制备了一组新的线性单体(图1)。除了60个碱基决定单体外，本发明还设计了两个新的连接单体dsDNA10.5和dsDNA17.5(图6A；表2)。然后可以通过在96孔PCR平板中用一对通用引物(PCR-TAL-F/R；表1)扩增来复制制备的所有线性单体。这组线性单体可用于构建具有18bp靶序列的任何定制TALEN(图6B)。为了制备功能性TALEN，还构建了一个新的TALEN(TALE-FokI)骨架质粒，该质粒带有一个LacZ表达盒，可通过蓝白斑筛选轻松地筛选最终的阳性TALEN菌落(白色菌落)(图6C)。使用强启动子CMV控制TALEN在哺乳动物细胞中的表达(图6C)。

2.2.用新型无质粒单体构建TALEN的流程

使用新设计和生产的线性单体(PCR片段)(图6A)和TALEN骨架载体(图 6C)，设计了一条新流程，可在一天之内快速构建定制TALEN(图6E)。和Addgene 试剂盒2.0一样，该流程仍使用Golden Gate方法组装了定制的TALEN，其中两种IIS限制酶BsaI和BsmBI的不同切割位点用于切割线性单体、五聚体和TALEN 骨架载体。为了构建定制的TALEN，首先用单体BsaI和T4 DNA连接酶构建了四个切割-连接反应(也称为Golden Gate反应)，产生了四个环状五聚体。然后，用四个五聚体、TALEN骨架载体、BsmBI和T4 DNA连接酶构建另一个切割-连接反应，产生最终的TALEN载体，可直接用于编辑基因组。最终的TALEN 质粒载体可以通过细菌转染(有或没有菌落PCR鉴定)以及质粒提取来获得。最终的TALEN阳性质粒载体可通过EcoRI消化进一步快速确认。注意，根据 TALEN编辑的原理，使用TALEN编辑某一靶点时，使用一对相向结合的TALEN 蛋白(图6D)，这对蛋白由左右两个TALEN表达载体分别表达(如编辑基因RELA 时，使用表4中的RELA-left-TALEN和RELA-right-TALEN两种表达载体)。

2.3.构建针对NF-κB基因的TALEN

为了验证新的TALEN组装流程和基因编辑功能，按照方法中所述的组装步骤组装了靶向NF-κB的TALEN表达载体，分别命名为RELA-左TALEN (RELA-left TALEN)、RELA-右TALEN(RELA-right TALEN)、RELB-左TALEN (RELB-left TALEN)、RELB-右TALEN(RELB-right TALEN)、CREL-左TALEN (CREL-left TALEN)、CREL-右TALEN(CREL-right TALEN)、NF-κB1-左TALEN (NF-κB1-left TALEN)、NF-κB1-右TALEN(NF-κB1-right TALEN)、NF-κB2-左TALEN(NF-κB2-left TALEN)和NF-κB2-右TALEN(NF-κB2-right TALEN)。将上述最终的TALEN表达载体分别转染大肠杆菌并在固体琼脂培养基上培养。结果表明，产生了大量白色斑点(图7A)。在琼脂平板上没有看到蓝点，表明本发明方法的具有很高的切割-连接效率。随机挑选的菌落经过菌落PCR检测证实了插入片段的大小，并且还揭示出通常超过80％的菌落是真正的阳性菌落(图 7B)，表明用本发明的方法构建定制TALEN(图6)的效率很高。随后提取质粒的EcoRI消化进一步证实了菌落PCR的结果，这表明通常80％的白色斑点是正确且成功组装的最终TALEN(图7B)。

由于可高效获得阳性菌落，为进一步节省时间，从流程中删除了菌落筛选步骤。用构建的最终TALEN质粒转染细菌后，将它们直接在含有抗生素的液体培养基中培养4小时(图6E)。然后从细菌中提取质粒。细菌和质粒也可以通过菌液PCR扩增和EcoRI消化来确认(图7C)。这种方法节省了在琼脂上过夜培养细菌的时间。因此，可以在一天之内获得细胞转染所需的TALEN质粒(图6E)。

使用针对NF-κB基因的TALEN表达载体(图7C)，以将TALEN编辑与 CRISPR/Cas9编辑进行比较，构建了针对相同五个NF-κB基因的Cas9/sgRNA表达载体，称为RELA-sgRNA-Cas9、RELB-sgRNA-Cas9、CREL-sgRNA-Cas9、 NF-κB1-sgRNA-Cas9和NF-κB2-sgRNA-Cas9(图7C)。

2.4.双标签同源重组的编辑效率研究

为了检查快速TALEN制备方案的可靠性并比较两种编辑工具的编辑效果，通过同源指导修复(HDR)在NF-κB家族的5个基因的末端插入一个双标签DNA 片段。因此，制备了五对TALEN载体和五个靶向这些基因的sgRNA-Cas9载体。制备了两种线性HDR供体，即SBP-IRES2-displaySBP和 AviTag-IRES2-displayAviTag，其中将SBP/AviTag融合到靶基因的C末端以标记靶蛋白，同时displaySBP/displayAviTag来编码可展示在细胞表面上的 SBP/AviTag，用于标记细胞(图8A)。如果将HDR供体成功插入靶基因，则双重标签可以在靶基因启动子的控制下表达。可以使用荧光标记的链霉亲和素检测细胞表面展示的SBP/AviTag。具有SBP/AviTag的细胞也可以用链霉亲和素偶联的珠子(例如Dynabeads^TMM-280Streptavidin)进行分离。在使用AviTag时，还需用pMy-BirA质粒共转染细胞以生物素化AviTag。

为了评估两种编辑工具的编辑效果，首先，将靶向RELA的TALEN或 CRISPR和两种HDR供体共转染了三种不同的细胞系293T、HepG2和PANC1。然后，将转染的细胞培养48小时，并用IRDye-800CW标记的链霉亲和素染色。染色的细胞用NIRF成像仪成像。结果表明，使用两种HDR供体，TALEN和 CRISPR均成功编辑了三种细胞系(图8B～D)；然而，在所有细胞系中， RELA-TALEN的编辑效率均远高于RELA-sgRNA-Cas9(图8B～D)。此外，HDR 供体SBP-IRES2-displaySBP优于AviTag-IRES2-displayAviTag(图8B～D)。只用脂质体转染的对照细胞则无荧光。

为了进一步定量评估两种编辑工具和HDR供体的作用，用靶向RELA的 TALEN(RELA-left TALEN与RELA-right TALEN)或CRISPR (RELA-sgRNA-Cas9)和两种HDR供体进行HepG2和PANC1的转染，并做了三次生物学重复试验。将转染的细胞用Alexa

488链霉亲和素染色，然后用流式细胞仪进行定量分析。结果还表明，TALEN的编辑效率远高于CRISPR/Cas9(图9A～C)，HDR供体SBP-IRES2-displaySBP优于 AviTag-IRES2-displayAviTag(图9A～C)。如果无法使用流式细胞术，还可以通过另一种方式对细胞进行定量分析，即将收集的细胞滴在载玻片上，并用荧光显微镜成像在明场和荧光通道拍照，然后用Image J软件计数细胞(图9D)。

尽管SBP-IRES2-displaySBP(1076bp)和AviTag-IRES2-displayAviTag(1028 bp)的长度相似，但是在使用AviTag-IRES2-displayAviTag时，必须另外共转染表达生物素连接酶的载体pMy-BirA。因此，选择了更简洁的HDR供体 SBP-IRES2-displaySBP进行进一步研究。分别用针对NF-κB家族五个基因的 HDR供体SBP-IRES2-displaySBP和TALEN转染了HepG2细胞，以检查TALEN 编辑不同基因的能力。将转染的细胞同样用Alexa

488链霉亲和素染色，然后用流式细胞仪进行定量分析。结果表明，通过本发明制备的TALEN对所有五个基因进行了高效编辑(图10)。

为了进一步确认TALEN编辑并将其与CRISPR进行比较，通过qPCR检测了TALEN/CRISPR编辑的细胞。PCR反应使用一对分别与目标基因和融合的 IRES2编码序列退火的引物，以扩增被成功编辑的基因。从转染的细胞中提取 gDNA，并将等量的gDNA用作PCR模板。结果表明，所有五个基因均已由HDR 供体成功编辑和修复(图11A)。将HDR供体与靶基因融合(图11B)。在所有五个基因中，TALEN的编辑效率均高于CRISPR(图11C)。

2.5.阳性细胞的筛选和NF-κB蛋白的验证

在成功编辑的细胞表面上展示了标记肽SBP/AviTag。展示的标签不仅有助于轻松检测编辑效率(如上所述)，而且还可以用于筛选阳性细胞。因此，使用链霉亲和素偶联的磁珠(Dynabeads^TM M-280streptavidin)分离了阳性细胞(图 12A)。培养磁珠捕获的细胞，然后再次用

488链霉亲和素染色(图12B)，并用流式细胞仪分析(图12C)。发现单轮磁分选后，阳性细胞高度富集 (从10％增加到30％)。当然，还可以通过具有分离功能的流式细胞仪来富集阳性细胞。最后，为了进一步验证目标蛋白标签，用TNFα处理了富集的细胞。从细胞中分离细胞核，并使用

488链霉亲和素通过免疫组化检测。结果表明，TNFα处理诱导了SBP标记的NF-κB RELA的明显核移位(即进入细胞核)(图12D)。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种TALEN表达载体及其制备方法及靶基因和细胞双标记系统和应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 149

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tatcatcatg cctcctctag aggtctcctc gacttaaacc ggccaacata cccgtctctg 60

gcggcaagca agcgctcgaa acggtgcagc ggctgttgcc ggtgctgtgc caggaccatg 120

gccgagaccc tcgagccacc catgaccaa 149

<210> 2

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tatcatcatg cctcctctag aggtctccga aacggtgcag cggctgttgc cggtgctgtg 60

ccaggaccat ggcctgaccc cggaccaagt ggtggctatc gagaccctcg agccacccat 120

gaccaa 126

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctgagtcaga tcagctcc 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtgctctgg ggagggca 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggggcctg aagccacg 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccccacccag tgcccctc 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tatgaatttt ttcaagta 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcaagattt aaaaggat 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctctagaag gcaaaatt 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttggtttaca cggtgtgg 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccccagcctc aggtgcac 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgggaaggg ggctgggg 18

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagtcagatc agctcctaag ggg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gccccgcgat gccagaggag ggg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aggtggtatc aagatttaaa agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gggctttggt ttacacggtg tgg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgtacagggg gtccgggaag ggg 23

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggaagacgg caccgggagt cagatcagct cctaaggttt gggtcttcga 50

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcgaagaccc aaaccttagg agctgatctg actcccggtg ccgtcttcct 50

<210> 20

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aggaagacgg caccgggccc cgcgatgcca gaggaggttt gggtcttcga 50

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcgaagaccc aaacctcctc tggcatcgcg gggcccggtg ccgtcttcct 50

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aggaagacgg caccggaggt ggtatcaaga tttaaagttt gggtcttcga 50

<210> 23

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcgaagaccc aaactttaaa tcttgatacc acctccggtg ccgtcttcct 50

<210> 24

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aggaagacgg caccgggggc tttggtttac acggtggttt gggtcttcga 50

<210> 25

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcgaagaccc aaaccaccgt gtaaaccaaa gcccccggtg ccgtcttcct 50

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

aggaagacgg caccggtgta cagggggtcc gggaaggttt gggtcttcga 50

<210> 27

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcgaagaccc aaaccttccc ggaccccctg tacaccggtg ccgtcttcct 50

Claims

1.一种基于TALEN表达载体的靶基因和细胞双标记系统，其特征在于，所述靶基因和细胞双标记系统为TALEN编辑细胞产生双链断裂后，可用于同源指导修复HDR的两种线性供体：SBP-IRES2-displaySBP和AviTag-IRES2-displayAviTag；所述TALEN表达载体主要由一组线性单体、一种TALEN骨架质粒组装而成，所述一组线性单体包括60个碱基决定单体和2个连接单体；所述TALEN骨架质粒由强启动子CMV、TALE-N端序列、LacZ序列、TALE-C端序列及核酸酶FokI序列构成。

2.根据权利要求1所述的基于TALEN表达载体的靶基因和细胞双标记系统，其特征在于，所述线性单体可通过通用引物进行高保真PCR扩增再生产；所述LacZ序列可被TALE-DNA结合序列替代并可用蓝白斑筛选阳性克隆。

3.根据权利要求1所述的基于TALEN表达载体的靶基因和细胞双标记系统，其特征在于，所述TALEN表达载体的快速制备方法，包括如下步骤：

（1）四个环状五聚体制备

建立N1~N5、N6~N10、dsDNA10.5-N11~N14和N15~N17-dsDNA17.5-N18四个切割-连接反应；其中N1~N18为碱基决定单体，dsDNA10.5与dsDNA17.5为连接单体；其中每个切割-连接反应主要包含BsaI、T4 DNA连接酶和五种单体，制备得到四个环状五聚体；

（2）最终TALEN表达质粒制备

建立一个新的切割-连接反应，该反应主要包含BsmBI、T4 DNA连接酶、TALEN骨架质粒以及步骤（1）制备的四种环状五聚体，制备得到最终TALEN表达质粒；

（3）细菌转化及质粒提取

4.根据权利要求3所述的基于TALEN表达载体的靶基因和细胞双标记系统，其特征在于，步骤（1）和（2）中每个切割-连接反应的温控程序均为：2~5个循环：37℃ 3~10分钟和16℃ 5~15分钟；50℃ 2~10分钟；80℃ 2~10分钟。

5.根据权利要求3所述的基于TALEN表达载体的靶基因和细胞双标记系统，其特征在于，步骤（1）中每个切割-连接反应结束后，向其中添加质粒安全核酸酶和ATP，在37℃及70℃下依次下孵育10~20分钟，消除线性DNA片段。

6.根据权利要求1所述的靶基因和细胞双标记系统，其特征在于，所述SBP-IRES2-displaySBP和AviTag-IRES2-displayAviTag，其中SBP为链亲和素结合肽，AviTag为生物素酶靶点；其中SBP或AviTag可用于标记靶基因，displaySBP与displayAviTag可用于标记细胞；其中SBP或AviTag标记靶基因后，靶基因所表达的蛋白其羧基末端则带有SBP或AviTag标签；其中SBP或AviTag标签可用于靶蛋白及细胞的检测、富集、分离。

7.根据权利要求1所述的靶基因和细胞双标记系统，其特征在于，所述两种线性供体用于指导目标DNA修复时，可针对该目标DNA设计一对引物PCR，其5′端为35 nt的靶DNA配对序列，其3′端分别为23nt的GS-linker配对序列及24nt的SBP或AviTag配对序列；所述引物可用于PCR扩增SBP-IRES2-displaySBP或AviTag-IRES2-displayAviTag模板，制备用于指导目标DNA修复的线性供体。

8.一种权利要求1所述的靶基因和细胞双标记系统在基因编辑领域中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，所述TALEN表达载体为可结合任何18 bp靶点的TALEN表达载体。